Summary
In questo studio, presentiamo un protocollo per l'estrazione del cortisolo dalla pinna e mascella delle specie di storione. I livelli di cortisolo di pinna e mascella sono stati ulteriormente esaminati confrontando due solventi per il lavaggio seguiti dai saggi ELISA. Questo studio ha sperimentato la fattibilità del cortisolo mascellare come un nuovo indicatore di stress.
Abstract
Gli obiettivi di questo studio erano di sviluppare una tecnica per l'estrazione del cortisolo dalle pinne di storione utilizzando due solventi di lavaggio (acqua e isopropanolo) e quantificare eventuali differenze nei livelli di cortisolo tra tre specie di storione principali. Le pinne sono state raccolte da 19 storioni sacrificati tra cui sette beluga (Huso huso), sette siberiani (Acipenser baerii), e cinque sevruga (A. stellatus). Gli storioni sono stati raccolti nelle aziende agricole iraniane per 2 anni (2017-2018), e l'analisi dell'estrazione del cortisolo è stata condotta in Corea del Sud (gennaio-febbraio 2019). Le ossa della Mascella di cinque H. huso furono usate anche per l'estrazione del cortisolo. I dati sono stati analizzati utilizzando la procedura glM (General Linear Model) nell'ambiente SAS. I coefficienti di variazione intra-e inter-saggio sono stati rispettivamente di 14,15 e 7,70. In breve, la tecnica di estrazione del cortisolo prevedeva il lavaggio dei campioni (300 x 10 mg) con 3 mL di solvente (acqua ultrapura e isopropanolo) due volte, rotazione a 80 giri/ per 2,5 min, asciugatura d'aria dei campioni lavati a temperatura ambiente (22-28 gradi centigradi) per 7 giorni, ulteriore i campioni che utilizzano un battitore di perline a 50 Hz per 32 min e li macinano in polvere, applicando 1,5 mL di metanolo alla polvere essiccata (75 x 5 mg) e una rotazione lenta (40 giri/) per 18 h a temperatura ambiente con miscelazione continua. Dopo l'estrazione, i campioni sono stati centrifugati (9.500 x g per 10 min), e 1 supernatante mL è stato trasferito in un nuovo tubo di microcentrifuga (1,5 mL), incubato a 38 gradi centigradi per far evaporare il metanolo e analizzato tramite l'analisi immunosorante legata agli enzimi (ELISA) . Non sono state osservate differenze nei livelli di cortisolo delle pinne tra le specie o nei livelli di cortisolo a pinna e mascella tra i solventi di lavaggio. I risultati di questo studio dimostrano che la matrice della mascella dello storione è un indicatore di sollecitazione alternativa promettente alle matrici solide.
Introduction
Cortisolo è un indicatore affidabile dello stress animale. L'estrazione del cortisolo fornisce un quadro valido per i ricercatori per monitorare i livelli di stress e modelli generali nei fattori di stress. Ad esempio, studi precedenti hanno condotto la convalida metodologica delle misurazioni del cortisolo dei capelli utilizzando vari metodi in esseri umani1,2, scimmie3,4, bovini5, pecore6, e pesce rosso7,8. Nelle specie ittiche, le misurazioni del cortisolo in matrici come squame, muco cutaneo, feci e sangue9 hanno dimostrato di fornire informazioni sulla salute dei pesci. Quando il campionamento del sangue è problematico o mancano le scale, sono necessarie matrici alternative per l'estrazione del cortisolo. Nei pesci, matrici alternative possono includere la mascella, un tessuto duro simile al dente umano10.
Lo sviluppo di nuove matrici e tecniche convalidate per determinare i livelli di stress del pesce è di particolare interesse per l'industria del caviale, dove lo storione può sperimentare un'esposizione prolungata a fattori di stress ambientale11. Il sesso di storione non può essere determinato prima dei 2 anni di età, e lo storione non ha squame. Poiché il cortisolo si accumula gradualmente in matrici solide durante la fase di crescita2,7,12, i dati di accumulo di cortisolo a lungo termine da matrici dure come pinne e mascelle potrebbero fornire informazioni sullo stress diverse fasi di crescita. Al contrario, i livelli di cortisolo nel sangue forniscono un'istantanea dei livelli di stress al momento della morte e non possono rappresentare con precisione lo stress durante le condizioni di allevamento a lungo termine13,14. Con l'aumento della concorrenza nel mercato dei caviale, nuovi approcci per migliorare le condizioni di stress per la produzione di ovuli più sani tra le specie di storione durante l'allevamento a lungo termine (8-12 anni o più) sono un'area di ricerca sempre più importante. A causa dell'elevato costo dello storione, i campioni raccolti sono estremamente costosi (8.000-15.000 dollari per pesce maturo a seconda delle specie e della fase di crescita), un fattore limitante per i progetti di ricerca. Tuttavia, lo sviluppo di una tecnica appropriata per l'estrazione del cortisolo dalle pinne di storione e dalle mascelle potrebbe essere utilmente applicato sia ai sistemi di allevamento ittico che ai pesci selvatici per migliorare la qualità e la raccolta delle uova di storione sia per il consumo che per conservazione.
Oltre a fornire risultati affidabili6, la selezione di un'adeguata tecnica di estrazione del cortisolo è di fondamentale importanza per garantire che altri composti presenti nella matrice durante la preparazione del campione non confondano l'output, il che potrebbe portare a risultati incoerenti. È altrettanto importante determinare se i livelli di cortisolo pinna e mascella sono influenzati dai livelli di ormone nell'acqua circostante. L'Heimbàrge et al.15 ha suggerito che una serie di fattori possono influenzare i livelli di cortisolo tra cui età, sesso, gravidanza, stagione, colore12e regione del corpo da cui il cortisolo viene estratto16. Tuttavia, sono disponibili poche informazioni sugli effetti dei solventi per il lavaggio sull'estrazione del cortisolo nelle matrici del corpo dei pesci8e nessuna su questi effetti nello storione, fatta eccezione per le uova di storione17.
Anche se l'analisi dei livelli di cortisolo di base dalle pinne e dalle ossa mascellari dello storione richiede che il pesce sia eutanasia, questo approccio non comporta le tecniche invasive necessarie per il campionamento del sangue nello storione vivo. I campioni di pinne e mascelle sono facilmente raccolti e l'estrazione da questi tessuti può essere eseguita rapidamente. Allo stesso modo, l'estrazione e l'analisi degli ormoni sono semplici e richiedono poche attrezzature specializzate.
In questo studio, presentiamo una nuova tecnica e facilmente applicata per l'estrazione, il lavaggio e la determinazione del cortisolo dalle pinne di pesce e dalle mascelle, con l'obiettivo di determinare se i livelli di cortisolo misurati da queste matrici possono essere utilizzati in modo affidabile come stress Indicatori. I vantaggi di questa tecnica includono un approccio8 facile e non invasivo, meno variazioni di dati e uscita affidabile1,6,8,17; la tecnica è applicabile alle specie ittiche senza squame come lo storione. La tecnica richiede la macellazione del pesce, la selezione di adeguati solventi di lavaggio2,4, corretta macinazione dei campioni3,5, saggio immunosorbente enzimatico professionale (ELISA) applicazione5,7, e una vasta conoscenza dell'incorporazione di fonti di cortisolo in matrici solide6.
Abbiamo applicato due diversi solventi per il lavaggio (acqua ultrapura e isopropanolo) per ottenere livelli di cortisolo basale nelle pinne da tre specie di storione: beluga (Huso huso), Siberian (Acipenser baerii), e sevruga (A. stellatussa ), in condizioni ambientali standard per ciascuna specie. Le ossa di H. huso furono usate anche per valutare lo stress nello storione. Questo è il primo studio per misurare i livelli di cortisolo nelle ossa mascellari di storione. I risultati di questo studio forniranno dati comparativi di cortisolo per le specie di storione nella fase di crescita precoce (1 anno) prima della determinazione del sesso.
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Protocol
Le seguenti procedure e metodi sperimentali sono stati approvati dall'Autorità per il benessere e l'etica degli animali della Kangwon National University, Chuncheon, Repubblica di Corea.
1. Collezione Fin
- Catturare delicatamente lo storione usando una rete per ridurre al minimo le lesioni e lo stress.
- Sciacquare il pesce con attenzione con acqua dolce e quindi pulire la superficie del corpo con un asciugamano assorbente prima dell'eutanasia.
- Colpisci la testa del pesce usando un martello di plastica in modo che il pesce sia stordito o perda conoscenza. Rimuovere la testa con un coltello.
- Misurare il peso corporeo (g) e la lunghezza (cm).
- Dopo l'eutanasia, raccogliere i campioni di pinna tagliando il più vicino possibile al corpo utilizzando forbici chirurgiche sterilizzate.
NOTA: per ogni pesce devono essere utilizzati asciugamani assorbenti singoli e non riciclati. Le statistiche descrittive per le specie utilizzate in questo studio sono state le seguenti: storione beluga (H. huso): età : 18 2,1 mesi, peso corporeo , 2.700 x 300 g, e lunghezza del corpo 55 , 5 cm; Storione siberiano(A. baerii): età: 9,6 x 2,4 mesi, peso corporeo , 1.750 x 250 g, e lunghezza del corpo: 45 x 5 cm; Storione di sevruga(A. stellatus): età : 14 x 1,3 mesi, peso corporeo 1.000 x 100 g, e lunghezza del corpo 65 x 5 cm.
2. Preparazione fin per l'estrazione del cortisolo
- Collocare i campioni di pinne (un campione per tessuto: 3 g) su carta da pesatura di laboratorio (107 mm e 210 mm) e asciugarli a temperatura ambiente per alcuni giorni fino all'asciutto.
- Avvolgere i campioni in fogli di foglio di alluminio, mettere in sacchetti di plastica etichettati, e trasferire al laboratorio.
- Conservare i campioni in frigorifero per un ulteriore utilizzo, tra cui lavaggio, estrazione del cortisolo, essiccazione e analisi ELISA (Figura 2).
3. Fin cortisolo analisi
- Calibrare la bilancia analitica digitale (precisione: 0.0001) e pesare campioni da 300 x 10 mg con carta di pesatura sulla teglia della bilancia.
- Lavare i campioni.
- Trasferire ogni campione in un tubo di polipropilene conico da 15 L. Aggiungere 3 mL di isopropanolo ad ogni tubo utilizzando una pipetta a canale singolo da 5.000 l.
- Ruotare i tubi a 80 giri per 2,5 min per lavare il cortisolo e rimuovere qualsiasi potenziale contaminazione esterna. Ripetere questa procedura due volte.
- Asciugare all'aria i campioni lavati a temperatura ambiente (22-28 gradi centigradi) per 7 giorni.
- Ripetere la procedura di lavaggio utilizzando acqua ultrapura come agente di lavaggio.
- Estrarre l'osso mascellare dal tessuto corporeo utilizzando pinze di taglio osseo. Applicare i passaggi da 1.5 a 3.2.4 ai campioni della mandibola.
- Pesare i campioni di pinna o mascella essiccati (75 x 5 mg) e macinare con un battitore di perline a 50 Hz per 32 min.
- Fornire 1,5 mL di metanolo in ogni tubo contenente pinna o mascella in polvere utilizzando una pipetta da 1000 L. Posizionare i campioni su un rotatore tubo a rotazione lenta (40 giri/) per 18 h a temperatura ambiente per estrarre il cortisolo con miscelazione continua.
- Dopo l'estrazione del cortisolo, centrifugare i campioni a 9.500 x g per 10 min a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, raccogliere lo strato organico superiore contenente cortisolo (1 mL) da ogni campione e collocarlo in un tubo di microcentrifuga separato da 1,5 mL.
- Asciugare i campioni per incubazione a 38 gradi centigradi per far evaporare il metanolo. Tenere i campioni di cortisolo estratti sotto una cappa di fumi durante la notte per consentire al metanolo di dissiparsi.
NOTA: Lo strato contenente cortisolo è di solito di colore giallastro.
- Asciugare i campioni per incubazione a 38 gradi centigradi per far evaporare il metanolo. Tenere i campioni di cortisolo estratti sotto una cappa di fumi durante la notte per consentire al metanolo di dissiparsi.
4. Rilevamento cortisolo fin
- Scongelare i campioni di pinna secca o mascella a temperatura ambiente per 1,5 h prima di utilizzare il kit ELISA.
- Aggiungere 400 l di tampone di fosfato, vortice e centrifugaa a 1.500 x g per 15 min.
- Eseguire ogni campione (25 l) in duplicato per migliorare la precisione e l'affidabilità del saggio. Rimuovere tutti i dati al di fuori della curva standard come outlier.
- Impostare un lettore di micropla a 450 nm, quindi impostare su .g dL-1 e leggere la densità ottica della piastra.
- Utilizzare il software microplacca con una curva di regressione non lineare a quattro parametri. Convertire i livelli di cortisolo dei campioni ottenuti dal software in pg mg-1 utilizzando la seguente equazione:
F - 10.000E (A/B) (C/D),
dove F - il valore finale del livello di cortisolo pinna in (pg mg-1), E - il volume (mL) del buffer di prova utilizzato per ricostituire l'estratto essiccato, A - la concentrazione (g dL-1) fornita dall'uscita del saggio, B - il peso (mg) della pinna sottoposta a extra Ction, C - il volume (mL) del metanolo aggiunto alla pinna in polvere, e D - il volume (mL) del metanolo recuperato dall'estratto e successivamente essiccato3.
- Utilizzare il software microplacca con una curva di regressione non lineare a quattro parametri. Convertire i livelli di cortisolo dei campioni ottenuti dal software in pg mg-1 utilizzando la seguente equazione:
5.Analisi statistica
- Dividere ogni campione in due sottocampioni prima della procedura di lavaggio e quindi eseguire in duplicato durante il test del kit ELISA (2 x 2 x 4 osservazioni per campione) per migliorare la potenza del test e l'affidabilità dei risultati.
- Confrontare gli effetti dei due solventi di lavaggio e le loro interazioni applicando la procedura del modello lineare generale (GLM) nell'ambiente software SAS ai dati di misurazione18.
- Verificare le differenze tra i mezzi utilizzando il test di Tukey a un livello di significatività di p < 0.05. Accettare 0,05 < p < 0,10 come prova di una tendenza anziché come differenza significativa.
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Representative Results
La tecnica di estrazione del cortisolo pinna presentata è stata sviluppata e confermata in questo studio utilizzando tre specie di storione. I livelli di cortisolo ottenuti utilizzando acqua ultrapura e isopropanolo come solventi per il lavaggio sono stati confrontati (Figura 2). Cortisolo da H. huso mascella ossa è stato esaminato per determinare se gli storioni possono essere utilizzati come matrice alternativa alle pinne. Gli effetti del solvente di lavaggio, delle specie di storione e della loro interazione sono riportati nella Tabella 1. I livelli di cortisolo tendevano ad essere più elevati nei campioni di pinne lavati con isopropanolo rispetto a quelli lavati con acqua (p - 0,089). Non vi sono state differenze significative nei livelli di cortisolo delle pinne (p - 0,525) tra le specie di storione. Non c'è stata un'interazione significativa tra i solventi per il lavaggio e le specie di storione (p - 0,947). Il solvente di lavaggio non ha avuto alcun effetto significativo sul livello di cortisolo nello storione H. huso (p - 0,45) (tabella 2). I coefficienti di variazione intra-analisi e tra saggi erano rispettivamente 14,15 e 7,70. I dati hanno mostrato un'elevata somiglianza tra le pinne delle tre specie di storione (Tabella 1) e in H. huso jawbones (Tabella 2). Non abbiamo studiato le correlazioni tra i livelli di cortisolo nelle ossa mascellari e quelli nelle pinne di diverse specie di storione perché abbiamo ottenuto campioni di mascella solo da H. huso. Queste relazioni dovrebbero essere esplorate in uno studio futuro.
Figura 1. (A) Fotografia dello storione Di Huso huso (10 anni). (B)Caratteristiche morfologiche dello storione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Infografica dell'analisi del cortisolo pinna5,6 eseguita in laboratorio. Tutte le fotografie presentate nell'infografica sono state scattate in laboratorio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Specie di Sturgeon (SS) | Solvente di lavaggio (WS) | Valore P | ||||||||
| Huso Huso | Acipenser baerii | Acipenser stellato | Sem | acqua | Isopropanolo | Sem | Ss | Ws | SS-WS | |
| Cortisolo (pg mg-1) | ||||||||||
| 3.46 | 2.85 | 3.34 | 0.41 | 2.86 | 3.69 | 0.33 | 0.52 | 0.08 | 0.95 | |
Tabella 1. Livelli di cortisolo fin in tre specie di storione ottenuti utilizzando due diversi solventi di lavaggio.
| Solvente di lavaggio (WS) | Sem | Valore P | ||
| acqua | Isopropanolo | |||
| Cortisolo (pg mg-1) | 1.11 | 1.43 | 0.31 | 0.45 |
Tabella 2. Livelli di cortisolo Jawbone nello storione di beluga (Huso huso) utilizzando due diversi solventi di lavaggio.
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Discussion
Sturgeon è talvolta chiamato un "fossile vivente" perché ha mostrato pochi adattamenti nel corso dei millenni passati. Il genere storione Acipenser contiene 27 specie che producono caviale; tuttavia, tre specie (beluga, baerii e sevruga) producono la maggior parte dell'approvvigionamento di caviale globale. Gli storioni sono vulnerabili alla pesca eccessiva e alle interferenze nel loro habitat naturale e sono quindi più a rischio di estinzione di qualsiasi altro gruppo di specie. Sturgeon appartiene al più antico gruppo di vertebrati viventi, che esiste da 150 milioni di anni. Le specie di acipenser maturano e crescono lentamente; alcuni (ad esempio, H. huso) possono vivere per 100 anni e superare i 2.000 kg di peso. Lo sturgeon sono pesci cartilagine senza squame, e sono caratterizzati da cinque file di grandi piastre ossee chiamate scuti e barbe tattili situate nella parte anteriore della bocca (Figura 1). Le differenze fisiologiche tra queste specie e altri pesci includono la diminuzione delle risposte plasmatiche (corticosteroidi) ai fattori di stress ambientali. Le nostre misurazioni del cortisolo pinna forniscono la prova che la mandibola dello storione accumula cortisolo in proporzione alle concentrazioni circolanti.
I pesci mostrano numerose risposte a fattori di stress fisici, chimici e percepiti. Queste reazioni sono ben note come meccanismi adattivi che permettono ai pesci di far fronte a disturbi ambientali e mantenere uno stato omeostatico. Se uno stressante è sufficientemente prolungato o grave che il pesce non è in grado di ritrovare l'omeostasi usando le sue risposte naturali, allora il pesce può avere effetti negativi, mettendo in pericolo la sua salute generale e/o la vita19. Il sesso di storione può essere determinato da circa 2 anni di età. Pertanto, per determinare se i livelli di cortisolo e il sesso di storione sono correlati, è necessario documentare l'accumulo di cortisolo a lungo termine nelle pinne e nelle mascelle (come nuovo approccio e matrice alternativa) di storione. Questo studio è il primo a segnalare i livelli di cortisolo pinna e mascella in storione.
Il ruolo di un solvente di lavaggio del cortisolo è quello di rimuovere le fonti esterne di cortisolo dal muco della pelle9. Aerts et al.14 utilizzato acqua distillata per rimuovere la contaminazione esterna del cortisolo dalla pelle dei pesci; negli studi precedenti2,5,12,17, abbiamo confrontato gli effetti dell'uso di isopropanolo e acqua come solvente per esaminare il contenuto di cortisolo per capelli. Gli effetti del solvente di lavaggio possono variare tra i campioni a causa delle differenze nelle proprietà delle uova di storione13, pelle15, pinne e mascelle. Brossa7 ha riferito che il livello di cortisolo in squame di pesci rossi (Carassius auratus) è rimasto costante quando l'isopropanolo è stato utilizzato come solvente indipendentemente dal numero di fumi, mentre i livelli di cortisolo variavano quando veniva utilizzata l'acqua. I nostri risultati hanno mostrato che il solvente di lavaggio non ha avuto alcun effetto sui livelli di cortisolo della mascella. Le differenze tra questi studi includono il numero di fucari, agitazione contro vortice, purezza isopropanolo, e, soprattutto, la sensibilità o resistenza di squame / pelle alla penetrazione del liquido esterno. Ghassemi Nejad et al.20 ha dimostrato che l'applicazione di diversi saggi come RIA ed ELISA può portare a differenze nella produzione. Gli steroidi sono più solubili in alcoli di massa molecolare più bassi (ad esempio, metanolo) che in alcoli di peso molecolare superiore come isopropanol4. L'estrazione del metanolo denatura le proteine rompendo legami non covalenti, permettendo così il rilascio di cortisolo per capelli. Il metanolo modifica anche la struttura ormonale rompendo legami non covalenti, con conseguente rilascio di cortisolo dai tessuti. Per omogeneizzare efficacemente le pinne di storione e le ossa mascelle prima dell'estrazione del metanolo, un battitore di perline può essere utilizzato per abbattere in modo efficiente la struttura del tessuto. Questa procedura richiede tempo per macinare completamente i campioni di pinna e mascella; pertanto, il processo deve essere ripetuto per garantire la completa pulverizzazione e omogeneizzazione prima dell'estrazione del cortisolo. La rotazione lenta per 18 h consente la graduale rimozione del cortisolo mediante lavaggio.
Come suggerito in studi precedenti sui capelli dei mammiferi4,5,6, fonti esterne o interne di contenuto di cortisolo nelle pinne e nelle mascelle, diverse dal sangue, non devono essere trascurate. Anche se questo studio non è stato specificamente progettato per studiare come il cortisolo diffonde dal sangue alle pinne o alle mascelle, evidenzia la necessità di espandere la nostra conoscenza di questo processo per interpretare meglio le fluttuazioni del cortisolo da queste matrici. Le proprietà delle pinne e delle mascelle differiscono da quelle delle squame e della pelle. Uova Bussy et al.17 quantificate di cortisolo nelle uova di storione del lago (A. fulvescens) per studiare gli effetti ambientali sulla condizione fisiologica materna e sulla qualità delle uova. Hanno usato il tert-butylether metile (MTBE), l'acetato etilico (AcOEt) MTBE e l'etere dietillo (Et2O) come solventi per il lavaggio e hanno concluso che l'acetato di etilio era il miglior solvente di estrazione in termini di recupero e effetto matrice. Nel presente studio, l'isopropanolo ha rimosso una maggiore quantità di cortisolo esterno dal muco cutaneo durante il lavaggio, portando ad una leggera sopra5valutazione del cortisolo dalle pinne di sturgeon, che deve essere attentamente considerato quando si interpretano i risultati dell'estrazione. È possibile che l'isopropanolo sia stato in grado di lavare la pelle della pinna, come è stato riportato in uno studio precedente7. Isopropanol è noto per penetrare follicoli piliferi e squame di pesce4,7. I risultati del presente studio indicano che la scelta del solvente non ha avuto alcun effetto significativo sui livelli di cortisolo, suggerendo che l'estrazione del cortisolo può essere più difficile in alcune parti della pinna che in altre che utilizzano acqua ultrapura; in questi casi, l'isopropanolo può essere utilizzato come alternativa.
Questo studio ha dimostrato l'applicabilità della mascella come una nuova matrice per l'indicazione affidabile dello stress nello storione. I valori di cortisolo h. huso mascellare erano simili a quelli estratti da pinne della stessa specie; studi futuri dovrebbero confermare questo risultato tra diverse specie, età e sessi attraverso l'analisi di correlazione. Un basso numero di pesce è stato utilizzato nello studio attuale a causa dell'alto costo dello storione; abbiamo cercato di superare questa limitazione testando ogni campione due volte e duplicando anche l'estrazione di metanolo per eLISA. L'uso della moltiplicazione quadrupla potrebbe aumentare la potenza del test per coprire il basso numero di campioni.
Concludiamo che il tipo di solvente per il lavaggio ha influenzato moderatamente l'estrazione del cortisolo dalle pinne, ma non dalle mascelle, dello storione. Prima di generalizzare la conclusione di questo studio e di convalidare questi risultati, dovrebbero essere condotte ulteriori ricerche utilizzando diverse specie e solventi. Il presente lavoro fornisce la prova che la mascella dello storione può essere applicata come matrice alternativa negli studi futuri utilizzando il cortisolo come indice di stress nello storione. Nel presente studio è stata dimostrata anche l'idoneità di ELISA per la misurazione del cortisolo a pinna e mascella. La ricerca futura dovrebbe concentrarsi su due aspetti: 1) determinare la correlazione tra i livelli di cortisolo nelle ossa mascellari e quelli nelle pinne dello storione e 2) raccogliere campioni di matrice per la misurazione del cortisolo da pesci più vecchi e il loro caviale per determinare lo stress a lungo termine diversi tipi di storioni per tutta la durata della vita.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato condotto con il supporto del Programma di Ricerca Cooperativa per l'Agricoltura Scienza & Sviluppo Tecnologico (titolo del progetto: Analisi della produttività del bestiame con il cambiamento climatico, Progetto n. PJ012771), Amministrazione dello sviluppo rurale, Repubblica di Corea. Inoltre, questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione (No. PJ01344604) dell'Animal Nutrition & Physiology Team, Istituto Nazionale di Scienze Animali, RDA, Seoul, Repubblica di Corea. Gli autori riconoscono con gratitudine il CEO dei gesti persiani Mohammad Hassan Salmanzadeh e il suo team, che ha fornito pesce delle tre specie di storione esaminate in questo studio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposal latex surgical gloves | Ansell | 63754090 | |
| Platform scale-electronic weighing 100kg | Baskoolnikoo | 101 EM | |
| Serological pipette to deliver up to 24 mL | Becton Dickinson Falcon | 35-7550 | |
| Micro plate reader with 450 nm and 490 to 492 nm reference filters | BioTek | 8041000 | |
| Reagent reservoirs | BrandTech | 703459 | |
| Zipper storage plastic bag | Cleanwrap | 30cm x100m | |
| Isopropyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5035-4400 | |
| Methyl alcohol | Daejung chemicals & Metals | 5558-4100 | |
| Tube rotator- MX-RL-Pro | DLAB Scientific | 824-222217777 | |
| Precision pipette to deliver 1.5 and 10 mL | Eppendorf Research Plus | M21518D | |
| Precision pipette to deliver 15 and 25 μL | Eppendorf Research Plus | R25623C | |
| Weighing paper (107 x 210 mm) | Fisherbrand | 09-898-12B | |
| Bead beater, 50/60 Hz 2A | GeneReach Biotechnology Corp | tp0088 | |
| Plate rotator with orbit capable of 500 rpm | Hangzhou Miu Instrument | MU-E30-1044 | |
| Disposable polypropylene tubes to hold at least 24 mL | Hyundai Micro | H20050 | |
| Fume hood | Kwang Dong Industrial | KD 901-22128175 | |
| Micro-centrifuge capable of 1500 x g | Labo Gene | 9.900.900.729 | |
| Mini vortex mixer | LMS | VTX-3000L | |
| Lotte aluminum foil roll | Lotte Aluminum | B0722X5FK5 | |
| Digital scale | Mettler Toledo | ME204 | |
| Ultrapure water | MDM | MDM-0110 | |
| Pipette tips | Neptune Scientific | REF 2100.N | |
| Large fish net | Pond H2O | Hoz135 | |
| Salivary cortisol kit | Salimetrics | 1-3002-4 | |
| Bone cutting forceps | Sankyo | 26-188A | |
| Precision multichannel pipette to deliver 50 μL and 200 μL | VITLAB | 18A68756 | |
| Towel | Yuhan Kimberly | 1707921546 | |
| Tissue paper (107 × 210) | Yuhan Kimberly | 41117 |
References
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary- adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Ghassemi Nejad, J., et al. A cortisol study: facial hair and nails. Journal of Steroids Hormonal Sciences. 7, 1-5 (2016).
- Meyer, J. S., Novak, M. A., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147, 255-261 (2006).
- Ghassemi Nejad, J., Ataallahi, M., Park, H. K. Methodological validation of measuring Hanwoo hair cortisol concentration using bead beater and surgical scissors. Journal of Animal Science and Technology. 61, 41-46 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Wool cortisol is a better indicator of stress than blood cortisol in ewes exposed to heat stress and water restriction. Animal. 8, 128-132 (2014).
- Brossa, A. C. Cortisol in skin mucus and scales as a measure of fish stress and habitat quality. Ph.D. dissertation. , Faculty of Veterinary Medicine, Universitat Autonoma de Barcelona. Ph.D. dissertation (2018).
- Carbajal, A., et al. Cortisol detection in fish scales by enzyme immunoassay: biochemical and methodological validation. Journal of Applied Ichthyology. 34, 1-4 (2018).
- Bertotto, D., et al. Alternative matrices for cortisol measurement in fish. Aquaculture Research. 41, 1261-1267 (2010).
- Ghassemi Nejad, J., Jeong, C., Shahsavarani, H., Sung, I. K., Lee, J. Embedded dental cortisol content: a pilot study. Endocrinology & Metabolic Syndrome. 5, 240 (2016).
- Pankhurst, N. W. The endocrinology of stress in fish: an environmental perspective. General and Comparative Endocrinology. 170, 265-275 (2011).
- Ghassemi Nejad, J., Kim, W. B., Lee, B. H., Sung, K. I. Coat and hair color: hair cortisol and serotonin levels in lactating Holstein cows under heat stress conditions. Animal Science Journal. 88, 190-194 (2017).
- Baker, M. R., Gobush, K. S., Vynne, C. H. Review of factors influencing stress hormones in fish and wildlife. Journal of Nature Conservation. 21, 309-318 (2013).
- Aerts, J., et al. Scales tell a story on the stress history of fish. PLoS One. 10, e0123411 (2015).
- Heimbürge, S., Kanitz, E., Otten, W. The use of hair cortisol for the assessment of stress in animals. General and Comparative Endocrinology. , 10-17 (2019).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Comparing hair cortisol concentrations from various body sites and serum cortisol in Holstein lactating cows and heifers during thermal comfort zone. Journal of Veterinary Behavior: Clinical and Application Research. 30, 92-95 (2019).
- Bussy, U., Wassink, L., Scribner, K. T., Li, W. Determination of cortisol in lake sturgeon (Acipenser fulvescens) eggs by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B. 1040, 162-168 (2017).
- SAS. 1999. SAS. User's Guide (Version 8.01 Edition). , SAS Inst. Inc. Cary, NC, USA. (1999).
- Barton, B. A. Stress in fishes: a diversity of responses with particular reference to changes in circulating corticosteroids. Integrative and Comparative Biology. 42, 517-525 (2002).
- Ghassemi Nejad, J., et al. Measuring hair and blood cortisol in sheep and dairy cattle using RIA and ELISA assay: a comparison. Biological Rhythm Research. Accepted. , (2019).
