Summary
يقدم هنا بروتوكول لاستخدام نظام CRISPR-Cas9 للحد من إنتاج البروتين في الدماغ نحل العسل الكبار لاختبار خصوصية الأجسام المضادة.
Abstract
الكتلة بانتظام Interspaced يكرر Palindromic قصيرة (CRISPR)/CRISPR المرتبطة البروتين 9 (Cas9) هو أسلوب تحرير الجينات المستخدمة على نطاق واسع في دراسات وظيفة الجينات. نحن نستخدم هذه الطريقة في هذه الدراسة للتحقق من خصوصية الأجسام المضادة التي وضعت ضد الحشرة GABAA مستقبلات مقاومة subldrin (RDL) ومستقبلات الغلوتامات ميتابوتروبيك mGlutR1 (mGluRA). تم إنشاء الأجسام المضادة في الأرانب ضد الببتيدات المترافقة المحددة لذباب الفاكهة(Drosophila melanogaster)وكذلك لنحل العسل(أبيس mellifera). استخدمنا هذه الأجسام المضادة في أقسام الدماغ نحل العسل لدراسة توزيع المستقبلات في أدمغة نحل العسل. تم تنقية الأجسام المضادة ضد الببتيد واختبارها مع النبلة المناعية والطريقة الكلاسيكية للببتيد مع مترافقات الببتيد لإظهار أن الأجسام المضادة محددة لاقتران الببتيد المقابلة التي أثيرت ضدها. هنا قمنا بتطوير تقنية CRISPR-Cas9 لاختبار للحد من أهداف البروتين في الدماغ 48 ساعة بعد حقن CRISPR-Cas9 مع دليل الحمض النووي المصممة للمستقبلات المقابلة. يمكن أيضًا استخدام طريقة CRISPR-Cas9 في التحليلات السلوكية في النحل البالغ عندما تحتاج جينة واحدة أو عدة جينات إلى تعديل.
Introduction
نظام CRISPR/Cas9 الذي تم اكتشافه مؤخرًا هو أداة قوية تم استخدامها لتغيير الحمض النووي الجينومي في أنظمة النماذج والكائنات الحية المختلفة. وقد عجلت البحوث الطبية الحيوية والاختراقات التكنولوجية الكبرى من خلال جعل تعديل الجينوم أكثر كفاءة وقوة من الأساليب السابقة1. الأصلي إلى S. pyogenes البكتيريا، ونظام يعتمد على Endonuclease Cas9، الذي يؤدي النشاط إلى فواصل تقطعت بهم السبل مزدوجة (DSBs) في الحمض النووي، ورنا دليل (gRNA) الذي يوجه البروتين Cas9 إلى موقع محدد، تعتمد على تسلسل2. يمكن إصلاح الفواصل المزدوجة التي تم إنشاؤها بواسطة CRISPR/Cas9 عن طريق الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) ، وهي عملية عرضة للخطأ يمكن أن تؤدي إلى تحولات إطارية ، أو إصلاح مباشر للهومولوجيا عند وجود قالب متبرع. وgRNA نفسها تتكون من مجموعة محددة الهدف CRISPR RNA (crRNA) وإعادة تنشيط شامل (tracrRNA) والتي يمكن توليفها كيميائيا وتسليمها مع تنقية Cas9 nuclease كمركب ribonucleoprotein (RNP)2،3. يمكن وضع العلامات الفلورية من gRNA أو Cas9 nuclease تسمح للكشف والتصور داخل الخلايا من المكونات الجزيئية عن طريق المجهر الفلوري4.
في عملنا الحالي، نستفيد من نظام CRISPR-Cas9 لتقليل مستويات البروتين في أدمغة نحل العسل البالغين. درسنا مستقبلات الغلوتامات الميتاتروبيك (mGluR) ومكافحة mGlutR1 مستقبلات الأجسام المضادة وGABAA مستقبلات الفرعية RDL والأجسام المضادة RDL. طورنا طريقة بسيطة لتقليل كمية البروتين في دماغ نحل العسل البالغ واستخدمناه لدفع اختبارات إضافية للأجسام المضادة التي تم تطويرها ضد البروتينات المقابلة. رصد مضان كريسبر-كاس9 سمح لنا بتقدير المناطق والخلايا المشاركة في الحد من البروتين.
باستخدام هذه الطريقة ، قمنا أيضًا بتوصيف الأجسام المضادة لـ mGlutR1 التي تم صنعها في الأرانب ضد الببتيد المترافق. الجينوم نحل العسل ترميز AmGlura حفظ عالية (اسمه mGlutR1 وفقا لتسمية NCBI) مستقبلات الغلوتامات المستقلب5. يحتوي جين نحل العسل mGlutR1 على أربعة متغيرات توقع لصق وفقا لقاعدة بيانات NCBI. وقد أفيد أنه يتم التعبير عنها في الجهاز العصبي المركزي (CNS) من كل من مراحل النحل pupal والكبار وتشارك في تكوين الذاكرة على المدى الطويل5. الأجسام المضادة التي وضعت ضد mGlutR1 يمكن أن تكون أداة أساسية لدراسة نظام الجلوتامات في عملية التعلم والذاكرة في نحل العسل.
في دراساتنا، كما تميزنا الأجسام المضادة RDL المتقدمة في الأرانب المحصنة مع الببتيدات مترافقة من apis mellifera RDL مستقبلات الوحدة الفرعية. جين نحل العسل Rdl، AmRdl (XM_006565102.3، قاعدة بيانات NCBI)، وقد 14 المتغيرات لصق المتوقعة. تم الإبلاغ عن جزء مستنسخ جزئيًا في قاعدة بيانات NCBI AF094822.1. تتم دراسة وظيفة مستقبلات RDL وعلم وظائف الأعضاء بشكل جيد في الحشرات6،7،8، بما في ذلك نحل العسل9،10،11. يمكن أن تكون الأجسام المضادة التي تم تطويرها ضد مضادات RDL أداة أساسية لدراسة نظام GABAergic في عملية التعلم والذاكرة في نحل العسل.
دراسة سابقة عن دور أوكتوبامين ومستقبلات الثيامين المستخدمة RNAi حقنها في الدماغ مع اختبار لاحق لكمية البروتين من قبل لطخة الغربية12,13. ومع ذلك ، RNAi لديها بعض القيود الهامة. هناك فقط فترة زمنية قصيرة بعد حقن RNAi التي يحدث فيها انخفاض البروتين13. تم استخدام CRISPR-Cas9 مؤخرًا في أجنة نحل العسل لحذف أو تعديل الجينات في الحيوان بأكمله14،15،16. أبلغنا عن استخدام CRISPR-Cas9 لتقليل كمية البروتين في نحل العسل البالغ. طورنا هذا النهج لنحل العسل بسبب القدرة على الزوجان من الدراسات السلوكية للتعلم والذاكرة في ظل ظروف المختبر الخاضعة للرقابة17.
في العمل الحالي ، قمنا بتطوير أجسام مضادة ضد اثنين من المستقبلات واختبرناها على أقسام الدماغ نحل العسل الكبار بعد أن تم تخفيض البروتين عن طريق حقن CRISPR-Cas9. وفي الوقت نفسه، أنشأنا تصميمًا تجريبيًا يسمح باستخدام الطريقة للتجارب السلوكية.
Protocol
البروتوكول الموصوف هنا يتبع المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات من جامعة ولاية أريزونا.
1. مجموع عزل البروتين من أدمغة أبيس mellifera
ملاحظة: استخدام Apis mellifera العالم الجديد كارنيولان الآكلون من عمر غير معروف لهذه التجربة.
- ضع شاشة شبكة من الألومنيوم فوق مدخل الخلية لالتقاط النحل المزور17. التقاط كل النحلة في قارورة مع ثقب صغير في كل غطاء. وضع قوارير تحتوي على النحل في الجليد لخفض درجة حرارة الجسم وشل حركتها. ترك النحل في الجليد لمدة لا تزيد عن 3 دقيقة.
- تأمين النحل الجمود في أصحاب المعادن المعدة سابقا. تأكد من أن يتم بناء أصحاب المعادن بحيث يمكن تأمين النحل مع قطع صغيرة من الشريط اللاصق، ولكن لا يزال لديها الصدر الخلفي، وأجنحة، والرأس يتعرض.
تنبيه: تأكد من أن النحل معطل بالكامل قبل محاولة وضعه في أصحاب. - إطعام النحل مع محلول السكروز 1 M باستخدام حقنة 5 مل حتى أنهم لم يعودوا جائعين. ضع النحل المضمون في صندوق مع منشفة ورقية مبللة لضمان بيئة رطبة.
- تشريح الدماغ النحل بسرعة عن طريق قطع الرأس مع مقص الباراكير إيريس (انظر جدول المواد)واستخدام مقص لفتح الرأس من الجبهة.
- قطع الدماغ من كبسولة الرأس، واتخاذ الدماغ مع ملقط #5، ووضعه في 100 ميكرولتر من البرد (4-8 درجة مئوية) العازلة. ويتكون المخزن المؤقت للانليس من 120 mM Tris-HCl، 2% كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS), 5% الجلسرين, 0.2 mM dithiothreitol, 1% تريتون X-100, و 1-5 ميكروغرام/مل من مثبطات البروتياز PMSF (phenylmethylsulphonylfolride), أبروتينين, البنزين (pH 6.8) عند 4 درجات مئوية. تجانس الدماغ في محلول الانحلال عن طريق تحويل في الحشرات لحوالي 2 دقيقة.
- الطرد المركزي العينة في 12،000 ز لمدة 20 دقيقة تستنشق 90 ميكرولتر من supernatant والتخلص من بيليه.
- خذ 1 ميكرولتر من الـ supernatant لكميات البروتين الكلي باستخدام مقياس الفلور. وكان التركيز التقريبي للبروتين الكلي بين 2-3 ملغ/مل لكل النحلة. خذ 10 ميكرولتر من السوبرناستان وإضافة 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للانليس و 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت 6x Laemmli18. تدور لفترة وجيزة ويغلي لمدة 3 دقيقة، ثم تبرد على الجليد. تدور لمدة 1 دقيقة في 10،000 × ز لإزالة جميع الحطام. عُشر دماغ النحل يحتوي على حوالي 25 نانوغرام من إجمالي البروتين.
2. الغربية النشاف19
- جعل 30 مل من 10٪ هلام تشغيل تحتوي على 12.15 مل من الماء المقطر فائقة النقاء، 7.5 مل من 1.5 M Tris-HCl (درجة الحموضة 8.8)، 0.3 مل من 10٪ SDS، 10 مل من 30٪ محلول الأكريلاميد-بيس الأكريلاميد، 0.15 مل من 10٪ من كبريتات الأمونيوم (APS)، و 20 ميكرولتر من رباعي ميثيل ميثيل الإيثيلينديامين (TEMED ).
- يلقي الجل بين اثنين من لوحات الزجاج مفصولة الفواصل.
- جعل 20 مل التراص هلام يحتوي على 12.1 مل من الماء المقطر فائقة النقاء، 5.0 مل من 0.5 M تريس-HCl (درجة الحموضة 6.8)، 0.2 مل من 10٪ SDS، 2.6 مل من الأكريل-بيس أكريلاميد، 0.1 مل من 10٪ APS، و 20 μL من TEMED.
- عندما الهلام قيد التشغيل solidifies صب هلام التراص. إضافة بعناية فاصل البلاستيك ليلقي حارة التحميل، وتجنب فقاعات. انتظر 15-30 دقيقة، حتى يتم ترسيخ الجل.
- بدء تحميل الجل باستخدام 5 ميكرولتر من معايير البروتين. تحميل 20 ميكرولتر من خليط ليسات من الخطوة 1.8 لكل حارة، المقابلة ل ~ 1/15 من دماغ النحل أو ~ 16 نانوغرام من البروتين الكلي لكل حارة. تشغيل العينات لمجموع 3.5-4 ح في 16 mA في هلام التراص و 32 مالا في هلام قيد التشغيل. توقف عندما تترك الصبغة الجل.
- نقل البروتينات على أغشية النيتروسليلوز في نقل العازلة (25 mM تريس-HCl، 192 mM الجليسين، 15٪ الميثانول) في 0.45 mA لمدة 1 ساعة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية.
- لتقييم كفاءة نقل البروتين بعد SDS-PAGE قبل التنبل المناعي، أضف محلول تلطيخ Ponceau S (أضف 0.1 غرام من Ponceau S و 5 مل من حمض الخليك إلى الماء إلى حجم نهائي يبلغ 100 مل). يُحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة ويشطف بسرعة بالماء المقطر.
- تسمية كل حارة مع قلم الكرة، وقطع الغشاء الذي يحتوي على اثنين من الممرات مع تجانس الدماغ وحارة واحدة مع علامة البروتين ووضع كل في مربع احتضان لطخة الغربية. غسل 3x لمدة 5 دقيقة لكل من الفوسفات المالحة العازلة (PBS) التي تحتوي على 0.1٪ توين 20 (PBS-Tw).
- قم بسد الغشاء مع 10٪ NGS (1 مل من مصل الماعز العادي إلى 10 مل من PBS-Tw) في مربع حضانة لطخة غربية لمدة 1 ساعة. جعل تخفيف mGlutR1 المضادة (5 μL من الأجسام المضادة في 10 مل من 10٪ NGS). جعل المضادة RDL1 والمضادة RDL2 المخففات (5 ميكرولتر من الأجسام المضادة في 10 مل من 10٪ NGS لكل منهما). استبدال حل الحجب في كل مربع مع الأجسام المضادة المخففة وترك بين عشية وضحاها (16-24 ساعة) في 4 درجة مئوية.
- غسل الغشاء 3x لمدة 5 دقيقة لكل في PBS-Tw. احتضان الغشاء مع المضادة للأرنب IgG HRP-الاقتران الأجسام المضادة الثانوية في 1:10,000 في 10% NGS PBS-Tw ل2 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT). غسل الأغشية 3x في PBS-Tw، ثم 1x في برنامج تلفزيوني.
- الكشف عن العصابات باستخدام الركيزة HRP chemiluminescent الغربية. مزيج اثنين من ركائز 1:1 (v / v) في RT، ووضع جميع الأغشية في نفس المربع وتغطيتها مع مزيج الركيزة لمدة 2 دقيقة (في غرفة مظلمة مع الضوء الأحمر) في RT. المضي قدما في الكشف عن البروتين باستخدام فيلم التصوير الشعاعي للخرائط مع عدة مرات التعرض. عادة ما يتم اختبار جسم مضاد واحد على غشاء واحد يحتوي على نفس تخفيف تجانس الدماغ على اثنين أو ثلاثة حارات وممر واحد مع علامة الوزن.
3. الإجراءات الكيميائية المناعية
- لتشريح أدمغة نحل العسل لكيمياء المناعة، شل نحل العسل في الجليد لمدة 30 s. بعد أن يتم شل النحل، وقطع رأس النحل مع مقص ووضع الرأس في حل من 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني. العمل تحت غطاء الدخان.
تنبيه: يجب التخلص من الجسم بعناية لأن البطن لا يزال يلسع بعد قطع الرأس. - بعناية ولكن بسرعة إزالة الهوائيات، والعيون المركبة، وقطع في جميع أنحاء الهيكل الخارجي العلوي مع مقص الباراكير إيريس. السماح للرؤساء للالجلوس في الحل المثبت لمدة 10 دقائق. إزالة ما تبقى من الهيكل الخارجي للرأس وقطع جميع القصبة الهوائية المتبقية.
- ضع كل دماغ في أنبوب طرد مركزي صغير 1.5 مل يحتوي على ما لا يقل عن 1 مل من محلول بارافورمالديهايد بنسبة 4٪ واتركه بين عشية وضحاها عند 4-8 درجة مئوية.
- جعل 7.6٪ أغروس حل عن طريق خلط 3.8 غرام من agarose و 50 مل من الماء المقطر في قارورة Erlenmeyer. الميكروويف الحل حتى liquifies agarose.
ملاحظة: يمكن وضع قطعة صغيرة من ورق الأنسجة في فتحة القارورة من أجل منع محلول الأغروس من الفيضان أثناء التدفئة. - ضع أدمغة نحل العسل الثابتة (3-4 أدمغة) في طبق بيتري مقاس 35 مم وإزالة المثبت الزائد بورق الأنسجة. صب محلول الأروز السائل على العقول. توجيه العقول في أغاروز بحيث الفصوص الهوائي تواجه لأعلى. السماح للagarose لتبرد وترسيخ.
- بعد أن توطد الأغروس، قطع كتل من أغاروز كل تحتوي على الدماغ.
- للتشريح الهزاز، وإعداد لوحة 24 جيدا مع كل بئر تحتوي على سلة مع شبكة مسعور في الجزء السفلي. ملء كل بئر مع 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
- قطع كل كتلة إلى 70 ميكرومتر المقطع العرضي باستخدام آلة الهزاز ووضع المقاطع في سلة تحتوي على برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: تأكد من وضع مقاطع من نفس الدماغ في نفس السلة. - غسل أقسام الدماغ 6x لمدة 10 دقيقة مع كل من PBS-TX لضمان عدم وجود مثبت في المقاطع. ضع لوحة multiwell على شاكر مداري واغسل الأدمغة عند 210 دورة في الدقيقة. قبل كل غسل تأكد من استبدال حل PBS-TX بحل PBS-TX الطازج. كتلة مع 1٪ مصل حمار عادي خلال غسل الماضي.
- لاختبار الأجسام المضادة المضادة mGlutR1 المضادة الأولية، وإعداد تخفيف 1:112 من الأجسام المضادة لmGlutR1 المضادة عن طريق إضافة 9 مل من PBS-TX إلى 80 ميكرولتر من الأجسام المضادة لmGlutR1 في أنبوب طرد مركزي 15 مل. دوامة أنبوب لفترة وجيزة لخلط جيدا. تم تحديد تخفيف العمل من الأجسام المضادة في التجارب الأولية.
- لاختبار الأجسام المضادة المضادة لـ RDL الأولية، قم بإعداد تخفيف 1:100 من الأجسام المضادة لـ RDL عن طريق إضافة 30 ميكرولتر من الببتيد المضاد RDL 1، و 30 ميكرولتر من الببتيد المضاد RDL 2، و 6 مل من PBS-TX في أنبوب طرد مركزي 15 مل. دوامة أنبوب لفترة وجيزة لخلط جيدا. تم تحديد تخفيف العمل من الأجسام المضادة في التجارب الأولية.
- إضافة 800 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة إلى كل بئر في اللوحة. تغطية لوحة متعددة الآبار والتفاف عليه في رقائق الألومنيوم لمنع تدهور من التعرض للضوء. وضع لوحة ملفوفة في رقائق الألومنيوم على شاكر المداريويهز في 210 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة. ثم ترك بين عشية وضحاها في RT دون اهتزاز.
- بعد أن تركت أقسام الدماغ بين عشية وضحاها، وغسل مع برنامج تلفزيوني-TX لمدة 10 دقيقة. كرر خطوة الغسيل 6x.
- إعداد الأجسام المضادة الثانوية (المضادة للأرنب من الحمار) عن طريق جعل تخفيف 1:225 من الأجسام المضادة الثانوية عن طريق إضافة 40 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية إلى 9 مل من PBS-TX.
- أضف 800 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة الثانوية إلى كل بئر. تغطية لوحة والتفاف عليه في رقائق الألومنيوم. وضع لوحة ملفوفة في رقائق الألومنيوم على شاكر المداري ويهز في 210 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة. ثم اتركه بين عشية وضحاها في RT.
- غسل أقسام الدماغ 3x لمدة 10 دقيقة مع كل من PBS-TX و 3x مع محلول PBS العادية.
- لتضمين المقاطع في الشرائح ، وإعداد وسائل الإعلام المتصاعدة / الجلسرول تضمين الحل المعدلة من رودريغيز وآخرون20. أضف 5 غرام من وسط التركيب في 20 مل PBS ويحرك لمدة 16 ساعة مع التحريك المغناطيسي. أضف 10 مل من الجلسرين وحرك لمدة 16 ساعة أخرى مع محرّك مغناطيسي. الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 4000 × ز، واتخاذ supernatant متجانسة السائل ، وaliquot في أنابيب 1 مل. حافظ على درجة الحرارة -20 درجة مئوية
- قم بتضمين المقاطع على الشرائح مع قطرة من الوسط المتصاعد المعدة في الخطوة 3.17، مع التأكد من أن كل شريحة تحتوي على مقاطع من دماغ واحد.
- التحكم المسبق في المناعة مع الببتيدات المترافقة
- لمكافحة RDL والببتيدات مترافقة، احتضان تخفيف العمل من الأجسام المضادة لRDL مع الببتيد المقابلة اقتران بين عشية وضحاها في RT على شاكر: حالة 1) 500 ميكروغرام الببتيد مترافق مع ثقب مفتاح ليمبيت هيموشيانين (KLH) عبر الجلوتارالدهيد; الشرط 2) دون أي اقتران.
- الطرد المركزي كل خليط لمدة 10 دقيقة في 10،000 × ز وجمع supernatant من كلا الشرطين (الخطوة 3.19.1).
- احتضان المقاطع التسلسلية من الدماغ نحل العسل مع كل supernatant وعملية مع الأجسام المضادة الثانوية المذكورة أعلاه. المقاطع التسلسلية هي الأقسام التي تتبع بعضها البعض خلال إجراءات قسمة الهزاز ، لذلك سيتعرض نفس الجزء من الدماغ لضوابط إيجابية وسلبية.
- لمكافحة mGlutR1 والببتيد مترافق، احتضان تخفيف العمل من الأجسام المضادة mGlutR1 في RT مع الببتيد مترافق KLH التي تحتوي على الببتيد10-4 م (الشرط 1) ودون أي اقتران (شرط 2).
- الطرد المركزي كل خليط لمدة 10 دقيقة في 10،000 × ز وجمع supernatant من كل من الضوابط.
- احتضان المقاطع التسلسلية من الدماغ نحل العسل مع supernatant من كل من الشروط وعملية مع الأجسام المضادة الثانوية (الخطوات 3.14-3.15).
- تضمين المقاطع من كلا الشرطين على الشريحة باستخدام وسائط التضمين (الخطوة 3.17).
4. اختبار RDL وmGlutR1 التعبير البروتين من قبل الكيمياء المناعية (القسم 3) في الدماغ نحل العسل بعد حقن نظام CRISPR-Cas9 المقابلة
- تصميم الأدلة باستخدام أداة تصميم CRISPR-Cas9 عبر الإنترنت21 باستخدام تسلسل الحمض النووي الجينومي لـ AmRdl (XM_006565102.3) وتسلسل mGlutR1 (XM_006566244.3)(الجدول 1). النظام كما Cas9 crRNA وكاس-9 tracrRNA مع صبغة الفلورسنت ATTO550 في نهاية 5'. اطلب Cas9 Nuclease V3 (انظر جدول المواد).
- قم بإعداد المكونات لنظام CRISPR-Cas 9 عن طريق صنع مخزون 100 ميكرومتر لكل دليل crRNA و tracrRNA باستخدام المياه الخالية من nuclease. Aliquot وتخزينها في -20 درجة مئوية. إعداد تركيز العمل من محلول Cas-9 بإضافة 2.5 ميكرولتر من Cas 9 nuclease V3 (10 ملغم/مل) إلى 47.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت الخالي من النيوكليوتيدات للحصول على تركيز نهائي قدره 0.5 ميكروغرام/ميكرولتر.
- إعداد تشكيل gRNA المعقدة لكل دليل RNA بشكل منفصل (دليل RNA:tracrRNAATTO550)
- قم بتسمية أنبوب اختبار يحمل اسم gRNA، أضف 92 ميكرولتر من المخزن المؤقت الخالي من النيوكليوتيدات، 4 ميكرولتر من 100 ميكرومتر كريسبر-كاس9 tracrRNA- 5'ATTO550، و 4 ميكرولتر من دليل محلول crRNA. تخلط بلطف وتدور.
ملاحظة: مثال على وضع العلامات من أنابيب gRNA لRDL: GRDL1، GRDL2، GRDL3 (المقابلة لأدلة RDL RNA في الجدول 1). مثال على وضع العلامات على أنابيب gRNA لmGlutR1: GMGL1، GMGL2، GMGL3(الجدول 1). - سخني المحلول إلى 95 درجة مئوية لمدة 5 سنوات لإنشاء gRNA. يُبرّد المزيج في RT لمدة 10 دقيقة.
- قم بتسمية أنبوب اختبار يحمل اسم gRNA، أضف 92 ميكرولتر من المخزن المؤقت الخالي من النيوكليوتيدات، 4 ميكرولتر من 100 ميكرومتر كريسبر-كاس9 tracrRNA- 5'ATTO550، و 4 ميكرولتر من دليل محلول crRNA. تخلط بلطف وتدور.
- إعداد تشكيل RNP المعقدة (gRNA: S.p Cas9Nuclease)، وخلائط التسليم، والسيطرة.
- قم بتسمية أنبوب اختبار باسم RNP، أضف 6 ميكرولتر من محلول gRNA و6 ميكرولتر من 0.5 ميكروغرام/ميكرولتر S.p Cas9 Nuclease V3. مزيج بلطف واحتضان الحلول في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة قبل الحقن.
ملاحظة: مثال تسميات أنبوب RNP: RRDL1، RRDL2، RRDL3. - جعل RNPRDLmix. لإعداد الخليط النهائي المستخدم للحقن، إضافة 4 ميكرولتر من كل RNP من RDL معا. مزيج RNP/RDL = 4 μL RRDL1 + 4 μL RRDL + 4 μL RRDL3.
- جعل RNPmGlutR1mix. مزيج 4 μL من كل RNP من mGlutR1 معا لإعداد الخليط النهائي المستخدمة للحقن (RNPmGlutR1mix) = 4 μL RMG1 + 4 μL RMG2 + 4 μL RMG3.
ملاحظة: مثال تسميات أنبوب RNP: RMG1، RMG2، RMG3. - جعل حل noguideRNA التحكم عن طريق خلط 4 ميكرولتر من tracrRNA، 92 ميكرولتر من العازلة، و 4 ميكرولتر من الماء بدلا من guideRNA (انظر القسم 4.3). مزيج 6 ميكرولتر من هذا الحل noguideRNA و 6 μL من 0.5 ميكروغرام / μL Cas9 Nuclease V3 (الخطوة 4.4.1) لإنتاج محلول حقن التحكم.
- قم بتسمية أنبوب اختبار باسم RNP، أضف 6 ميكرولتر من محلول gRNA و6 ميكرولتر من 0.5 ميكروغرام/ميكرولتر S.p Cas9 Nuclease V3. مزيج بلطف واحتضان الحلول في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة قبل الحقن.
5. حقن الإجراء
- شل كل النحل ة كما هو موضح في الخطوة 1.3 وإطعامهم كما في الخطوة 1.4. بعد ذلك ، قم بإعداد مجموعتين من صندوقين خشبيين لتحرير النحل بعد الحقن: صندوق أبيض (حالة تجريبية) وصندوق أسود (تحكم). يجب أن يحتوي كل صندوق على مشط صغير وطبق بيتري تغذية. يرصد جانب واحد من كل مربع من الزجاج للسماح للمراقبة.
- جعل تغذية أطباق بيتري. تأخذ غطاء من طبق بيتري 35 ملم، ووضع الشمع داخل السطح، ووضع الجزء السفلي من طبق بيتري على الشمع. أمّن اللوحة في الصندوق.
- باستخدام حقنة 5 مل، حقن محلول السكروز 1M بين الغطاء والجزء السفلي من الطبق. النحل يمكن أن تضع بسرعة خرطومها بين الطبقتين وسوف تبقى جافة لفترة حضانة 48 ساعة. وضع طبق واحد في كل مربع.
- لإعداد نظام الحقن المجهري، ملء الشعيرات الدموية مع الزيوت المعدنية دون أي فقاعات الهواء. ضع الشعيرات الدموية في حامل حاقن نظام الحقن المجهري. لتحميل الشعيرات الدموية مع حل الحقن المطلوب، ضع فيلم مسعور على سطح مستو، وpipette الحل على ذلك. حقن النفط من الشعيرات الدموية واستبدال الخليط مع مزيج RNP المقابلة.
- باستخدام نظام الحقن المجهري، حقن 345 nL من محلول خليط RNP مباشرة في ocelli كل النحلة المتوسط.
- لحقن RDL-CRISPR-Cas9، حقن ثمانية النحل مع RNPRDLmix أعدت على النحو المبين في الخطوة 4.4.2. إطعامهم 1M السكروز بعد الحقن. الإفراج عنهم في مربع أبيض (تجريبي) مع مشط صغير وتغذية طبق بيتري لمدة 48 ساعة. استخدام ثمانية أخرى النحل كضوابط دون أي حقن، وإطعامهم، والإفراج عنهم في مربع أسود (التحكم).
- لmGlutR1 CRISPR-Cas9، حقن تسعة النحل مع RNPmGlutR1mix أعدت على النحو المبين في الخطوة 4.4.3. للتحكم في حقن ثمانية نالمع خليط الحمض النووي الريبي بدون دليل (RNAmix_noguide) أعدت على النحو المبين في الخطوة 4.4.4. إطعامهم 1M السكروز بعد الحقن. إطلاق النحل من أصحابها في الصندوق الأبيض (حالة تجريبية) أو الصندوق الأسود (التحكم) أعدت على النحو المبين في القسم 5.1.
- وضع صناديق في وعاء البوليسترين مع ورقة مبللة داخل للرطوبة. ترك النحل لمدة 48 ساعة ومراقبة 2x يوميا للتأكد من أن لديهم ما يكفي من الطعام والرطوبة جيدة.
- تشريح الدماغ من كل النحل بعد 48 ح (الخطوة 3.1) وعملية للكيمياء المناعية كما هو موضح في القسم 3. لمضادات mGlutR1 المناعة استخدام الخطوة 3.11 والمضادة لـ RDL المناعة استخدام الخطوة 3.12.
- إجراء التصوير البؤري لتقييم مستوى الفلورسة في أقسام الدماغ الملطخة بالمناعة.
- لتقييم انخفاض البروتين في الأدمغة المسماة بالمناعة، استخدم جمع الصور المعتمة على نفس المستوى من الكسب لكل من التحكم والأدمغة المحقونة.
6. qPCR المستندة إلى الإنزال فحص لتقييم تعديل الجينوم RDL الحمض النووي 48 H بعد CRISPR Cas9 RNPRDLmix حقن
- تصميم التمهيديات، والتحقيق التحكم، والتحقيق المنسدلة لتقييم كمية الحمض النووي المعدلة عن طريق حقن CRISPR-Cas9. تم تصميم كل التمهيدي بحيث يحيط واحد على الأقل كريسبر كاس 9 دليل وحجم amplicon هو 132 bp. وفيما يلي الكبيرات والمسابير المستخدمة:
RDL1_For: CTCGGAGTGACCACCGT
RDL1_Rev: CAACGAGGCGAACACCAT
RDL1_control_probe: /5HEX/CGA+C+G+TTT+A+C+CT/3IAbkfq/
RDL1_Drop-off_probe: /56-FAM/CCTA+C+G+T+CA+A+GT/3IAbkfq/- تأكد من أن الالتمهيديات تتوافق مع التسلسلات الفريدة الخاصة بالمنطقة. تأكد من أن مسبار الإنزال مصمم للمنطقة التي تتداخل مع دليل RDL-CRISPR-Cas9.
- لاختبار ما إذا كان هناك تعديل لgDNA في منطقة الدليل، حقن 12 النحل في أوتشيلي مع مزيج RNP_RDL وصفها في الخطوة 5.3.1 واستخدام ثمانية النحل غير حقن كضوابط.
- تشريح أدمغة النحل دون الفصوص البصرية 48 ساعة بعد الحقن واستخراج gDNA من كل حقن والسيطرة على أدمغة النحل (دون فصوص بصرية) باستخدام عدة بعد بروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
- تقييم كمية ونوعية ونقاء الحمض النووي المستخرج باستخدام مطياف ضوئي.
- قم بتحديد التعبير النسبي لـ gDNA المعدلة من AmRDL باستخدام بروتوكول الإنزال المستند إلى qPCR ودورة PCR في الوقت الفعلي.
- إعادة تعليق oligos إلى 100 ميكرومتر، تمييع الكبيات إلى 10 ميكرومتر، والمسابير إلى 5 ميكرومتر.
- إعداد تفاعل PCR في لوحة بئر 96 كما هو موضح هنا لعينة واحدة من gDNA (3 تكرار): 10 ميكرولتر من المزيج الرئيسي (انظر جدول المواد)،1 μL من التمهيدي إلى الأمام، 1 μL من التمهيدي العكسي، 1 μL من مسبار التحكم، 1 μL من التحقيق الإنزال، 2 μL من gDNA (50 نانوغرام)، 4 μL من المياه خالية من nuclease لجلب حجم التفاعل النهائي إلى 20 μL
ملاحظة: عناصر التحكم هي الحل بدلاً من العينات والمياه بدلاً من المسابير. - إعداد برنامج ركوب الدراجات على النحو التالي لدورة PCR في الوقت الحقيقي: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقيقة تليها 40 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 15 ث، 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
- تقييم تعديل الجينات النسبية باستخدام طريقة 2-ΟCtCt ، حيث
و
و
7. القياس الكمي النسبي للRDL RNA 48 H بعد حقن RNPRDLmix
- لاختبار ما إذا كان هناك انخفاض في مرنا RDL، حقن 20 النحل في أوتشيلي مع مزيج RNP_RDL كما هو موضح في الخطوة 5.3.1 واستخدام 12 النحل غير المحقونة والضوابط. تشريح أدمغة النحل (بدون فصوص بصرية) 48 ساعة بعد الحقن ، واستخراج إجمالي مرنا من كل النحلة المحقونة ، وفصل باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
- إزالة أي بقايا الحمض النووي المتبقية في العينة باستخدام مجموعة خالية من الحمض النووي (انظر جدول المواد).
- تقييم جودة ونقاء الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام مطياف ضوئي.
- قم بتحديد تعبير AmRDL باستخدام مجموعة RT-PCR الفلورية المتاحة تجاريًا(جدول المواد)على جهاز تدوير PCR في الوقت الفعلي باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة للوحة بئر 384.
ملاحظة: في هذه التجربة، تم استخدام الكبيات المنشورة مسبقاً. بالنسبة لـ AmRDL (AmRDL_F GGTCGATGGGTGTTACTACCTG؛ AmRDL_R TCGATCGACTTGACGTAGGA)22 والتمهيديات actin كجين مرجعي [AmActin_F TGCCAACACTGTCCTTTCtG; AmActin_R GAATTGACCCACCAATCCAATCCA]23. تم حساب التعبير الجيني النسبي باستخدام طريقة2-ΟΟCt (الخطوة 6.6).
8. qPCR القائم على إسقاط فحص لتقييم الحمض النووي الجينوم المعدلة 48 H بعد حقن RNPmGlutR1mix
- تصميم الكبيرات، والتحكم، وتحقيقات الإنزال لتقييم كمية الحمض النووي المعدلة عن طريق حقن CRISPR-Cas9. تصميم التمهيديات بحيث أنها تحيط واحد على الأقل كريسبر كاس 9 دليل وحجم amplicon هو 96 نقطة أساس.
mGlutR1_For: GGTGAAACGAACGACGGA
AmGlurR1_Rev: GGAGAGAGGGAGCGAGAA
AmGlurR1_control_probe: /5HEX/CGAGG+G+AAA+CGA+GT/3iAbkfq/
AmGlurR1_Drop-off_probe: /56-FAM/CGA+C+A+C+CG+TC/3IAbkfq/
ملاحظة: تأكد من أن الالتمهيديات تتوافق مع تسلسلات فريدة خاصة بالمنطقة التي يجب تعديلها. تم تصميم مسبار الإنزال للمنطقة التي تداخلت مع دليل CRISPR-Cas9. - لاختبار ما إذا كان هناك تعديل لgDNA في منطقة الدليل، حقن 12 النحل في أوتشيلي مع مزيج RNP_ GlutR1 كما هو موضح في الخطوة 5.3.1 واستخدام ثمانية النحل غير حقن كضوابط.
- تشريح أدمغة النحل (بدون فصوص بصرية) 48 ساعة بعد الحقن واستخراج الحمض النووي من كل حقن والسيطرة على دماغ النحل (بدون فصوص بصرية) باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
- تقييم كمية ونوعية ونقاء الحمض النووي المستخرج باستخدام مطياف ضوئي.
- قم بتحديد التعديل النسبي لـ gDNA AmGlutR1 باستخدام بروتوكول الإنزال qPCR ودورة PCR في الوقت الحقيقي كما هو موضح في الخطوة 6.5.
- تقييم تعديل الجينات النسبية باستخدام طريقة 2-ΟCtCt ، حيث
و
و
9. quantification mGlutR1 RNA 48 ح بعد حقن RNPmGlutR1mix
- لاختبار ما إذا كان هناك انخفاض في mGlutR1 RNA RNA، حقن ستة النحل في أوتشيلي مع مزيج RNP_RDL كما هو موضح في الخطوة 5.3.2 واستخدام ستة النحل غير حقن كضوابط. تشريح أدمغة النحل (بدون فصوص بصرية) 48 ساعة بعد الحقن ، واستخراج إجمالي مرنا من كل النحلة المحقونة ، وفصل باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة لعزل الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد).
- إزالة أي بقايا الحمض النووي المتبقية في العينة باستخدام مجموعة خالية من الحمض النووي (انظر جدول المواد).
- تقييم جودة ونقاء الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام مطياف ضوئي.
- قم بتحديد تعبير mGlutR1 باستخدام طقم SYBR Green RT-PCR (انظر جدول المواد)على مدورة PCR في الوقت الحقيقي مع البروتوكول المقدم لمجموعة 384 جيداً. استخدام الالتمهيديالتالي لmGlutR1 (mGlut_F CCTCCTCAACGTCTCTCTCatA؛ mGlut_R TGCCGTGTGTTCCGATTT) والتمهيديات actin كجين مرجعي [AmActin_F TGCCAACACTGTCTTTCtG؛ AmActin_R GAATTGACCCACCAATCCA]. حساب التعبير الجيني النسبي باستخدام طريقة2-ΟCtCt (الخطوة 8.6).
Representative Results
اختبارات الأجسام المضادة لـ RDL
تم إنتاج الأجسام المضادة ضد الببتيد RDL مترافق كما هو موضح في الشكل 1A. الخطوة الأولى في توصيف الأجسام المضادة لـ RDL هي التحقق من تجانس البروتين المستخرج من دماغ النحل باستخدام لطخة غربية مع الأجسام المضادة لـ RDL والماعز المسمى HRP IgG الأجسام المضادة الثانوية(الشكل 1A، إدراج). واعترفت كل من الأجسام المضادة لـ RDL بالنطاق الموجود عند 50-60 كيلو متر (سهم) ، وهو ما يعادل الوزن المقدر للبروتينات isoform للوحدة الفرعية RDL. لإثبات أن الأجسام المضادة لـ RDL تعرفت على الببتيد في شرائح الدماغ ، استخدمنا عنصر تحكم preadsorption(الشكل 1B ، C). عندما كانت الأجسام المضادة تسبق الببتيدات المترافقة ، كان تلطيخ المقطع غائبًا. وقد أظهر ذلك أن الأجسام المضادة لـ RDL تعرفت على الببتيد المترافق الذي تربيت عليه. من أجل إثبات أن الأجسام المضادة لـ RDL تتعرف على البروتين في أنسجة الدماغ الثابتة ، استخدمنا CRISPR-Cas9 لضرب جين RDL الذي ينتج بروتين RDL في الخلايا. الشكل 1D1-3، يظهر أقسام الدماغ النحل الأمامية التحكم التي كانت تحمل علامة على الأجسام المضادة RDL. لم يتم حقن هذه النحلة مع RDL-CRISPR-Cas9 RNP. في الشكل 1D1، المضادة لتسميات RDL neuropils في القسم الأمامي من الدماغ النحل. نفس القسم الأمامي في الشكل 1D2 يظهر عدم وجود الفلورسينس من ATTO550، لأنه لم يتم حقن مجمع RDL-CRISPR-Cas9.
يوضح الشكل 1E1-E3 قسم ًا دماغيًا من نحلة تم حقنها بـ RDL-CRISPR-Cas 9 ثم تتم معالجتها بنفس كمية الأجسام المضادة مثل دماغ التحكم في الشكل 1D1-D3. تم تخفيض تلطيخ المضادة لـ RDL بشكل ملحوظ في الدماغ كله 48 ساعة بعد الحقن، وتوزيع تلطيخ ATTO550 في الدماغ(الشكل 1E2)يظهر نجاح حقن RDL-CRISPR-Cas 9 في أوتشيلي وسيط النحل. الخلايا المتناثرة متعددة من الدماغ يحمل ATTO550. حقن ناجحة من RDL-CRISPR-Cas 9 خفضت التعبير البروتين بالمقارنة مع السيطرة(الشكل 1E1-3). من ثمانية أدمغة النحل الملطخة بالمناعة ، كان دماغ واحد فقط على مستوى عال من توزيع RDL-CRISPR-Cas9 في خلايا جسم الفطر ، بروتوسيديربروم ، وفص الهوائي ، في حين أن الأدمغة الأخرى كان تلطيخ الخلية مع ATTO550 في calyx الجسم الفطر ، المجمع المركزي ، ولكن ليس فص الهوائي. من المهم أن نلاحظ أنه في هذه النحل، والحد من مضاد لـ RDL المناعة لم يكن دراماتيكيا كما هو الحال في الدماغ هو مبين في الشكل 1E1.
بعد ذلك، لتقدير مستوى GDNA RDL المعدلة في النحل 48 ساعة بعد حقن RDL-CRISPR-Cas9، قمنا بإجراء اختبار إنزال qPCR، حيث تم تصميم مسبار الإنزال ليتناسب مع منطقة واحدة من RDL gRNAs. في هذه التجارب، في أدمغة النحل التي تم حقنها بـ RDL-CRISPR-Cas 9، كان الانخفاض النسبي للفلورية يتوافق مع عدد الحمض النووي المعدل في العينات. في اختباراتنا كانت المنطقة المقابلة لهذا الدليل في gDNA في 12 النحل حقن مع RDL-CRISPR-Cas9 64 ٪ ± (متوسط ± 30 ٪ SD) مقارنة مع gDNA في النحل غير حقن(الشكل 3A).
بعد ذلك ، لتقدير مستوى الحمض النووي الريبي RDL في النحل 48 ساعة بعد الحقن ، قمنا بإجراء qRT-PCR في مجموعة منفصلة من النحل(الشكل 3B). قارنا مستوى RDL RNA من RDL-CRISPR-Cas 9 النحل المحقون (n = 19) مع مستوى الحمض النووي الريبي في النحل التي لم يتم حقنها (ن = 12). في هذه التجارب، كان الانخفاض النسبي للمرنا RDL 59٪ ± (متوسط ± 15٪ SE) مقارنة مع مستوى الحمض النووي الريبي في النحل غير حقن. عندما فحصنا مستوى الحمض النووي الريبي RDL في كل النحل على حدة، فقط 13 النحل من أصل 19 النحل أظهرت انخفاضا كبيرا من الحمض النووي الريبي. وتشير هذه البيانات إلى أن حقن RDL-CRISPR-Cas9 من خلال أوتشيلي قد لا تصل دائما إلى عدد كبير من خلايا الدماغ, مما يؤكد البيانات مع RDL الملطخة بالمناعة RDL-CRISPR-Cas9 حقن النحل. في هذه الاستعدادات، كان نحلة واحدة فقط من أصل 8 RDL CRISP-Cas9 في العديد من خلايا الدماغ (جسم الفطر، بروتوسيريروم، وفص الهوائي) مقارنة مع أدمغة النحل الأخرى، حيث تركز توزيع RDL-CRISPR-Cas9 في الخلايا في بروتوسيسبروم (فطر الجسم calyx والمجمع المركزي) ولكن ليس الفص الهوائي(الشكل 4A-D).
اختبارات الأجسام المضادة mGlutR1
استخدمنا الأجسام المضادة mGlutR1 المنتجة في أرنب ضد الببتيدات مترافق ة محددة لdrosophila melanogaster (الشكل 2A). تسلسل هذا الببتيد يظهر هوية 94٪ مع الببتيد النحل (CLSDKTRFDYFARTVPPD) الشكل 2A. أولاً، فحصنا الأجسام المضادة ضد بروتين دماغ النحل باستخدام النفخ المناعي. تم فصل تجانس دماغ النحل بنسبة 10٪ SDS-PAGE ونقل كهربائيا من إلى غشاء النيتروسليلوز وملطخة بمكافحة mGlutR1. يظهر الإدراج في الشكل 2A نطاقين مع الأوزان المقدرة (103 و 83 كيلو د) المقابلة لاثنين من isoforms. عندما اختبرنا هذا الجسم المضاد على أدمغة نحل العسل ، وجدنا أنها تسمي ملامح عصبية وخلايا في أقسام دماغ النحل كما هو موضح في الشكل 2B، D. بعد preadsorption من الأجسام المضادة لmGlutR1 مع الببتيد مغلوت-mGlutR1، اختفى تلطيخ محددة في شريحة الدماغ النحل(الشكل 2C). وهذا يؤكد أن الأجسام المضادة mGlutR1 التعرف على الببتيد(الشكل 2C). بعد ذلك ، قمنا بحقن مزيج من mGlutR1-CRISPR-Cas9 في ocelli المتوسط واستخدمنا noguideRNA التحكم. في النحل السيطرة (ن = 7) ، لم يتركز الفلورمنس من ATTO550 في الخلايا. وكان بعض العقول الفلورية المتناثرة ATTO550 الوسم. وهكذا، فإن إعداد السيطرة في الشكل 2D1-3 يظهر تلطيخ مكافحة mGlutR1 في الدماغ ولكن ليس الفلورATAT550. عندما تم حقن mGlutR1-CRISPR-Cas9 في أوتشيلي وتناولها العديد من الخلايا، تم تخفيض مستوى الفلورمنس من الأجسام المضادة الثانوية بشكل كبير في المنطقة التي تلتقط mGlutR1RNP وظيفية(الشكل 2E1-3). تم رصد النحل لمدة 48 ساعة ، وتم العثور على نبواحد من كل حالة تجريبية ميتة. وهكذا، في هذه التجربة، فحصنا سبعة نالات تحكم وثمانية نالات CRISPR-Cas9. وكان جميع النحل حقن مع CRISPR-Cas9 الخلايا التي أخذت في mGlutR1-CRISPR-Cas9. وكانت معظم هذه الخلايا في calyx الجسم الفطر, مجمع مركزي, وprotocerebrum الخلفي. أظهر اثنان فقط من النحل من أصل سبعة ATTO550 الوسم في العديد من الخلايا في الجسم الفطر، مجمع مركزي، والفص الهوائي. ويرد مثال على واحدة من هذه النحل في الشكل 2E. وكان الحد من مستوى تلطيخ mGlutR1 في هذه الاستعدادات كبيرة. النحل الخمسة الأخرى لديها ATTO550 الوسم المقابلة للتسليم الناجح للmGlutR1 CRISPR-Cas9 في الجسم الفطر وprotocerebrum الخلفي ولكن ليس في فصوص الهوائي.
بعد ذلك ، لتقدير مستوى mGlutR1 gDNA المعدلة في النحل 48 ساعة بعد الحقن ، قمنا بإجراء اختبار الإنزال القائم على qPCR ، حيث تم تصميم مسبار الإنزال ليكون في المنطقة بالقرب من دليل mGlutR1. في هذه التجارب، في أدمغة النحل حقن مع mGlutR1-CRISPR-Cas 9، وكان التعديل النسبي لgDNA في 12 النحل 59٪ ± (متوسط ± 33 ٪ SD) مقارنة مع gDNA في النحل غير حقن(الشكل 3A).
كما تم تأكيد هذه النتائج من خلال اختبارات qRT-PCR في مجموعة مختلفة من النحل، حيث قدرنا مستويات الحمض النووي الريبي mGlutR1 باستخدام qRT-PCR في النحل 48 ساعة بعد الحقن مع RNPmGlutR1mix(الشكل 3B). قارنا مستوى mGlutR1 RNA من النحل المغلور 1-CRISPR-Cas9 حقن النحل (ن = 6) مع مستويات الجيش الملكي النيبالي في النحل التي لم يتم حقنها (ن = 6). في هذه التجارب، كان الانخفاض النسبي للmGlutR1 مرنا في النحل حقن 53٪ ± (متوسط ± 18٪ SE) مقارنة مع النحل غير حقن(الشكل 3B).
يظهر القسم من أربعة نحلات مختلفة عبرت عن RNP RDL-CRISPR-Cas9 في خلية كينيون من جسم الفطر في الشكل 4A-D. سبيل المثال نحلة مع ATTO550 الفلورسينس في الجسم الفطر والفص الهوائي هو مبين في الشكل 4E، F.
| ادله | تسلسل | gRNA | RNP |
| [guideRNA: tracrRNA] | [gRNA:Cas9 Nuclease] | ||
| RDL_Guide1 | ACCGTAACGCGACCCCCGCT | GRDL1 | RRDL1 |
| RDL_Guide2 | AACGTCGCGACTTGACGT | GRDL2 | RRDL2 |
| RDL_Guide3 | CCATGACGAAACACGTGCCC | GRDL3 | RRDL3 |
| mGlu_Guide 1 | CGAAAGTATCTGACGGGT | GMGL1 | RMGL1 |
| mGlu_Guide 2 | TTCAACGAGAGCAGTTCAT | GMGL2 | RMGL2 |
| mGlu_Guide 3 | GCAACGTCGGTAGGAGTGA | GMGL3 | RMGL3 |
الجدول 1: تسلسل النيوكليوتيدات من الأدلة المصممة لRDL و mGlutR1.
الشكل 1: توصيف الأجسام المضادة لـ RDL. (أ)التخطيطي للوحدة الفرعية RDL، حيث تشير الدوائر الوردية إلى توطين الببتيد 2 (CVNEKQQYHIATATTTSIRI-amide) في N-terminus والببتيد 1 (CVRFKVHDPKSKGGTL-amide داخل الخلايا) في C-terminus. إدراج في A يظهر العصابات في اللطخة الغربية من مقتطفات الدماغ نحل العسل معالجتها مع الأجسام المضادة لRDL المقابلة (واحد مع مكافحة RDL pep1 ومكافحة RDL pep2). كل مناعي يظهر الحجم الظاهر للبروتين ~ 50-60 كيلو د، المقابلة للأوزان المقدرة من isoform مختلفة من الوحدات الفرعية RDL. (B, C) Preadsorption من الأجسام المضادة لRDL مع الببتيد مترافق 1. الصورة في C يظهر انخفاض في تلطيخ في القسم عندما كانت الأجسام المضادة preincubated مع الببتيد مترافق 1. الجسم على شكل مروحة (FB) والجسم الإهليلجي (eb) هي هياكل مركزية معقدة في الدماغ. M = الفص الميديا من الجسم الفطر. (D1-3) مكافحة RDL تلطيخ عنصر تحكم, غير حقن قسم الدماغ النحل بعد 48 ح. الأخضر يشير إلى التشكيل الجانبي المضادة RDL إيجابية في الدماغ. (د2) لم يتم حقن هذه النحلة ولا تحتوي على ATTO550 الفلورسينس. (د3) الصور المدمجة من D1 و D3. (E1-3) حقن RDL-CRISPR-Cas9 خفضت المضادة لRDL تلطيخ بعد 48 ح.(E2)ATTO550 الفلورسينفية في نواة الخلية وأشار نجاح RDL-CRISPR-Cas9 التسليم. (E3) الصورة المدمجة لمكافحة RDL (الأخضر) وATTO550 (الأحمر). مقياس شريط = 100 ميكرون (B-E). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: توصيف الأجسام المضادة mGlutR1. (أ)التخطيطي لـ GCPR mGluR الذي يظهر ببتيد الغرانوغاستر Drosophila المستخدم للتحصين. للمقارنة، يظهر الببتيد ميللايفرا أبيس أدناه. تشير الدائرة إلى تعريب الببتيد في المنتصف N من مجال مستقبلات mGlutR1 خارج الخلية. إدراج في ألف يظهر أن الأجسام المضادة لmGlutR1 المعترف بها اثنين من العصابات في اللطخة الغربية من أدمغة النحل ~ 103 kD و ~ 83 kD التي تتوافق مع الأوزان المقدرة من isoforms المعروفة. (B, C) السيطرة المسبقة على الأجسام المضادة mGlutR1 المضادة في قسمين متتاليين من الكبيبات الفص الهوائي. صورة لمكافحة mGlutR1 في المقطع الكبيبات الهوائي في C يظهر الحد من تلطيخ نتيجة للاحتضان المسبق للببتيد المضادة mGlutR1 مع الأجسام المضادة mGlutR1. هذا الإجراء يسبب الجسم المضاد للتعجيل من الحل، الذي يلغي تلطيخ بالمقارنة مع B (السيطرة، وعدم وجود الببتيد في precontrolon). (D1)يظهر تلطيخ مكافحة mGlutR1 في شريحة الدماغ النحل بعد حقن التحكم في ocellus المتوسط. تفتقر هذه الحقنة إلى mGlutR1 gRNA التي تمكن من هدم مستقبلات mGlutR1 بواسطة CRISPR-Cas9 ، وبالتالي لم يتم تقليل تلطيخ الأجسام المضادة لـ mGlutR1 (الخضراء). (د2) عدم وجود ATTO550 الفلوريشير إلى عدم وجود وظيفة CRISPR-Cas9 في الدماغ. (د3) دمج الصور المضادة mGlutR1 وATTO550. (E1-E3)تظهر تلطيخ مكافحة mGlutR1 في قسم الدماغ حيث تم ضرب mGlutR1 بشكل دائم أسفل 48 ساعة بعد الحقن مع mGlutR1-CRISPR-Cas 9 في ocellus المتوسط. وهكذا ، يتم تقليل تلطيخ في هذا الدماغ إلى حد كبير بسبب خروج المغلوب الناجح من mGlutR1 في العديد من الخلايا. (E2) ATTO550 تلطيخ في العديد من نواة الخلية في أدمغة النحل يشير إلى أن حقن mGlut1-CRISPR-Cas 9 كان ناجحا. (E3) صورة مدمجة من ATTO550 (أحمر) ومكافحة mGlutR1 (الأخضر). مقياس شريط = 10 ميكرون (B, C); 100 ميكرومتر (D, E). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تقييم gDNA المعدلة والتعبير عن مرنا من RDL وmGlutR1 مرنا في أدمغة النحل 48 ساعة بعد الحقن مع 345 nL من RPN CRISPR-Cas9 المقابلة. (أ)تم حساب اختبار فحص الإنزال المستند إلى qPCR لتقييم كمية الحمض النووي الصبغي مع منطقة تعديل باستخدام طريقة 2-ΟΟCt وتطبيعها ضد السيطرة ، والأدمغة غير المحقونة. يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط + SD.(B)تم استخدام اختبار TheqRT-PCR لتقييم كمية مرنا في كريسبر-كاس9 النحل عن طريق الحقن وغير المحقون. تم استخدام AmActin كجين مرجعي. تم حساب التعبير الجيني النسبي باستخدام طرق2 -ΟΟCt وتطبيع ضد السيطرة، والعقول غير المحقونة. يتم التعبير عن البيانات على أنها تعني + SE. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مثال على توزيع RNP CRISPR-Cas9 في أدمغة النحل عن طريق ATTO550 الفلورية. (A-D) أقسام الدماغ من أربعة النحل المختلفة التي عبرت عن RNP RDL-CRISPR-Cas9 في خلية كينيون من الجسم الفطر. (E, F) مثال على اثنين من العقول 48 ساعة بعد الحقن مع RNPmGlutR1 CRISPR-Cas9. مقياس شريط = 150 ميكرون (A-F). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
توصيف مكافحة RDL ومكافحة mGlutR1
أولا، نحن تتميز المضادة لمكافحة RDL ومكافحة mGlutR1 بواسطة المناعة والامتزاز قبل على شرائح من أدمغة نحل العسل الثابتة. تم إجراء كل جسم مضاد للتعرف على جميع أشكال النظائر المعروفة ، ويظهر التحليل الغربي أنهم يعترفون بالعصابات التي تتوافق مع أوزانهم الجزيئية المتوقعة. بعد ذلك ، تم حظر كلا الأجسام المضادة من قبل الببتيد المترافق الذي تم إنتاجهما على أقسام الدماغ نحل العسل.
كان أحد الأهداف الأولى في دراستنا هو إثبات أن الأجسام المضادة المنتجة ضد الببتيد المترافق محددة خاصة ببروتينها في أنسجة الدماغ الثابتة. ولهذا الغرض، استفدنا من نظام كريسبر - كاس9. قمنا بتصميم أدلة محددة لـ HONEYbee RDL و mGlutR1 واستخدمنا كل واحد منهم لصنع CRISPR-Cas9 المسمى مع مسبار الفلورسنت ATTO550. لكل مستقبلات، ونحن حقن خليط من ثلاثة مختلفة CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins في ocelli للحد من كمية البروتين المستهدف في الدماغ نحل العسل الكبار عن طريق القضاء على الجين المقابلة في الخلايا التي اتخذت لدينا تصميم نظام Cas9. في دراستنا، أنجزنا هذه الخطوة.
واحدة من الخطوات الحاسمة الأولى لنجاح هذه التجارب هو تصميم دليل مناسب RNAs. نوصي بتصميم ما يصل إلى خمسة أدلة RNAs ، وتقع في البداية والوسط ونهاية التسلسل الجيني. في عملنا الأولي، اختبرناها في مجموعات مختلفة على ثلاثة إلى خمسة نحل. حاولنا أيضا تركيزات مختلفة من الحقن، فضلا عن مرات بعد الحقن، وخلائط مختلفة من RNP في الحقن. قمنا بتشريح الأدمغة ومعالجتها باستخدام الأجسام المضادة المضادة لـ RDL ومكافحة mGlutR1. في هذه الاختبارات الأولية، أنشأنا المزيج المناسب، وقت ما بعد الحقن، فضلا عن تركيز وكمية CRISPR-Cas9 للحقن. وكانت هذه الاختبارات الأولية هي الأساس لإعداد التجارب التي وصفناها بالتفصيل هنا.
كان الهدف مزدوجًا: 1) أن نثبت في النحلة أن تلطيخ الأجسام المضادة لدينا قد انخفض بعد العلاج باستخدام CRISPR-Cas9 و 2) للعمل من خلال أفضل الظروف التجريبية للدراسات السلوكية. وهكذا، ونحن نظهر أنه إذا كان العديد من نواة الخلية تحتوي على CRISPR-Cas9 48 ساعة بعد الحقن، والحد من المضادة لRDL والمضادة لmGlutR1 تلطيخ كبير. بالإضافة إلى ذلك، أن يدل على أن الأجسام المضادة اختبارها تعترف على وجه التحديد بروتين mGlut1 وRDL في إعداد الدماغ نحل العسل وأنه يمكن استخدامها لدراسات التعريب في الدماغ نحل العسل.
الإعداد التجريبي CRISPR-Cas9 للدراسة السلوكية
بعد ذلك ، قمنا بإعداد التجارب بحيث يمكن استخدام CRISPR-Cas9 في الدراسات السلوكية. تم جمع ثمانية أو تسعة نحل عسل للتحكم والعلاجات التجريبية. تم اختبارها سلوكيا قبل وبعد الحقن، ومن ثم تم تجهيز أدمغتهم لATTO550 و / أو الكيمياء المناعية لتحديد مناطق الدماغ التي أظهرت انخفاضا في البروتين المستهدف. هنا من الضروري أن نلاحظ أن عدد النحل المأخوذ لمجموعة واحدة من التجارب كان يقتصر على ما لا يزيد عن 8-9 النحل للسيطرة والظروف التجريبية. وبهذه الطريقة يمكن اختبار كلا الشرطين في نفس اليوم. أيضا، مرة واحدة ونحن إعداد مخاليط CRISPR-Cas9 للحقن، ونحن أبدا تجميدها. لم يتغير خليط CRISPR-Cas9 في الفعالية عند استخدامه لمدة 3 أيام متتالية وأبقى عند 4-8 درجة مئوية. ومع ذلك، لم نختبره بعد 3 أيام.
كما وصفنا في قسم النتائج لكلا المجموعتين من الحقن التجريبية ولكل من الأجسام المضادة، وأظهرت ثلاثة فقط من النحل من 16 اختبار توزيع كبير ATTO550 في الجسم الفطر، بروتوسيدبروم، وفصوص الهوائي. في جميع النحل الأخرى ، كان توزيع CRISPR-Cas9 يقتصر على جسم الفطر ، والمجمع المركزي ، و / أو البروتوسيدبرومي الخلفي. من الضروري أن نفهم لأي دراسات سلوكية أن استخدام طريقة الحقن هذه سيتم تقييد الحد من البروتين المستهدف فقط إلى جسم الفطر في معظم النحل. لن يمتد إلى الفص الهوائي أو العقدة تحت المريء. وبالتالي ، فإن تقنية الحقن التي نستخدمها مناسبة لدراسة تأثير الحد من المستقبلات في جسم الفطر والمجمع المركزي في التجارب السلوكية ، في حين أن طريقة مختلفة لإدخال CRISPR-Cas9 ستكون أكثر ملاءمة لدراسة مناطق الدماغ الأخرى.
في الختام، أظهرت دراستنا التطبيق الناجح لCRISPR-Cas9 كتحكم لتلطيخ الأجسام المضادة في الدماغ. لكل من الأجسام المضادة (المضادة RDL ومكافحة mGlutR1) ، عندما كان من شأن الاستفادة من mGlutR1 - CRISPR - Cas9 أو RDL - CRISPR - Cas9 ناجحة ، كما انخفض مستوى تلطيخ الأجسام المضادة المقابلة بشكل كبير. أيضا، من الضروري أن نلاحظ أن الحقن في أوتشيلي أدى إلى توزيع CRISPR-Cas9 في الدماغ التي لم تكن متجانسة. تفاوت التوزيع من منطقة صغيرة تحيط بجسم أوتشيلي والفطر إلى العديد من الخلايا في الدماغ كله. كان من المرجح أن يكون اختلاف mGlutR1-أو RDL-CRISPR-Cas9 من قبل الخلايا بسبب الاختلاف في الحقن. تظهر بياناتنا أن نظام CRISPR-Cas9 يعمل في نحل العسل ، ولكن طريقة الحقن تحتاج إلى تحسين للحد من تباين تناول CRISPR-Cas9 عبر أدمغة النحل الفردية. ضمن هذه القيود ، أصبح من الممكن الآن استخدام هذه التقنية للتلاعب بالجينات في النحل البالغ للتجارب السلوكية.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل الجوائز التالية التي منحت هاوووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووووو المعاهد الوطنية للصحة (R01 GM113967)؛ مختبر أفكار NSF (1556337). تم تصميم الببتيد والأجسام المضادة لDmGlura في المختبر الدكتور سيرج بيرمان (مرسيليا، لوميني، فرنسا) عندما تم دعم IS من قبل برنامج d'Urgence FRM/Postdocs UFP20060306548 من مؤسسة من أجل لا Recherche Medicale. نحن ممتنون لدانييلا Junqueira Marosi وأليكس هاانتر من تكنولوجيا الحمض النووي المتكاملة (IDT) للمساعدة في تصميم أدلة RDL واختبارات الإنزال qPCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283_100 mL | western blotting |
| Acrylamide-bis Acrylamide | Bio-Rad | 500 mL 1610156 | western blotting |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A0169-250g | used with distilled water to fix honey bee brain in blocks |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Research Laboratories | 711-546-152 | secondary antibody to reveal the primary antibodies from rabbit |
| Alt-R CRISPR-cas9 tracrRNA-5'ATTO | IDT | 1075934 | with desinged guide RNA, it creates gRNA |
| Alt-R S.p. Cas9 nuclease V3 | IDT | 1081058 | enzyme used to make ribonucleoprotein for CRISPR system |
| Ammonium Persulfate | Bio-RAD | 10 g 1610700 | western blotting |
| Anti-mGlutR1 antibodies | Covalab (FRANCE)/21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of mGlut 1 in honey bees |
| Anti-RDL antibodies | 21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of RDL in honey bees |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | Y0001154 | protease inhibitor |
| Barraquer Iris Scissors 7mm Blade Sharp point | World Precision Instruments | 14128-G | used for dissection honey bee brain |
| Benzamidine | Sigma-Aldrich | 12072 | protease inhibitor |
| Blade (breakable) for blade holder | Fine Science Tool | 10050-00 | dissection for western blotting |
| Blade holder and breaker | Fine Science Tool | 15309 | dissection for western blotting |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100 F | for injection procedure |
| Chemiluminescent western blot detection substrate | Bio-Rad | 1705062 | western blotting |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 472476-50mL | RNA isolation |
| Dithiothreitol | Bio-Rad | 1610611 | western blotting |
| DNA easy kit | QIAGEN | 69504 | DNA extractionuj |
| DNA-free kit | INVITROGEN | AM1907 | Used to remove DNA |
| Eppendorf Research plus pipette, 3-pack | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
| Falcon 24 Well Polystyrene Multiwell | Falcon | 351147 | Multiwell |
| Flat Bottom Embedding Capsules, Polyethylene | Electron Microscopy Science | 70021 | basket for brain sections |
| Forceps Dumont #5 (pair) | Fine Science Tool | 11254-20 | for dissection of honey bee brain from the head |
| Forceps Dumont #5S (pair) | Fine Science Tool | 11252-00 | to clean up the brain from trachea befor dissection |
| Gene Expression Master Mix | Integrated DNA Technologies | 1055770 | qPCR drop off assay |
| Glutaraldehyde | EMS | 16220 | used for preparation of peptide conjugates for control peabsorption |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500 mL | western blotting, embedding media |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | western blotting |
| Hydrophobic filtered nylonmesh | Spectrum Labs | 145910 | for bottom of basket for brain sections |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-50mL | RNA isolation |
| Keyhole limpet hemocyanin | Sigma-Aldrich | H7017 | used for preparation of conjugates for control |
| LSM800 cofocal microscope | Zeiss | ||
| mGlu_Guide 1 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
| mGlu_Guide 2 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
| mGlu_Guide 3 | IDT | designed guide RNA for CRISPR. Target mGlutR1 genome sequences | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | western blotting |
| 96-well PCR microplate | Applied biosystem | 4346907 | qPCR drop off assay and qRT-PCR |
| 384-well PCR microplate | Sigma-Aldrich | Z374911 | qRT-PCR |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904_500mL | for injection procedure |
| Model p87 Flaming Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Capillary Preparation | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | for embedding solution |
| Nanoliter 2000 | World Precision Instruments Nanoliter | Injection Apparatus | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Research Laboratories | AB_2337258 | blocking agent for immunocytochemistry |
| Non-immune Goat Serum | Invitrogen | 50-062Z 100 mL | blocking agent for immunoblotting |
| Nuclease-free buffer | IDT | 1072570 | Nuclease-free buffer that is used in the preparation of CRISPR-Cas9 injection |
| Nuclease-free water | IDT | AM9337 | nuclease -free water that is used in preparation of CRISPR-Cas 9 system |
| OrbitalShaker Mp4 | Genemate | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500 g | used with PBS to make fixative for bee brains |
| Phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626-250 mg | protease inhibitor |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | Used with Paraformaldehyde as fixative; buffer for antibodies |
References
- Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current Protocols in Human Genetics. 83 (15), 7-27 (2014).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Kouranova, E., et al. CRISPRs for Optimal Targeting: Delivery of CRISPR Components as DNA, RNA, and Protein into Cultured Cells and Single-Cell Embryos. Human Gene Therapy. 27 (6), 464-475 (2016).
- Schubert, M., et al. Fluorescently labeled tracrRNA provides efficient genome editing while allowing cellular microscopy and FACS analysis. Genome Editing. , www.idtdna.com 1-3 (2017).
- Kucharski, R., Mitri, C., Grau, Y., Maleszka, R. Characterization of a metabotropic glutamate receptor in the honeybee (Apis mellifera): implications for memory formation. Invertebrate Neuroscience. 7 (2), 99-108 (2007).
- Aronstein, K., Auld, V., Ffrench-Constant, R. Distribution of two GABA receptor-like subunits in the Drosophila CNS. Invertebrate Neuroscience. 2 (2), 115-120 (1996).
- Thompson, M., Steichen, J. C., ffrench-Constant, R. H. Conservation of cyclodiene insecticide resistance-associated mutations in insects. Insect Molecular Biology. 2 (3), 149-154 (1993).
- Chung, B. Y., Kilman, V. L., Keath, J. R., Pitman, J. L., Allada, R. The GABA(A) receptor RDL acts in peptidergic PDF neurons to promote sleep in Drosophila. Current Biology. 19 (5), 386-390 (2009).
- Taylor-Wells, J., Hawkins, J., Colombo, C., Bermudez, I., Jones, A. K. Cloning and functional expression of intracellular loop variants of the honeybee (Apis mellifera) RDL GABA receptor. Neurotoxicology. 60, 207-213 (2017).
- Jones, A. K., Sattelle, D. B. The cys-loop ligand-gated ion channel superfamily of the honeybee, Apis mellifera. Invertebrate Neuroscience. 6 (3), 123-132 (2006).
- Dupuis, J. P., et al. Homomeric RDL and heteromeric RDL/LCCH3 GABA receptors in the honeybee antennal lobes: two candidates for inhibitory transmission in olfactory processing. Journal of Neurophysiology. 103 (1), 458-468 (2010).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
- Guo, X., Wang, Y., Sinakevitch, I., Lei, H., Smith, B. H. Comparison of RNAi knockdown effect of tyramine receptor 1 induced by dsRNA and siRNA in brains of the honeybee, Apis mellifera. Journal of Insect Physiology. 111, 47-52 (2018).
- Roth, A., et al. A genetic switch for worker nutrition-mediated traits in honeybees. PLOS Biology. 17 (3), e3000171 (2019).
- Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of Knockout Mutants by CRISPR/Cas9 in the European Honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science (BIOONE). 33 (5), 505-512 (2016).
- Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-Efficiency CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing in Honeybee Apis mellifera Embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
- Smith, B. H., Burden, C. M. A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research. Journal of Visualized Experiments. (91), e51057 (2014).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Protein Blotting Guide. , BIO-RAD. http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_2895.pdf (2019).
- Rodriguez, J., Deinhardt, F. Preparation of a semipermanent mounting medium for fluorescent antibody studies. Virology. 12, 316-317 (1960).
- Custom Alt-R® CRISPR-Cas9 guide RNA. , Integrated DNA Technologies. https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM (2019).
- Bonnafe, E., et al. Effect of a thymol application on olfactory memory and gene expression levels in the brain of the honeybee Apis mellifera. Environmental Science and Pollutant Research (International). 22 (11), 8022-8030 (2015).
- Wang, Y., et al. Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honeybee ovaries. Journal of Experimental Biology. 215 (Pt 1), 124-134 (2012).
