Summary
우리는 세로 해마 뇌 슬라이스에 기록 및 자극 전극을 사용하고 세포 외 후유증 전위를 불러 일으키고 입증하기 위해 생체 내 등도 해마에서 세로 로 배치 된 기록 및 자극 전극을 사용했습니다. 세로 인터라멜라 CA1을 따라 장기 시냅스 가소성.
Abstract
해마에 있는 시냅스 가소성의 연구 결과는 CA3-CA1 lamellar 네트워크의 사용에 집중했습니다. 종방향 인터라멜라 CA1-CA1 네트워크에 덜 주의를 기울였습니다. 그러나 최근에는 CA1-CA1 피라미드 뉴런 간의 연관 연결이 표시되었습니다. 따라서, 해마의 종방향 인터멜라 CA1-CA1 네트워크가 시냅스 가소성을 지원하는지 여부를 조사할 필요가 있다.
우리는 생체 내 및 시험관 내 둘 다 전기 생리학 필드 기록을 사용하여 인터라멜라 해마 CA1 네트워크에서 장기 시냅스 가소성의 존재 또는 부재를 조사하는 프로토콜을 설계했습니다. 생체 외 세포외 필드 기록의 경우, 기록 및 자극 전극을 등쪽 해마의 중격-측두축에 세로 각도로 배치하여, 현장 흥분성 후분증 전위를 연상시킨다. 시험관 내 세포외 필드 기록의 경우, 해마 세로 슬라이스는 중격 측두평면과 평행하게 절단되었다. 기록 및 자극 전극은 종축을 따라 해마의 지층 오리엔스(S.O) 및 지층 라디에이텀(S.R)에 배치하였다. 이를 통해 자극적인 흥분성 포스트내시 전설의 방향성 및 층 특이성을 조사할 수 있었습니다. 이미 확립된 프로토콜은 생체 내 및 시험관 내에서 장기 적인 위약감(LTP) 및 장기 우울증(LTD)을 유도하는 데 사용되었다. 우리의 결과는 세로 인터멜라 CA1 네트워크가 N-메틸-D-아스파르타(NMDA) 수용체 의존성 장기 전력(LTP)을 지향성 또는 층 특이성 없이 지원한다는 것을 입증했습니다. 인터라멜라 네트워크는, 그러나, 횡 라멜라 네트워크와는 대조적으로, 어떤 중요한 장기 불경기 (LTD)와 함께 존재하지 않았다.
Introduction
해마널리 인지 연구에 사용되어왔다1,2,3. 횡축의 해마 라멜라 네트워크는 탈수자체, CA3 및 CA1 영역으로 구성된 삼중 시냅스 회로를 형성합니다. 라멜라 네트워크는 병렬 및 독립 유닛4,5로간주된다. 이 lamellar 관점은 해마의 생체 내 및 생체 외 전기 생리학 연구 둘 다에 대한 횡방향 및 횡방향 슬라이스의 사용에 영향을 미쳤습니다. 새로운 연구에 비추어, lamellar 가설은 재평가되고6 및 관심은 또한 해마의 interlamellar 네트워크에 주어지고 있습니다. 해마 인테르멜라 네트워크에 관해서는, CA3 지역은 긴 조사7,8,9,10,그러나 경도 CA1 해마 지역은 수신되었습니다 최근까지 상대적으로 작은 관심. CA1 인터라멜라 네트워크에 관해서는, 쥐의 등쪽 경도 해마 CA1 축을 따라 단기 시냅스 특성은11변화하는것으로 나타났다. 또한, 상과 장소에 반응하는 해마 세포의 클러스터는 쥐에서 해마의 세로 축을 따라 체계적으로 배열되는 것으로 나타났으며, 단기기억 작업(12)을 거치게 된다. 또한, 간질 발작 활동은 세로 축13을따라 전체 해마를 따라 동기화되는 것으로 나타났다.
그러나 종방향 CA1 해마 영역의 대부분의 연구는, CA3로부터 CA1 영역11,14,15로의입력을 이용했다. 세로 뇌 슬라이스를 만들기 위해 독특한 프로토콜을 사용하여, 우리의 이전 작업은 세로 축을 따라 CA1 피라미드 뉴런의 협회 연결을 입증하고 효과적으로 신경 신호를 처리하는 능력을 연루16. 그러나, 가로 입력 없이 세로 축을 따라 CA1 피라미드 뉴런이 장기간 시냅스 가소성을 지원할 수 있는지 여부를 결정할 필요가 있다. 이 발견은 해마에 관한 신경 학적 문제의 조사에 또 다른 각도를 추가 할 수 있습니다.
정보 전송의 효능을 적응 하는 뉴런의 능력 시 냅 스 가소성으로 알려져 있다. 시냅스 가소성은 학습 및 기억과 같은 인지 과정에 대한 기본 메커니즘으로 연루된다17,18,19,20. 장기 시 냅 스가 소성 중 하나 로 입증 된다 장기 potentiation (LTP), 신경 응답의 강화를 나타내는, 또는 장기 우울증 (LTD), 신경 반응의 약화를 나타내는. 장기 시 냅 스 가소성은 해 마의 횡축에서 공부 하고있다. 그러나, 이것은 CA1 피라미드 뉴런의 해 마 세로 축에서 장기 시 냅 스가 소성을 입증 하는 첫 번째 연구.
Yang et al.16에의해 사용되는 프로토콜로부터 구축, 우리는 CA1 피라미드 뉴런의 해마 종축에서 LTP 및 LTD를 입증하는 프로토콜을 설계했다. 우리는 생체 외 에서 실험에 대 한 5-9 주 사이 배열 하는 나이 C57BL6 남성 마우스를 사용 하 고 6-12 생체 내 실험에 대 한 오래 된 주. 이 상세한 기사는 마우스에서 경도 해마 뇌 조각이 시험관 내 기록을 위해 어떻게 얻어졌는지, 그리고 어떻게 생체 내 기록이 세로 축에서 기록되었는지보여줍니다. 시험관 내 기록을 위해, 우리는 해마의 격막 및 측두엽 단부를 표적으로 하여 경도 CA1 시냅스 가소성의 방향 특이성을 조사했습니다. 우리는 또한 해마의 지층 오리엔스 및 지층 라디에이터럼으로부터 기록함으로써 종방향 CA1 시냅스 가소성의 층 특이성을 조사하였다. 생체 내 기록을 위해, 우리는 해마의 세로 방향에 가장 적합한 각도를 조사했습니다.
생체 내 및 생체외 외 필드 기록을 모두 사용하여, 우리는 종방향 연결 CA1 피라미드 뉴런이 LTD가 아닌 LTP로 제시되는 것을 관찰했다. 그러나 CA3 및 CA1 뉴런을 모두 포함하는 횡방향은 LTP와 LTD를 모두 지원합니다. 해마의 횡단 및 세로 방향 사이 시 냅 스 기능에 있는 구별 추측 그들의 기능 연결에 차이 의미 할 수 있습니다. 추가 실험 그들의 시 냅 스 기능에 차이 해독 하는 데 필요한.
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Protocol
모든 동물은 국립 보건원의 동물 관리 및 실험실 사용의 지침 및 규정에 따라 처리되었습니다. 여기에 설명된 모든 방법은 홍콩 시대학교와 인천대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다.
1. 생체 내 현장 녹화
- 동물 준비
- 마우스를 마취시키기 위해 복강 내 우레탄 (무게 25g 당 0.06 g)을 주입하십시오. 아트로핀의 근육 주사와 보충 (0.05 mg/kg). 전체 마취가 적용 될 때까지 어두운 조용한 자리에 마우스를 유지.
주의: 우레탄은 발암 가능성이 있습니다. 조심스럽게 다루고 노출된 피부와의 접촉을 피하기 위해 보호복을 착용하십시오.
참고 : 또는, 이소플루란은 마취로 사용할 수 있습니다. - 마취의 전체 수술 평면이 적용 될 때까지 간헐적으로 마취의 깊이를 확인합니다. 발가락 핀치, 귀 꼬집기, 꼬리 꼬집기 및 각막 터치 테스트를 수행하여 물리적 자극에 대한 마우스의 반응을 관찰하여 마취의 깊이를 확인합니다.
참고: 마우스가 마취의 완전한 수술 평면에 있을 때 반사 또는 자발적인 움직임을 관찰해서는 안됩니다. - 발가락 핀치 테스트의 경우 마우스의 뒷쪽이나 앞에서 확장하고 무딘 집게 또는 손가락으로 단단히 꼬집습니다. 마우스는 다리를 철회하거나 몸을 흔들거나, 관찰 가능한 호흡률을 증가시키지 않거나, 보컬 사운드를 내는 경우 전체 마취를 위해 확인되지 않습니다.
- 귀 핀치 테스트를 위해, 무딘 집게 또는 손가락한 쌍으로 피나 끝을 단단히 꼬집습니다. 마우스가 수염을 앞으로 움직이거나 머리를 흔들거나 보컬 사운드를 내거나 호흡률이 눈에 띄지 않으면 전체 마취가 확인되지 않습니다.
- 꼬리 핀치 테스트를 위해 마우스의 꼬리를 부드럽게 잡고 무딘 힘또는 손가락으로 단단히 꼬집습니다. 수술 시 완전히 마취할 때 꼬리 움직임, 보컬 소리 또는 호흡률의 관찰 된 증가를 관찰해야합니다.
- 각막 터치 테스트를 위해, 면 심지와 함께 부드럽게 마우스의 각막을 터치. 수술을 위해 완전히 마취할 때 눈꺼풀 운동, 수염 운동 또는 호흡률의 관찰 가능한 증가를 관찰해서는 안 됩니다.
- 마우스의 목과 두개골에 머리카락을 면도합니다.
- 완전히 마취된 마우스를 37°C로 설정된 가열 패드에 놓고 직장 온도 프로브를 직장에 삽입합니다. 이를 통해 가열 패드에서 생성된 열이 마우스의 체온 변화에 따라 조정될 수 있습니다.
- 마우스의 눈을 적시기 위해 아이 젤을 바하십시오.
- 포셉을 사용하여 혀를 입술 의 측면으로 부드럽게 당기고 두 개의 앞니를 입체 기구의 두 번째 또는 세 번째 치아 구멍에 고정시다. 눈 클램프를 사용하여 마우스의 두개골을 단단히 고정하십시오.
참고: 또는 입체 적인 귀 클램프를 사용할 수 있습니다. - 현미경으로 관찰, 시스테르나 마그나를 노출하는 메스와 마우스의 interparietal 및 후두 뼈의 끝에 피하 조직과 근육을 분리. 면봉으로 듀라 마더를 말립니다.
- 날카로운 뾰족한 메스 블레이드로 얕은 컷을 만들어 뇌척수액 (CSF)을 배출하여 시스터나 마그나를 부드럽게 찔렀습니다. CSF를 계속 배출하기 위해 면봉을 부착하십시오.
- 마우스를 마취시키기 위해 복강 내 우레탄 (무게 25g 당 0.06 g)을 주입하십시오. 아트로핀의 근육 주사와 보충 (0.05 mg/kg). 전체 마취가 적용 될 때까지 어두운 조용한 자리에 마우스를 유지.
- 개두술
- 집게로 두피에 피부를 잡고, 절단 및 수술 가위로 피부를 제거합니다. 두피에 bregma와 람다 자국을 노출하기에 충분한 피부를 잘라. 노출된 부위를 건조하게 유지하십시오.
- 마우스의 고정된 두개골을 조정하여 브레그마 와 람다 포인트가 비슷한 높이의 수평 레벨에 정렬될 수 있도록 합니다. 전방 후방 위치 또는 내측 측면 위치에서 머리를 기울이지 마십시오.
- 버니어 캘리퍼스의 도움을 사용하여 해마 부위에 해당하는 점을 표시합니다. 정확한 좌표를 결정하는 데 도움이 참조로 입체 좌표 책에서 마우스 뇌를 사용합니다.
참고: 해마절개에 대해 표시하는 위치는 브레그마를 기준점으로 사용하여 전방 후방(AP)으로 지칭되는 중간선에서 1 mm x 3 mm이고, 중간선의 점을 연결하는 미드라인(ML)에 수직인 3mm x 3mm입니다. 입체 좌표는 다음과 같이 제공됩니다 (AP : 1,3 및 ML : 3,3). - 현미경으로 관찰하는 동안 메스 또는 고속 드릴을 사용하여 표시된 점을 따라 해마의 등도 부위 위의 두개골을 절개하십시오.
참고 : 절개 후 2mm x 3mm 크기의 직사각형 개구부를 얻어야합니다. 노출된 부위를 깨끗하게 유지하여 뇌의 부상을 피하십시오. - 조심스럽게 듀라 메이터를 노출하고 부드럽게 표면을 촉촉하게 유지하기 위해 생리 식염수 용액을 적용하기 위해 주사기 또는 드롭퍼를 사용하여 집게와 느슨한 두개골을 꺼내.
- 바늘이나 날카로운 뾰족한 팁 집게로 경막미를 조심스럽게 제거합니다.
참고 : 개두술 중에 뇌 조직에 손상을 입히지 않도록주의하십시오. 이것은 두뇌의 팽윤으로 이끌어 내고 결과에 영향을 미칠 것입니다. - 노출 된 뇌 조직을 생리식염수 또는 불활성 오일을 드롭퍼 또는 주사기를 사용하여 바르고 촉촉하게 유지하십시오.
- 생체 내 녹음
- 자극 및 레코딩 전극을 고정 홀더에 고정하고 배치합니다. CA1 등도 해마 위의 자극 및 기록 전극에 대한 상응하는 AP 및 ML 좌표의 위치에 따라 입체 계측기를 조정한다.
참고: 등쪽 세로 CA1 해마 부위의 좌표를 찾는 데 지침으로 입체 좌표에서 마우스 뇌를 사용합니다. 예를 들어, CA1 해마 영역에 대한 입체 좌표는 자극 전극에 대한 기록 전극 및 (AP 1.7, ML 1.5)에 대한 (AP 1.5, ML 1.0)이 될 것이다. - 자극 전극을 세로 방향으로 기록 전극에 측면으로 찾습니다.
참고: 사용 전에 자극과 기록 전극이 모두 깨끗한지 확인하십시오. 이렇게 하면 녹음 시 노이즈가 발생하는 것을 방지할 수 있습니다. - 레코딩의 경우 다중 채널 전극을 사용하십시오. 먼저, 제1 채널을 사용하여 CA1 해마 영역에 대한 입체 좌표를 찾습니다. 브레그마 포인트에서 중간선과 관련하여 자극 및 기록 전극의 각도가 30° ~ 60° 범위에 있도록 나머지 전극을 배치합니다.
참고: 이 각도는 CA1 해마 영역의 세로 방향에 해당합니다. - 대조군으로서, 등쪽 해마의 CA1 영역 및 CA3 영역 위의 자극 전극 위에 기록 전극을 찾아내라. 예를 들어, 마우스 브레인을 가이드로서, CA1-CA3 해마 영역에 대한 입체 좌표는 자극 전극에 대한 기록 전극 및 (AP 1.5, ML 1.5)에 대한 (AP 1.8, ML 1.0)이 될 것이다.
참고: 이 단계는 대체 컨트롤이며 별도의 실험에서 수행해야 합니다. - 기준 전극을 노출된 뇌 영역의 말단 부분 또는 마우스의 피부 아래에 놓습니다.
- 레코딩 시스템을 켭니다.
- 기록 및 데이터 수집을 위한 소프트웨어를 엽니다.
참고: 다른 실험실에는 기록 및 데이터 수집을 위해 선호하는 소프트웨어가 있습니다. - 현미경으로 관찰하면 뇌 표면에 닿을 때까지 마이크로 조작기사용을 사용하여 기록 및 자극 전극을 천천히 낮춥시됩니다. 점을 0점으로 표시하여 해마 영역에 대한 정확한 깊이 계산을 시작합니다.
참고: 마이크로 조작기를 사용하여 지정된 시간에 전극이 삽입되는 깊이를 모니터링할 수 있습니다. 전극이 뇌 표면에 닿을 때 임피던스의 증가를 관찰하십시오. - CA1 해마에 대해 선택한 입체 좌표에 해당하는 대략적인 깊이로 전극을 천천히 낮춥힙습니다.
참고: 마우스 브레인을 입체 좌표로 사용하여 선택한 입체 좌표에 해당하는 대략적인 깊이를 얻을 수 있습니다. - 자극(100 μs 지속 시간, 30s 간격으로 반복)을 주고 안정된 자극된 장 흥분성 전위(fEPSP)가 관찰될 때까지 50 μm 이하의 단계로 전극 깊이를 조정합니다.
참고: 20 μA의 자극은 일반적으로 관찰 가능한 반응을 불러 일으키기에 충분합니다. - 자극 강도를 변화시켜 안정적인 fEPSP가 연상되었는지 확인합니다. fEPSP의 경사 또는 진폭의 현저한 증가는 각각의 증가된 자극 강도와 함께 관찰되어야 한다. 이를 입력 출력 곡선이라고 합니다. 입력 출력(I-O) 곡선을 생성하여 최대 자극 강도를 감지하여 호출된 fEPSP의 경사가더 이상 증가하지 않습니다(그림 6).
참고: 실험 중에 섬유 발리가 사라지면 데이터를 버리고 전극 위치를 변경합니다. - 입력 출력 곡선을 사용하여 기준 강도를 최대값의 40~50%로 설정합니다. 기준선 기록에 해당하는 자극 강도를 사용합니다.
- 로컬 필드 잠재력을 20-30분 동안 기준선으로 기록합니다.
- 동일한 입력 출력 곡선을 사용하여 고주파 자극(HFS) 또는 파상풍을 최대 강도의 75%로 자극 강도를 설정합니다. 또는, 장기 우울증을 유도할 때, 저주파 자극(LFS)을 불러일으키면 기준선을 기록하는 데 사용되는 것과 동일한 자극 강도를 유지한다.
- 100 Hz 펄스의 파상풍 자극을 10 s 간격으로 4 회 적용하여 LTP를 유도합니다.
참고: 장기 potentiation 실험에서 작업할 때만 이 프로토콜을 사용합니다. - 이미 확립된 프로토콜에 따라 LTD를 유도하기 위해 5Hz(3분 동안 900 자극), 1Hz LFS(15분 동안 900 자극) 또는 1Hz 페어링 펄스(50 ms 페어링 펄스 간격, 15분 동안 900쌍의 자극)의 저주파 자극을 적용합니다.
참고: 장기 우울증 실험에서 작업할 때만 이러한 프로토콜을 사용하십시오. - HFS 또는 LFS 후 1시간 동안 로컬 필드 전위를 기록하거나 기록합니다.
- 소프트웨어를 사용하여 데이터를 내보내고 분석합니다.
- 기록된 영역을 병변으로 30s에 대한 10 μA 전류의 자극을 줌으로써 기록 및 자극 전극의 위치를 확인한다. 경부 4% 파라 포름 알데히드와 마우스를 정중 하 고 슬라이스 하 고 에 따라 Cresyl 바이올렛염색에 대 한 두뇌를 수확.
- 실험 후 자궁 경부 탈구 또는 치명적인 마취 제의 주입에 의해 마우스를 안락사.
- 자극 및 레코딩 전극을 고정 홀더에 고정하고 배치합니다. CA1 등도 해마 위의 자극 및 기록 전극에 대한 상응하는 AP 및 ML 좌표의 위치에 따라 입체 계측기를 조정한다.
2. 시험관 내 현장 녹화
- 산소 슬라이스 및 인공 뇌척수액(ACSF) 용액 준비
- 슬라이싱 용액 2L의 경우, 부피 플라스크에 약 1L의 이중 증류수를 넣고 교반기 플레이트에 힘차게 저어줍니다.
- 다음 슬라이싱 용액 성분(mM)을 추가: 87.0 NaCl, 2.5 KCl, 1.3 NaH2PO4,25.0 NaHCO3,25.0 포도당, 75.0 자당, 7.0 MgCl 2.6H2O 및 0.5 CaCl2∙2O(표 1).
참고: 대안적으로, MgCl2∙6H2O 및 CaCl2∙2H2O는 이 단계에서 제외될 수 있으며 나중에 부피를 사용할 준비가 되어 있다. - 이중 증류수로 최대 2L까지 올려서 힘차게 저어줍니다.
- ACSF 2L의 경우, 부피 플라스크에 약 1L의 이중 증류수를 넣고 교반기 플레이트에 힘차게 저어줍니다.
- 다음 ACSF 용액 성분(mM내)을 추가합니다: 125.0 NaCl, 2.5 KCl, 1.3 NaH2PO4,25.0 NaHCO3,25 포도당, 1.0 MgCl2∙6H2O 및 2.0 CaCl2∙2H2O (표1).
참고: 대안적으로,MgCl 2.6H2O 및 CaCl2∙2H2O는 이 단계에서 제외될 수 있으며 나중에 부피를 사용할 준비가 되어 있다. - 이중 증류수로 최대 2L까지 올려서 힘차게 저어줍니다.
- 설정 및 뇌 슬라이스
- 이미 제조된 슬라이싱 용액 400 mL을 별도의 플라스크 및산소공급액(95% O 2/5% CO2)에 약 20분 동안 붓습니다.
- 나머지 1.6L 용액을 4°C 냉장고에 보관합니다. 곰팡이 성장을 피하기 위해 사용하지 않으면 폐기해야하는 1 주까지 용액을 유지하십시오.
- 플라스크에 산소로 된 슬라이싱 용액 200 mL을 붓고 파라필름으로 덮고 약 20 분 동안 -80 °C 냉동고로 옮겨 슬러시를 만듭니다.
- 남은 200 mL의 슬라이스 용액을 뇌 슬라이스 홀딩 챔버에 붓고 연속 버블링으로 32 °C 수조에 보관하십시오.
- 슬라이스를 위해 벤치를 준비합니다. 종이 타월을 내려놓고 수술 도구를 벤치 위에 놓습니다. 빠르고 효율적인 과정을 용이하게 하기 위해 수술 도구를순서대로 배열한다(그림 7).
- 냉동고에서 차가운 슬라이스 용액을 꺼내 비커에 약 50 mL을 붓습니다. 필터 페이퍼가 들어있는 페트리 접시에 약 10 mL를 부어 적십시. 해부 부위에 얼음위에 놓습니다.
- 슬라싱 슬릭 용액의 나머지 부분을 슬라이스 챔버에 붓고 진동에 고정합니다.
- 동물 관리 및 국립 보건 원 실험실의 사용에 대한 지침 및 규정을 사용하여 이소플루란으로 마우스를 마취하고 홍콩 시와 인천 국립 대학의 기관 동물 사용 및 관리위원회의 승인 된 방법 대학.
- 한 쌍의 가위로 마취 된 마우스를 참수하고 티슈 페이퍼에 머리를 놓습니다. 마우스의 두개골을 덮고 피부를 잘라 가위로 피부 근육을 잘라. 수술 가위를 사용하여 후두뼈에 중간선을 따라 두개골 판을 잘라.
- 뇌를 노출하는 무딘 집게로 두개골을 엽니 다. 주걱으로 뇌를 부드럽게 떠서 비커의 차가운 슬라이스 용액에 넣습니다. 30에 대해 기다립니다.
- 숟가락을 사용하여 뇌를 꺼내 조심스럽게 페트리 접시에 이전에 축축한 여과 지에 배치합니다.
- 메스 블레이드와 중간선을 따라 두 뇌 반구를 분리합니다. 해마를 주걱으로 피질에서 부드럽게 분리하여 분리하고 축축한 필터 용지에 조심스럽게 놓습니다. 메스를 사용하여 고립 된 해마의 중격 및 측두경을 잘라냅니다.
- 무딘 주걱과 브러시를 사용하여 고립 된 해마를 집어 들십시오. 여분의 물을 제거하기 위해 티슈 페이퍼에 주걱을 부드럽게 두드려주세요.
- 진동의 슬라이스 플레이트에 소량의 접착제를 바하십시오.
- 세로 CA1 해마 슬라이스의 경우, 해마의 CA3 부위를 접착제로 슬라이스 플레이트에 부착합니다. 신속하지만 신중하게 냉각 산소 슬라이스 용액을 포함하는 진동의 슬라이스 챔버에 배치합니다.
- 대조군역할을 할 횡방향 슬라이스의 경우, 해마의 복부 말단을 진동기의 슬라이스 플레이트에 부착한다. 신속하지만 신중하게 냉각 산소 해부 용액을 포함하는 슬라이스 챔버에 배치합니다.
참고: 이 단계는 위의 단계에 대한 대안이며 별도로 수행해야 합니다. - 블레이드 각도를 90°로 배치합니다. 진동 매개변수를 0.05mm/s의 속도, 진폭 1.20mm, 슬라이스 두께 400μm로 설정합니다.
- 부착된 해마를 진동으로 슬라이스합니다.
참고 : 좋은 세로 CA1 해마 뇌 슬라이스는 CA1의 한 층과 2 층의 치과 자이러스를 가질 것입니다. 최대 2 개의 좋은 해마 조각을 얻을 수 있습니다. 대안적으로, 횡 방향 해마 뇌 슬라이스는 치과 자이러스, CA3 및 CA1 부위를 그대로 가질 것이다. - 피펫으로 비브라토메에서 세로 해마 뇌 조각을 전송하고 수조에서 챔버를 들고 뇌 슬라이스에 배양.
- 32 °C의 온도에서 20 분 동안 수조에서 슬라이스를 인큐베이팅하고 30 분 동안 실온으로 가져 오십시오.
참고: 또는 수조에서 나올 때 뇌 슬라이스를 옮기고 30분 동안 32°C의 온도에서 산소가 흐르는 ACSF를 사용하여 녹음 실에 부드럽게 놓습니다. - 수조에서 배양하는 동안, ACSF 용액 400 mL을 별도의 플라스크 및 산소화(95%O 2/5% CO2)에 약 20-30분 동안 부어 뇌 슬라이스를 기록 챔버로 옮김을 옮김으로 옮김을 넣는다. ACSF를 2mL/min의 속도로 녹음 챔버에 지속적으로 대체합니다.
- 온도 컨트롤러를 켜서 흐르는 ACSF를 32°C로 가열합니다.
- 나머지 1.6L 용액을 4°C 냉장고에 보관합니다. 곰팡이 성장을 피하기 위해 사용하지 않으면 폐기해야하는 1 주일 까지 용액을 유지하십시오.
- 체외 녹화
- 필요한 모든 하드웨어를 켜서 레코딩 리그를 설정합니다.
- 슬라이스 홀딩 챔버에서 뇌 슬라이스를 녹음 챔버로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김. 무딘 집게로 뇌 슬라이스의 위치를 조정하고 하프와 장소에 개최. ACSF가 최소 20분 동안 실행되도록 허용합니다. 이렇게 하면 기록하기 전에 뇌 슬라이스가 안정될 수 있습니다.
- 내부 솔루션으로 ACSF로 녹음 파이펫을 채웁니다.
- 지정된 소프트웨어로 기록 파이펫 저항을 확인합니다. 기록 파이펫 저항은 3-5 MΩ 범위 내에 있어야 합니다.
- 데이터 수집을 위해 소프트웨어를 켭니다. 이 소프트웨어는 앞에서 보여 준 생체 내 레코딩과 유사한 방식으로 데이터 수집을 가능하게 하는 유사한 기능을 가져야 합니다.
- 스테레오택 악기 홀더에 레코딩 및 자극 전극을 단단히 고정합니다. 레코딩 챔버의 ACSF에 기준 전극을 놓습니다.
- 세로 슬라이스의 경우, 지층 오리엔스(S.O.)에 자극 및 기록 전극을 배치합니다. 전극 사이의 거리를 약 300~500 μm로 유지합니다. 자극 전극을 뇌 슬라이스의 중격 또는 측에 놓고동일한 층에서 기록하고 (그림 8).
- 대안적으로, 지층 라디에이텀(S.R.)에 자극 및 기록 전극을 위치시다. 뇌 슬라이스의 중격 또는 시간측면에 자극 전극을 놓습니다.
- 제어로서 횡방향 슬라이스의 경우, 자극 전극을 CA3(샤퍼 부수적 통로) 영역에 위치시키고, 기록 전극을CA1 영역에 위치한다(그림 9).
참고: 이것은 대체 제어 단계이며 별도의 실험에서 수행해야 합니다. - 분리 된 자극 발생기를 켜고 자극 (100 μs 지속 시간, 30 s 간격으로 반복)을 제공합니다. 안정된 흥분성 위치 전위 전위가 관찰될 때까지 기록 전극 깊이 및/또는 위치를 조정합니다.
- 자극 강도를 변화시켜 안정적인 fEPSP가 연상되었는지 확인합니다. fEPSP의 경사에서 주목할만한 변화는 자극 강도의 각 변화와 함께 관찰되어야한다. 이를 입력 출력 곡선이라고 합니다. 입력 출력(I-O) 곡선을 생성하여 FEPSP의 경사가 더 이상 증가하지 않는최대 자극 강도를 감지합니다(그림 6).
참고: 실험 중에 섬유 발리가 사라지면 데이터를 버리고 전극 위치를 변경합니다. - 입력 출력 곡선을 사용하여 기준선 기록을 위한 자극 강도를 설정하고 고주파 자극(HFS) 또는 파상풍을 최대 발생 fEPSP의 30-40%로 불러오릅니다.
- 또는 LTD와 관련된 실험의 경우 입력 출력 곡선을 사용하여 기준선 기록을 위한 기준 세기를 설정하고 저주파 자극(LFS)을 최대 발생 fEPSP의 70%로 불러오릅니다.
- 로컬 필드 잠재력을 20-30분 동안 기준선으로 기록합니다.
- 100Hz 펄스의 HFS를 30s 간격으로 두 번 적용하여 LTP를 유도합니다.
- 또는, LTD 실험의 경우, 5Hz(3분 동안 900 자극) 또는 1Hz LFS(15분 동안 900 자극) 또는 1Hz 페어링 펄스(50 ms 페어링 펄스 간격, 15분 동안 900쌍의 자극)의 저주파 자극을 적용하여 이미 LTD를 유도합니다. 확립된 프로토콜.
- HFS 또는 LFS 후 1시간 동안 로컬 필드 전위를 기록합니다.
- 데이터를 내보내고 분석합니다.
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Representative Results
우리는 생체 외와 시험관에서 세포 외 필드 기록을 사용하여 해마의 세로 CA1 피라미드 뉴런의 장기 시냅스 가소성을 탐구했습니다. LTP 및 LTD는 해마의 횡축에서 단방향성으로 입증된 장기 시냅스 가소성의 측면입니다.
우리는 여기에서 세로 해마 두뇌 조각을 사용하여, 해마의 CA1 세로 축에 있는 LTP가 있다는 것을 보여주었습니다. 우리는 횡방향 슬라이스에 수직인 격막축을 따라 해마의 세로 슬라이스를 준비하였다(그림 1). 해마의 CA1 부위로부터의 기록을 사용하여, 방향이 구체적이지 않은 LTP의 존재를 보여주었다. 세로 해마 뇌 슬라이스의 중격 또는 측두측에서의 기록에 통계적으로 유의한 차이가 없었다(도2)측. 우리는 또한 계층 특정되지 않은 LTP의 존재를 보여 주었다; 따라서, 지층 라디에이텀 및 지층오리엔스 모두에서의 기록(도 2)은 세로 뇌 슬라이스에서 LTP를 성공적으로 유도한 것으로 나타났다. 우리는 D-AP5를 사용, NMDAR 길항제는 유도 된 LTP가 NMDA수용체에 의존했다는 것을 입증하기 위해 (그림 3). 시험관 내에서 일어나는 일은 반드시 생체 내 조건을 반영하지 는 않으므로 생체 내에서 LTP를 조사했습니다. 그림 4 a는 생체 내 CA1 영역의 종축을 따라 등쪽 해마에 위치된 자극 및 기록 전극의 개략도를 나타낸다. 기록 및 자극에 사용되는 전극의 위치는 병변 마크 및 크리스탈 바이올렛 염색에 의해 확인되었다(도4a). 우리는 종방향 CA1 지역에서 생체 내 LTP의 존재를 입증하였다(도4b).
LTD를 유도하기 위해 이미 확립된 프로토콜을 사용하여, 우리는 생체 내 및시험관 내 모두에서 LTD를 성공적으로 유도하지 못했다(그림 5).
그림 1 . 가로 및 세로 해마 뇌 슬라이스의 개략도 도면. 이 수치는 2018 년21일 외에서 조정및 수정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 . 세로 슬라이스의 LTP. S.R. (a) 또는S.O. (b)세로 슬라이스에서 시냅스 응답은 파상풍 자극 직후에 시간 및 중격 입력 (S.R./temporal (n = 12, c), S.R./septal (n = 12, c), S.O/septal (n=12, s.c. 9, d).
n은 슬라이스 수를 의미합니다. 오류 막대는 SE를 나타냅니다. 이 수치는 2018 년21일 외에서 조정및 수정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 . 세로 슬라이스에서 NMDAR 의존 LTP. (a,b) 시간 및 중격 방향으로LTP 유도는 50 μM D-AP5 (측두, n = 6, a)에 의해 차단된다 (격막, n = 5, b). (c,d) 시간 및 중격 방향의 LTP 유도도 D-AP5에 의해 차단됩니다. n은 슬라이스를 의미합니다. 오류 막대는 SE를 나타냅니다. 이 수치는 2018 년21일 외에서 조정및 수정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 . 인터라멜라 네트워크에서 생체 내 LTP. (a) 마취된 동물의 기록 및 자극 전극의 개략도면. 기록의 궤위 (CA1의 격막 측에) 및 자극 전극 (CA1의 측에) 병변 표시에 의해 확인되었다. (b) LTP는 100 Hz 고주파 자극(HFS)에 의해 인터멜라 연결에서 유도된다(n=10 마우스). 색상 추적: HFS 이전(검은색) 및 이후(빨간색) 오류 막대는 SE를 나타냅니다. 이 수치는 2018 년21일 외에서 조정및 수정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 . 인터라멜라 CA1 네트워크에서 생체 내 및 체외 LTD의 부재. (a) 1 Hz-pp LFS는 생체 내에서 유도하지 않습니다 .(b) 1 Hz pp-LTP, (c) 5 Hz LFS, 및 (d) 1 Hz LFS는 세로 뇌 슬라이스의 시간 적 또는 중격측에 LTD를 생성하지 않는다. LTD가 횡방향 슬라이스에서 1Hz pp-LFS에 의해 유도되는 동안: 시간(n = 8), 격막(n =11) 및 1Hz pp-LFS를 가진 횡방향(n=6); ; 5Hz LFS를 가진 측두(n=3) 및 격막(n=3); 1Hz LFS를 가진 측두 (n = 3) 및 격막 (n = 3) . n은 슬라이스를 의미합니다. 오류 막대는 SE를 나타냅니다. 이 수치는 2018 년21일 외에서 조정및 수정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 . 해마 뇌 슬라이스에서 증가하는 자극 입력에 반응하여 fEPSP 경사를 제시하는 입력 출력 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 . 시험관 내 뇌 슬라이스 중 해마 격리에 사용되는 수술 도구. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8 . 세로 뇌 슬라이스 기록 준비. 자극 전극 및 기록 파이펫은 지층 라디에름에 삽입된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9 . 가로 해마 뇌 슬라이스 기록 준비. 자극 전극은 샤퍼 담보 CA3 영역에 삽입되고 기록 피펫은 CA1 영역에 삽입된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 화합물 | 슬라이싱 솔루션(mM) | ACSF (mM) |
| CaCl2.2H2O | 0.5 | 2 |
| 포도 당 | 25 | 25 |
| KCl | 2.5 | 2.5 |
| MgCl2.6H2O | 7 | 1 |
| Nacl | 87 | 125 |
| NaH2PO4 | 1.3 | 1.3 |
| 나코3 | 25 | 25 |
| 자당 | 75 |
표 1: 뇌 슬라이스 및 인공 뇌척수액 솔루션의 화합물 농도.
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Discussion
이 프로토콜은 시험관내 해마의 세로 CA1-CA1 축에서 뇌 슬라이스뿐만 아니라 생체 내에서 장기 시냅스 가소성을 유도하는 방법을 보여 준다. 설명된 단계는 종방향 해마 CA1-CA1 연결에서 LTP 및 LTD를 조사하기 위한 실험자에게 충분한 세부 정보를 제공합니다. 필드 흥분성 잠재력을 성공적으로 기록하는 데 필요한 기술을 연마하려면 연습이 필요합니다.
연습을 필요로하는 것 외에도 좋은 결과를 얻는 데 필수적인 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 먼저, 뇌 슬라이스가 만들어진 각도가 해마16의CA1-CA1 영역에서 피라미드 뉴런의 세로 돌기를 잘라내거나 보존할 수 있음을 이전에 나타내었습니다. 세로 피라미드 뉴런은 거의 수직인 각도로 횡방향 뉴런의 프로젝트입니다. CA1 뉴런이 해마 내의 다양한 각도로 전파됨에 따라, 그(것)들 사이 세로 연결은 해마의 dorsoventral 축을 따라 배치됩니다. 따라서, 시험관 내 기록의 경우, 실험자는 등쪽-복부 축을 따라 단경된 해마 조직을 절단하여 세로 축을 따라 CA1-CA1 해마 뉴런을 정확하게 표적으로 삼을 것을 명심해야 한다. 또한, 생체 내 기록의 경우, 자극 및 기록 전극이 위치되는 각도는 얻어진 결과가 세로 축또는 가로 및 세로 축의 혼합물을 나타내는지 여부를 결정합니다. CRISPR-Cas9를 활용한 추가 조사를 수행하여 호출된 응답이 CA1 영역과 CA3 지역 모두에서 응답이 혼합될 수 있으므로 CA1 리전에서만 호출되는지 여부를 확인할 수 있습니다.
둘째, 시험관 내 실험의 경우, 실험자는 뇌 슬라이스 용액, ACSF, 작업대 및 뇌 슬라이스와 접촉하는 모든 장비 또는 기기에 오염 물질이 없는지 확인해야 합니다. 오염의 어떤 형태는 뇌 슬라이스의 무결성 또는 죽음의 악화로 이어질 것입니다. 깨끗한 전극 표면을 유지하면 시험관 내 및 생체 내 실험 모두에 대해 양호하고 안정적인 기록을 보장할 수 있습니다.
우리는 경도 해마 CA1 네트워크가 NMDAR 의존적 LTP를 나타내지만 LTD는 나타내지 않는 것으로 나타났습니다. 그러나 트리시냅스 회로는 LTP 및 LTD22,23을모두 제공합니다. 이것은 세로 CA1 네트워크 및 트라이 시냅스 회로가 독특한 특징을 가지고 있음을 의미합니다. 우리의 프로토콜은 전기 생리학적 기록만을 사용하므로 이 두 네트워크 간의 차이를 찾는 데 제한이 있습니다.
정신 분열증과 같은 뇌 질환에 대한 치료법에 대한 검색은 계속됩니다. CA1 해마 소지역의 쇠퇴 또는 기형은 일부 정신 분열증 증상24,25와연결되었습니다. 우리의 프로토콜의 응용 프로그램, 비록 기본, CA1 종방향 해 마 소지역의 독특한 시 냅 스 능력을 빛을 가져왔다. 이 지식은 해마의 세로 CA1 축을 따라이 쇠 약 뇌 질환을 더 조사 할 수있는 실험을 설계하는 데 유용합니다.
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Disclosures
우리는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 인천대학교(국제협동조합) 연구보조금의 지원을 받았습니다. 데이터 수집을 도와주신 최고나 씨에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atropine Sulphate salt monohydrate, ≥97% (TLC), crystalline | Sigma-Aldrich | 5908-99-6 | Stored in Dessicator |
| Axon Digidata 1550B | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| Clampex 10.7 | |||
| D-(+)-Glucose ≥ 99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Eyegel | Dechra | ||
| Isoflurane | RWD Life Sciences | R510-22 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, BioXtra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
| Matrix electrodes, Tungsten | FHC | 18305 | |
| Multiclamp 700B Amplifier | |||
| Potassium chloride, BioXtra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous ≥99% | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | Stored in Dessicator |
| Pump | Longer precision pump Co., Ltd | T-S113&JY10-14 | |
| Silicone oil | Sigma-Aldrich | 63148-62-9 | |
| Sodium Bicarbonate, BioXtra, 99.5-100.5% | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | |
| Sodium Chloride, BioXtra, ≥99.5% (AT) | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic, powder | Sigma-Aldrich | 7558-80-7 | |
| Sucrose, ≥ 99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | 57-50-1 | |
| Temperature controller | Warner Instruments | TC-324C | |
| Tungsten microelectrodes | FHC | 20843 | |
| Urethane, ≥99% | Sigma-Aldrich | 51-79-6 | |
| Vibratome | Leica | VT-1200S | |
| Water bath | Grant Instruments | SAP12 |
References
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