Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Identificering af mutationer ved høj opløsning smelter i en TILLING population af ris

Published: September 2, 2019 doi: 10.3791/59960
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 4
1National Key Laboratory of Rice Biology, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Resources, Institute of Crop Science, Zhejiang University, 2Jiaxing Academy of Agricultural Sciences, 3Institute of Nuclear Agricultural Sciences, Zhejiang University, 4The New Countryside Development Institute at Zhejiang University

Summary

I denne artikel præsenterer vi den protokol, der er beskrevet som høj opløsning smelte analyse (HRM)-baseret Target induceret lokale læsioner i genomer (TILLING). Denne metode udnytter fluorescens ændringer under smeltning af DNA-duplex og er egnet til høj gennemløbs screening af både indsættelse/sletning (Indel) og enkelt base substition (SBS).

Abstract

Target inducerede lokale læsioner i genomer (TILLING) er en strategi for reverse Genetics for high-gennemløb screening af inducerede mutationer. Men, TILLING system har mindre anvendelighed til indsættelse/sletning (Indel) detektion og traditionelle TILLING behov mere komplekse trin, ligesom CEL I nuclease fordøjelse og gel elektroforese. For at forbedre gennemløbs-og udvælgelses effektiviteten, og for at gøre screeningen af både indels og enkelt base substitions (SBSs) muligt, udvikles et nyt højopløsnings-smelte system (HRM). Her præsenterer vi en detaljeret HRM-TILLING protokol og viser dens anvendelse i mutation screening. Denne metode kan analysere mutationer af PCR amplikoner ved at måle denaturering af dobbeltstrenget DNA ved høje temperaturer. HRM-analyse udføres direkte efter PCR uden yderligere behandling. Desuden er en enkel, sikker og hurtig (SSF) DNA-ekstraktionsmetode integreret med HRM-TILLING for at identificere både indels og SBSs. Dens enkelhed, robusthed og høje gennemløb gør det potentielt nyttigt for mutation scanning i ris og andre afgrøder.

Introduction

Mutanter er vigtige genetiske ressourcer til plante funktionel genomforskning og avl af nye sorter. En Forward genetik tilgang (dvs. fra mutant udvælgelse til genkloning eller variation udvikling) plejede at være den vigtigste og eneste metode til brug af inducerede mutationer omkring 20 år siden. Udviklingen af en ny reverse Genetics-metode, TILLING (målretning af inducerede lokale læsioner i genomer) af McCallum et al.1 åbnede et nyt paradigme, og det er siden blevet anvendt i et stort antal dyre-og plantearter2. TILLING er især nyttig for avls egenskaber, der er teknisk vanskelige eller dyre at fastsættes (f. eks. sygdomsresistens, mineralindhold).

Tilling blev oprindeligt udviklet til screening punktmutationer induceret af kemiske mutagener (f. eks. EMS1,3). Det omfatter følgende trin: etablering af en eller andre TILLING af befolkningsgrupper; DNA-forberedelse og pooling af individuelle planter PCR amplifikation af Target DNA fragment; heteroduplexer dannelse ved denaturering og Udglødning af PCR amplikoner og spaltning af cel I nuclease; og identifikation af mutante individer og deres specifikke molekylære læsioner3,4. Denne metode er dog stadig relativt kompleks, tidskrævende og lav gennemløb. For at gøre det mere effektivt og med højere gennemløb er der udviklet mange modificerede tilling metoder, såsom sletning af fliser (de-tilling) (tabel 1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.

HRM-kurve analyse, som er baseret på fluorescens ændringer under smeltning af DNA-duplex, er en enkel, omkostningseffektiv og High-gennemløb metode til mutation screening og genotypebestemmelse13. HRM har allerede været meget anvendt i plante forskning, herunder HRM-baseret TILLING (HRM-TILLING) til screening SBS-mutationer induceret af EMS mutagenese14. Her præsenterede vi detaljerede HRM-TILLING protokoller for screening af mutationer (både Indel og SBS) induceret af gamma (γ) stråler i ris.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. præparater

  1. Udvikling af de mutagenicerede bestande af γ-stråler
    1. Behandl ca. 20.000 tørrede risfrø (med vandindhold på ca. 14%) af en japonica-rislinje (f. eks. DS552) med 137CS gammastråler ved 100 Gy (1 Gy/min) i et γ-bestrålingsanlæg (f. eks. gamma celle).
      Bemærk: frø, der anvendes til behandling, skal have en høj levedygtighed (f. eks. med en spire hastighed > 85%). Bestrålings dosen for Indica-ris kan øges til 150 Gy.
    2. Så de bestrålede frø efter spiring på en frøplante seng og transplantations frøplanter enkeltvis til en Paddy felt og vokse ind i M1 befolkning.
      Bemærk: direkte såning af M1 anlæg sparsomt kunne også anvendes til at spare arbejdskraft omkostninger. Forhindre udpassage af M1 anlæg med andre rissorter ved hjælp af fysisk eller biologisk isolation betyder.
    3. Bulk-høst M2 frø fra m1 planter, med 1-2 frø fra hver m1 panik, at danne en m2 befolkning.
      Bemærk: i praksis og for enkelhed, høst alle frø af M1 planter og efter fuldstændig blanding, en portion er udtaget til at danne en M2 befolkning.
    4. Sug omkring 5.000 M2 frø i vand til 24 (indica Rice)-36 (japonica Rice) h ved stuetemperatur. Lad derefter frøene spire ved 37 °C i 2 dage på fugtigt filtrerpapir i Petri skåle.
      Bemærk: mere M2 frø kan spire til analyse for at øge sandsynligheden for at identificere mutanter.
    5. Placer de germinerede frø til såning paneler med små huller og dyrke dem hydroponisk for 3-4 uger i en kultur løsning modificeret fra Yoshida et al.15 i et drivhus med en 12 h fotoperiode [dagtimerne (30 ± 2) °c og nat (24 ± 2) °c].
  2. Prøveudtagning af bladvæv: skær en skive (Φ ~ 2 mm) fra det fuldt udvidede blad af hver såning på samme position ved hjælp af en hulpuncher.
  3. Fremstilling af DNA ekstraktions løsninger
    1. Buffer A: Tilsæt 2 mL 5 M NaOH og 10 mL 20% Tween 20 for at gøre det endelige volumen på 50 mL. Frisk klargøre buffer A før DNA-ekstraktion.
    2. Buffer B: Tilsæt 20 mL 1 M Tris-HCl (pH 8,0) og 80 μL af 0,5 M EDTA for at fremstille et endeligt volumen på 100 mL.
  4. PCR primere
    1. Primere til HRM-analyse: design primere til forstærkning af målsekvensen ved hjælp af software (f. eks. primer Premier5) og syntetisere af en kommerciel virksomhed.
      Bemærk: fordi HRM er mindre anvendelig på analysen af lange fragmenter, og dermed, amplikoner bør være mindre end 400 BP. fragmenter med for høj (> 75%) eller for lav (< 25%) GC-indhold er heller ikke godt for HRM-analyse.
    2. Primere til kvalitetskontrol: Brug de 24 SSR-markører, der er fordelt på de 12 riskromosomer fra Peng et al.16.

2. DNA-ekstraktion

  1. Placer 4 blad skiver i hver brønd af en 96-brønd PCR plade, tilsæt buffer en opløsning (50 mL/brønd). Pladen fastfryses i en-80 °C fryser i 10 min.
  2. Affryse pladen ved stuetemperatur, og derefter inkubere ved 95 °C i 10 min.
  3. Tilsæt 50 μL buffer B til hver brønd og bland godt ved vortexing.
  4. Centrifuger pladen i 1 min. ved 1.500 x g. Supernatanten er klar til PCR.

3. PCR amplifikation

  1. PCR-optimering
    1. Tilsæt følgende reagenser til hver PCR brønd: 1 μL DNA (supernatanten i trin 2,4), 5 μL 2x Master Mix (indeholdende 2x PCR buffer, 4 mmol/L MgCl2, 0,4 mmol/L 2 '-deoxyribonucleosid triphosphater (dNTP'er) og 50 U/ml Taq DNA Polymerase, 0,2 μl hver af 10 μmol/L Primers, og lav en endelig volumen på op til 10 μL ved hjælp af nuclease frit vand.
    2. Brug en gradient-kompatibel termisk blok til at bestemme den optimale udglødnings temperatur for hvert mål fragment ved hjælp af følgende PCR program: 5 min ved 94 °C, efterfulgt af 40 cyklusser af 30 s ved 94 °C, 30 s ved 52-62 °C (gradient temperatur), og 30 s ved 72 °C , med en endelig forlængelse ved 72 °C i 8 min. og et hold ved 16 °C.
    3. Undersøg amplikoner på 1% agopstået geler til bestemmelse af den optimale udglødnings temperatur.
      Bemærk: en optimal udglødnings temperatur skal muliggøre specifik forstærkning af målfragmentet uden uspecifik forstærkning og primer-dimerization.
  2. PCR til HRM-analyse
    Bemærk: HRM-kompatible plader og DNA af M2 -frøplanter ekstraheret som beskrevet i trin 2,4 anvendes til PCR.
    1. Der udføres PCRs i et endeligt volumen på 10 μL med 1 μL DNA (supernatant), 5 μL 2x Master Mix, 0,2 μL hver af 10 μmol/L primere og 1 μL 10x fluorescens farvestof. I hver plade er der én vildtype (WT) pareret prøve og én negativ (uden DNA) kontrol.
    2. Tilsæt en dråbe mineralolie til hver brønd for at forhindre fordampning.
    3. Forsegl pladen med Klæbefolie og centrifugeres ved 1.000 x g i 1 min.
    4. Kør PCR ved hjælp af den optimerede udglødnings temperatur.
      Bemærk: i nogle få tilfælde, fluorescens farvestof kan påvirke PCR amplifikation, derfor farvestoffet tilsættes efter afslutningen af PCR. I sådanne tilfælde er farvestoffet indarbejdet i DNA-tråde ved post-PCR denaturering og udglødning.

4. HRM-scanning og mutation bekræftelse

  1. Fjern den selvklæbende folie fra pladen, og sæt pladen i en HRM-maskine.
  2. Vælg ny kørsel i menuen filer, eller tryk på knappen Kør øverst på skærmen.
  3. Angiv start-og temperaturerne for smelten fra 55 °C til 95 °C.
    Bemærk: efter den første kørsel kan Smeltetemperaturen bestemmes for et bestemt fragment. Derfor kan Smeltetemperaturen justeres til efterfølgende analyse af det samme fragment for at spare tid.
  4. Vælg prøver til smelte analyse med høj opløsning, Udelad prøver, der ligner den negative kontrol.
  5. Normaliser smelte kurverne for at have samme begyndelse og afslutning af fluorescens. Visuelt bekræfte, at de lavere min og nedre Max temperatur markører er i en region af kurver.
  6. Hold ∆ F (forskel på fluorescens) niveau ved standardindstillingen på 0,05.
  7. Vælg den almindelige kontra variant på listen standard valg, og vælg den normale følsomhed.
  8. Brug WT som kontrolelement. prøver med en ∆ F -værdi på ≥ 0,05 fra WT anses for at indeholde mutant plante.
  9. Identifikation og bekræftelse af mutante planter.
    1. Identificere de fire planter, som hver mutant pool blev foretaget.
    2. Uddrag DNA fra hver af disse planter ved hjælp af en CTAB metode ifølge Allen et al.17 med nogle ændringer.
      Bemærk: DNase-fri RNase og naac anvendes ikke, når DNA udpakkes ved hjælp af den ctab-metode, der er beskrevet af Allen et al.17, da DNA-kvaliteten er god nok til yderligere PCR-amplifikation. DNA justeres til en endelig koncentration på ~ 25 ng/μL efter kvantificering ved hjælp af et spektrofotometer.
    3. Amplificere målfragmentet ved hjælp af PCR-primere og programmere det samme som for HRM-analyse.
    4. Identificer specifikke molekylære læsioner ved sanger sekvensering af amplicons.
      Bemærk: når PCR-amplificeringen er fuldført, skal du sende amplikoner til en virksomhed for sanger sekvensering. Den molekylære læsion kan identificeres ved at sammenligne sekvenser mellem M2 PLANTEN og WT.

5. kvalitetskontrol af udvalgte mutanter med molekylære markører

  1. Udfør PCR for 24 SSR-markører i et endeligt volumen på 10 μL med 25 ng af genomisk DNA (ekstraheret ved hjælp af CTAB-protokollen), 5 μL 2x Master Mix, 0,2 μL af hver 10 μM SSR-primere.
  2. Kør PCR ved hjælp af følgende program: 5 min ved 94 °C, efterfulgt af 30 cyklusser på 30 s ved 94 °C, 30 s ved 55 °C og 30 s ved 72 °C, med en endelig forlængelse ved 72 °C i 7 min.
  3. Adskil amplikoner på 8% polyacrylamid geler og Afslør polymorfi af forstærkede fragmenter ved sølvfarvning18.
  4. Sammenlign SSR-haplotyperne for udvalgte varianter og WT.
    Bemærk: inducerede mutanter har ofte SSR-haplotyper, der er identiske med deres WT, hvis mere end én SSR-markører er forskellige mellem en variant og WT, er varianten høj sandsynlighed for at være et genetisk forurenende stof (f. eks. en blanding eller et overkrydset anlæg) i stedet for en induceret mutant18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HRM scanning og analyse

I alt blev 1.140 samlede DNA-prøver fra 4.560 M2 frøplanter produceret og udsat for PCR amplifikation. To fragmenter med en størrelse på 195 BP og 259 BP blev forstærket for henholdsvis OsLCT1 og SPDT(tabel 2). De fleste prøver havde smelte kurver, som ikke var signifikant forskellige fra WT (ΔF < 0,05). HRM-kurver, der afviger væsentligt fra WT (ΔF > 0,05), blev grupperet med farve (r) forskelligt fra WT af softwaren (figur 1).

Mutation bekræftelse og hyppighed

En DNA-prøve fra en individuel frøning blev anvendt til forstærkning og det respektive fragment blev sekvenserede. Mutations typen og positionen på generne kan bekræftes af sekvente Rings kromatogrammerne (figur 2). Tre mutationer, herunder to Indeler og en SBS, blev identificeret fra 4.560 M2 frøplanter (tabel 2). Det konstateredes, at alle tre mutante dele var heterozygot på Mutations stedet (figur 2).

Mutationsfrekvensen her omtales som hyppigheden af mutation forekom i genomet i en TILLING population. Baseret på formlen nedenfor blev det konstateret, at mutationsfrekvensen udgjorde ca. 1/690 KB.

Equation 1

Figure 1
Figur 1: HRM-TILLING af M2 frøplanter til mutationer i OsLCT1 (A, B) eller SPDT (C) gener. Wild typen blev valgt som reference for udviklingen af fluorescens forskel kurver. De mutanter viste signifikant forskellige HRM-kurver med Δfs > 0,05 ved temperaturer på henholdsvis 90.0-92.0 °c og 81.5-83.5 °c. Dette tal er blevet modificeret fra Li et al.19. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: sekvensering af kromatogrammer af målrettede fragmenter af mutanter. Den rektangulære boks indikerer et heterozygot sted med en mutation af G → A ved 4304 BP af OsLCT1 (a); en enkelt nukleotid en indsættelse på 4240 BP af OsLCT1 er angivet med en pil (B); og en TTC trinucleotid sletning på positionen af 5948-5950 BP af SPDT er angivet med en sort linje (C). Dette tal er blevet modificeret fra Li et al.19. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Forkortelse Fulde navn Fordele eller anvendelighed Ulemper Reference
Traditionel TILLING Målretning af inducerede lokale læsioner i genomer For screening punktmutationer Tids-og omkostningskrævende McCallum et al., 2000; Till et al., 2003
Øko-TILLING Ecotype-TILLING Til screening af mutationer i naturlige populationer Bekostelig og lav følsomhed Comai et al., 2004
De-TILLING Sletning TILLING Til store sletnings screening Afhænger stærkt af et godt PCR-system Rogers et al., 2009
iTILLING Individualiseret TILLING Identifikation af mutationer ved hjælp af personlige TIILLING populationer Ikke permanent population Bush og Krysan, 2010
DHPLC-TILLING Denaturering af højtydende væskekromatografi baseret TILLING Tidsbesparende Lavt gennemløb Colasuonno et al., 2016
SEQ-TILLING TILLING ved sekvensering Højt gennemløb, ikke-enzymatisk system Relativt bekostelig og højere falsk positiv Tsai et al., 2011; Kumar et al., 2017
HRM-TILLING Smelte-TILLING med høj opløsning Høj gennemløb og tidsbesparelse; Ikke-enzymatisk system Grænse for PCR-Fragmentets længde DONG et al., 2009; Gady et al., 2009

Tabel 1: fordele og ulemper ved forskellige TILLING tilgange.

Gennavn Gene loci Genfunktion Primer sekvens (5 '-3 ') TM efter optimering (°C) Produktstørrelse (BP) Antal mutationer (Mutations type)
OsLCT1 LOC_Os06g38120 Lav cadmium transportør LCT-F: CTCGATGTTAAGCATGCTCC LCT-R: AGAGTCAGGAACGCGGCTAC 61 195 2 (G-A overgang, 1-BP indsættelse)
SPDT LOC_Os06g05160 SULTR-lignende phosphor distributions transportør SPDT-F: TTCTCGGAGGAGGCTAAT SPDT-R: CCACGCATTCTGGTTACAT 52 259 1 (3-BP sletning)

Tabel 2: oplysninger om to Målgener, PCR amplifikation og mutationer identificeret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TILLING har vist sig at være et kraftfuldt omvendt genetisk værktøj til identificering af inducerede mutationer til genfunktionel analyse og afgrøde opdræt. For nogle egenskaber, der ikke let observeres eller bestemmes, kan VIPNING med PCR-baseret mutation detektion med høj gennemløb være en nyttig metode til at opnå mutanter til forskellige gener. HRM-TILLING metode har været anvendt i EMS-mutagenicerede populationer af tomat12, hvede11 og Grapevine20 for mutation screening. I dette dokument blev der påvist en enklere og kraftigere HRM-TILLING, som var gældende for både Indel-og SBS-Mutations screening.

For at forbedre effektiviteten blev DNAs ekstraheret ved hjælp af SSF-metoden i stedet for den almindelige CTAB-metode, som er tids-og arbejdskrævende og kræver giftige kemiske agenser. Si et al.21 sammenlignede kvaliteten af dna ekstraheret ved hjælp af SSF og ctab metode. Selv om det blev konstateret, at DNA fra SSF ekstraktion havde renhed ringere end CTAB ekstraktion, det kunne opfylde kravene i PCR og til HRM analyse i ris. Det skal dog bemærkes, at DNA fra SSF ekstraktion ikke kunne lagres i lang tid, derfor er det ikke egnet til at etablere et permanent mutant bibliotek.

I en tidligere undersøgelse kunne samleprøver med 1/8 mutant DNA differentieres fra vildtype ved hjælp af HRM-analyse i både EMS-og gamma-mutagenicerede populationer14,19. Overvejer M2 planter kunne være heterozygot for inducerede mutationer, pooling af fire M2 planter blev anbefalet til påvisning af mutationer ved HRM-tilling.

For at opnå flere mutanter er det også afgørende at udvikle mutagenicerede populationer med en høj mutationsfrekvens. Gamma stråler havde betydelig indvirkning på væksten af M1 planter. Det er blevet rapporteret, at behandling med højere dosis resulterede i øget hyppighed af chlorophyll-mangelfulde mutanter og ringere ydeevne af frugtbarhed, frøsæt og plante højde i M2 planter18. Desuden var det kendt, at tolerance over for mutagener varierede mellem forskellige arter. Derfor blev den dosis, der resulterede i ca. 50% dødelighed (LD50) i M1 -planter, betragtet som den optimale bestrålingsdosis. Men, Li et al. fundet forskellige mutation doser (165, 246 og 389 Gy) resulterede i lignende Mutations rater i hele genomet ved resequencing, hvilket indebar en lav dosis kunne anvendes til at generere mutationer22.

Dette papir viste eksemplet med HRM-TILLING for mutation screening af gamma induceret planter. Den HRM-TILLING, der er beskrevet i dette dokument, bør også anvendes til screening af mutationer i EMS-mutagenicerede populationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Kinas nationale nøgle forsknings-og udviklings program (nr. 2016YFD0102103) og Kinas National Natural Science Foundation (nr. 31701394).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2× Taq plus PCR Master Mix Tiangen, China KT201 PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification
96-well plate Bio-rad, America MSP-9651 Specific plate for PCR in HRM analysis
Mastercycler nexus Eppendorf, German 6333000073 PCR amplification
LightScanner Idaho Technology, USA LCSN-ASY-0011 For fluorescence sampling and processing
CALL-IT 2.0 Idaho Technology, USA For analysis of the fluorescence change
EvaGreen Biotium, USA 31000-T Fluorescence dye of HRM
Nanodrop 2000 Thermo Scientific, USA ND2000 For DNA quantification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McCallum, C. M., Comai, L., Green, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiology. 123, 439-442 (2000).
  2. Taheri, S., Abdullah, T. L., Jain, S. M., Sahebi, M., Azizi, P. TILLING, high-resolution melting (HRM), and next-generation sequencing (NGS) techniques in plant mutation breeding. Molecular Breeding. 37 (3), 40 (2017).
  3. Till, B. J., et al. Large-scale discovery of induced point mutations with high throughput TILLING. Genome Research. 13 (3), 524-530 (2003).
  4. Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single nucleotide mutation discovery. The Plant Journal. 45 (4), 684-694 (2006).
  5. Comai, L., et al. Efficient discovery of DNA polymorphisms in natural populations by Ecotilling. The Plant Journal. 37, 778-786 (2004).
  6. Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicagotruncatula. Plant Physiology. 151 (3), 1077 (2009).
  7. Bush, S. M., Krysan, P. J. ITILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in arabidopsis. Physiology. 154 (1), 25-35 (2010).
  8. Colasuonno, P., et al. DHPLC technology for high-throughput detection of mutations in a durum wheat TILLING population. BMC Genetics. 17 (1), 43 (2016).
  9. Tsai, H., et al. Discovery of rare mutations in populations: TILLING by sequencing. Plant Physiology. 156, 1257-1268 (2011).
  10. Kumar, A. P. K., et al. TILLING by Sequencing (TbyS) for targeted genome mutagenesis in crops. Molecular Breeding. 37, 14 (2017).
  11. Dong, C., Vincent, K., Sharp, P. Simultaneous mutation detection of three homoeologous genes in wheat by High Resolution Melting analysis and Mutation Surveyor. BMC Plant Biology. 9, 143 (2009).
  12. Gady, A. L., Herman, F. W., Wal, M. H. V. D., Loo, E. N. V., Visser, R. G. Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations. Plant Methods. 5 (41), 6974-6977 (2009).
  13. Ririe, K. M., Rasmussen, R. P., Wittwer, C. T. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 245, 154-160 (1997).
  14. Lochlainn, S. O., et al. High resolution melt (HRM) analysis is an efficient tool to genotype EMS mutants in complex crop genomes. Plant Methods. 7, 43 (2011).
  15. Yoshida, S., Forno, D. A., Cock, J. H., Gomez, K. A. Laboratory manual for physiological rice. The International Rice Research Institute. , Manila, the Philippines. (1976).
  16. Peng, S. T., Zhuang, J. Y., Yan, Q. C., Zheng, K. L. SSR markers selection and purity detection of major hybrid rice combinations and their parents in China. Chinese Journal of Rice Science. 17, 1-5 (2003).
  17. Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissues using cetyltrimethymmonium bromide. Nature. 1 (5), 2320-2325 (2006).
  18. Fu, H. W., Li, Y. F., Shu, Q. Y. A revisit of mutation induction by gamma rays in rice (Oryza sativa L.): implications of microsatellite markers for quality control. Molecular Breeding. 22 (2), 281-288 (2008).
  19. Li, S., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y. High-resolution melting-based tilling of γ ray-induced mutations in rice. Journal of Zhejiang University-Science B. 19 (8), 620-629 (2018).
  20. Acanda, Y., Óscar, M., Prado, M. J., González, M. V., Rey, M. EMS mutagenesis and qPCR-HRM prescreening for point mutations in an embryogenic cell suspension of grapevine. Cell Reports. 33 (3), 471-481 (2014).
  21. Si, H. J., Wang, Q., Liu, Y. Y., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Development and application of an HRM-based, safe and high-throughput genotyping system for photoperiod sensitive genic male sterility gene in rice. Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 31 (11), 2081-2086 (2017).
  22. Li, S., Zheng, Y. C., Cui, H. R., Fu, H. W., Shu, Q. Y., Huang, J. Z. Frequency and type of inheritable mutations induced by γ rays in rice as revealed by whole genome sequencing. Journal of Zhejiang University-Science B. 17 (12), 905 (2016).

Tags

Genetik høj opløsning smelte analyse HRM TILLING mutation screening Indel og SBS gammastråler ris
Identificering af mutationer ved høj opløsning smelter i en TILLING population af ris
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, S., Yu, Y. P., Liu, S. M., Fu,… More

Li, S., Yu, Y. P., Liu, S. M., Fu, H. W., Huang, J. Z., Shu, Q. Y., Tan, Y. Y. Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice. J. Vis. Exp. (151), e59960, doi:10.3791/59960 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter