Summary
Мы представляем протокол для использования белка microarray построен путем печати антигенов гриппа на нитроцеллюлозы покрытием слайды одновременно зонд сыворотки для нескольких изотипов антител против более чем 250 антигенов из различных штаммов вируса, таким образом, позволяет измерять широту антител сыворотки через вирусные подтипы.
Abstract
Вирус гриппа остается важной причиной смертности во всем мире из-за ограниченной эффективности имеющихся в настоящее время вакцин. Ключевой проблемой для разработки универсальных вакцин против гриппа является высокое антигенное разнообразие в результате антигенного дрейфа. Преодоление этой проблемы требует новых исследовательских инструментов для измерения широты антител сыворотки, направленных против многих штаммов вируса через различные антигенные подтипы. Здесь мы представляем протокол для анализа широты антител сыворотки от различных штаммов вируса гриппа с использованием белкового микроаррейя антигенов гриппа.
Этот микроар микроар антиген гриппа построен путем печати очищенных гемагглютинина и нейраминидазы антигенов на нитроцеллюлозы покрытием мембраны с помощью microarray принтера. Человеческая сера инкубируется на микроарле, чтобы связать антитела против антигенов гриппа. Квантовая точка-конъюгированные вторичные антитела используются для одновременного обнаружения igG и IgA антител, связывающих сяклет ы на каждый антиген на микроаре. Количественные связывания антител измеряется как интенсивность флуоресценции с помощью портативного изображения. Представлены репрезентативные результаты, демонстрирующие воспроизводимость в измерении подтиповых и кросс-реактивных антител гриппа в человеческой сыпи.
По сравнению с традиционными методами, такими как ELISA, микроаррей антигена гриппа обеспечивает высокую пропускную способность мультиплексный подход, способный проверить сотни сыпок на несколько изотипов антител против сотен антигенов в короткие сроки, и, таким образом, имеет применения в сероэпциозном и разработке вакцин. Ограничением является неспособность отличить связывающие антитела от нейтрализующих антител.
Introduction
Вирус гриппа является причиной потери 20 миллионов лет жизни ежегодно в результате смерти или инвалидности, в том числе 1% всех смертей во всем мире каждый год, с несоразмерным воздействием на пожилых людей и населения в тропиках и развивающемся мире1, 2,3. В дополнение к бремени болезней сезонных эпидемий, появление новых штаммов гриппа через генетический реассортимент либо естественным образом у общих хозяев, либо искусственно для биотерроризма может привести к пандемиям во всем мире с быстрым распространением и высокой летальностью 4 , 5. В то время как многочисленные вакцины противгриппа в настоящее время доступны, их эффективность ограничена подтипной спецификой 6, создавая необходимость разработки универсальных вакцин против гриппа, которые дают долгосрочный иммунитет против нескольких вирусов штаммов7.
Ключевой проблемой для разработки универсальных вакцин против гриппа является высокое антигенное разнообразие штаммов. Антигенная специфичность нынешних вакцин в сочетании с антигенной вариацией циркулирующих вирусов создает несоответствие между штаммами вакцин и циркулирующими штаммами. Это дает эволюционное преимущество в пользу дальнейшего генетического дрейфа от штаммов вакцины во время эпидемии, ограничивая эффективность вакцины часто менее 50%8,9. Дополнительным источником антигенного несоответствия является яйцеадативной вирусной мутации, порожденные при производстве вакцины, которые приводят к антителам, которые плохо связываются с циркулирующими вирусами10,11.
Преодоление этой проблемы высокого антигенного разнообразия потребует новых исследовательских инструментов для характеристики широты уже существующих и вызываемых иммунных реакций в клинически значимых антигенных вариантах в образцах сыворотки и слизистой оболочки. Имеющиеся в настоящее время методы, включая ингибирование гемагглютинации (HAI), микронейнейтаризация (MN) и традиционные ELISA, ограничиваются выявлением антител против одного штамма вируса одновременно, поэтому их использование для обнаружения нескольких изотипов антител против нескольких штаммов вируса быстро истощает имеющиеся клинические образцы и лабораторные ресурсы. Кроме того, HAI и MN требуют живой культуры вируса, которая доступна только в специализированных лабораториях.
Белковые микроаррей, потенциально состоящие из тысяч антигенов, напечатанных на слайдах с покрытием нитроцеллюлозы, как показано на рисунке 1, могут заполнить эту потребность12. Эти микроаррей могут быть произведены и исследованы в высокой пропускной форме, потребляя при этом небольшие количества клинического образца для определения количественных уровней изоттипа антитела/подтипа против каждого отдельного антигена на массиве. Этот подход к открытию антигена был применен к диагностической и вакцинной разработке против нескольких инфекционных патогенов13. На сегодняшний день мы произвели микроаррей для более чем 35 патогенных микроорганизмов, включая более 60 000 всего выраженных белков, и использовали их для исследования более 30 000 человеческих серот инфицированных и контролирующих лиц. Недавно разработанная портативная платформа изображений для слайдов microarray сделала эту методологию более доступной для конечных пользователей14.
Опираясь на обширную предыдущую работу нескольких участников в области15,16,17,18,19, микроаррей белка гриппа был недавно разработан, который содержит более 250 очищенных гемагглютинина (HA) антигенных вариантов с представлением всех 18 подтипов12,20. Используя эту методологию, естественная инфекция гриппа была продемонстрирована для создания широко реактивных igG и IgA антител против филогенетически связанных подтипов HA, в то время как внутримышечная вакцинация против гриппа генерируется только подтип-специфический IgG антитела21. Тем не менее, добавление адъювант, который активирует платных рецепторов к вакцинам против гриппа было показано, расширить вызвали IgG антитела ответ через ПОДтипы HA в исследованиях на животных22.
Этот microarray в настоящее время используется для зонда сера собраны из перспективных когортное исследование студентов колледжа, которые последовали за гриппом инфекции. Здесь сообщается о методологии микроаррэя антигена гриппа с демонстрацией воспроизводимости анализов для выявления подтиповых и кросс-реактивных антител в подмножестве образцов, полученных в ходе этого исследования.
Protocol
Вся человеческая сера обрабатывается и управляется в соответствии с утвержденными институциональными протоколами для биобезопасности с использованием защитного личного оборудования. Все сотрудники лабораторий, участвующие в этом протоколе, прошли подготовку по вопросам биобезопасности и исследовательской этики.
1. Производить микроаррей антигена гриппа
-
Дизайн и получение антигена набор для microarray
- Получить выраженные и очищенные белковые антигены в виде лиофилизированного порошка.
-
Печать антигенов на слайдах microarray
- Восстановите каждый лиофилизированный антиген до концентрации 0,1 мг/мл в фосфатно-буферном сольном (PBS) с 0,001% Tween-20 (T-PBS). Передача 10 зл и зол каждого восстановленного антигена в отдельные скважины необработанной 384-пущенной плоской нижней пластины.
- Печать антигенов с помощью microarray принтер (microarray принтер, используемый в этом исследовании больше не коммерчески доступны, см. Обсуждение) с низким объемом microarray пятнистость булавки, которые аспирантийных антигенов в образец канала и депозит через прямой контакт и капиллярное действие на 16-падовые нитроцеллюлозы покрытием стеклянные горки.
- Программа печатного программного обеспечения (например, Gridder) с конфигурацией исходной пластины и параметрами печати.
- Используйте выдвижное меню, чтобы выбрать название типа пластины, которое будет использоваться с помощью этого метода печати. Для этого исследования используйте необработанную 384-пуговую плоскую нижнюю пластину.
- Выберите текстовый ящик рядом с числом пластин и введите количество образцов пластин, которые будут использоваться в этом протоколе печати. Для этого исследования используйте 1 пластинку.
- Выберите конфигурацию контакта для использования с помощью этого метода. Для этого исследования используйте 8-контактную конфигурацию.
- Убедитесь, что смещения происхождения — это расстояния (в X- и Y-направлениях) между происхождением слайда (который откалиброван в административном разделе) и местом, где контакты печати начнут печататься на слайдах.
- Используя вкладку Array Design, определите размер и форму массивов (расстояние точек и количество точек на подражу). Для этого исследования, печать 324 пятна (180 мкм диаметром 300 мкм интервал) на 16-пад слайды в формате 18x18 с использованием 8 контактов.
- Выберите параметры того, как типопечатные булавки подбирают и распределяют образцы. Для этого исследования, каждый контактный аспирирует 250 nL антигена раствора и печатает 1 nL на каждом из 40 пятен (всего 20 слайдов для всех 8 контактов)
- Нанастройка протокола очистки штифта и протокола промотирования. Для этого исследования, каждый контактный печатает антиген, окунается в стерильные ddH2O в звуковой контейнер для мытья, а затем аспирирует следующий антиген.
- Определите последовательность, в которой блоки образца печатаются на слайдах. Программное обеспечение массива будет построен аннотированный индекс сетки (.gal) файл для описания расположения антигенов в каждом microarray.
ПРИМЕЧАНИЕ: Верхний ряд используется для фидуциалий (с флуоресценцией на всех длинах волн, используемых в визуализации, например, смесь стрептавидина sdot 585 нм конъюгированных и стрептавидин sdot 800 nm в этом исследовании) для ориентации сетки во время визуализации. Для длинных тиражей антигены в исходной пластине могут периодически вновь подвешиваться путем подачи трубвверх вверх и вниз, а затем центрифугирования, или новый источник пластины могут быть подготовлены и использованы.
- Программа печатного программного обеспечения (например, Gridder) с конфигурацией исходной пластины и параметрами печати.
- Поместите не-зондированные слайды microarray в светонепроницаемую коробку и держите в шкафу для дешикатора при комнатной температуре для длительного хранения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен на неопределенный срок на этом этапе.
-
Выполните проверку качества (требуется полигистидин теги)
- Прикрепите слайд к зондирующим камерам и регидратировать с блокирующим буфером, как описано в шаге 2.1.1-2.1.2 и показанном на рисунке 2.
- Разбавить мышь моноклональной поли-Его антитела 1:100 в фильтрованных 1x блокирующий буфер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если неочищенные белковые антигены (например, выраженные в транскрипции и переводческой системе) непосредственно используются для печати микроаррей, добавьте компоненты системы экспрессии белка (например, E. coli lysate) в соотношении 1:10 с блокирующий буфер, используемый для разбавления сыворотки для того, чтобы блокировать любые антитела, направленные против этих компонентов. - Добавьте 100 л разбавленных поли-Его антитела к каждой слайд-камере, содержащей массив площадку после аспирации и инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре или на ночь при 4 градусов по Цельсию на шейкере. Вымойте 3x с буфером T-TBS, как описано в шаге 2.2.1. Разбавить биотин-конъюгированный коза анти-мышь IgG вторичное антитело 1:200 в блокирующем буфере, добавить 100 л л на хорошо после аспирации, и инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере. Вымойте 3x с буфером T-TBS.
- Разбавить здот 585 нм стрептавидин сопряжендование до 4 нм в блокирующем буфере, добавить 100 л л на хорошо после аспирации, и инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере. Вымойте 3x с t-TBS буфер, а затем один раз с буфером TBS (без Tween).
- Рассеивая и количественно слайды, описанные в шаге 2.2.5 - 3.1.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Белковые антигены должны содержать его10 тегов, чтобы использовать этот протокол контроля качества. Кроме того, если включен другой тег, проверка контроля качества может быть выполнена с антителами или лигандом для этого тега.
2. Зонд сера для антител гриппа с использованием microarrays
-
Инкубировать серу на микроаррей для связывания антител
- Прикрепите слайды microarray к камерам с помощью клипов и поместите в кадры, как показано на рисунке 3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда избегайте прикосновения к microarray площадку руками и инструментами. Убедитесь, что слайды ориентированы с колодки вверх и небольшой выемки в правом верхнем углу. - Регидратные микроаррейные слайды с 100 л на скважину отфильтрованного 1x блокирующего буфера и разбавленную сыворотку 1:100 в 100 л блокирующего буфера (можно использовать необработанные 96-нуколойпластины или 2 мл труб). Инкубировать как регидратированные microarray слайды в крытых рам и разбавленной сыпок отдельно в течение 30 минут при комнатной температуре на орбитальной шейкер на 100-250 об/мин. Выполните все последующие инкубационные шаги аналогичным образом на шейкере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сера должна быть алицитирована и заморожена при -80 градусов по Цельсию для длительного хранения, чтобы свести к минимуму циклы замораживания-оттепели и должна быть вихрем, чтобы смешивать и центрифугировать, чтобы удалить частицы перед использованием. Внимательно соблюдайте слайд-камеры во время и после этого шага, чтобы обнаружить любую утечку, которая требует повторной сборки слайд-камер. - Используя пипетки советы, подключенные к вакуумной линии со вторичной колбы сбора, тщательно аспирировать блокирование буфера из угла каждой камеры, не касаясь колодки. Выполняйте все последующие шаги аспирации аналогичным образом. Добавьте разбавленную серу в прокладки быстро после аспирации, чтобы не дать колодки высохнуть.
- Поместите покрытые рамы в лотки внутри вторичного контейнера, окруженного влажными бумажными полотенцами и запечатанными, чтобы предотвратить испарение. Инкубировать ночь при температуре 4 градусов по Цельсию на качалке шейкер (альтернативно, может инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре на орбитальной шейкер евкиприг при 100-250 об/мин).
- Прикрепите слайды microarray к камерам с помощью клипов и поместите в кадры, как показано на рисунке 3.
-
Этикетка связаны сыворотки антител с квантовой-точка-конъюгированных вторичных антител
- Аспират сера из камер тщательно, как описано выше, добавить 100 л на скважину буфера T-TBS (20 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, 0,05% Tween-20 в ddH2O скорректированы на рН 7,5 и фильтруется, могут быть получены коммерчески), и инкубировать в течение 5 минут на орбите шейкерна на орбитальной шейкере на орбите 100-250 об/мин. Повторите этот шаг мытья в общей сложности 3x (все последующие шаги мыть выполняются аналогичным образом).
- Приготовьте смесь вторичных антител, разбавленных до 1 мкм в блокирующем буфере и тщательно перемешайте путем пайпетирования до и во время использования для поддержания однородности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания воспроизводимости анализа, одна и та же партия каждого вторичного антитела должна быть использована для всех экспериментов зондирования, для которых количественное сравнение данных через эксперименты планируется. Специфическая концентрация вторичных антител может быть изменена в зависимости от сродства; следовать протоколам производителя, когда это возможно. - Аспир буфер из камер после окончательной стирки, добавить 100 л на хорошо вторичной смеси антитела, и инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре на шейкер.
- Аспирируете вторичную смесь антител смыть 3x с буфером T-TBS, а затем промыть один раз с буфером TBS (без Tween).
- Разбирайте микроаррей из камер тщательно, чтобы избежать касания прокладок, аккуратно промыть фильтром ddH2O и высушите, разместив в 50 мл трубки и центрифугирование на 500 х г в течение 10 мин.
- Поместите исследуемые слайды microarray в светонепроницаемую коробку и держите в шкафу для дешикатора при комнатной температуре для длительного хранения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен на срок до 1 недели в этой точке.
3. Количественная связывание антител к антигенам в микроаре
-
Визуализируйте слайды microarray и количественно определить интенсивность спотовой флуоресценции для измерения связывания антител
- Приобретайте изображения слайдов microarray с помощью портативного изображения со встроенным программным обеспечением.
- Во вкладке "Настройка Imager" выберите правильную конфигурацию слайда. Для этого исследования используйте 16-панельные слайды.
- Во вкладке «Управление изображением» выберите правильный флуоресцентный канал и отрегулируйте увеличение, время экспозиции и время приобретения в зависимости от реактивности сыпой для получения оптимальных изображений. Для этого исследования флуоресцентные каналы для IgA и IgG составляли 585 нм и 800 нм соответственно, а настройки изображения получили 50, время экспозиции 500 мс и время приобретения 1 с.
- Нажмите на Capture, чтобы начать процесс приобретения изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Microarray слайды могут быть повторно изображения в нескольких настройках без деградации сигнала до тех пор, как они хранятся темные и сухие. Другие системы визуализации могут быть использованы, если совместимы с слайдами.
- Обнаружить пятна массива с помощью сетки, ориентированные на основе фидуциальных маркеров и измерить интенсивность пятен, как медиана интенсивности пикселей минус фон измеряется вокруг пятен. Выполните этот алгоритм количественной оценки в пакете с помощью встроенного программного обеспечения imager, который использует файл .gal, построенный в шаге 1.2.2 для подключения интенсивности пятен к отдельным антигенам на каждом microarray.
- В панели файлов Info загрузите файл .gal, выбрав из папки на компьютере, и укажите папку, в которой должны быть сохранены выводные файлы анализа в разделе Параметры анализа.
- Во вкладке «Управление изображением» откройте одно из полученных изображений, подав имевещ, и выберите кнопку Auto в правом верхнем углу.
- В разделе Array Analysis в правом нижнем углу создайте фидуциальный шаблон по указанию программного обеспечения.
- Нажмите на анализпакета, выберите папку, которая содержит изображения, которые будут количественно, и выберите фидуциальный шаблон, который был создан на предыдущем этапе. Программное обеспечение анализирует каждое изображение и количественно интенсивность точек.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг будет генерировать файл .csv, содержащий пятно интенсивности количественной антител в каждом образце сыворотки, которые связываются с каждым отдельным антигеном на microarray, которые впоследствии могут быть манипулированы в электронной таблице манипуляции или анализа программного обеспечения.
- Анализ необработанных данных для сравнения связывания антител между антигенами и образцами сыворотки. Для этого исследования антитела IgA и IgG, измеренные как 585 нм и 800 нм флуоресцентных пятен интенсивности были сравнены во всех антигенов между 2 независимыми запусками эксперимента с использованием различных слайдов в разные дни, и корреляционный анализ был выполнен мера просказа воспроизводимости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для неочищенных белков, напечатанных в виде экспрессии смеси, анализ данных должен начинаться с фонового вычитания контроля ДНК.
- Приобретайте изображения слайдов microarray с помощью портативного изображения со встроенным программным обеспечением.
Representative Results
В качестве демонстрации протокола, базовые сыпи были анализированы от 16 человек в рамках перспективного когортного исследования студентов колледжа следуют для гриппа инфекции на вирусно-вирусной вакцины против гриппа microarray. Чтобы продемонстрировать воспроизводимость, эти образцы были исследованы дважды, на разных слайдах и в разные дни.
Для этого исследования очищенные противогриппозные антигены, содержащиеего 10 тегов, были получены от коммерческого поставщика (см. ТаблицуМатериалов) и сотрудников. Эти антигены включают 251 всего HA антигенов, с 63 шаровой головы доменов (HA1) и 186 полнометражных белков (HA0), в том числе 96 мономерных белков HA0 и 90 тримеризированных HA0 белков, содержащих слитые тримеризации ("foldon") домен23. Полный список антигенов и элементов управления, используемых в данном исследовании, включен в качестве дополнительного файла. Для этого исследования, вторичные антитела, используемые были козы анти-человека IgG сопряжены с квантовой точкой, испускающей на 800 нм (GAH-IgG-No800) и коза анти-человека IgA сопряжены с квантовой точкой, излучающей на 585 нм (GAH-IgA-585) для мультиплексного обнаружения IgG и IgA антител как показано на рисунке 3. IgG и IgA связываются с различными подтипами и молекулярными формами антигенов гриппа HA были сравнены для серы, полученной из описанной выше клинической когорты.
Полученная тепловая карта показана на рисунке 4 с графическим представлением на рисунке 5. В этих цифрах, только клинически значимые подтипы с высоким представлением на массиве помечены, чтобы сэкономить место, с "Я", обозначающий все остальные подтипы более высокого числа, и незначительные или менее хорошо представлены подтипы включены в соответствии с заказом (например, H2 между H1 и H3). Полный список штаммов и подтипов на массиве включен в качестве дополнительного файла. Эти данные свидетельствуют о том, что антитела к головной группе HA являются подтип-специфическими с ожидаемым большим количеством антител к клинически распространенным штаммам (H1N1, H3N2 и B) и низким количеством антител к другим штаммам. Тем не менее, антитела ко всему HA, который включает в себя домен стебля, являются более кросс-реактивными по подтипам, и этот эффект, как представляется, увеличивается, когда весь HA тримеретизирован. Этот результат не является неожиданным, так как весь HA включает в себя стволовые области, которая высоко сохраняется по подтипам. Таким образом, антитела к целым молекулам HA из неклинических подтипов (например, H5 и H7), вероятно, представляют собой антистволовые антитела, первоначально вырабатываемые против клинических подтипов (например, H1 и H3), которые перекрестно реагируют с стволовыми регионами других подтипов HA на массиве. Этот момент иллюстрирует важность включения как головной HA, так и целой молекулы HA на массиве, чтобы различать антитела к голове и стволовые области, которые показывают различные профили реактивности.
Ассес демонстрирует хорошую воспроизводимость через зондирующие трассы. Второй запуск показывает немного более низкие антитела IgG во всех штаммах, хотя картина между штаммами является последовательной. Это повсеместное небольшое снижение, вероятно, из-за вариативности партии к партии во вторичном антитела, который был изменен между работает для IgG, но не для IgA. Таким образом, как отмечается в протоколе, рекомендуется использовать одинаковую партию каждого вторичного антитела для любых экспериментов, между которыми планируется количественное сравнение. Если различные партии антител необходимы из-за большого количества образцов, которые будут протестированы, мы рекомендовали включить общие образцы между экспериментальными пробегами с различными партиями антител, чтобы обеспечить количественное сравнение с коррекцией.
Рисунок 1: Схема микроаррей белка. Каждый слайд содержит несколько колодок каждый с одним массивом, который состоит из сотен антигенов, напечатанных на пятна, расположенные в сетке, с каждым пятном, содержащим один антиген адсорбируется на трехмерной топографии поверхности нитроцеллюлозы, к которому антитела из сыворотки связаны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Схема гриппа антигена microarray печати и зондирования протокола. Слева направо, microarray печатается с помощью на нитроцеллюлозы покрытием слайды, которые используются для зонда сера для IgG и IgA антител с помощью квантовой точки конъюгированных вторичных антител, со слайдами, изображенными с помощью портативного изображения, и результаты проанализированы создать тепловую карту. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Процедура крепления зондирующей камеры к слайду microarray. От А до F, зондирующая камера помещается поверх слайда в правильной ориентации, прилагается к слайду с помощью горизонтальных зажимов по бокам, и помещается в зондирующий лоток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Репрезентативные результаты микроаррэя антигена гриппа. Тепловые карты представляют антиген-специфические ответы антител, с каждой строки, представляющих один антиген расположен молекулы, подтип, и деформации, и каждый столбец, представляющий зондирующий пробег одного образца, организованный изотипом антител и запустить (A, белый й 0, черный й 20000, красный й 40000 интенсивность флуоресценции). Подтипы антигена, включающая все подтипы гемагглютинина от 1 до 18 и все подтипы нейраминидаза от 1 до 10 расположены вертикально и помечены слева. Сравнение интенсивности флуоресценции между двумя трассами демонстрирует хорошую воспроизводимость полинейной регрессии для IgA (B) и IgG (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Хлеб антител сыворотки, измеренных на микроаре антигена гриппа. Сыворотка IgA (A) и IgG (B) сгруппированы по HA и NA молекулярных форм и подтипов, чтобы продемонстрировать высокую специфичность HA головной группы антител для клинических подтипов и высокой поперечной реактивности всего HA и тримеризированных целых антител HA с включения сталкового региона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительный файл: Список антигенов на микроаррей антигена гриппа. Содержимое отображается для всех 324 пятен на массиве, включая пробелы, фидуциалы, элементы управления (человеческие IgG и IgA и анти-человеческие IgG и IgA на 0,1 мг/мл и 0,3 мг/мл), а также антигены с информацией об источнике, молекулярной форме, подтипе и деформации. Аббревиазации являются следующими: для источника, Sino sino Biological Inc., FKL и Флориан Краммер лаборатории; для молекулярной формы, HA1 - голова HA, HA0 - целый HA, HA2 - стебель HA, NP - нуклеопротеин. Для антигенов, полученных из Sino Biological Inc., отображаются номера каталогов; для антигенов, полученных из лаборатории Краммер, антиген иди перечислены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Описанный здесь протокол микрогенов антигена гриппа адаптируется к любому проекту, который требует анализа реакции антител на многие антигены. Платформа microarray может быть использована с любым желаемым набором белковых антигенов, выраженных в любой системе, которая может достичь 0,1 мг/мл или более высокой урожайности с или без очистки, как ранее описано12. Если неочищенные белковые антигены (например, выраженные в транскрипции и переводческой системе in vitro) непосредственно используются для печати микроаррей, компоненты системы экспрессии белка (например, E. coli lysate) должны быть добавлены 1:10 к блокированию буфера, используемого для разбавления серы и контроля качества антител для того, чтобы блокировать любые антитела, направленные против этих компонентов. Конфигурации слайдов доступны с меньшим количеством больших колодок на каждом слайде для размещения большего количества антигенов на массиве. Для этого исследования мы использовали принтер MicroArray OmniGrid 100 GeneMachines, который использует булавки, которые непосредственно контактируют с поверхностью нитроцеллюлозы, чтобы определить пятна на массиве. В то время как этот принтер microarray больше не является коммерчески доступным, другие коммерчески доступные принтеры microarray могут быть использованы в этом протоколе, но могут потребовать пользовательских контактов (либо контактных, либо бесконтактных) и программного обеспечения и должны иметь достаточное разрешение точек и совместимость со слайдами и изображением. В зависимости от реактивности серы можно использовать разбавления с 1:50 до 1:400. Безысывороточный буфер может быть использован в качестве отрицательного контроля, в то время как моноклональные антитела, известные связываться с антигеном, могут быть использованы в качестве положительного контроля.
Пользователи должны быть осведомлены о нескольких проблемах, связанных с устранением неполадок. Цель проверки качества с использованием антител к его тегу состоит в том, чтобы проверить наличие каких-либо антигенов, для которых печать не увенчалась успехом. Любые пятна, которые постоянно дают низкий сигнал в проверке контроля качества нескольких массивов, вероятно, представляют собой недостаточное количество напечатанных антигенов. Возможные причины включают агрегацию или осадки или антиген ажиотажа в исходной пластине или плохой контакт между печатью штифт и microarray слайд из-за переменной толщины нитроцеллюлозы площадку. На данный момент мы не выполняем нормализацию ассеа на основе количественных результатов проверки контроля качества, учитывая, что обнаруженная связка анти-Его антител может зависеть от наличия этого тега, который зависит от трехмерной конформации для каждого антигена.
Микроаррей антигена гриппа предоставляет ряд преимуществ по сравнению с традиционными методами, такими как ELISA, и дополняет функциональные ассы, такие как HAI и MN. 16-падового белка microarray является образцом-щадящий технологии с потенциалом для измерения антител нескольких изотипов одновременно против примерно 300 антигенов из 1 зл. Количество антигенов может быть увеличено до тысячи за счет уменьшения количества колодок на слайды. Мультиплексированный ассеион также экономит время персонала и расходные ресурсы, учитывая, что сотни сыпок можно исследовать на антитела за 2 дня, а все материалы, кроме слайдов и реагентов, воспламеняются, поэтому не генерируют большое количество пластиковых отходов.
В то время как принтеры microarray не могут быть широко распространены, слайды microarray могут быть напечатаны в централизованном месте, а затем транспортированы конечному пользователю для зондирования. Единственным оборудованием, необходимым для зондирования, является недорогой и портативный изображение. Цель распространения этого протокола состоит в том, чтобы сделать использование этого метода более распространенным.
Основными ограничениями микрократа антигена гриппа являются неспособность охарактеризовать функцию и кинетику выявленных антител. Микроаррей обнаруживает поликлональный набор связывающих антител для каждого антигена. Эти антитела могут или не могут быть функциональными в нейтрализации вируса в HAI и MN анализы. Тем не менее, HAI и MN анализы требуют живой культуры вируса с связанной потребностью в специализированных учреждениях с высоким уровнем биобезопасности шкафы для тестирования на антитела против птичьего подтипов гриппа, в то время как белок microarray не связаны живой вирус компоненты, так что могут быть использованы в любой основной лаборатории. Что касается связывающей кинетики, то одно разбавление сыворотки, проверенной массивом, содержащей одну концентрацию каждого антигена, дает единую точку данных, которая представляет собой составное количество и сродство, суммированное по всем антителам, которые связываются с антигеном . Для полной устранения антиген-антитела связывающей кинетики, несколько концентраций антигена и / или серийных разбавления сыпок не требуется.
Несмотря на эти ограничения, микроаррей антигена гриппа является полезным инструментом для характеристики широты антител гриппа по всему антигенному ландшафту, который может дополнять функциональные анализы, которые являются более ограниченными по пропускной связи и доступности.
Disclosures
Авторы не раскрытии информации.
Acknowledgments
Авторы хотели бы признать профессора Дона Милтона (Институт прикладного общественного здравоохранения, Университет Штата Мэриленд, Колледж-Парк, MD, США) для сбора человеческой сыпи в соответствии с Университетом штата Мэриленд IRB протокол #313842 финансируется DARPA N66001-2-4015 P00001. Авторы также хотели бы отметить профессора Флориана Краммера (Icahn Школа медицины, Mt. Sinai, NY, США) за предоставление тримеризированных HA и NA антигенов, финансируемых ODNI IARPA DJF-15-1200-K-0001725. С. Хан частично поддерживается Национальным центром исследовательских ресурсов и Национальным центром продвижения трансляционных наук, Национальными институтами здравоохранения, через грант KL2 TR001416. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16-pad nitrocellulose-coated glass slides | Grace Bio Labs | 305016 | |
| 1x GVS FAST blocking buffer | Fischer Scientific | 10485356 | |
| ArrayCam portable imager | Grace Bio Labs | 400S | Other imaging devices can be used to visualize slides if capable of achieving the resolution of the microarray spots and the excitation and emission wavelengths of the quantum dots. |
| Biotin-conjugated goat anti-mouse-IgG antibody | Thermo Fischer | 31800 | |
| HiBase 384-well plate | Greiner Bio-One | T-3037-11 | |
| Microarray pins | ArrayIt | GMP2 | Each different microarray printer may require its own custom microarray pins. |
| Mouse monoclonal poly-His antibody | Sigma-Aldrich | H1029 | |
| OmniGrid 100 microarray printer | GeneMachines | The version of the microarray printer used in this work is no longer commercially available, but the updated similar equipment is the OmniGrid Accent microarray printer from Digilab (Hopkinton, MA), and the same protocol can be carried out with most commercially available microarray printers. | |
| ProPlate slide chambers | Grace Bio Labs | 246890 | |
| ProPlate slide clips | Grace Bio Labs | 204838 | |
| ProPlate slide frames | Grace Bio Labs | 246879 | |
| Quantum dot 585 nm conjugated goat anti-human-IgA antibody | Grace Bio Labs | 110620 | |
| Quantum dot 585 nm streptavidin conjugate | Thermo Fischer | Q10111MP | |
| Quantum dot 800 nm conjugated goat anti-human-IgG antibody | Grace Bio Labs | 110610 |
References
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2010).
- Renegar, K. B., Crouse, D., Floyd, R. A., Krueger, J. Progression of influenza viral infection through the murine respiratory tract: the protective role of sleep deprivation. Sleep. 23 (7), 859-863 (2000).
- Li, L., et al. Heterogeneity in Estimates of the Impact of Influenza on Population Mortality: A Systematic Review. American Journal of Epidemiology. 187 (2), 378-388 (2018).
- Fauci, A. S. Seasonal and pandemic influenza preparedness: science and countermeasures. Journal of Infectious Diseases. 194 Suppl 2, S73-S76 (2006).
- Duggal, A., Pinto, R., Rubenfeld, G., Fowler, R. A. Global Variability in Reported Mortality for Critical Illness during the 2009-10 Influenza A(H1N1) Pandemic: A Systematic Review and Meta-Regression to Guide Reporting of Outcomes during Disease Outbreaks. PLoS One. 11 (5), 2009-2010 (2016).
- Demicheli, V., Jefferson, T., Ferroni, E., Rivetti, A., Di Pietrantonj, C. Vaccines for preventing influenza in healthy adults. Cochrane Database Systematic Reviews. 2, CD001269 (2018).
- Erbelding, E. J., et al. A Universal Influenza Vaccine: The Strategic Plan for the National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Journal of Infectious Diseases. , (2018).
- Xie, H., et al. H3N2 Mismatch of 2014-15 Northern Hemisphere Influenza Vaccines and Head-to-head Comparison between Human and Ferret Antisera derived Antigenic Maps. Scientific Reports. 5, 15279 (2015).
- Tricco, A. C., et al. Comparing influenza vaccine efficacy against mismatched and matched strains: a systematic review and meta-analysis. BMC Medicine. 11, 153 (2013).
- Katz, J. M., Webster, R. G. Efficacy of inactivated influenza A virus (H3N2) vaccines grown in mammalian cells or embryonated eggs. Journal of Infectious Disease. 160 (2), 191-198 (1989).
- Zost, S. J., et al. Contemporary H3N2 influenza viruses have a glycosylation site that alters binding of antibodies elicited by egg-adapted vaccine strains. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (47), 12578-12583 (2017).
- Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (3), 547-552 (2005).
- Liang, L., Felgner, P. L. A systems biology approach for diagnostic and vaccine antigen discovery in tropical infectious diseases. Current Opinion in Infectious Diseases. 28 (5), 438-445 (2015).
- Jain, A., et al. Evaluation of quantum dot immunofluorescence and a digital CMOS imaging system as an alternative to conventional organic fluorescence dyes and laser scanning for quantifying protein microarrays. Proteomics. 16 (8), 1271-1279 (2016).
- Desbien, A. L., et al. Development of a high density hemagglutinin protein microarray to determine the breadth of influenza antibody responses. Biotechniques. 54 (6), 345-348 (2013).
- Mace, C. R., et al. Label-free, arrayed sensing of immune response to influenza antigens. Talanta. 83 (3), 1000-1005 (2011).
- Koopmans, M., et al. Profiling of humoral immune responses to influenza viruses by using protein microarray. Clinical and Microbiology Infections. 18 (8), 797-807 (2012).
- Bucukovski, J., Latorre-Margalef, N., Stallknecht, D. E., Miller, B. L. A Multiplex Label-Free Approach to Avian Influenza Surveillance and Serology. PLoS One. 10 (8), e0134484 (2015).
- Meade, P., Latorre-Margalef, N., Stallknecht, D. E., Krammer, F. Development of an influenza virus protein microarray to measure the humoral response to influenza virus infection in mallards. Emerging Microbes and Infection. 6 (12), e110 (2017).
- Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
- Nakajima, R., et al. Protein Microarray Analysis of the Specificity and Cross-Reactivity of Influenza Virus Hemagglutinin-Specific Antibodies. mSphere. 3 (6), (2018).
- Van Hoeven, N., et al. A Formulated TLR7/8 Agonist is a Flexible, Highly Potent and Effective Adjuvant for Pandemic Influenza Vaccines. Scientific Reports. 7, 46426 (2017).
- Krammer, F., et al. A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates. PLoS One. 7 (8), e43603 (2012).
