Summary
Questo articolo dimostra un modello per studiare il rimodellamento cardiaco dopo la crioinfortuni miocardica nei topi.
Abstract
L'uso di modelli animali è essenziale per sviluppare nuove strategie terapeutiche per la sindrome coronarica acuta e le sue complicazioni. In questo articolo, dimostriamo un modello infarto crioinfortunio criologico murino che genera dimensioni infarto precise con elevata riproducibilità e replicabilità. In breve, dopo l'intubazione e la sternotomia dell'animale, il cuore viene sollevato dal torace. La sonda di un sistema di erogazione di azoto liquido portatile viene applicata sulla parete miocardiale per indurre criolesioni. La funzione ventricolare alterata e la conduzione elettrica possono essere monitorate con ecocardiografia o mappatura ottica. Il rimodellamento miocardico transmurale dell'area infartuata è caratterizzato dalla deposizione di collagene e dalla perdita di cardiomiociti. Rispetto ad altri modelli (ad esempio, la legatura LAD), questo modello utilizza un sistema di somministrazione di azoto liquido portatile per generare dimensioni infarto più uniformi.
Introduction
La sindrome coronarica acuta (ACS) è la principale causa di morte nel mondo occidentale1,2. L'occlusione acuta delle arterie coronarie porta all'attivazione della cascata ischemica e della necrosi del tessuto cardiaco interessato3. Il miocardio danneggiato viene gradualmente sostituito dal tessuto cicatriziale non contrattuale, che manifesta clinicamente come insufficienza cardiaca4,5. Nonostante i recenti progressi nel trattamento dell'ACS, la prevalenza di ACS e insufficienza cardiaca correlata all'ACS è in aumento e le opzioni terapeutiche sono limitate6,7. Pertanto, lo sviluppo di modelli animali per studiare ACS e le sue complicazioni sono di immenso interesse.
Ad oggi, il modello animale più utilizzato per studiare il rimodellamento miocardico indotto da ACS e ACS è la legatura dell'arteria coronaria discendente sinistra (LAD). La legatura del LAD porta ad ischemia acuta del miocardio, simile al tessuto miocardico umano durante l'ACS. Tuttavia, le dimensioni infarto incoerenti rimangono il tallone d'Achille della legatura LAD. La variazione chirurgica e la variabilità anatomica del LAD portano a dimensioni incoerenti degli infarti e ostacolano la riproducibilità e la replicabilità di questa procedura8,9,10. Inoltre, la legatura LAD ha un'alta mortalità intra e postchirurgica. Nonostante i recenti sforzi per migliorare la riproducibilità e ridurre la mortalità11,12, un gran numero di animali sono ancora necessari per valutare correttamente le terapie anti-rimodellamento.
Modelli alternativi di ACS sono stati proposti e studiati negli ultimi anni, tra cui radiofrequenza13,14 termiche o lesioni criogeniche15,16,17,18. Gli attuali metodi di crioinfortuni applicare un'asta metallica pre-raffreddata in azoto liquido per danneggiare il tessuto cardiaco del soggetto15,16. Tuttavia, questa procedura deve essere ripetuta più volte per generare una dimensione infarto sufficiente. A causa dell'elevata conduttività e della bassa capacità di calore dell'asta rispetto al tessuto, la sonda si riscalda rapidamente e il tessuto viene raffreddato (e quindi infarcerato) eterogeneamente. Per superare queste limitazioni, descriviamo qui un modello di criointazione utilizzando un sistema portatile di somministrazione di azoto liquido. Questo modello è riproducibile, facile da eseguire e può essere stabilito velocemente e in modo affidabile. Viene generata una lesione infarto riproducebile indipendente dall'anatomia coronarica, che alla fine porta a insufficienza cardiaca. Questo metodo è particolarmente adatto per studiare il processo di rimodellamento per la valutazione di nuove strategie terapeutiche basate sull'ingegneria farmacologica e tissutale.
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Protocol
Gli animali hanno ricevuto cure umane nel rispetto della Guida per i Principi degli Animali da Laboratorio, preparata dall'Istituto di Risorse Animali da Laboratorio, e pubblicata dai National Institutes of Health. Tutti i protocolli sugli animali sono stati approvati dall'autorità locale competente (comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della California (UCSF).
1. Cura degli animali
- Ottenere topi all'età di 14 settimane del peso di circa 27 g (ad esempio, dall'Istituto di Animali da laboratorio).
NOTA: i mouse BALB/c vengono utilizzati per questo articolo. - Tenere i topi in condizioni convenzionali in armadi ventilati, alimentando loro cilici standard e acqua autoclaved ad libitum.
2. Preparazione del mouse
- Utilizzare una camera di induzione per anantenere il topo con isoflurane (3,5%).
- Rimuovere i capelli sul petto e sul collo con un trimmer per capelli.
- Posizionare il mouse in posizione supina su un pad riscaldato e mantenere l'anestesia con una maschera facciale che copre bocca e naso del mouse.
- Controllare la profondità sufficiente di anestesia pizzicando i piedi posteriori e la coda per verificare l'assenza di riflessi.
- Iniettare buprenorphina sottocutanea (0,03 mg/kg) per l'analgesia.
- Stendere gli arti posteriori e anteriori e fissare la loro posizione utilizzando il nastro.
- Con iodio povidone, disinfettare l'area rasata, seguita da strofinamento con 80% di etanolo. Ripetere questo passaggio due volte.
- Utilizzare una piccola forbice per fare un'incisione della pelle mediana dal terzo inferiore dello sterno al mento.
- Utilizzare pinze curve e separare con attenzione i muscoli intorno al collo per esporre la trachea.
- Utilizzare una micro forbice per eseguire una tracheotomia tra il secondo e il terzo anello della cartilagine.
- Impostare il ventilatore su una frequenza di ventilazione di 110/min con un volume di marea di 0,5 mL.
- Rimuovere la maschera facciale e inserire una cannula di plastica (20 G), collegata al ventilatore, nella trachea. Ventilate l'animale.
NOTA: Assicurarsi che la cannula di ventilazione non sia inserita troppo in profondità confermando la ventilazione polmonare bilaterale. - Utilizzare il cauterio per staccare il muscolo pettorale destro dalla sua origine sternale tra la terza e la settima costola.
- Utilizzare forbici a molla angolate laterali per tagliare la quarta o la sesta costola il più vicino possibile allo sterno.
- Cauterizzare l'arteriamammaria, se il sanguinamento è visibile.
- Diminuire l'isoflurane al 2,5%.
- Disseta il tessuto connettivo alla base per ottenere una visione chiara nella cavità toracica.
- Utilizzare pinze smussate per aprire il pericardio ed esporre il cuore.
- Utilizzare un mini retrattore Goldstein per stendere le costole e mantenere aperta la cavità toracica.
- Sollevare il cuore dalla cavità toracica con un'asta smussata.
- Diminuire la tensione del retrattore per ridurre l'apertura del torace e per evitare che il cuore ricada.
- Precool la criosonia (3 mm di diametro) per 10 s.
- Applicare la criosonia sulla parete anteriore del ventricolo sinistro e congelare per 10 s per generare un infarto crioferico ventricolare sinistro.
NOTA: Il criosone può essere applicato a diverse pareti del cuore a seconda della domanda scientifica e delle necessità. - Irrigare la criosonia con salina a temperatura ambiente per staccare la sonda dalla parete ventricolare sinistra.
- Utilizzare il retrattore per ingrandire l'apertura del torace.
- Riportare delicatamente il cuore alla cavità toracica con un'asta smussata.
- Rimuovere il retrattore e collegare la sternotomia con un singolo nodo utilizzando 6-0 sutura.
- Chiudere la cavità toracica con sutura in esecuzione 6-0. Utilizzare una siringa da 10 mL per evacuare l'aria rimanente dal petto prima di legare il nodo.
- Adattare la pelle sul bordo caudale e suturarla fino al punto dell'apertura tracheale con sutura in esecuzione (5-0).
- Impostare isoflurane all'1,5% e attendere che l'animale acquisisca la respirazione spontanea.
- Rimuovere il catetere tracheale e riapplicare la maschera facciale sulla bocca e sul naso dell'animale per mantenere l'anestesia.
- Chiudere l'incisione tracheale con un 8-0 sutura.
- Riposizionare i muscoli ventrali del collo nella loro posizione per coprire la trachea.
- Completare la sutura della pelle.
- Aggiungere metamizolo all'acqua potabile (50 mg di metamizolo per 100 mL) per l'analgesia del dolore per 3 giorni e monitorare l'animale ogni giorno.
NOTA: il periodo di osservazione per questo modello è di 8 settimane. Assicurati di seguire le linee guida della tua istituzione in materia di regime di analgesia.
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Representative Results
Il modello infarto crioinfortuni è adatto per studiare ACS e le sue complicazioni. In questo modello si riscontrano bassi tassi di mortalità e un efficiente recupero postchirurgico. Il crioinfortuni ha indotto danni miocardici che portano a una ridotta funzione cardiaca, allo saccoppiamento elettrico e al rimodellamento transmurale.
L'ecocardiografia può essere utilizzata per monitorare la funzione cardiaca in modo non invasivo in vivo. Nei cuori crioferiti, l'ecocardiografia dimostra una riduzione significativa della frazione di espulsione e del cambiamento dell'area frazionaria (Figura 1a-c). La compromissione funzionale continua dal giorno 7 post-intervento chirurgico fino all'endpoint osservazionale di 56 giorni.
La funzione cardiaca dettagliata può essere valutata in modo invasivo attraverso l'analisi del ciclo del volume di pressione (PV-loop). Nel ventricolo sinistro viene introdotto un catetere di conduttanza da 1,2 Fr e la pressione ventricolare sinistra viene tracciata rispetto al volume ventricolare sinistro. È possibile calcolare parametri emodinamici come il volume della corsa, il lavoro di corsa, l'uscita cardiaca e la potenza massima regolata dal precarico. Come mostrato nella Figura 1d-h, la crioinfarazione porta a alterato ventricolo sinistro (funzione LV0, che si riflette come una diminuzione del volume di corsa, lavoro di corsa, uscita cardiaca e potenza massima regolata dal precarico.
Per studiare l'elettrofisiologia cardiaca, la mappatura ottica può essere eseguita ex vivo. I cuori vengono rimossi, perfusi con la tecnica di perfusione Langendorff e macchiati con un coloranti sensibili alla tensione fluorescente. I cuori criolesi dimostrano il blocco della conduzione elettrica al confine della lesione, indicando lo saccoppiamento elettrico locale (Figura 1i).
La colorazione istologica con il tricromo di Masson dimostra la formazione di tessuto fibrotico transmurale nel luogo della lesione (Figura 2a). Le dimensioni dell'infarto possono essere calcolate misurando l'area della cicatrice infarto o la lunghezza della cicatrice mediana19 (Figura 2b). Immunofluorescenza colorazione contro l'alfa-sarcomerico actinina (marcatore cardiomiocito) e collagene-I conferma il rimodellamento fibrotico e la perdita di cardiomiociti nel sito di lesione (Figura 2c).
Figura 1 : Analisi funzionale ed elettrofisiologica del cuore crioleso. Rappresentativo dell'ecocardiografia bidimensionale scattate pre-operatorie (D0) e al giorno post-operatorio 7 (D7), 28 (D28) e 56 (D56). (a) Il pannello superiore mostra la vista parasterna dell'asse lungo in corrispondenza della diastole finale e il pannello inferiore in corrispondenza della sistemastia finale. (b, c) La frazione di espulsione (EF) e il cambio di area frazionaria (FAC) diminuiscono dopo la crio-infarzione e sono rimasti diminuiti nel tempo la funzione cardiaca è stata valutata invasiva mediante l'analisi della curva del volume di pressione. (d-g) Giorno 56 volume di ictus post infortunio (SV), lavoro di ictus (SW), uscita cardiaca (CO) e potenza massima regolata con precarico (PAMP) erano significativamente inferiori rispetto agli animali nativi pre-operatori. (h) I loop fotovoltaici rappresentativi degli animali autoctono e 56 giorni dopo la chirurgia hanno mostrato un caratteristico spostamento di destra e un calo dell'ampiezza del segnale di pressione a seguito dell'occlusione toracica vena cava (TVC). (i) Mappa Isochrone della mappatura ottica cardiaca da cuori nativi e crioferiti 14 giorni dopo l'intervento chirurgico. I pannelli superiore e inferiore mostrano i cuori camminati rispettivamente dall'apice e dalla base. L'area infarto è contrassegnata da una linea bianca tratteggiata. Le differenze tra gruppi sono state valutate mediante analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) con il test post-Hoc di Bonferroni o il test t-testdi Student. N - 3 animali. : indica p < 0,05. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD). ESPVR - relazione volume di pressione end-systolic; EDPVR - relazione volume di pressione end-diastolico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : valutazione istologica dei cuori autoctoni e crio-feriti. (a) La colorazione tricromatica di Masson mostra la deposizione di collagene (verde) nell'area infarto. La percentuale infartuata del ventricolo sinistro è stata misurata come area (b) e lunghezza in farto della linea mediana (c). (d) L'attenuazione dell'immunofluorescenza dimostra una maggiore deposizione di collagene-I con perdita concomitante di cardiomiociti in una zona infarto. LV - ventricolo sinistro; RV - ventricolo destro; endo - endocardio; epi - epicardio. N - 3 animali. Le barre di errore mostrano SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo articolo descrive un modello di crioglione del topo per studiare ACS e le relative opzioni farmacologiche e terapeutiche.
Il passo più importante è l'applicazione della criosonia sul tessuto cardiaco. La durata del contatto deve essere strettamente controllata per ottenere la dimensione ottimale dell'infarto e per garantire risultati riproducibili. Il raffreddamento prolungato del miocardio porterà a infarti di grandi dimensioni o perforazione ventricolare. Al contrario, il tempo di raffreddamento ridotto genera lesioni epicardiali limitate e non elimina tutte le cellule residenti. Quindi, questo può essere confuso quando si studia il trapianto di cellule rigenerative.
Rispetto ad altri metodi di crioinzione20, l'approccio al petto aperto descritto in questo articolo ha il vantaggio che l'infarto può essere indotto liberamente su diverse posizioni del cuore. Inoltre, questo approccio facilita l'iniezione di cellule terapeutiche o l'applicazione di patch, in quanto il bordo infarto è visibile e il sito di trapianto di cellule può essere scelto di conseguenza.
Uno svantaggio di questo modello è l'eziologia delle lesioni miocardiche. Il crioinfortuni ompeggio causa alla generazione di cristalli di ghiaccio che interrompono la membrana cellulare piuttosto che un'ischemia diretta. Inoltre, la direzione della lesione è di solito da epicardio verso l'interno, mentre gli infarti ischemici tendono a propagarsi verso l'esterno dallo strato endocardio allo strato epicardio. Pertanto, questo modello si limita a studiare i meccanismi patofisiologici dell'ischemia miocardiale o a imitare l'impostazione ischemia-reperfusione.
In conclusione, il modello qui descritto è economico, facile da eseguire, può essere stabilito velocemente e in modo affidabile. Necrosi cardiomiocita e successiva formazione di cicatrici si sviluppano nel tempo, con conseguente funzione della pompa alterata progressiva e conduttanza elettrica. Le dimensioni, la forma e la posizione dell'infarto ben controllabili rendono questo modello ideale per valutare interventi sperimentali mirati a ripristinare la funzione cardiaca o la rigenerazione cardiaca. Le opzioni di trattamento testate con successo dovrebbero essere ulteriormente confermate in grandi studi sugli animali.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Christiane Pahrmann per la sua assistenza tecnica. D.W. è stato sostenuto dalla Max Kade Foundation. La T.D. ha ricevuto sovvenzioni dall'Else Kroner Fondation (2012_EKES.04) e dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE2133/2-1_. S. S. ha ricevuto sovvenzioni per la ricerca dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SCHR992/3- 1, SCHR992/4-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml Syringe | Thermo Scientific | 03-377-23 | |
| 5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
| 8-0 Ethilon suture | Ethicon | 2808G | |
| Absorption Spears | Fine Science Tools | 18105-01 | |
| BALB/c | The Jackson Laboratory | Stock number 000651 | |
| Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer | 1578675 | Eye ointment |
| Betadine Solution | Betadine Purdue Pharma | NDC:67618-152 | |
| Blunt Forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC Codes: 12496-0757-1, 12496-0757-5 | Buprenorphine |
| Cryoprobe 3mm | Brymill Cryogenic Systems | Cry-AC-3 B-800 | |
| Ethanol 70% | Th. Geyer | 2270 | |
| Forceps curved | S&T | 00284 | |
| Forceps fine | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Forceps standard | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| Gross Anatomy Probe | Fine Science Tools | 10088-15 | |
| Hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
| High temperature cautery kit | Bovie | 18010-00 | |
| ISOFLURANE | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| IV Catheter 20G | B. Braun | 603028 | |
| Mini-Goldstein Retractor | Fine Science Tools | 17002-02 | |
| NaCl 0.9% | B.Braun | PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160 | saline |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12075-14 | |
| Needle Holder, Curved | Harvard Apparatus | 72-0146 | |
| Novaminsulfon | Ratiopharm | PZN 03530402 | Metamizole |
| Operating Board | Braintree Scientific | 39OP | |
| Replaceable Fine Tip | Bovie | H101 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Small Animal Ventilator | Kent Scientific | RV-01 | |
| Spring Scissors - Angled to Side | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Surgical microscope | Leica | M651 | |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-1 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15400-12 | |
| Vaporizer | Kent Scientific | VetFlo-1205S |
References
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