Summary
Dieser Artikel zeigt ein Modell zur Untersuchung des Herzumbaus nach Myokard-Kryoverletzung bei Mäusen.
Abstract
Die Verwendung von Tiermodellen ist für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für das akute Koronarsyndrom und seine Komplikationen unerlässlich. In diesem Artikel zeigen wir ein murines Kryoverletzungsinfarktmodell, das präzise Infarktgrößen mit hoher Reproduzierbarkeit und Reproduzierbarkeit erzeugt. Kurz gesagt, nach Intubation und Sternotomie des Tieres wird das Herz aus dem Thorax gehoben. Die Sonde eines handgeführten flüssigen Stickstoffzufuhrsystems wird auf die Myokardwand aufgetragen, um Kryoverletzungen auszulösen. Beeinträchtigte ventrikuläre Funktion und elektrische Leitung können mit Echokardiographie oder optischer Kartierung überwacht werden. Die transmuraale myokardiale Umgestaltung des Infarktbereichs ist durch Kollagenablagerung und den Verlust von Kardiomyozyten gekennzeichnet. Im Vergleich zu anderen Modellen (z.B. LAD-Ligation) nutzt dieses Modell ein handgehaltenes Flüssigstickstoff-Liefersystem, um einheitlichere Infarktgrößen zu erzeugen.
Introduction
Akutes Koronarsyndrom (ACS) ist die häufigste Todesursache in der westlichen Welt1,2. Akute Okklusion der Herzkranzgefäße führt zur Aktivierung der ischämischen Kaskade und Nekrose des betroffenen Herzgewebes3. Beschädigtes Myokard wird nach und nach durch nicht-kontraktiles Narbengewebe ersetzt, das sich klinisch als Herzinsuffizienzmanifestiert 4,5. Trotz der jüngsten Fortschritte in der Behandlung von ACS, die Prävalenz von ACS und ACS-bedingte Herzinsuffizienz steigt, und therapeutische Optionen sind begrenzt6,7. Daher ist die Entwicklung von Tiermodellen zur Untersuchung von ACS und seinen Komplikationen von immensem Interesse.
Bis heute ist das am weitesten verbreitete Tiermodell zur Untersuchung von ACS- und ACS-induziertem Myokardumbau die Ligation der linken absteigenden Herzkranzgefäße (LAD). Ligation des LAD führt zu akuter Ischämie des Myokards, ähnlich wie beim menschlichen Myokardgewebe während ACS. Inkonsistente Infarktgrößen bleiben jedoch die Achillesferse der LAD-Liga. Chirurgische Variation und anatomische Variabilität des LAD führen zu inkonsistenten Infarktgrößen und behindern die Reproduzierbarkeit und Reproduzierbarkeit dieses Verfahrens8,9,10. Darüber hinaus hat die LAD-Ligation eine hohe intra- und postchirurgische Sterblichkeit. Trotz der jüngsten Bemühungen, die Reproduzierbarkeit zu verbessern und die Sterblichkeit zu senken11,12, sind immer noch eine große Anzahl von Tieren erforderlich, um Anti-Remodeling-Therapien richtig zu bewerten.
Alternative Modelle von ACS wurden in den letzten Jahren vorgeschlagen und untersucht, einschließlich Hochfrequenz13, thermische14 oder kryogene Verletzungen15,16,17,18. Aktuelle Kryoverletzungsmethoden wenden einen metallenen Stab vorgekühlt in flüssigem Stickstoff an, um das Herzgewebe des Subjekts zu schädigen15,16. Dieses Verfahren muss jedoch mehrmals wiederholt werden, um eine ausreichende Infarktgröße zu erzeugen. Durch die hohe Leitfähigkeit und geringe Wärmekapazität der Stange im Vergleich zum Gewebe erwärmt sich die Sonde schnell und das Gewebe wird heterogen gekühlt (und damit infarktiert). Um diese Einschränkungen zu überwinden, beschreiben wir hier in einem Kryoinfarktmodell unter Verwendung eines handgehaltenen flüssigen Stickstoffabgabesystems. Dieses Modell ist reproduzierbar, einfach durchzuführen und lässt sich schnell und zuverlässig etablieren. Es entsteht eine reproduzierbare transmurale Infarktläsion unabhängig von der koronaren Anatomie, die schließlich zu Herzinsuffizienz führt. Diese Methode eignet sich besonders zur Untersuchung des Umbauprozesses zur Bewertung neuartiger therapeutischer pharmakologischer und gewebetechnischer Strategien.
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Protocol
Tiere wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Prinzipien von Labortieren, der vom Institut für Labortierressourcen erstellt und von den National Institutes of Health veröffentlicht wurde, humane Pflege erhalten. Alle Tierprotokolle wurden von der zuständigen lokalen Behörde (Dem Institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschuss der University of California San Francisco (UCSF) genehmigt.
1. Tierpflege
- Erhalten Sie Mäuse im Alter von 14 Wochen mit einem Gewicht von ca. 27 g (z. B. vom Institut für Labortiere).
HINWEIS: FÜR diesen Artikel werden BALB/c-Mäuse verwendet. - Halten Sie Mäuse unter konventionellen Bedingungen in belüfteten Schränken, füttern sie Standard-Mäuse Chow und autoklaviertes Wasser ad libitum.
2. Mausvorbereitung
- Verwenden Sie eine Induktionskammer, um die Maus mit Isofluran (3,5%) zu beästhesieren.
- Entfernen Sie das Haar über Brust und Hals mit einem Haarschneider.
- Legen Sie die Maus in supine Position auf einem beheizten Pad und halten Sie Anästhesie mit einer Gesichtsmaske, die Mund und Nase der Maus bedeckt.
- Überprüfen Sie die ausreichende Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Hinterfüße und den Schwanz kneifen, um das Fehlen von Reflexen zu überprüfen.
- Subkutanes Buprenorphin (0,03 mg/kg) zur Analgesie injizieren.
- Verteilen Sie die Hinter- und Vorderbeine und fixieren Sie ihre Position mit Klebeband.
- Mit Povidon-Jod, desinfizieren Sie den rasierten Bereich, gefolgt von Schrubben mit 80% Ethanol. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
- Verwenden Sie eine kleine Schere, um einen Mittellinien-Hautschnitt vom unteren Drittel des Brustbeins bis zum Kinn zu machen.
- Verwenden Sie gekrümmte Zangen und trennen Sie vorsichtig die Muskeln um den Hals, um die Luftröhre freizulegen.
- Verwenden Sie eine Mikroschere, um eine Tracheotomie zwischen dem zweiten und dritten Knorpelringen durchzuführen.
- Stellen Sie das Beatmungsgerät auf eine Belüftungsfrequenz von 110/min bei einem Gezeitenvolumen von 0,5 ml ein.
- Entfernen Sie die Gesichtsmaske und legen Sie eine Mitschleifkanüle (20 G), die mit dem Beatmungsgerät verbunden ist, in die Luftröhre ein. Belüften Sie das Tier.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Lüftungskanüle nicht zu tief eingesetzt wird, indem Sie die bilaterale Lungenbelüftung bestätigen. - Verwenden Sie Kautery, um den rechten Pectoralis-Muskel von seinem sternalen Ursprung zwischen der dritten und siebten Rippe zu lösen.
- Verwenden Sie seitlich abgewinkelte Federschere, um die vierte bis sechste Rippe so nah wie möglich am Brustbein zu schneiden.
- Cauterize dieBrustarterie, wenn Blutungen sichtbar sind.
- Isofluran auf 2,5% verringern.
- Sezieren Sie das zugrunde liegende Bindegewebe, um einen klaren Blick in die Brusthöhle zu erhalten.
- Verwenden Sie stumpfe Zange, um das Perikard zu öffnen und das Herz freizulegen.
- Verwenden Sie einen Mini Goldstein Retraktor, um die Rippen zu verteilen und halten Sie die Brusthöhle offen.
- Heben Sie das Herz aus der Brusthöhle mit einer stumpfen Stange.
- Verringern Sie die Spannung des Retraktors, um die Brustöffnung zu reduzieren und das Herz vor dem Zurückfallen zu bewahren.
- Die Kryoprobe (3 mm Durchmesser) für 10 s vorkühlen.
- Tragen Sie die Kryoprobe auf die vordere linke Ventrikelwand auf und frieren Sie 10 s ein, um einen linksventrikulären Kryoverletzungsinfarkt zu erzeugen.
HINWEIS: Die Kryoprobe kann je nach wissenschaftlicher Frage und Bedarf auf verschiedene Herzwände aufgebracht werden. - Bewässern Sie die Kryosonde mit Raumtemperatur-Salin, um die Sonde von der linken ventrikulären Wand zu lösen.
- Verwenden Sie den Retraktor, um die Brustöffnung zu vergrößern.
- Bringen Sie das Herz vorsichtig mit einer stumpfen Stange in die Brusthöhle zurück.
- Entfernen Sie den Retraktor und verbinden Sie die Sternotomie mit einem einzigen Knoten mit 6-0 Naht.
- Schließen Sie die Brusthöhle mit 6-0 Laufnaht. Verwenden Sie eine 10 ml Spritze, um die verbleibende Luft aus der Brust zu evakuieren, bevor Sie den Knoten binden.
- Passen Sie die Haut an der kaudalen Kante an und verschließen Sie sie bis zur Stelle der Trachealöffnung mit laufender Naht (5-0).
- Set Isoflurane auf 1,5% und warten, bis das Tier spontane Atmung erhält.
- Entfernen Sie den Luftröhrenkatheter und tragen Sie die Gesichtsmaske erneut auf den Mund und die Nase des Tieres auf, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten.
- Schließen Sie den Trachealschnitt mit einem 8-0 naht.
- Positionieren Sie die ventralen Nackenmuskeln wieder in ihre Position, um die Luftröhre zu bedecken.
- Vervollständigen Sie die Hautnaht.
- Fügen Sie Metamizol in das Trinkwasser (50 mg Metamizol pro 100 ml) für Schmerzanalgesie für 3 Tage und überwachen Sie das Tier täglich.
HINWEIS: Der Beobachtungszeitraum für dieses Modell beträgt 8 Wochen. Achten Sie darauf, die Richtlinien Ihrer Institution in Bezug auf Analgesie-Regime zu befolgen.
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Representative Results
Das Kryoverletzungsinfarktmodell eignet sich zur Untersuchung von ACS und seinen Komplikationen. Niedrige Sterblichkeitsraten und effiziente postoperative Genesung sind in diesem Modell zu sehen. Kryoverletzung induzierte Myokardschäden führen zu reduzierter Herzfunktion, elektrischer Entkopplung und transmuraalem Umbau.
Echokardiographie kann verwendet werden, um die Herzfunktion nicht invivo zu überwachen. In kryoverletzten Herzen zeigt die Echokardiographie eine signifikant reduzierte Auswurffraktion und Bruchflächenveränderung (Abbildung 1a-c). Die Funktionelle Beeinträchtigung setzt sich vom 7. Tag bis zum Beobachtungsendpunkt von 56 Tagen fort.
Die detaillierte Herzfunktion kann durch Druckvolumenschleifenanalyse (PV-Loop) invasiv beurteilt werden. Ein 1.2 Fr Leitfähigkeitskatheter wird in den linken Ventrikel eingeführt und der linke ventrikuläre Druck gegen das linke ventrikuläre Volumen geplottet. Es können hämodynamische Parameter wie Hubvolumen, Hubarbeit, Herzleistung und vorspannungsangepasste Maximalleistung berechnet werden. Wie in Abbildung 1d-hdargestellt, führt der Kryoinfarkt zu einer beeinträchtigten linken Ventrikel (LV0-Funktion, die sich als Abnahme des Hubvolumens, der Hubarbeit, der Herzleistung und der vorspannungsangepassten Maximalleistung widerspiegelt.
Zur Untersuchung der Herzelektrophysiologie kann die optische Kartierung ex vivo durchgeführt werden. Herzen werden entfernt, mit Langendorff-Perfusionstechnik durchsetzt und mit einem fluoreszierenden spannungsempfindlichen Farbstoff gefärbt. Kryoverletzte Herzen zeigen eine Blockade der elektrischen Leitung an der Verletzungsgrenze, was auf die lokale elektrische Entkopplung hinweist (Abbildung 1i).
Histologische Färbung mit Massons Trichrom zeigt die transmuraale fibrotische Gewebebildung an der Unfallstelle (Abbildung 2a). Die Infarktgröße kann durch Messung der Infarktnarbenfläche oder mittelliniennarbenlänge19 (Abbildung 2b) berechnet werden. Immunfluoreszenzfärbung gegen alpha-sarkomeric Actinin (Kardiomyozytenmarker) und Kollagen-Ich bestätigen fibrotische Remodellierung und Verlust von Kardiomyozyten an der Stelle der Verletzung (Abbildung 2c).
Abbildung 1 : Funktionelle und elektrophysiologische Analyse des kryogeschädigten Herzens. Repräsentative zweidimensionale Echokardiographie-Bilder, die voroperativ (D0) und am postoperativen Tag 7 (D7), 28 (D28) und 56 (D56) aufgenommen wurden. (a) Das obere Panel zeigt die parasternale Langachsenansicht am Enddiastole und die untere Platte am End-Systole. (b, c) Ejection Fraction (EF) und Fractional Area Change (FAC) nehmen nach Kryoinfarkt ab und verminderten sich im Laufe der Zeit die Herzfunktion wurde durch Druckvolumenkurvenanalyse invasiv beurteilt. (d-g) Tag 56 nach Verletzung Schlaganfallvolumen (SV), Schlaganfallarbeit (SW), Herzleistung (CO) und vorbelastete Maximalleistung (PAMP) waren deutlich niedriger als bei präoperativen einheimischen Tieren. (h) Repräsentative PV-Schleifen von einheimischen und 56 Tagen nach der Operation Tieren zeigten charakteristische Rechtsverschiebung und Abnahme der Amplitude des Drucksignals nach Thoraxvena cava (TVC) Okklusion. (i) Isochrone Karte der kardialen optischen Kartierung von einheimischen und kryoverletzten Herzen 14 Tage nach der Operation. Obere und untere Paneele zeigen Herzen, die von der Spitze bzw. Basis schritten. Der Infarktbereich ist durch eine gestrichelte weiße Linie gekennzeichnet. Interfraktionelle Unterschiede wurden durch eine einseitige Varianzanalyse (ANOVA) mit Bonferronis Post-Hoc-Test oder Student es t-Testbewertet. N = 3 Tiere. * zeigt p < 0,05 an. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (SD) dar. ESPVR = endsystolische Druckvolumenbeziehung; EDPVR = enddiastolische Druckvolumenbeziehung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Histologische Beurteilung von einheimischen und kryoverletzten Herzen. (a) Massons trichrome Färbung zeigt Kollagenablagerung (grün) im Infarktbereich. Der Infarktprozentsatz des linken Ventrikels wurde als (b) Fläche und (c) Mittellinieninfarktlänge gemessen. (d) Die Immunfluoreszenzfärbung zeigt eine erhöhte Kollagen-I-Ablagerung mit gleichzeitigem Verlust von Kardiomyozyten im Infarktbereich. LV = linker Ventrikel; RV = rechter Ventrikel; endo = endokardial; epi = epikardial. N = 3 Tiere. Fehlerleisten zeigen SD. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Dieser Artikel beschreibt ein Maus-Kryoverletzungsmodell zur Untersuchung von ACS und verwandten pharmakologischen und therapeutischen Optionen.
Der wichtigste Schritt ist die Anwendung der Kryoprobe auf das Herzgewebe. Die Kontaktdauer muss streng kontrolliert werden, um die optimale Infarktgröße zu erhalten und reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten. Eine längere Abkühlung des Myokards führt zu übergroßen Infarkten oder ventrikulärer Senforation. Im Gegensatz dazu erzeugt verkürzte Abkühlzeit begrenzte Epikardialläionen und eliminiert nicht alle ansässigen Zellen. Daher kann dies beim Studium der regenerativen Zelltransplantation verwirrend sein.
Im Vergleich zu anderen Kryoinfarktmethoden20hat der in diesem Artikel beschriebene offene Brustansatz den Vorteil, dass der Infarkt frei an verschiedenen Positionen des Herzens induziert werden kann. Darüber hinaus erleichtert dieser Ansatz therapeutische Zellinjektionen oder Patchanwendungen, da die Infarktgrenze sichtbar ist und der Ort der Zelltransplantation entsprechend gewählt werden kann.
Ein Nachteil dieses Modells ist die Ätiologie der Myokardverletzung. Kryoverletzung führt zum Zelltod aufgrund der Erzeugung von Eiskristallen, die die Zellmembran stören, anstatt eine direkte Ischämie. Darüber hinaus ist die Verletzungsrichtung in der Regel von Epikardie nach innen, während ischämische Infarkte dazu neigen, sich nach außen vom Endokard zur Epikardialschicht zu vermehren. Daher ist dieses Modell beschränkt sich auf die Pathophysiologischen Mechanismen der Myokard-Ischämie zu studieren oder die Ischämie-Reperfusion Einstellung zu imitieren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier beschriebene Modell kostengünstig, einfach durchzuführen, schnell und zuverlässig aufgebaut werden kann. Im Laufe der Zeit entwickeln sich Kardiomyozytennekrose und anschließende Narbenbildung, was zu einer fortschreitenden Beeinträchtigung der Pumpenfunktion und der elektrischen Leitfähigkeit führt. Gut kontrollierbare Infarktgröße, Form und Lage machen dieses Modell ideal, um experimentelle Interventionen zu bewerten, die darauf abzielen, die Herzfunktion oder die Herzregeneration wiederherzustellen. Erfolgreich getestete Behandlungsmöglichkeiten sollten in großen Tierstudien weiter bestätigt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Christiane Pahrmann für ihre technische Unterstützung. D.W. wurde von der Max Kade Foundation unterstützt. T.D. erhielt Stipendien der Else Kröner Fondation (2012_EKES.04) und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DE2133/2-1_. S. S. erhielt Forschungsstipendien der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG; SCHR992/3- 1, SCHR992/4-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml Syringe | Thermo Scientific | 03-377-23 | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
| 8-0 Ethilon suture | Ethicon | 2808G | |
| Absorption Spears | Fine Science Tools | 18105-01 | |
| BALB/c | The Jackson Laboratory | Stock number 000651 | |
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer | 1578675 | Eye ointment |
| Betadine Solution | Betadine Purdue Pharma | NDC:67618-152 | |
| Blunt Forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC Codes: 12496-0757-1, 12496-0757-5 | Buprenorphine |
| Cryoprobe 3mm | Brymill Cryogenic Systems | Cry-AC-3 B-800 | |
| Ethanol 70% | Th. Geyer | 2270 | |
| Forceps curved | S&T | 00284 | |
| Forceps fine | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Forceps standard | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| Gross Anatomy Probe | Fine Science Tools | 10088-15 | |
| Hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| High temperature cautery kit | Bovie | 18010-00 | |
| ISOFLURANE | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| IV Catheter 20G | B. Braun | 603028 | |
| Mini-Goldstein Retractor | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| NaCl 0.9% | B.Braun | PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160 | saline |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12075-14 | |
| Needle Holder, Curved | Harvard Apparatus | 72-0146 | |
| Novaminsulfon | Ratiopharm | PZN 03530402 | Metamizole |
| Operating Board | Braintree Scientific | 39OP | |
| Replaceable Fine Tip | Bovie | H101 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Small Animal Ventilator | Kent Scientific | RV-01 | |
| Spring Scissors - Angled to Side | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Surgical microscope | Leica | M651 | |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-1 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Vaporizer | Kent Scientific | VetFlo-1205S |
References
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