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Genetics

Un ensayo robusto basado en la reacción en cadena de la polimerasa para cuantificar las repeticiones de trinucleótido de citosina-guanina-guanina en el gen frágil X mental retardado-1

Published: September 16, 2019 doi: 10.3791/59963
Automatic Translation
*1, *2,3, *3,4, 2, 2,3, 2,3, 2, 5, 5, 6,7, 2,3
1Central Laboratory, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, The Chinese University of Hong Kong, 3Shenzhen Research Institute, The Chinese University of Hong Kong, 4Department of Genetics and Metabolism, Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, 5PerkinElmer Diagnostics, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University, 7Maternal-Fetal Medicine Institute, Bao'an Maternity and Child Health Hospital, Jinan University
* These authors contributed equally

Summary

Un ensayo preciso y robusto basado en la reacción en cadena de la polimerasa para cuantificar las repeticiones de trinucleótido de citosina-guanina-guanina en el gen frágil X de retraso mental-1 facilita el diagnóstico molecular y el cribado del síndrome de X frágil y las repeticiones X frágiles trastornos con menor tiempo de respuesta e inversión en equipos.

Abstract

El síndrome X frágil (FXS) y los trastornos asociados son causados por la expansión de la repetición de trinucleótido de citosina-guanina-guanina (CGG) en la región no traducida (UTR) de 5' del promotor del gen Frágil X de retardación mental-1 (FMR1). Convencionalmente, el análisis de fragmentos de electroforesis capilar en un analizador genético se utiliza para el dimensionamiento de las repeticiones CGG de FMR1,pero se requiere un análisis adicional de la mancha sureña para la medición exacta cuando el número de repetición es superior a 200. Aquí, presentamos un método preciso y robusto basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la cuantificación de las repeticiones CGG de FMR1. El primer paso de esta prueba es la amplificación por PCR de las secuencias de repetición en el 5'UTR del promotor FMR1 utilizando un kit de PCR X Frágil, seguido de la purificación de los productos pcR y el tamaño de los fragmentos en un instrumento de electroforesis capilar microfluídica, y interpretación posterior del número de repeticiones de CGG haciendo referencia a normas con repeticiones conocidas utilizando el software de análisis. Este ensayo basado en PCR es reproducible y capaz de identificar toda la gama de repeticiones de CGG de los promotores de FMR1, incluidos aquellos con un número repetido de más de 200 (clasificados como mutación completa), 55 a 200 (premutación), 46 a 54 (intermedio) y 10 a 45 (normal). Es un método rentable que facilita la clasificación de los trastornos asociados al FXS y X frágiles con robustez y tiempo de notificación rápido.

Introduction

Los trastornos asociados al síndrome De X frágil (FXS) y X frágil, por ejemplo, el síndrome de temblor y ataxia (FX-TAS), y la insuficiencia ovárica primaria (FX-POI) son causados principalmente por la expansión de repetición de trinucleótidos de citosina-guanina-guanina (CGG) en los 5' no traducidos (UTR) del gen de retardo mental X frágil-1 (FMR1) en Xq27.31,2. La proteína codificada FMR1 (FMRP) es una proteína de unión al ARN asociada al polisistores que funciona en el desarrollo neuronal y la plasticidad sináptica regulando el empalme alternativo, la estabilidad y el transporte dendrítico de ARNm o síntesis moduladora de proteínas postsinápticas parciales3,4,5,6,7.

La variación dinámica con un tamaño de repetición CGG de >200 se describe como mutación completa, que induce la hipermetilación aberrante y el posterior silenciamiento transcripcional del promotor FMR1 8. La ausencia o falta resultante de la proteína FMRP interrumpe el desarrollo neuronal normal y causa FXS9,caracterizado por varios síntomas clínicos, incluyendo discapacidad intelectual moderada a grave, retraso del desarrollo, comportamientos hiperactivos, contactos pobres y manifestaciones autistas10,11,12. La presentación en pacientes con FXS femeninos es generalmente más leve que la de los hombres. El tamaño de repetición de CGG que oscila entre 55 y 200 y 45 a 54 se clasifican como premutación y estado intermedio, respectivamente. Debido al alto grado de inestabilidad, el tamaño de repetición CGG en una premutación o alelo intermedio presumiblemente se expande cuando se transmite de los padres a la descendencia13,14. Por lo tanto, los portadores con alelos de premutación tienen un alto riesgo de tener niños afectados con FXS debido a la expansión repetida, y en algunos casos, los alelos intermedios pueden ampliar su tamaño de repetición a todo el rango de mutación durante dos generaciones15, 16. Además, los machos con premutación también transmiten un mayor riesgo de desarrollar FX-TAS17,18,19,mientras que las hembras de premutación están predispuestas tanto para FX-TAS como para FX-POI20, 21,22. Recientemente, se ha informado de que los trastornos del espectro autista con retraso del desarrollo y los problemas en las conductas sociales se presentan en niños con premutación FMR1 alelos23,24.

Para determinar el tamaño exacto de la repetición CGG es de gran importancia para la clasificación y predicción de los trastornos asociados al FXS y Xfrágiles 25,26. Históricamente, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) específica de la región de cGG con tamaño de fragmento más análisis de manchas del sur han sido el estándar de oro para el perfilmolecular de la repetición FMR1 CGG27. Sin embargo, la PCR específica tradicional es menos sensible a las premutaciones grandes con más de 100 a 130 repeticiones y es incapaz de amplificar mutaciones completas27,28. Además, la electroforesis capilar en un analizador genético tradicional para el tamaño repetido no detecta los productos de PCR FMR1 con más de 200 repeticiones De CGG. El análisis de la mancha meridional permite la diferenciación de una gama más amplia de tamaño de repetición, de números de repetición de mutaciones normales a completos, y se ha utilizado ampliamente para confirmar mutaciones completas (en varones) y diferenciar alos heterocigotos con una mutación completa de aparentemente alelos homocigotos con tamaños de repetición normales (en hembras). Sin embargo, la resolución para cuantificar las repeticiones es limitada. Más importante aún, esta estrategia de pruebas paso a paso requiere mucha mano de obra, requiere mucho tiempo y es ineficaz en cuanto a costos.

Aquí, presentamos un método preciso y robusto basado en PCR para la cuantificación de las repeticiones CGG de FMR1. El primer paso de esta prueba es la amplificación PCR de las secuencias de repetición en el 5'UTR del promotor FMR1 utilizando el kit de PCR Frágil X. Los productos PCR son purificados y el tamaño de fragmentos se realiza en un instrumento de electroforesis capilar microfluídica, y la interpretación posterior del número de repeticiones de CGG utilizando el software de análisis haciendo referencia a estándares con repeticiones conocidas basadas en el la longitud de los fragmentos de PCR es directamente proporcional al número de repeticiones de CGG. El sistema PCR incluye reactivos que facilitan la amplificación de la región de repetición de trinucleótidos altamente rica en GC. Este ensayo basado en PCR es reproducible y capaz de identificar todas las gamas de repeticiones de CGG de los promotores de FMR1. Este es un método rentable que puede encontrar una amplia aplicación en el diagnóstico molecular y el cribado de trastornos relacionados con FXS y X frágiles con menos tiempo de respuesta e inversión en equipos y, por lo tanto, puede ser utilizado en un espectro más amplio de clínica Laboratorios.

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Protocol

La aprobación ética fue otorgada por el Comité de ética de la investigación clínica del clúster oriental de la Universidad China Conjunta de Hong Kong-Nuevos Territorios (Número de referencia: 2013.055)

1. Amplificación de PCR

  1. Antes de comenzar, retire la mezcla tampón de PCR, el diluyente de muestras y las muestras de ADN (tanto el ADN de prueba como el de referencia) (ver la Tabla de Materiales)del congelador de -20 oC y manténgalos a temperatura ambiente durante 20-30 minutos para asegurarse de que todos los reactivos y el ADN estén completamente descongelados. Vórtice y gire brevemente antes de su uso.
  2. Mida la concentración de las muestras de ADN utilizando un espectrofotómetro (ver Tabla de Materiales). La concentración de ADN debe ser de 25 ng/L; diluir con diluyente de muestra a la concentración adecuada si es necesario.
    NOTA: El ADN debe extraerse y purificarse para eliminar sustancias que interfieren, como proteínas y altas concentraciones de sal. El ADN no degradado y de alta calidad debe utilizarse para la posterior amplificación y análisis de PCR (A260/A280: 1.8–2.0 y A260/A230: >1.0).
  3. Etiquetar pozos de una placa PCR o tubos PCR de 0,2 ml para identificar muestras de ADN de referencia y analizadas.
  4. Calcule el número de reacciones de PCR necesarias para las muestras de prueba, 2 muestras de referencia y muestras de control negativo. Preparar la mezcla maestra de PCR añadiendo 15 ml de mezcla tampón de PCR, 2,6 ml de diluyente de muestra y 0,4 ml de polimerasa para cada reacción.
    NOTA: Un control negativo utilizando diluyente de muestra es esencial para monitorear el rendimiento de la PCR. Preparar la mezcla maestra PCR a temperatura ambiente, NO pipetear en hielo. La mezcla de búfer PCR es viscosa. Mezcle el tubo y luego gire brevemente hacia abajo antes de usarlo.
  5. Vortex la mezcla maestra PCR del paso 1.4 para 10-20 s y girar hacia abajo. Dispensar lentamente 18 ml de la mezcla en cada pocal o tubo.
  6. Vórtice y espírelas. Pipetear 2 l de cada ADN en el pozo o tubo apropiado para un volumen final de PCR de 20 l. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5 veces.
    NOTA: La cantidad total de ADN por reacción debe ser de 50-100 ng. Las cantidades de ADN superiores a 150 ng por reacción de PCR de 20 ml pueden dar lugar a una baja amplificación de los alelos repetidos grandes. Para los ADN concentrados más bajos, la cantidad de diluyente de muestra en la mezcla maestra de PCR puede ser reemplazada por una solución de ADN.
  7. Sellar la placa con sellador de placa adhesiva, o con tapas de tubo.
  8. Coloque la placa o tubos PCR sellados en el ciclor térmico con tapa calentada. Ejecutar el programa con los siguientes ajustes: 95 oC durante 5 min, seguido de 25 ciclos de desnaturalización a 98 oC para 35 s, recocido a 59 oC para 35 s, y extensión a 72 oC durante 4 min; un paso final a 72 oC durante 10 minutos. Mantenga los productos de PCR a 4 oC en el ciclor hasta su posterior extracción para su posterior elaboración.
  9. Después de la amplificación de PCR, purifique y analice los productos inmediatamente, o almacene a +2 a +8 oC durante la noche. Alternativamente, el producto se puede almacenar durante un máximo de 30 días a -30 a -16 oC.

2. Purificación de los productos PCR

  1. Precalentar la coctelera de la incubadora a 65oC.
  2. Para cada reacción de PCR, añada 80 ml de búfer de TE 1x (consulte la Tabla de materiales)a los 20 ml de cada producto pcR de la sección 1.
  3. Transfiera la mezcla de muestras a una placa de limpieza de PCR (consulte Tabla de materiales)utilizando una pipeta multicanal.
  4. Mantenga la placa descubierta y colóquela en la coctelera de la incubadora, e incubar a 65 oC mientras agita a 1.200 rpm durante 10 minutos.
  5. Después de la incubación, ajuste el instrumento de vacío a 250 mbar (o 25 kPa, 188 mmHg, 7.4 en Hg) y aspire la solución a través del filtro durante 15 minutos.
  6. Enfríe la coctelera de la incubadora hasta los 25 oC.
  7. Después de la primera aspiración, apague el vacío y agregue 50 s de tampón TE de 1x a cada poca. No mezclar. Aspirar la solución durante 10 minutos utilizando la configuración de vacío en el paso 2.5.
  8. Seque la parte inferior de la placa del filtro presionándola firmemente sobre una pila de toallas de papel.
  9. Añadir 20 s de 1x te tampón en el centro inferior de cada poca. Colocar la placa en la coctelera de la incubadora e incubar a 25oC mientras agita a 1.200 rpm durante 5 min.
  10. Después de la incubación, transfiera >15 l de ADN pcR purificado desde el paso 2.9 hasta una placa de PCR nueva de 96 pocillos. El ADN purificado se puede analizar directamente, o alternativamente se puede almacenar a -30 a -16 oC hasta que sea necesario.

3. Tamaño de fragmentos de productos de PCR

  1. Antes de comenzar, permita el concentrado de colorante de ADN, la matriz de gel de ADN, el marcador de ADN, la escalera de ADN y las muestras de ADN purificadas desde el paso 2 para equilibrar la temperatura ambiente durante 30 min.
  2. Configure la estación de cebado.
    1. Reemplace la jeringa (consulte Tabla de materiales)cuando utilice un nuevo lote de reactivos.
    2. Ajuste la placa base y suelte la palanca del clip de la jeringa y deslícela hasta la posición superior.
  3. Inicie el software de dimensionamiento (ver Tabla de Materiales)y prepare la mezcla gel-dye.
  4. Concentrado de tinte vórtice para 10 s y girar hacia abajo. Añadir 25 ml del tinte a un vial de matriz de gel. Vortex la solución mezclada bien y girar hacia abajo.
    1. Transfiera la mezcla gel-dye a un filtro de espín. Coloque el filtro de centrifugado en una microcentrífuga y gire durante 10 minutos a temperatura ambiente a 1.500 x g a 20%.
      NOTA: Proteja la solución con tinte de la luz y guárdela a 4 oC después de su uso. La mezcla gel-dye se puede utilizar para unos 15 chips una vez preparado. Deje que la mezcla gel-dye se equilibre a temperatura ambiente durante 30 minutos cada vez antes de su uso.
  5. Cargue la mezcla gel-dye.
    1. Inserte un nuevo chip de ADN en la estación de cebado. Añadir 9 l de mezcla gel-dye en el bien marcado con "G". Asegúrese de que el émbolo esté situado en la marca de 1 ml y, a continuación, cierre la estación de cebado.
    2. Presione el émbolo de la jeringa hacia abajo hasta que lo mantenga el clip. Espere exactamente 30 s y suelte el clip. Espere 5 s y, a continuación, tire lentamente del émbolo de vuelta a la posición de 1 ml.
    3. Abra la estación de cebado y añada 9 l de mezcla gel-dye en los pozos marcados con "G".
  6. Añadir 5 sL de marcador en el bien marcado con el símbolo de la escalera y también añadir 5 sL de marcador en cada uno de los 12 pozos de muestra. No deje ningún pozo vacío.
  7. Añadir 1 l de escalera de ADN en el bien marcado con el símbolo de la escalera. Añadir 1 l de producto PCR (pozos usados) a partir del paso 3.1 o 1 l de agua ultrapura (pozos no utilizados) en cada uno de los 12 pozos de muestra. Coloque el chip horizontalmente en el adaptador del mezclador de vórtice y el vórtice durante 1 min en el ajuste indicado (2.400 rpm).
  8. Inserte el chip en el instrumento del bioanalizador y ejecute el chip en el instrumento en un plazo de 5 minutos.
  9. Una vez completado el ensayo, retire inmediatamente el chip usado del instrumento.
  10. Añadir lentamente 350 s de agua desionizada en uno de los pozos del limpiador de electrodos. Abra la tapa del bioanalizador y coloque el limpiador de electrodos en él. Cierre la tapa e incubar durante unos 10 s. Abra la tapa y retire el limpiador de electrodos. Espere otros 10 s para permitir que el agua de los electrodos se evapore y luego cierre la tapa.

4. Analizar los resultados de tamaño de fragmentos

NOTA: Las muestras de referencia deben ser amplificadas y analizadas por el mismo ciclor térmico y bioanalizador en el mismo lote con las muestras desconocidas.

  1. Una vez completada la ejecución del bioanalizador, exporte los datos de pico de cada ejecución como un archivo de tabla .csv para su posterior análisis.
  2. Inicie el software de análisis y abra el archivo de tabla de picos .csv exportado desde el paso 4.1.
  3. A través de la pestaña del menú QC, revise la línea de regresión ajustada a los cuatro puntos (mostrados como diamantes azules en la gráfica) de las dos muestras de referencia. El valor R2 de la línea de regresión debe ser >0,98 (los valores típicos superan 0,999).
  4. A través de la pestaña del menú Resultados, compruebe el tamaño de repetición de cada muestra cuya longitud de fragmento se traza automáticamente con la curva estándar de regresión lineal derivada de las muestras de referencia. El software también proporciona la clasificación de cada muestra de acuerdo con diferentes directrices.
  5. A través de la pestaña exportar menú, exporte el informe de resultados para cada muestra con los números de repetición y la clasificación de diagnóstico, así como un resumen de la información de muestra y el informe de control de calidad para cada ejecución.
    NOTA: El software de análisis permite el uso de directrices de clasificación personalizadas, como el Colegio Americano de Genética Médica (ACMG) o la Sociedad Clínica de Genética Molecular/Sociedad Europea de Genética Humana (CMGS/ESHG), así como las directrices de clasificación predefinidas Criterios.

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Representative Results

Los resultados de tamaño de la muestra de referencia femenina de premutación (NA20240, tamaños de repetición de 30 y 80) y la muestra de referencia femenina de mutación completa (NA20239, tamaños de repetición de 20 y 200) se muestran en la Figura 1A y la Figura 1B,respectivamente. Normalmente, dos picos de marcador (marcador inferior 50 pares base [bp] y marcador superior 10.380 bp) se incluyen en el perfil de tamaño de fragmento. Por lo general, hay un pico complejo de imprimación con un tamaño de casi 95 bp. A través de la muestra de referencia, se puede construir una curva estándar de regresión lineal con cuatro puntos, como se muestra en la Figura 1C.

Las características representativas del tamaño de las muestras clínicas normales, intermedias, de premutación y de mutación completa se muestran en la Figura 2A–D. En particular, en la Figura 2Ese presentan mutaciones completas de mosaico con dos picos de fragmentos expandidos y un pico normal. En algunos casos femeninos, sólo se muestra un pico en los resultados de la electroforesis microfluídica, como se muestra en la Figura 2F. Esto puede explicarse por la presentación de alelos homocigotos normales (con los mismos números de repetición De CGG en los dos alelos) en estos casos o la incapacidad de diferenciar alelos heterocigotos que tienen diferencias numéricas repetidas de cuatro o menos29. Sin embargo, estos resultados de un solo pico podrían clasificarse como normales, ya que se ha validado que la canalización basada en PCR permite una amplificación y detección robustas de alelos de mutación o premutación completa, lo que minimiza la posibilidad de falsos negativos en esta situación. Un tipo de situación subóptima es el sesgo de línea de base, como se muestra en la Figura 2G, que podría producir resultados ambiguos o no interpretables en algunos casos. Se sospecha que tal condición es causada por un instrumento. Los tamaños de fragmento medidos de muestras desconocidas se trazan con la curva estándar de regresión lineal derivada de las muestras de referencia para calcular automáticamente los tamaños de repetición utilizando el software de análisis, como se muestra en la Figura 2H. Los tamaños de fragmento inferiores a 200 repeticiones se interpolan en la curva estándar de regresión lineal, mientras que los tamaños de alelo de mutación completa más grandes se miden extrapolando a lo largo de la misma línea estándar. El software también muestra la clasificación de cada muestra de acuerdo con diferentes directrices.

Figure 1
Figura 1: Los resultados de tamaño de las muestras de referencia femeninas y la curva de regresión lineal correspondiente. (A, B) muestran las características de tamaño de la muestra de referencia femenina de premutación (NA20240, tamaños de repetición de 30 y 80) y la muestra de referencia femenina de mutación completa (NA20239, tamaños de repetición de 20 y 200), respectivamente. En el resultado de la electroforesis se incluyen dos marcadores (marcador inferior, 50 bp y marcador superior 10380 bp) para cada muestra. El pico con un tamaño de casi 95 bp indica un complejo de imprimación. Las flechas negras indican el tamaño máximo del complejo de imprimación y las flechas azules representan la longitud del fragmento de la muestra de referencia. (C) La curva estándar de regresión lineal con cuatro puntos (diamantes azules) a partir de las dos muestras de referencia se construye en el software de análisis. Los ejes horizontal y vertical muestran los números de repetición de CGG calculados y la longitud del fragmento medido en electroforesis microfluídica. El valor R2 de la regresión fue 0,99967. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Los resultados representativos de las muestras clínicas con diferentes tamaños de repetición de CGG. (A–E) muestran las características representativas del tamaño por bioanalizador en el orden de normal (con longitudes de fragmento de 328 bp y 353 bp, correspondientes a los números repetidos de 28 y 36), intermedios (con longitudes de fragmento de 335 bp y 390 bp, correspondientes a la números de repetición de 30 y 49), premutación (con longitudes de fragmento de 332 bp y 439 bp, correspondientes a los números repetidos de 29 y 65), mutación completa (con longitudes de fragmento de 337 bp y 1911bp, correspondientes a los números repetidos de 31 y 545) y mosaico completo mutaciones (con longitudes de fragmento de 349 bp, 1201 bp y 2688 bp, correspondientes a los números repetidos de 33, 294 y 751) muestras. (F) presenta un resultado de electroforesis microfluídica de un solo pico (con una longitud de fragmento de 334 bp, correspondiente al número de repetición de 30) de una hembra que probablemente tenga alelos homocigotos (con los mismos números de repetición de CGG en los dos alelos) o alelos heterocigotos (con el CGG repetir diferencias numéricas de cuatro o menos). (G) muestra un tipo de la situación subóptima que es sesgo de línea base. Las flechas negras indican el tamaño máximo del complejo de imprimación y las flechas rojas representan la longitud del fragmento de la muestra. (H) muestra la interfaz de resultados principal del software de análisis. Los tamaños de fragmento medidos de muestras desconocidas se trazan con la curva estándar de regresión lineal para calcular automáticamente los tamaños de repetición. El alelo normal de la muestra femenina de mutación completa del mosaico que se muestra en (E) se asigna a la curva estándar en la esquina inferior izquierda de la región del eje de coordenadas (trazado en verde), y los alelos de mutación completa más grandes (trazados en rojo) extrapolados más allá de la esquina izquierda cuatro puntos estándar (diamantes azules en la curva). Las secciones tabulares en la mitad inferior de la figura presentan los tamaños de fragmento y la clasificación de diagnóstico correspondiente de acuerdo con los límites de directrices ACMG elegidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

FXS es la segunda causa más común de deterioro intelectual después de la trisomía 21, que representa casi la mitad del retraso mental ligado al X30, que puede afectar aproximadamente a 1 de cada 4.000 hombres y 1 de cada 8.000 mujeres. Más importante aún, casi 1 de cada 250–1.000 hembras lleva una premutación, y esta frecuencia es 1 en 250-1.600 en los machos26,31,32,33. Dado que el riesgo de que cGG repita la expansión a mutaciones completas al transmitir los alelos de premutación a la descendencia eleva dramáticamente, por ejemplo, del 4% cuando el tamaño de repetición materna es del 55-59 al 98% cuando el tamaño es 100-20014,la determinación del CGG tamaño de repetición en un rango más amplio podría facilitar el diagnóstico de FXS y la detección de portadores de premutación para su planificación reproductiva. El método basado en PCR introducido aquí es preciso, rápido y robusto para amplificar las secuencias de repetición en el 5'UTR del promotor FMR1 y cuantificar el espectro completo de números de repetición CGG en un instrumento de electroforesis capilar microfluídica, y por lo tanto puede impulsar su amplia aplicación en el diagnóstico molecular y el cribado de fxS y trastornos relacionados con X frágiles con menos tiempo de respuesta e inversión en equipos. El instrumento de bioanalizador se puede utilizar con confianza en configuraciones de prueba de bajo a moderado rendimiento para la medición del tamaño de repetición. El equipo es mucho más pequeño, menos costoso y más simple de mantener que otros instrumentos de electroforesis capilar, como los analizadores genéticos capilares ABI. Para la detección de alto volumen, el sistema MultiDX que contiene hasta un modelo de 384 muestras proporciona una amplia flexibilidad y rendimiento para las pruebas.

El ensayo incluye cuatro pasos principales: amplificación pcR de las secuencias de repetición en el 5'UTR del promotor FMR1 (la configuración de PCR y la amplificación de PCR tarda casi 3,5 h), la purificación de los productos PCR (toma casi 1 h), fragmentándose en un microfluídico instrumento de electroforesis capilar (toma casi 1 h), y la interpretación del número de repeticiones DeCGG utilizando el software de análisis deduciendo de las normas de referencia con repeticiones conocidas (toma casi 0,5 h). En total, el tiempo de respuesta de este ensayo es de aproximadamente 6 h. Para un rendimiento óptimo, las muestras de ADN deben purificarse para eliminar sustancias que interfieren putativas, como proteínas y altas concentraciones de sal. Además, la cantidad recomendada de ADN de entrada es de 50 a 100 ng por 20 ml de reacción de PCR. Se ha demostrado que las cantidades de ADN superiores a 150 ng por 20 l del sistema PCR dan lugar a una amplificación deficiente de los alelos de repetición grandes. Además, se recomienda encarecidamente configurar al menos dos muestras de referencia con tamaños de repetición bien caracterizados en cada ejecución de PCR para el análisis simultáneo de números de repetición como control de calidad y el consiguiente dimensionamiento automatizado de fragmentos en el software de análisis 29. Normalmente, el valor R2 de la curva de regresión lineal derivada de las muestras de referencia debe ser mayor que 0,98. Además, los productos PCR deben purificarse antes de la electroforesis capilar microfluídica para mejorar la eficiencia de detección. Como la imprimación PCR está etiquetada con fluorescencia FAM29,el tamaño de fragmentos con un sistema de electroforesis adecuado (por ejemplo, bioanalizador y sistema MultiDX) se puede realizar directamente sin etiquetado adicional.

Una variedad de metodologías para el diagnóstico y estudio de FXS y trastornos relacionados han sido revisadas exhaustivamente por Bruce E. Hayward et al., incluyendo ensayos basados en ADN y ensayos de proteína FMRP34. Como en la mayoría de los casos la base molecular de FXS es una mutación dinámica caracterizada por una repetición de CGG de expansión en la región promotora del gen FMRP1, los ensayos basados en la hincha meridional y la amplificación mediante el uso de ADN genómico son los ensayos más utilizados para determinación del número de repetición. Es bien sabido que los ensayos basados en PCR superan la hincha del sur en la rentabilidad y el requisito de cantidad mínima de ADN. Sin embargo, la amplificación de la repetición CGG es un desafío principal ya que el alto contenido de GC puede afectar a la eficiencia, y se ha hecho mucho esfuerzo para la optimización del sistema PCR a lo largo de los años34. El frágil kit X PCR ha sido optimizado para una amplificación precisa de todas las repeticiones de trinucleótidos de CGG, y nuestro grupo29ha informado previamente de un estudio de validación sobre el rendimiento de este método basado en PCR. En 201235,Mailick Seltzer y otros informaron de un método similar basado en PCR, pero el instrumento ABI 3730xl se utilizó para la determinación del tamaño de repetición y sólo se identificaron individuos con un tamaño de repetición inferior a 200. Esto puede deberse al hecho de que su plataforma elegida no pudo detectar las repeticiones más grandes con un tamaño de repetición superior a 200. Por el contrario, el instrumento bioanalizador que utilizamos ofrece un ensayo de tamaño de fragmentos más robusto, ya que puede detectar de forma precisa y rentable todo el espectro de la repetición FMR1 CGG, incluidas las mutaciones completas29.

Excepto el número de repetición, también es necesario determinar varios otros factores para el diagnóstico adecuado de los trastornos relacionados con FXS y FXS, incluida la mutación FMR1, el grado de metilación y el mosaico34. El estado de metilación puede ser monitoreado por varios métodos tales como la incorporación de pasos de pre-digestión utilizando enzima de restricción sensible a la metilación o el ensayo de modificación de bisulfito34, sin embargo, nuestro ensayo es incapaz de determinar la estado de metilación del 5'UTR del promotor FMR1. Además, el riesgo de expansión de un alelo FMR1 también depende de la presencia de interrupciones de AGG, que pueden estabilizar el gen durante la transmisión. Los ensayos repetidos basados en PCR se han modificado para detectar interrupciones de AGG, mientras que la inestabilidad de la enzima digestión es una de las principales limitaciones. El PCR de triplece (TP) mediante el uso de un enlace de imprimación PCR híbrido en repeticiones de CGG o interrupciones de AGG es otro tipo de ensayo de PCR que puede detectar el tamaño de repetición de CGG y las interrupciones de AGG simultáneamente. Sin embargo, el método de PCR específico del gen FMR1 que hemos descrito no puede identificar las interrupciones de AGG a menos que se realice la secuenciación del gen FMR1 después de realizar la amplificación. Recientemente, Hayward et al. informaron de los métodos de PCR utilizados en su propio laboratorio para la determinación de todos los parámetros necesarios para un estudio genético completo o un estudio de laboratorio exhaustivo, incluyendo ensayos que pueden detectar el número de repetición, el estado de interrupción de AGG y estado de metilación36. Desafortunadamente, ninguno de los ensayos es capaz de determinar exhaustivamente todos estos factores hasta la fecha.

Vale la pena señalar que el ensayo es incapaz de detectar deleciones o variantes de un solo nucleótido dentro del gen FMR1, que representa aproximadamente el 1% de los casos de FXS27. En raras ocasiones, en individuos que tienen mosaico celular para la repetición de FMR1, PCR puede dar un resultado falso negativo debido al fracaso en la detección de mosaico para la premutación más grande y alelos de mutación completa37,38. Se ha demostrado que el umbral de este ensayo basado en PCR para la muestra masculina de mutación completa de mosaico (341 repeticiones) es del 2,5% cuando el umbral máximo del detector se establece en tres unidades de fluorescencia por encima de la línea de base29. Se recomienda el análisis de manchas meridionales en los casos si se indican alelos de mosaico. Además, en lo que respecta a las plataformas de electroforesis, un estudio previo ha indicado que, en comparación con los sistemas de electroforesis capilar (por ejemplo, el instrumento ABI 3130XL), el instrumento bioanalizador es incapaz de diferenciar el homocigoto normal muestras femeninas con picos de fragmentos individuales de muestras femeninas con tamaños de repetición heterocigotos que tienen diferencias numéricas repetidas de cuatro o menos29. Sin embargo, estas muestras de un solo pico podrían clasificarse como normales, ya que se ha validado que esta canalización basada en PCR permite una amplificación y detección robustas de alelos de mutación o premutación completa, lo que minimiza la posibilidad de falso sóxilo en esta situación. Independientemente de las limitaciones anteriores, el método puede utilizarse como una tubería de primer nivel para la identificación molecular de FXS y enfermedades asociadas a X frágiles con rentabilidad, robustez y tiempo de generación rápida, complementado por la secuenciación de la Análisis del gen FMR1 y de la mancha meridional de los niveles de metilación.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por subvenciones del Proyecto de Manejo de Emergencias de la NSFC (Grant No. 81741004), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 81860272), el Plan de Investigación Principal de la Fundación Provincial de Ciencia y Tecnología de Guangxi ( Concesión No. AB16380219), la Beca de la Fundación de Ciencia Postdoctoral de China (Concesión No. 2018M630993) y la Fundación de Ciencias Naturales de Guangxi (Concesión No. 2018GXNSFAA281067).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubes Axygen PCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1x TE buffer, pH 8.0, Rnase-free Ambion AM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrument Agilent G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR Plate Thermo Fisher AB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridge Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixer Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert software Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chips Agilent Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent DNA 7500 kit Agilent 5067-1506 For Fragment sizing
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chips Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap) Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Electrode Cleaner Agilent In kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Spin Filter Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Syringe Agilent Supplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Chip priming station Agilent 5065-4401 Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Cubee Mini-centrifuge GeneReach aqbd-i
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum Manifold Merck Millipore MSVMHTS00 Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopper Merck Millipore XX2004718 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pump Merck Millipore WP6122050 Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vessel Merck Millipore XX1004705 Filter plate vacuum Manifold
FragilEase Fragile X PCR kit PerkinElmer 3101-0010 For PCR amplification

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Genética Número 151 Reacción en cadena de la polimerasa electroforesis capilar microfluídica repeticiones de citosina-guanina-guanina trinucleótido retardación mental X frágil-1 promotor síndrome X frágil mutación completa premutación
Un ensayo robusto basado en la reacción en cadena de la polimerasa para cuantificar las repeticiones de trinucleótido de citosina-guanina-guanina en el gen frágil X mental retardado-1
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Wang, H., Zhu, X., Gui, B., Cheung, W. C., Shi, M., Yang, Z., Kwok, K. Y., Lim, R., Pietilä, S., Zhu, Y., Choy, K. W. A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene. J. Vis. Exp. (151), e59963, doi:10.3791/59963 (2019).

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