Summary
Abbiamo usato elettrodi di registrazione e stimolazione in fette di cervello ippocampali longitudinali e elettrodi di registrazione e stimolazione longitudinalmente posizionati nell'ippocampo dorsale in vivo per evocare potenziali post-ynaptici extracellulari e dimostrare plasticità sinaptica a lungo termine lungo l'interlamellar longitudinale CA1.
Abstract
Lo studio della plasticità sinaptica nell'ippocampo si è concentrato sull'uso della rete lamelllare CA3-CA1. Meno attenzione è stata data alla rete longitudinale interlamellar CA1-CA1. Recentemente, tuttavia, è stata mostrata una connessione associativa tra i neuroni piramidali CA1-CA1. Pertanto, è necessario verificare se la rete longitudinale interlamellar CA1-CA1 dell'ippocampo supporta la plasticità sinaptica.
Abbiamo progettato un protocollo per studiare la presenza o l'assenza di plasticità sinaptica a lungo termine nella rete interlamelare hippocampal CA1 utilizzando registrazioni elettrofisiologiche sul campo sia in vivo che in vitro. Per le registrazioni extracellulari sul campo in vivo, gli elettrodi di registrazione e stimolazione sono stati collocati in un asse settale-temporale dell'ippocampo dorsale con un angolo longitudinale, per evocare potenziali post-sinaptici eccitatori di campo. Per le registrazioni in vitro extracellulari sul campo, le fette longitudinali ippocampali sono state tagliate parallelamente al piano settale-temporale. Gli elettrodi di registrazione e stimolazione sono stati collocati nello strato oriens (S.O) e nel radiato strato (S.R) dell'ippocampo lungo l'asse longitudinale. Questo ci ha permesso di indagare la specificità direzionale e di strato dei potenziali post-naptici eccitatori evocati. I protocolli già stabiliti sono stati utilizzati per indurre il potenziamento a lungo termine (LTP) e la depressione a lungo termine (LTD) sia in vivo che in vitro. I nostri risultati hanno dimostrato che la rete longitudinale interlamellar CA1 supporta N-methyl-D-aspartate (NMDA) che dipende dal recettore (LTP) senza specificità direzionale o di strato. La rete interlamellar, tuttavia, in contrasto con la rete lamellare trasversale, non presentava alcuna depressione significativa a lungo termine (LTD).
Introduction
L'ippocampo è stato ampiamente utilizzato negli studi cognitivi1,2,3. La rete lamellare ippocampale nell'asse trasversale forma il circuito tri-sinaptico costituito dalle regioni giro dente, CA3 e CA1. La rete zoppa è considerata un'unitàparallela e indipendente 4,5. Questo punto di vista zoppo ha influenzato l'uso dell'orientamento trasversale e delle fette trasversali sia per gli studi elettrofisiologici in vivo che in vitro dell'ippocampo. Alla luce della ricerca emergente, l'ipotesi del lamellare è stata rivalutata6 e si sta atendo attenzione anche alla rete interlamellare dell'ippocampo. Per quanto riguarda la rete interlamellar ippocampale, la regione CA3 è stata a lungo studiata7,8,9,10, tuttavia la regione longitudinale CA1 ippocampale ha ricevuto relativamente poca attenzione fino a poco tempo fa. Per quanto riguarda la rete interlamellar CA1, le proprietà sinaptiche a breve termine lungo l'asse longitudinale longitudinale CA1 dell'ippocampo dorsoventrale dell'asse dei ratti hanno dimostrato di variaredi 11. Inoltre, gruppi di cellule ippocampali che rispondono alla fase e il luogo sono stati trovati per essere organizzato sistematicamente lungo l'asse longitudinale dell'ippocampo nei ratti, subendo un compito di memoria a breve termine12. Inoltre, le attività di crisi epilettiche sono state trovate per essere sincronizzate lungo l'intero ippocampo lungo l'asse longitudinale13.
La maggior parte degli studi della regione longitudinale CA1 ippocampale tuttavia, hanno utilizzato l'input dal CA3 alle regioni CA111,14,15. Utilizzando un protocollo unico per fare fette di cervello longitudinali, il nostro lavoro precedente ha dimostrato la connettività associativa dei neuroni piramidali CA1 lungo l'asse longitudinale e ha implicato la sua capacità di elaborare la segnalazione neuronale in modo efficace16. Tuttavia, è necessario determinare se i neuroni piramidali CA1 lungo l'asse longitudinale senza input trasversale possono supportare la plasticità sinaptica a lungo termine. Questa scoperta può aggiungere un altro angolo nelle indagini sui problemi neurologici relativi all'ippocampo.
La capacità dei neuroni di adattare l'efficacia del trasferimento di informazioni è conosciuta come plasticità sinaptica. Plasticità sinaptica è implicato come il meccanismo sottostante per i processi cognitivi come l'apprendimento e la memoria17,18,19,20. Plasticità sinaptica a lungo termine è dimostrato come sia potenziamento a lungo termine (LTP), che rappresenta il rafforzamento della risposta neuronale, o depressione a lungo termine (LTD), che rappresenta l'indebolimento della risposta neuronale. La plasticità sinaptica a lungo termine è stata studiata nell'asse trasversale dell'ippocampo. Tuttavia, questo è il primo studio a dimostrare la plasticità sinaptica a lungo termine nell'asse longitudinale ippocampale dei neuroni piramidali CA1.
Costruire da un protocollo utilizzato da Yang et al.16, abbiamo progettato il protocollo per dimostrare LTP e LTD nell'asse longitudinale ippocampale dei neuroni piramidali CA1. Abbiamo usato topi maschi C57BL6 con età comprese tra 5-9 settimane per esperimenti in vitro e 6-12 settimane per esperimenti in vivo. Questo articolo dettagliato mostra come sono state ottenute fette di cervello ippocampali longitudinali da topi per le registrazioni in vitro e come le registrazioni in vivo sono state registrate nell'asse longitudinale. Per le registrazioni in vitro, abbiamo studiato la specificità direzionale della plasticità sinaptica longitudinale CA1 prendendo di mira l'estremità settale e temporale dell'ippocampo. Abbiamo anche studiato la specificità dello strato della plasticità sinaptica longitudinale CA1 registrando dallo strato oriens e dal radiato strato dell'ippocampo. Per le registrazioni in vivo, abbiamo studiato gli angoli che meglio corrispondono alla direzione longitudinale dell'ippocampo.
Utilizzando sia le registrazioni extracellulari in vivo che in vitro, abbiamo osservato che i neuroni piramidali CA1 collegati longitudinalmente presentati con LTP, non LTD. L'orientamento trasversale che coinvolge neuroni CA3 e CA1, tuttavia, supporta sia LTP che LTD. La distinzione nelle capacità sinaptiche tra l'orientamento trasversale e l'orientamento longitudinale dell'ippocampo potrebbe significare speculativamente differenze nella loro connettività funzionale. Sono necessari ulteriori esperimenti per decifrare le differenze nelle loro capacità sinaptiche.
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Protocol
Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con le linee guida e le normative del Laboratorio di cura degli animali e l'uso del Laboratorio dell'Istituto Nazionale di Salute. Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) della City University di Hong Kong e dell'Incheon National University.
1. Registrazione sul campo in vivo
- Preparazione degli animali
- Iniettare l'uretano (0,06 g per 25 g di peso) intraperitonealmente per anesizzare il topo. Supplemento con iniezione intramuscolare di atropina (0,05 mg/kg). Tenere il mouse in un luogo buio e tranquillo fino a quando l'anestesia completa ha effetto.
AMMONIEnza: L'uretano ha un potenziale cancerogeno. Maneggiarlo con cura e indossare indumenti protettivi per evitare il contatto con la pelle esposta.
NOTA: In alternativa, l'isoflurane può essere utilizzato come anestesia. - Controllare la profondità dell'anestesia ad intermittenza fino a quando un piano chirurgico completo di anestesia ha effetto. Controllare la profondità dell'anestesia eseguendo pizzico di punta, pizzico dell'orecchio, pizzico di coda e test di tocco corneale per osservare la risposta del mouse agli stimoli fisici.
NOTA: Un riflesso o un movimento volontario non devono essere osservati quando il topo si trova su un piano chirurgico completo di anestesia. - Per il test del pizzico di punta, estendere la parte posteriore o anteriore del mouse e pizzicare saldamente con un paio di pinze smussate o dita. Il mouse non è confermato per l'anestesia completa se ritira la gamba o scuote il corpo, ha un aumento della frequenza respiratoria osservabile o emette suoni vocali.
- Per l'esame di pizzico dell'orecchio, pizzicare saldamente le estremità della pinna con un paio di pinze smussate o dita. L'anestesia completa non è confermata se il topo muove i baffi in avanti, scuote la testa, emette suoni vocali o ha un aumento della frequenza respiratoria osservabile.
- Per il test del pizzico di coda, tenere la coda del mouse delicatamente e saldamente pizzicare con una pinzata smussata o un dito. Nessun movimento della coda, suono vocale o aumento osservato della frequenza respiratoria devono essere osservati quando completamente anestesizzato per le procedure chirurgiche.
- Per il test di tocco corneale, toccare delicatamente la cornea del topo, con uno stoppino di cotone. Nessun movimento delle palpebre, movimento del baffo o aumento osservabile della frequenza respiratoria deve essere osservato quando completamente anestesizzato per la chirurgia.
- Rasare i capelli sul collo e cranio del mouse.
- Posizionare il mouse completamente afdistinto su un pad di riscaldamento impostato a 37 gradi centigradi e inserire la sonda della temperatura rettale nel retto. Ciò consente al calore prodotto dalla piastra di riscaldamento di adattarsi in risposta ai cambiamenti della temperatura corporea del mouse.
- Applicare il gel per gli occhi per inumidire gli occhi del mouse.
- Tirare la lingua sul lato delle labbra delicatamente con pinze e fissare i due denti anteriori nel secondo o terzo dente foro dello strumento stereotassico. Fissare saldamente il cranio del topo usando il morsetto.
NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare un morsetto auricolare stereotassico. - Osservando al microscopio, separare il tessuto sottocutaneo e i muscoli alla fine dell'osso interparietale e occipitale del topo con un bisturi per esporre la cisterna magna. Asciugare il dura mater con un tampone di cotone.
- Forare delicatamente la magna della cisterna facendo un taglio superficiale con una lama acuta appuntita per drenare il liquido cerebrospinale (CSF). Fissare un tampone di cotone per mantenere drenante il CSF.
- Iniettare l'uretano (0,06 g per 25 g di peso) intraperitonealmente per anesizzare il topo. Supplemento con iniezione intramuscolare di atropina (0,05 mg/kg). Tenere il mouse in un luogo buio e tranquillo fino a quando l'anestesia completa ha effetto.
- Craniotomy
- Tenendo la pelle sul cuoio capelluto con pinze, tagliare e rimuovere la pelle con un paio di forbici chirurgiche. Tagliare abbastanza pelle per esporre i segni di bregma e lambda sul cuoio capelluto. Mantenere asciutta la regione esposta.
- Regolare il cranio bloccato del mouse per consentire ai punti bregma e lambda di essere allineati in un livello orizzontale di altezza simile. Evitare l'inclinazione della testa nella posizione anteriore-posteriore o laterale mediale.
- Contrassegnare i punti corrispondenti alla regione ippocampale utilizzando l'aiuto di una pinza Vernier. Utilizzare il cervello del mouse in un libro di coordinate stereoattiche come riferimento per determinare le coordinate esatte.
NOTA: la posizione da contrassegnare per l'incisione per l'ippocampo è 1 mm x 3 mm sulla linea mediana indicata come anteriore-posteriore (AP) utilizzando la bregma come punto di riferimento e 3 mm x 3 mm perpendicolarmente alla linea mediana (ML) per collegare i punti sulla linea mediana. Le coordinate stereotassiche sono date come (AP: 1,3 e ML: 3,3). - Fare un'incisione nel cranio sopra la regione dorsale dell'ippocampo lungo i punti marcati utilizzando un bisturi o un trapano ad alta velocità durante l'osservazione al microscopio.
NOTA: Un'apertura a forma rettangolare con una dimensione di 2 mm x 3 mm dovrebbe essere ottenuta dopo l'incisione. Mantenere l'area esposta pulita per evitare lesioni al cervello. - Estrarre con attenzione il cranio sciolto con pinze per esporre la dura mater e utilizzare una siringa o un contagocce per applicare delicatamente una soluzione salina fisiologica per mantenere la superficie umida.
- Rimuovere il dura mater con attenzione con ago o punte appuntite.
NOTA: Fare attenzione a non causare danni al tessuto cerebrale durante craniotomia. Questo porterà al gonfiore del cervello e influenzerà i risultati. - Mantenere il tessuto cerebrale esposto umido applicando salina fisiologica o olio inerte utilizzando un contagocce o una siringa.
- Registrazione in vivo
- Fissare e posizionare saldamente l'elettrodo di stimolazione e registrazione nel supporto stereotassica. Regolare lo strumento stereotassico in base alla posizione delle coordinate AP e ML corrispondenti per gli elettrodi di stimolazione e registrazione sopra l'ippocampo dorsale CA1.
NOTA: Utilizzare il cervello del mouse nelle coordinate stereotassiche come guida per individuare le coordinate per la regione dorsale longitudinale CA1 hippocampal. Ad esempio, una coordinata stereotassica per la regione ippocampale CA1 sarà (AP 1.5, ML 1.0) per l'elettrodo di registrazione e (AP 1.7, ML 1.5) per l'elettrodo di stimolazione. - Individuare l'elettrodo stimolante laterale all'elettrodo di registrazione in direzione longitudinale.
NOTA: Assicurarsi che sia gli elettrodi di stimolazione che di registrazione siano puliti prima dell'uso. Ciò impedisce l'introduzione di rumore durante la registrazione. - Per le registrazioni, utilizzare elettrodi multicanale. In primo luogo, individuare le coordinate stereotassiche per la regione ippocampale CA1 utilizzando il primo canale. Posizionare gli elettrodi rimanenti in modo che l'angolo di stimolazione e registrazione degli elettrodi sia compreso tra i 30 e i 60 gradi rispetto alla linea mediana del punto bregma.
NOTA: Questo angolo corrisponde all'orientamento longitudinale della regione ca1 hippocampal. - Come controllo, individuare l'elettrodo di registrazione sopra la regione CA1 e l'elettrodo di stimolazione sopra la regione CA3 dell'ippocampo dorsale. Ad esempio, utilizzando il cervello del topo nelle coordinate stereotassiche come guida, una coordinata stereotassica per la regione hippocampal CA1-CA3 sarà (AP 1.8, ML 1.0) per l'elettrodo di registrazione e (AP 1.5, ML 1.5) per l'elettrodo di stimolazione.
NOTA: questo passaggio è un controllo alternativo e deve essere eseguito in un esperimento separato. - Posizionare l'elettrodo di riferimento in una parte distale della regione del cervello esposta o sotto la pelle del topo.
- Accendere il sistema di registrazione.
- Aprire il software per la registrazione e l'acquisizione dei dati.
NOTA: diversi laboratori hanno il loro software preferito per la registrazione e l'acquisizione dei dati. - Osservando al microscopio, abbassare lentamente gli elettrodi di registrazione e stimolazione utilizzando il micromanipolatore fino a toccare solo la superficie del cervello. Contrassegnare il punto come punto zero per iniziare a calcolare la profondità precisa nella regione dell'ippocampo.
NOTA: Il micromanipolatore può essere utilizzato per monitorare la profondità alla quale l'elettrodo viene inserito in un dato momento. Osservare un aumento dell'impedibile proprio quando l'elettrodo tocca la superficie del cervello. - Abbassare lentamente gli elettrodi alla profondità approssimativa corrispondente alle coordinate stereotassiche scelte per l'ippocampo CA1.
NOTA: Utilizzare il cervello del mouse nelle coordinate stereotassiche come guida per ottenere la profondità approssimativa corrispondente alle coordinate stereotassiche scelte. - Dare stimolazione (100 gradi di durata, ripetuta a intervalli di 30 s) e regolare la profondità dell'elettrodo a gradini di 50 m o meno fino a quando non viene osservato un potenziale post-nanaptico eccitatorio di campo evocato stabile (fEPSP).
NOTA: Di solito è sufficiente uno stimolo di 20 a per evocare una risposta osservabile. - Assicurarsi che un fEPSP stabile sia stato evocato variando l'intensità dello stimolo. Un notevole aumento della pendenza o dell'ampiezza del fEPSP deve essere osservato con ogni maggiore intensità di stimolo. Questo è definito come la curva di input-output. Creare una curva di input-output (I-O) per rilevare l'intensità massima dello stimolo in cui non vi è più alcun aumento della pendenza del fEPSP evocato (Figura 6).
NOTA: Eliminare i dati e modificare la posizione dell'elettrodo se la fibra volley scompare durante l'esperimento. - Utilizzare la curva di input-output per impostare l'intensità della linea di base su 40 - 50% del massimo. Utilizzare l'intensità di stimolo corrispondente per la registrazione della linea di base.
- Registrare il potenziale del campo locale come base per 20 - 30 min.
- Utilizzare la stessa curva di ingresso-output per impostare l'intensità dello stimolo per evocare la stimolazione ad alta frequenza (HFS) o il tetano al 75% dell'intensità massima. In alternativa, quando si induce depressione a lungo termine, mantenere la stessa intensità di stimolo utilizzata per registrare la linea di base quando si evoca la stimolazione a bassa frequenza (LFS).
- Applicare una stimolazione tetanica di 100 Hz impulsi 4 volte con un intervallo di 10 s per indurre LTP.
NOTA: utilizzare questo protocollo solo quando si lavora a un esperimento di potenziamento a lungo termine. - Applicare una stimolazione a bassa frequenza di 5 Hz (900 stimoli durante 3 min), 1 Hz LFS (900 stimoli durante 15 min), o 1 Hz a impulsi accoppiati (50 ms accoppiati a impulsi, 900 paia di stimoli durante 15 min) per indurre LTD secondo protocolli già stabiliti.
NOTA: utilizzare questi protocolli solo quando si lavora su un esperimento di depressione a lungo termine. - Registrare il potenziale di campo locale per 1 h dopo HFS o LFS, in alternativa.
- Esportare i dati e analizzarli utilizzando il software.
- Verificare la posizione dell'elettrodo di registrazione e di stimolazione dando una stimolazione di 10 s a corrente per 30 s per lesione delle aree registrate. Transcardialmente perfondere il topo con 4% paraformaldeide e raccogliere il cervello per affettare e colorare con Cresyl Violet secondo.
- Eutanasia topo da lussazione cervicale o iniezione di dosaggio anestetico letale dopo l'esperimento.
- Fissare e posizionare saldamente l'elettrodo di stimolazione e registrazione nel supporto stereotassica. Regolare lo strumento stereotassico in base alla posizione delle coordinate AP e ML corrispondenti per gli elettrodi di stimolazione e registrazione sopra l'ippocampo dorsale CA1.
2. Registrazione sul campo in vitro
- Preparazione di affettamenti ossigenati e soluzioni di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF)
- Per 2 L di soluzione di affettare, aggiungere circa 1 L di acqua doppia distillata in un flacone volumetrico e mescolare vigorosamente su una piastra di stirrer.
- Aggiungere i seguenti componenti della soluzione di affettatura (in mM): 87.0 NaCl, 2.5 KCl, 1.3 NaH2PO4, 25.0 NaHCO3, 25.0 glucosio, 75.0 saccarosio, 7.0 MgCl2.6H2O e 0.5 CaCl2s 2H2O (Tabella 1).
NOTA: In alternativa, MgCl2x 6H2O e CaCl2x 2H2O possono essere esclusi in questa fase e aggiunti in un secondo momento in un volume pronto all'uso. - Top fino a 2 L con acqua doppia distillata mescolando vigorosamente.
- Per 2 L di ACSF, aggiungere circa 1 L di acqua a doppia distillazione in un flacone volumetrico e mescolare vigorosamente su una piastra di stirrer.
- Aggiungere i seguenti componenti della soluzione ACSF (in mM): 125.0 NaCl, 2.5 KCl, 1.3 NaH2PO4, 25.0 NaHCO3, 25 glucosio, 1.0 MgCl2. 6H2O e 2.0 CaCl2. 2H2O (Tabella 1).
NOTA: In alternativa, MgCl2.6H2O e CaCl2x 2H2O possono essere esclusi in questa fase e aggiunti in seguito in un volume pronto all'uso. - Top fino a 2 L con acqua doppia distillata mescolando vigorosamente.
- Configurazione e affettatura cerebrale
- Versare 400 mL di soluzione di affettatura già preparata in un flacone separato e ossigenare (95% O2/5% CO2) per circa 20 min.
- Conservare il resto della soluzione da 1,6 L in un frigorifero a 4 gradi centigradi. Mantenere la soluzione fino a 1 settimana dopo di che deve essere scartato se non utilizzato per evitare la crescita fungina.
- Versare 200 mL della soluzione di affettatura ossigenata nel pallone, coprire con parafilm e trasferire in un congelatore -80 gradi per circa 20 min per fare una fanghiglia.
- Versare i restanti 200 mL di soluzione di affettare in una camera di tenuta di una fetta di cervello e conservare in un bagno d'acqua a 32 gradi con spumeggiamento continuo.
- Preparare la panca per affettare. Mettere gli asciugamani di carta verso il basso e gli strumenti chirurgici sulla parte superiore della panca. Disporre gli strumenti chirurgici in ordine di utilizzo per facilitare un processo rapido ed efficiente (Figura 7).
- Estrarre la soluzione di affettatura refrigerata dal congelatore e versare circa 50 mL in un becher. Versare circa 10 mL in una teglia Petri contenente carta da filtro per inumidirla. Metteteli sul ghiaccio dall'area di dissezione.
- Versare il resto della soluzione di affettare nella camera di taglio e fissarla sul vibratoma.
- Anestesizzare il topo con isoflurane utilizzando le linee guida e le normative sulla cura degli animali e l'uso del laboratorio del National Institute of Health, e i metodi approvati di Institutional Animal Use and Care Committee della City University di Hong Kong e Incheon National università.
- Decapitare il topo anestetizzato con un paio di forbici e posizionare la testa su carta velina. Tagliare la pelle che copre il cranio del topo e tagliare i muscoli cutanei con le forbici. Tagliare le lastre del cranio lungo la linea mediana fino all'osso occipitale usando forbici chirurgiche.
- Apri il cranio con pinze smussate per esporre il cervello. Scava delicatamente il cervello con una spatola e mettilo nella soluzione di affettatura refrigerata nel becher. Aspetta circa 30 s.
- Estrarre il cervello con il cucchiaio e posizionarlo con cura sulla carta filtrante precedentemente inumidita nel piatto Petri.
- Separare i due emisferi cerebrali lungo la linea mediana con una lama del bisturi. Isolare l'ippocampo staccandolo delicatamente dalla corteccia con una spatola e posizionarlo con attenzione sulla carta da filtro inumidita. Ritagliare il setto e l'estremità temporale dell'ippocampo isolato utilizzando il bisturi.
- Raccogliere l'ippocampo isolato con una spatola smussata e pennello. Tamponare delicatamente la spatola su una carta velina per rimuovere l'acqua in eccesso.
- Applicare una piccola quantità di colla sulla piastra di taglio del vibratoma.
- Per una fetta longitudinale CA1 ippocampale, attaccare la regione CA3 dell'ippocampo al piatto affettato con la colla. Posizionarlo rapidamente ma con attenzione nella camera di taglio del vibratoma contenente la soluzione di affettatura ossigenata refrigerata.
- Per la fetta trasversale che servirà come controllo, attaccare l'estremità ventrale dell'ippocampo alla piastra di taglio del vibratoma. Posizionarlo rapidamente ma con attenzione nella camera di taglio contenente la soluzione di dissezione ossigenata refrigerata.
NOTA: questo passaggio è un'alternativa al passaggio precedente e deve essere eseguito separatamente. - Posizionare l'angolo della lama a 90 gradi. Impostare i parametri vibratome su una velocità di 0,05 mm/s, un'ampiezza di 1,20 mm e uno spessore di fetta di 400 m.
- Affettare l'ippocampo attaccato con il vibratome.
NOTA: Una buona fetta di cervello ippocampo longitudinale CA1 avrà uno strato di CA1 e 2 strati di giro dentato. È possibile ottenere un massimo di 2 buone fette di ippocampo. In alternativa, una fetta di cervello dell'ippocampo trasversale avrà intatti i trattiri dentati, CA3 e CA1. - Trasferire le fette di cervello dell'ippocampale longitudinale dal vibratome con una pipetta e incubarlo nella fetta di cervello tenendo camera nel bagno d'acqua.
- Incubare le fette nel bagno d'acqua per 20 min ad una temperatura di 32 gradi centigradi e portare a temperatura ambiente per 30 min di recupero.
NOTA: In alternativa, trasferire la fetta cerebrale quando si è fuori dal bagno d'acqua e posizionarla delicatamente nella camera di registrazione con ACSF ossigenato che scorre ad una temperatura di 32 gradi centigradi per 30 min di recupero. - Durante l'incubazione nel bagno d'acqua, versare 400 mL di soluzione ACSF in un pallone separato e ossigenare (95% O2/5% CO2) per circa 20 - 30 min prima di trasferire la fetta di cervello nella camera di registrazione. Sovrafon l'ACSF nella camera di registrazione ad una velocità di 2 mL/min.
- Accendere il regolatore di temperatura per riscaldare l'ACSF che scorre a 32 gradi centigradi.
- Conservare il resto della soluzione da 1,6 L in un frigorifero a 4 gradi centigradi. Mantenere la soluzione fino a una settimana dopo la quale deve essere scartata se non utilizzata per evitare la crescita fungina.
- Registrazione in vitro
- Impostare un impianto di registrazione attivando tutto l'hardware necessario.
- Trasferire la fetta cerebrale dalla camera di detenzione della fetta nella camera di registrazione. Regolare la posizione della fetta cerebrale con pinze smussate e tenerla in posizione con un'arpa. Lasciare l'ACSF a funzionare per almeno 20 min. Ciò consente alla fetta di cervello di essere stabile prima della registrazione.
- Riempire la pipetta di registrazione con ACSF come soluzione interna.
- Controllare la resistenza delle pipette di registrazione con il software designato. La resistenza pipetta di registrazione dovrebbe essere all'interno della gamma di 3-5 M.
- Accendere il software per l'acquisizione dei dati. Questo software dovrebbe avere caratteristiche simili che consentono l'acquisizione dei dati in modo simile alle registrazioni in vivo mostrate in precedenza.
- Fissare saldamente la registrazione e gli elettrodi di stimolazione nel supporto dello strumento stereotassico. Posizionare l'elettrodo di riferimento nell'ACSF nella camera di registrazione.
- Per le fette longitudinali, posizionare l'elettrodo di stimolazione e registrazione nello strato oriens (S.O.). Mantenere la distanza tra gli elettrodi a circa 300 a 500 m. Posizionare l'elettrodo di stimolazione sul lato setto o temporale della fetta cerebrale e registrare dallo stesso strato (Figura 8).
- In alternativa, posizionare l'elettrodo di stimolazione e registrazione nel radiato dello strato (S.R.). Posizionare l'elettrodo di stimolazione sul lato setto o temporale della fetta cerebrale.
- Per le sezioni trasversali come controllo, posizionare l'elettrodo stimolante sulla regione CA3 (percorso collaterale di Schaffer) e l'elettrodo di registrazione sulla regione CA1 (Figura 9).
NOTA: si tratta di un passaggio di controllo alternativo che deve essere eseguito in un esperimento separato. - Accendere il generatore di stimolo isolato e dare stimolazione (durata di 100 gradi, ripetuta a intervalli di 30 s). Regolare la profondità e/o la posizione dell'elettrodo di registrazione fino a quando non viene osservato un potenziale di campo post-nanaptico eccitato reticolato stabile.
- Assicurarsi che un fEPSP stabile sia stato evocato variando l'intensità dello stimolo. Un notevole cambiamento nella pendenza del fEPSP deve essere osservato ad ogni cambiamento di intensità di stimolo. Questo è definito come la curva di input-output. Creare una curva di input-output (I-O) per rilevare l'intensità massima dello stimolo in cui non vi è più alcun aumento della pendenza del FEPSP (Figura 6).
NOTA: Eliminare i dati e modificare la posizione dell'elettrodo se la fibra volley scompare durante l'esperimento. - Utilizzare la curva input-output per impostare l'intensità dello stimolo per la registrazione di base e per evocare la stimolazione ad alta frequenza (HFS) o il tetano al 30-40% del fEPSP massimo evocato.
- In alternativa, per gli esperimenti riguardanti LTD, utilizzare la curva input-output per impostare l'intensità di base per la registrazione di base e per evocare la stimolazione a bassa frequenza (LFS) al 70% del fEPSP massimo evocato.
- Registrare il potenziale del campo locale come base per 20 - 30 min.
- Applicare gli impulsi HFS di 100 Hz due volte con un intervallo di 30 s per indurre LTP.
- In alternativa, per gli esperimenti LTD, applicare una stimolazione a bassa frequenza di 5 Hz (900 stimoli durante 3 min) o 1 Hz LFS (900 stimoli durante 15 min) o 1 Hz a impulsi accoppiati (50 ms accoppiati a intervallo di impulsi, 900 paia di stimoli durante 15 min) per indurre LTD a protocollo stabilito.
- Registrare il potenziale di campo locale per 1 h dopo HFS o LFS.
- Esportare i dati e analizzarli.
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Representative Results
Abbiamo esplorato la plasticità sinaptica a lungo termine dei neuroni piramidali longitudinali CA1 dell'ippocampo utilizzando registrazioni extracellulari sul campo sia in vivo che in vitro. LTP e LTD sono aspetti della plasticità sinaptica a lungo termine che sono stati dimostrati nell'asse trasversale dell'ippocampo come unidirezionale.
Abbiamo mostrato qui che usando le fette di cervello longitudinale dell'ippocampo, c'è LTP nell'asse longitudinale CA1 dell'ippocampo. Abbiamo preparato fette longitudinali dell'ippocampo lungo l'asse settotemporale, che è perpendicolare alle fette trasversali (Figura 1). Utilizzando le registrazioni della regione CA1 dell'ippocampo, abbiamo mostrato la presenza di LTP che non era specifica della direzione. Non c'erano differenze statisticamente significative nelle registrazioni dal lato setto o temporale (Figura 2) della fetta di cervello longitudinale dell'ippocampo. Abbiamo anche mostrato la presenza di LTP che non era specifica dello strato; così, le registrazioni provenienti sia dal radiato dello strato che dallo stratum oriens (Figura 2) hanno mostrato l'LTP indotto con successo nella fetta del cervello longitudinale. Abbiamo usato D-AP5, un antagonista NMDAR per dimostrare che l'indotto LTP dipendeva dai recettori NMDA (Figura 3). Ciò che accade in vitro non riflette necessariamente in condizioni di vivo, quindi abbiamo studiato LTP in vivo. Figura 4 a mostra un diagramma schematico dell'elettrodo di stimolazione e registrazione posizionato nell'ippocampo dorsale lungo l'asse longitudinale della regione CA1 in vivo. La posizione degli elettrodi utilizzati per la registrazione e la stimolazione è stata verificata dai segni di lesione e dalla colorazione viola di cristallo (Figura 4a). Abbiamo dimostrato la presenza di LTP in vivo nella regione longitudinale CA1 (Figura 4b).
Utilizzando protocolli già definiti per indurre LTD, non siamo riusciti a indurre con successo LTD sia in vivo che in vitro (Figura 5).
Figura 1 . Un disegno schematico di fette di cervello ippocampale trasversali e longitudinali. Questa cifra è adattata e modificata da Sun et al. 201821. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . LTP in fette longitudinali. Le risposte synaptiche aS.R. (a ) o S.O. (b) nelle fette longitudinali sono potenziate subito dopo la stimolazione del tetano con input temporali e settali (input sia temporali che settali (S.R./temporal (n 12, c), S.R./septal (n : 12, c.), S.O./temporali (n - 10, d.O./sepal n 9, d).
N sta per numero di fette. Le barre di errore rappresentano SE. Questa cifra è adattata e modificata da Sun et al. 201821. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . LTP dipendente da NMDAR in fette longitudinali. (a,b) L'induzione di LTP in direzione temporale e settale è bloccata da 50 M D-AP5 (temporale, n - 6, a) (setto, n - 5, b). (c,d) L'induzione di LTP in direzione temporale e settale è bloccata anche da D-AP5. La n sta per fetta. Le barre di errore rappresentano SE. Questa cifra è adattata e modificata da Sun et al. 201821. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . LTP in vivo nella rete interlamellar. (a) Disegno schematico degli elettrodi di registrazione e stimolazione negli animali anestetizzati. I loci di registrazione (sul lato setto di CA1) e gli elettrodi stimolanti (sul lato temporale del CA1) sono stati identificati da segni di lesione. (b) L'LTP è indotto nella connessione interlamellar da stimolazione ad alta frequenza 100 Hz (HFS) (n - 10 topi). Tracce di colore: prima (nero) e dopo (rosso) HFS. Le barre di errore rappresentano SE. Questa cifra è adattata e modificata da Sun et al. 201821. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Assenza di LTD in vivo e in vitro nella rete Interlamellar CA1. (a) 1 Hz-pp LFS non induce in vivo LTD. (b) 1 Hz pp-LTP, (c) 5 Hz LFS e (d) 1 Hz LFS non producono LTD sui lati temporali o settali della fetta di cervello longitudinale. mentre LTD è indotta da 1 Hz pp-LFS in fette trasversali: temporale (n - 8), settale (n - 11) e trasversale (n - 6) con 1 Hz pp-LFS; temporale (n - 3) e settale (n - 3) con LFS a 5 Hz; temporale (n - 3) e settale (n - 3) con LFS da 1 Hz. La n sta per fetta. Le barre di errore rappresentano SE. Questa cifra è adattata e modificata da Sun et al. 201821. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 . Curva di ingresso-output che presenta la pendenza fEPSP in risposta all'aumento dell'input di stimolo nella fetta del cervello ippocampale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7 . Strumenti chirurgici utilizzati per l'isolamento ippocampale durante il taglio del cervello in vitro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8 . Una fetta di cervello longitudinale pronta per la registrazione. L'elettrodo di stimolazione e la pipetta di registrazione sono inseriti nel radiato dello strato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9 . Una fetta di cervello ippocampale trasversale pronta per la registrazione. L'elettrodo di stimolazione viene inserito nella regione CA3 collaterale di Schaffer e la pippette di registrazione viene inserita nella regione CA1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| composto | Soluzione di affettatura (mM) | ACSF (mM) |
| CaCl2.2H2O | 0.5 | 2 |
| glucosio | 25 | 25 |
| Kcl | 2.5 | 2.5 |
| MgCl2.6H2O | 7 | 1 |
| Nacl | 87 | 125 |
| NaH2PO4 | 1.3 | 1.3 |
| NaHCO3 | 25 | 25 |
| saccarosio | 75 |
Tabella 1: Concentrazioni di composti nella fetta del cervello e soluzioni artificiali di liquido cerebrospinale.
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Discussion
Il protocollo dimostra il metodo per indurre plasticità sinaptica a lungo termine in vivo e da fette di cervello nell'asse longitudinale CA1-CA1 dell'ippocampo in vitro. I passaggi descritti forniscono dettagli sufficienti per uno sperimentatore per studiare LTP e LTD in una connessione longitudinale hippocampal CA1-CA1. La pratica è necessaria per affinare le competenze necessarie per registrare con successo i potenziali eccitatori sul campo.
Oltre a dover praticare, ci sono diversi passaggi critici che sono essenziali per ottenere buoni risultati. In primo luogo, è stato dimostrato in precedenza che l'angolo a cui sono state fatte le fette di cervello potrebbe troncare o preservare le proiezioni longitudinali dei neuroni piramidali nella regione CA1-CA1 dell'ippocampo16. I neuroni piramidali longitudinali si proiettano dai neuroni trasversali ad un angolo quasi perpendicolare. Poiché i neuroni CA1 si propagano in diversi angoli all'interno dell'ippocampo, la connessione longitudinale tra di loro si stende lungo l'asse dorsoventrale dell'ippocampo. Pertanto, per la registrazione in vitro, lo sperimentatore deve tenere questo in mente per indirizzare con precisione i neuroni ippocampali CA1-CA1 lungo l'asse longitudinale tagliando il tessuto ippocampo isolato lungo l'asse dorsale-ventrale. Inoltre, per le registrazioni in vivo, l'angolo in cui sono posizionati gli elettrodi di stimolazione e registrazione determina se i risultati ottenuti sono rappresentativi dell'asse longitudinale o di una miscela sia dell'asse trasversale che di quello longitudinale. Ulteriori indagini sull'utilizzo di CRISPR-Cas9 possono essere effettuate per confermare se la risposta evocata proviene esclusivamente dalla regione CA1, poiché potrebbe trattarsi di una combinazione di risposte sia dalle regioni CA1 che da quelle CA3.
In secondo luogo, per gli esperimenti in vitro, lo sperimentatore deve garantire che la soluzione di affettamento del cervello, ACSF, banco di lavoro e tutte le attrezzature o gli strumenti che entrano in contatto con la fetta del cervello siano privi di contaminanti. Qualsiasi forma di contaminazione porterà al deterioramento dell'integrità o della morte della fetta del cervello. Mantenere una superficie pulita degli elettrodi garantirà registrazioni buone e stabili sia per gli esperimenti in vitro che per gli esperimenti in vivo.
Abbiamo dimostrato che la rete longitudinale hippocampal CA1 presenta LPP NMDAR-dipendenti, ma non LTD. Il circuito trissinaptico, tuttavia, si presenta con sia LTP che LTD22,23. Ciò implica che la rete longitudinale CA1 e il circuito tri-sinaptico hanno caratteristiche uniche. Il nostro protocollo si avvale solo di registrazioni elettrofisiologiche e quindi è limitato nel trovare la differenza tra queste due reti.
Continua la ricerca di una cura per le malattie cerebrali come la schizofrenia. Declino o deformità delle sottoregioni ippocampali CA1 sono stati collegati con alcuni sintomi schizofrenici24,25. L'applicazione del nostro protocollo, anche se di base, ha portato alla luce una capacità sinaptica unica della sottoregione longitudinale ippocampale CA1. Questa conoscenza è utile nella progettazione di esperimenti che possono studiare ulteriormente questa malattia debilitante del cervello lungo l'asse longitudinale CA1 dell'ippocampo.
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Disclosures
Non abbiamo niente da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da Incheon National University (International Cooperative) Research Grant. Ringraziamo la signora Gona Choi per aver assistito con alcune raccolte di dati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atropine Sulphate salt monohydrate, ≥97% (TLC), crystalline | Sigma-Aldrich | 5908-99-6 | Stored in Dessicator |
| Axon Digidata 1550B | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| Clampex 10.7 | |||
| D-(+)-Glucose ≥ 99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Eyegel | Dechra | ||
| Isoflurane | RWD Life Sciences | R510-22 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, BioXtra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | |
| Matrix electrodes, Tungsten | FHC | 18305 | |
| Multiclamp 700B Amplifier | |||
| Potassium chloride, BioXtra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Potassium phosphate monobasic anhydrous ≥99% | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | Stored in Dessicator |
| Pump | Longer precision pump Co., Ltd | T-S113&JY10-14 | |
| Silicone oil | Sigma-Aldrich | 63148-62-9 | |
| Sodium Bicarbonate, BioXtra, 99.5-100.5% | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | |
| Sodium Chloride, BioXtra, ≥99.5% (AT) | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic, powder | Sigma-Aldrich | 7558-80-7 | |
| Sucrose, ≥ 99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | 57-50-1 | |
| Temperature controller | Warner Instruments | TC-324C | |
| Tungsten microelectrodes | FHC | 20843 | |
| Urethane, ≥99% | Sigma-Aldrich | 51-79-6 | |
| Vibratome | Leica | VT-1200S | |
| Water bath | Grant Instruments | SAP12 |
References
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