Summary
Presenteras här är ett protokoll för att använda CRISPR-Cas9-systemet för att minska produktionen av ett protein i den vuxna honungsbina hjärnan för att testa antikroppsspecificitet.
Abstract
Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associerat protein 9 (Cas9) är en genredigeringsteknik som ofta används i studier av genfunktion. Vi använder denna metod i denna studie för att kontrollera om det är specifika av antikroppar som utvecklats mot insekten GABA A-receptorunderenheten Resistens mot Dieldrin (RDL) och en metabotrop glutamatreceptormGlutR1 (mGluRA). Antikropparna genererades hos kaniner mot konjugerade peptider som är specifika för fruktflugor (Drosophila melanogaster) samt honungsbin (Apis mellifera). Vi använde dessa antikroppar i honungsbina hjärnan avsnitt för att studera fördelningen av receptorer i honungsbinhjärnor. Antikropparna var affinitet renas mot peptid och testas med immunoblotting och den klassiska metoden för preadsorption med peptid konjugat för att visa att antikropparna är specifika för motsvarande peptid konjugat mot vilka de höjdes. Här utvecklade vi CRISPR-Cas9-tekniken för att testa för minskning av proteinmål i hjärnan 48 h efter CRISPR-Cas9 injektion med guide RNAs avseddför motsvarande receptor. CRISPR-Cas9-metoden kan också användas i beteendeanalyser hos de vuxna bina när en eller flera gener behöver modifieras.
Introduction
Den nyligen upptäckta CRISPR/Cas9-systemet är ett kraftfullt verktyg som har använts för att förändra genomisk DNA i olika modellsystem och organismer. Den har påskyndat biomedicinsk forskning och stora tekniska genombrott genom att göra genommodifiering mer effektiv och robust än tidigare metoder1. Native to S. pyogenes bakterier, systemet förlitar sig på en Cas9 endonuclease, vars aktivitet leder till dubbel-strandsatta raster (DSBs) i DNA, och en guide RNA (gRNA) som leder Cas9 protein till en specifik, sekvens-beroende plats2. Dubbelsträngade raster som genereras av CRISPR/Cas9 kan repareras via icke-homolog a-anslutning (NHEJ), en felbenägen process som kan leda till frameshifts, eller homology direkt reparation när en givare mall är närvarande. GRNA består i sig av ett målspecifikt CRISPR RNA (crRNA) och en universell transaktiverande crRNA (tracrRNA) som kan syntetiseras kemiskt och levereras med renat Cas9-nuclease som ett ribonucleoproteinkomplex (RNP)2,3. Fluorescerande märkning av gRNA eller Cas9 nuclease kan möjliggöra detektion och intracellulär visualisering av molekylära komponenter via fluorescerande mikroskopi4.
I vårt nuvarande arbete drar vi nytta av CRISPR-Cas9-systemet för att minska proteinnivåerna i vuxna honungsbins hjärnor. Vi studerade metabotropa glutamatreceptorn (mGluR) och anti-mGlutR1 receptorantikroppar och GABA A-receptorns underavdelning RDL och anti-RDL antikroppar. Vi utvecklade en enkel metod för att minska mängden protein i hjärnan hos den vuxna honungsbiet och använde den för att driva ytterligare tester av de antikroppar som utvecklats mot motsvarande proteiner. Övervakning av fluorescens en CRISPR-Cas9 tillät oss att uppskatta de områden och celler som deltar i minskningen av proteinet.
Med hjälp av denna metod, vi karakteriserade också anti-mGlutR1 antikroppar som gjordes hos kaniner mot konjugerade peptid. Honungskonet kodar en mycket bevarad AmGluRA (namngiven mGlutR1 enligt NCBI-nomenklaturen) metabotropglutamatreceptor5. Honungsbiet mGlutR1 genen har fyra förutspådde skarv varianter enligt NCBI databasen. Det har rapporterats att det uttrycks i centrala nervsystemet (CNS) i både pupal och vuxna bin och det är involverat i långsiktigminnesbildning5. Antikroppar som utvecklats mot mGlutR1 kan vara ett viktigt verktyg för att studera det glutamatergic systemet i inlärnings- och minnesprocessen hos honungsbin.
I våra studier karakteriserade vi även anti-RDL-antikroppar som utvecklats hos kaniner som vaccinerats med konjugerade peptider från Apis mellifera RDL-receptorunderenheten. Honungsbiet Rdl genen, AmRdl (XM_006565102.3, NCBI databas), har 14 förutspådde skarv varianter. Ett delvis klonat fragment har rapporterats i NCBI-databasen AF094822.1. RDL-receptorfunktionen och dess fysiologi studeras väl i insekter6,7,8, inklusive honungsbin9,10,11. Antikroppar som utvecklats mot anti-RDL kan vara ett viktigt verktyg för att studera GABAergic systemet i lärande och minne process i honungsbin.
En tidigare studie om den roll som oktopamin och tyramin receptorer används RNAi injiceras i hjärnan med ett efterföljande test av mängden protein av västra blot12,13. RNAi har dock några betydande begränsningar. Det finns bara en kort tid fönster efter RNAi injektion inom vilken en minskning av protein förekommer13. CRISPR-Cas9 användes helt nyligen i honungsbinembryon för att radera eller modifiera gener i hela djuret14,15,16. Vi rapporterade användningen av CRISPR-Cas9 för att minska mängden protein i den vuxna honungsbiet. Vi utvecklade detta tillvägagångssätt för honungsbin på grund av förmågan att koppla den till beteendestudier av lärande och minne under kontrollerade laboratorieförhållanden17.
I det nuvarande arbetet utvecklade vi antikroppar mot två receptorer och testade dem på de vuxna honungsbina hjärnsektionerna efter att proteinet reducerades genom CRISPR-Cas9 injektion. Samtidigt etablerade vi en experimentell design som tillåter användning av metoden för beteendeexperiment.
Protocol
Protokollet beskrivs här följer djurvård riktlinjer arizona State University.
1. Total proteinisolering från hjärnan hos Apis mellifera
OBS: Använd Apis mellifera New World Carniolan förfalskare av okänd ålder för detta experiment.
- Placera en aluminiumnät skärm över ingången till bikupan för att fånga forager bin17. Fånga varje bi i en injektionsflaska med ett litet hål i varje lock. Placera injektionsflaskorna som innehåller bina i is för att sänka kroppstemperaturen och immobilisera dem. Lämna bina i is i högst 3 min.
- Säkra de immobiliserade bina i tidigare förberedda metallhållare. Se till att metallhållarna är tillverkade så att bien kan säkras med små bitar av silvertejp, men ändå ha sin ryggbröstkorg, vingar och huvud exponerade.
VARNING: Se till att bina är helt immobiliserade innan de försöker placera dem i innehavarna. - Mata bina med en 1 M sackaroslösning med en 5 ml spruta tills de inte längre är hungriga. Placera de säkrade bina i en låda med en våt pappershandduk för att säkerställa en fuktig miljö.
- Dissekera binhjärna snabbt genom att skära av huvudet med Barraquer Iris sax (se Table of Materials) och använda saxen för att öppna huvudet framifrån.
- Skär av hjärnan från huvudet kapseln, ta hjärnan med #5 pincett, och placera den i 100 μL av kallt (4-8 °C) lys buffert. Lysisbufferten består av 120 mM Tris-HCl, 2% natriumdodecylsulfat (SDS), 5% glycerol, 0,2 mM ditiotiotretitol, 1% Triton X-100 och 1-5 μg/ml av proteashämmarePMSF (fenylsulphonylfluorid), aprotinin, bensamidin (pH 6.8) vid 4 °C. Homogenisera hjärnan i lyslösningen genom att vrida i en pestle i ca 2 min.
- Centrifugprovet vid 12 000 x g i 20 min. Aspirate 90 μL av supernatanten och kassera pelleten.
- Ta 1 μL av supernatanten för att kvantifiera det totala proteinet med hjälp av en fluormeter. Den ungefärliga koncentrationen av det totala proteinet var mellan 2-3 mg/ml per bi. Ta 10 μL av supernatanten och tillsätt 10 μL lysbufferten och 10 μl av en 6x Laemmli buffert18. Snurra en kort stund och koka i 3 min, sedan svalna på is. Snurra i 1 min vid 10 000 x g för att ta bort allt skräp. En tiondel av en bihjärna innehåller cirka 25 ng av totalt protein.
2. Västra Blotting19
- Gör 30 ml 10% löpargel innehållande 12,15 ml ultraren destillerat vatten, 7,5 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 0,3 ml 10% SDS, 10 ml på 30% akrylamid-bis akrylamidlösning, 0,15 ml 10% ammoniumpersulfat (APS) och 20 μl tetrametyletylenediamin (TEMED ).
- Kasta gelen mellan två glasplattor åtskilda av distanser.
- Gör en 20 ml stapling gel som innehåller 12,1 ml ultraren destillerat vatten, 5,0 ml på 0,5 M Tris-HCl (pH 6.8), 0,2 ml 10% SDS, 2,6 ml akryl-bis akrylamid, 0,1 ml 10% APS och 20 μl TEMED.
- När löpgelen stelnar häll en staplinggel. Tillsätt försiktigt plastavskiljaren för att kasta lastfilen, undvika bubblor. Vänta 15-30 min, tills gelen är stelnad.
- Börja ladda gelen med 5 μL proteinstandarder. Ladda 20 μL av lysningsblandningen från steg 1,8 per körfält, motsvarande ~1/15 av en bihjärna eller ~16 ng av totalt protein per körfält. Kör proverna för 3,5-4 h totalt vid 16 mA i staplinggelen och 32 mA i löpgelen. Stanna när färgen lämnar gelen.
- Överför proteinerna till nitrocellulosamembran i överföringsbuffert (25 mM Tris-HCl, 192 mM glycin, 15% metanol) vid 0,45 mA i 1 tim 30 min vid 4 °C.
- För att utvärdera proteinöverföringens effektivitet efter SDS-PAGE före immunoblotting, tillsätt Ponceau S färgningslösning (tillsätt 0,1 g Ponceau S och 5 ml ättiksyra till vatten till en slutlig volym på 100 ml). Förvaras vid 4 °C i 1 min och skölj snabbt med destillerat vatten.
- Märk varje körfält med en kulspetspenna, skär membranet som innehåller två körfält med hjärnan homogenat och ett körfält med proteinmarkör och placera var och en i en västerländsk fläck inkuberande låda. Tvätta 3x i 5 min vardera i fosfatbuffrad saline (PBS) innehållande 0,1% Tween 20 (PBS-Tw).
- Blockera membranet med 10% NGS (1 ml normalt getserum till 10 ml PBS-Tw) i en västerländsk blotinkuberinglåda i 1 h. Gör en anti-mGlutR1 spädning (5 μl antikroppar i 10 ml av 10% NGS). Gör anti-RDL1 och anti-RDL2 spädningar (5 μl antikroppar i 10 ml 10% NGS vardera). Byt ut blockeringslösningen i varje låda mot de utspädda antikropparna och låt över natten (16-24 timmar)
- Tvätta membranet 3x i 5 min vardera i PBS-Tw. Inkubera membranet med anti-kanin IgG HRP-konjugerade sekundära antikroppar vid 1:10.000 i 10% NGS PBS-Tw för 2 h vid rumstemperatur (RT). Tvätta membran3x i PBS-Tw, sedan 1x i PBS.
- Upptäck banden med hjälp av västra chemiluminescent HRP substrat. Blanda två substrat 1:1 (v/v) vid RT, lägg alla membran i samma låda och täck dem med substratblandningen i 2 min (i ett mörkt rum med rött ljus) vid RT. Fortsätt till proteindetektering med hjälp av en autoradiografifilm med flera exponeringstider. Vanligtvis testas en antikropp på ett membran som innehåller samma utspädning av hjärnan homogenat på två eller tre körfält och ett körfält med viktmarkören.
3. Immunocytochemical Förfaranden
- För att dissekera honungsbinhjärnor för immunocytokemi, immobilisera honungsbina i is i 30 s. När bina är immobiliserade, halshugga bimed sax och placera huvudet i en lösning på 4% paraformaldehyd i PBS. Arbeta under rökhuven.
VARNING: Kroppen måste kasseras noggrant eftersom buken fortfarande kan sticka efter halshuggning. - Försiktigt men snabbt ta bort antenner, sammansatta ögon, och skär runt toppen exoskelett med Barraquer Iris sax. Låt huvudena sitta i den fixativa lösningen i 10 min. Ta bort resten av huvudets exoskelett och skär alla återstående luftstrupen.
- Placera varje hjärna i ett mikrocentrifugrör på 1,5 ml som innehåller minst 1 ml 4 % paraformaldehydlösning och låt över natten få 4–8 °C.
- Gör en 7,6% agarose lösning genom att blanda 3,8 g agaros och 50 ml destillerat vatten i en Erlenmeyer kolv. Mikrovågsugn lösningen tills agarose liquifies.
OBS: Ett litet papper kan placeras i kolvens öppning för att förhindra att agaroslösningen svämmar över under uppvärmningen. - Placera den fasta honungsbina hjärnor (3-4 hjärnor) i en 35 mm Petri skålen och ta bort överskottet fixerande med mjukpapper. Häll den flytande agaroslösningen över hjärnan. Orientera hjärnan i agarose så att antennen lober är vända upp. Låt agarose svalna och stelna.
- Efter agarose har stelnat, skär ut block av agarose var och en innehåller en hjärna.
- För vibratome-snittning, förbered en 24-brunnsplatta med varje brunn som innehåller en korg med hydrofoba nät i botten. Fyll varje brunn med 600 μl PBS.
- Skär varje block i 70 μm tvärsnitt med hjälp av vibratomemaskinen och placera sektionerna i korgen som innehåller PBS.
Obs! - Tvätta hjärnan sektioner 6x i 10 min vardera med PBS-TX för att säkerställa att ingen fixerande kvar i sektionerna. Placera multiwell plattan på en orbital shaker och tvätta hjärnan på 210 rpm. Före varje tvätt se till att pbs-tx-lösningen byts ut mot färsk PBS-TX-lösning. Block med 1% normalt åsneserum under den senaste tvätten.
- För att testa den primära antikroppsantistoringen mot antimglutR1, bered en 1:112 spädning av anti-mGlutR1-antikroppar genom att lägga till 9 ml PBS-TX till 80 μL anti-mGlutR1-antikroppar i ett centrifugrör på 15 ml. Virvel röret kort att blanda ordentligt. Arbetsutspädningen av antikroppar fastställdes i preliminära experiment.
- För att testa den primära anti-RDL-antikroppen, förbered en 1:100 spädning av anti-RDL-antikroppar genom att tillsätta 30 μL anti-RDL peptid 1, 30 μL anti-RDL peptid 2 och 6 ml PBS-TX i ett 15 ml centrifugrör. Virvel röret kort att blanda ordentligt. Arbetsutspädningen av antikroppar fastställdes i preliminära experiment.
- Tillsätt 800 μL antikroppslösning till varje brunn i plattan. Täck multiwell plattan och linda den i aluminiumfolie för att förhindra nedbrytning från ljusexponering. Placera plattan insvept i aluminiumfolie på en orbital shaker och skaka på 210 rpm för 2 h. Lämna sedan över natten på RT utan att skaka.
- Efter hjärnsektionerna har lämnats över natten, tvätta med PBS-TX i 10 min. Upprepa tvättsteg 6x.
- Förbered de sekundära antikropparna (antikanin från åsna) genom att göra en spädning på 1:225 av sekundära antikroppar genom att 40 μl sekundära antikroppar tillsätts till 9 ml PBS-TX.
- Tillsätt 800 μL av den sekundära antikroppsspädningen till varje brunn. Täck plattan och linda den i aluminiumfolie. Placera plattan insvept i aluminiumfolie på orbital shaker och skaka på 210 rpm för 2 h. Lämna det sedan över natten på RT.
- Tvätta hjärnan sektioner 3x i 10 min vardera med PBS-TX och 3x med regelbunden PBS lösning.
- För inbäddning av sektionerna i bilderna, förbered monteringsmediet/glycerolinbäddningslösningen modifierad från Rodriguez et al.20. Tillsätt 5 g monteringsmediet i 20 ml PBS och rör om i 16 timmar med en magnetisk omrörare. Tillsätt 10 ml glycerol och rör om i ytterligare 16 timmar med en magnetisk omrörare. Centrifug i 15 min vid 4 000 x g, ta den flytande homogena supernatanten och aliquot i 1 ml-rör. Håll vid -20 °C
- Bädda in avsnitten på bilderna med en droppe monteringsmedium som förberetts i steg 3.17, se till att varje bild innehåller sektioner från en hjärna.
- Preadsorption kontroll av immunfärgning med konjugerade peptider
- För anti-RDL och konjugerade peptider, inkubera arbetsutspädning av anti-RDL antikroppar med motsvarande peptid konjugat över natten vid RT på shaker: villkor 1) 500 μg peptid konjugerat med Nyckelhål Limpet Hemocyanin (KLH) via glutaraldehyd; villkor 2) utan konjugat.
- Centrifug varje blandning i 10 min vid 10 000 x g och samla supernatanten från båda förhållandena (steg 3.19.1).
- Inkubera de seriella delarna av honungsbins hjärna med varje supernatant och process med de sekundära antikroppar som beskrivs ovan. Seriella avsnitt är avsnitt som följer varandra under vibratome snittning förfaranden, så samma del av hjärnan kommer att utsättas för positiva och negativa kontroller.
- För antimglutR1 och konjugerad peptid, inkubera arbetsutspädning av anti-mglutR1 antikroppar vid RT med KLH konjugerad peptid som innehåller10-4 M peptid (skick 1) och utan konjugat (tillstånd 2).
- Centrifuge varje blandning i 10 min vid 10.000 x g och samla supernatant från båda kontrollerna.
- Inkubera de seriella delarna av honungsbins hjärna med supernatant från båda förhållandena och processen med de sekundära antikropparna (steg 3.14-3.15).
- Bädda in avsnitt från båda villkoren på bilden med hjälp av inbäddningsmedia (steg 3.17).
4. Test av RDL och mGlutR1 Protein Expression efter immunocytokemi (avsnitt 3) i Honeybee Brain Efter injektion av motsvarande CRISPR-Cas9-system
- Designa guiderna med hjälp av ett CRISPR-Cas9-designverktyg online21 med hjälp av genomiska DNA-sekvenser av AmRdl (XM_006565102.3) och sekvenser av mGlutR1 (XM_006566244.3) (tabell 1). Beställ som Cas9 crRNA och Cas-9 tracrRNA med lysrörat ATTO550 i 5-änden. Beställ Cas9 Nuclease V3 (Se Materialförteckningen).
- Förbered komponenterna för CRISPR-Cas 9-systemet genom att göra ett 100 μM-lager av varje styrcrRNA och tracrRNA med nucleasefritt vatten. Aliquot och förvara vid -20 °C. Förbered arbetskoncentrationen av Cas-9-lösning genom att tillsätta 2,5 μl Cas 9 nuclease V3 (10 mg/ml) till 47,5 μL nukleotidfri buffert för att uppnå en slutlig koncentration på 0,5 μg/μL. Gör gRNA och RNP för injektion.
- Förbered gRNA-komplex bildning för varje guide RNA separat (guideRNA:tracrRNAATTO550)
- Märk ett provrör med namnet gRNA, tillsätt 92 μL nukleotidfri buffert, 4 μl 100 μM CRISPR-Cas9 tracrRNA- 5'ATTO550 och 4 μL i styrcrRNA-lösningen. Blanda försiktigt och snurra.
OBS: Exempel på märkning av gRNA-rör för RDL: GRDL1, GRDL2, GRDL3 (motsvarande RDL RNA-guider i tabell 1). Exempel på märkning av gRNA-rör för mGlutR1: GMGL1, GMGL2, GMGL3 (tabell 1). - Värm lösningen till 95 °C i 5 min för att skapa gRNA. Kyl blandningen vid RT i 10 min.
- Märk ett provrör med namnet gRNA, tillsätt 92 μL nukleotidfri buffert, 4 μl 100 μM CRISPR-Cas9 tracrRNA- 5'ATTO550 och 4 μL i styrcrRNA-lösningen. Blanda försiktigt och snurra.
- Förbered RNP komplex bildning (gRNA: S.p Cas9Nuclease), leveransblandningar och kontroll.
- Märk ett provrör med namnet på RNP, tillsätt 6 μL gRNA-lösning och 6 μL på 0,5 μg/μL S.p Cas9 Nuclease V3. Blanda försiktigt och inkubera lösningarna vid 37 °C i 10 min före injektion.
EXEMPEL PÅ RNP-röretiketter: RRDL1, RRDL2, RRDL3. - Gör en RNPRDLmix. För att förbereda den slutliga blandningen som används för injektioner, tillsätt 4 μL av varje RNP från RDL tillsammans. RNP/RDL-blandning = 4 μL RRDL1 + 4 μL RRDL + 4 μL RRDL3.
- Gör en RNPmGlutR1mix. Blanda 4 μL av varje RNP från mGlutR1 tillsammans för att förbereda den slutliga blandningen som används för injektionsvätskor (RNPmGlutR1mix) = 4 μL RMG1 + 4 μL RMG2 + 4 μL RMG3.
EXEMPEL PÅ RNP-röretiketter: RMG1, RMG2, RMG3. - Gör en kontrollnoguideRNA-lösning genom att blanda 4 μl tracrRNA, 92 μl buffert och 4 μL vatten i stället för guideRNA (se avsnitt 4.3). Blanda 6 μL av denna noguideRNA-lösning och 6 μl 0,5 μg/μL Cas9 Nuclease V3 (steg 4. 4.1) för att producera kontrollinjektionslösningen.
- Märk ett provrör med namnet på RNP, tillsätt 6 μL gRNA-lösning och 6 μL på 0,5 μg/μL S.p Cas9 Nuclease V3. Blanda försiktigt och inkubera lösningarna vid 37 °C i 10 min före injektion.
5. Injektionsförfarande
- Immobilisera varje bi som beskrivs i steg 1.3 och mata dem som i steg 1.4. Förbered sedan två uppsättningar av två trälådor för att frigöra bina i efter injektion: en vit låda (experimentellt tillstånd) och en svart låda (kontroll). Varje låda ska innehålla en liten kam och en utfodring petriskål. Ena sidan av varje låda är gjord av glas för att möjliggöra observation.
- Gör utfodring Petri rätter. Ta locket på en 35 mm Petri skålen, placera vax inuti ytan, och placera den nedre delen av Petri skålen på vaxet. Fäst plattan i lådan.
- Använd en 5 ml spruta, injicera 1M sackaros lösning mellan locket och den nedre delen av skålen. Bin kan snabbt sätta sina snabel mellan de två plattorna och kommer att hålla sig torr under en 48 h inkubationstid. Lägg en maträtt i varje låda.
- För att förbereda mikroinsprutningssystemet, fyll kapillärerna med mineralolja utan luftbubblor. Placera kapillärerna i injektorhållaren i mikroinsprutningssystemet. För att ladda kapillären med önskad injektionslösning, placera en hydrofoba film på en plan yta och pipettlösningen på den. Injicera oljan från kapillärerna och byt ut blandningen med motsvarande RNP-blandning.
- Använd mikroinjektionssystemet, injicera 345 nL RNP-blandningslösning direkt i varje bis medianocelli.
- För Injektion av RDL-CRISPR-Cas9 injiceras åtta bin med RNPRDLmix som bereds enligt beskrivningen i steg 4.4.2. Mata dem 1M sackaros efter injektionen. Släpp dem i den vita (experimentella) rutan med den lilla kammen och utfodring Petri skålen för 48 h. Använd ytterligare åtta bin som kontroller utan injektioner, mata dem, och släpp dem i den svarta (kontroll) rutan.
- För mGlutR1 CRISPR-Cas9 injicerar du nio bin med RNPmGlutR1mix som bereds enligt beskrivningen i steg 4.4.3. För kontroll injicera åtta bin med RNA-blandning utan guide (RNAmix_noguide) beredd enligt beskrivningen i steg 4.4.4. Mata dem 1M sackaros efter injektionen. Släpp bin från sina hållare i den vita lådan (experimentellt tillstånd) eller den svarta lådan (kontroll) som utarbetats enligt beskrivningen i avsnitt 5.1.
- Placera lådorna i en polystyrenbehållare med vått papper inuti för fukt. Lämna bin i 48 timmar och observera 2x per dag för att säkerställa att de har tillräckligt med mat och god luftfuktighet.
- Dissekera hjärnan hos varje bi efter 48 h (steg 3.1) och process för immunocytokemi enligt beskrivningen i avsnitt 3. För anti-mGlutR1 immunostainings använd steg 3.11 och för anti-RDL immunfläckar användning steg 3.12.
- Utför konfokal avbildning för att utvärdera nivån av fluorescens i immun-färgade hjärnan sektioner.
- För att utvärdera minskningen av protein i immunolabeled hjärnor, använd konfokal bildinsamling på samma nivå av vinst för både kontroll och injicerade hjärnor.
6. qPCR-baserad drop-off-analys för att utvärdera den modifierade genomiska RDL DNA 48 H Efter CRISPR Cas9 RNPRDLmix Injection
- Designa primers, kontroll sond och drop-off sond för att utvärdera mängden DNA som modifierats av CRISPR-Cas9 injektion. Varje primer är utformad så att den flankerar minst en CRISPR-Cas 9 guide och amplicon storlek är 132 bp. De grundfärger och sonder som används anges nedan:
RDL1_For: CTCGGAGTGACCACCGT
RDL1_Rev: CAACGAGGCGAACACCAT
RDL1_control_probe: /5HEX/CGA+C+G+TTT+A+C+CT/3IABkFQ/
RDL1_Drop-off_probe: /56-FAM/CCTA+C+G+T+CA+A+GT/3IABkFQ/- Se till att grundfärgerna motsvarar unika sekvenser som är specifika för området. Se till att avlämningssonden är utformad för det område som överlappar RDL-CRISPR-Cas9-guiden.
- För att testa om det finns en modifiering av gDNA i styrområdet, injicera 12 bin i ocelli med RNP_RDL blandning som beskrivs i steg 5.3.1 och använd åtta oinjicerade bin som kontroller.
- Dissekera binens hjärnor utan optiska lober 48 timmar efter injektionerna och extrahera gDNA för varje injicerad och kontroll bihjärnor (utan optiska lober) med hjälp av satsen enligt tillverkarens protokoll (se Materialförteckning).
- Utvärdera mängden, kvaliteten och renheten hos det extraherade gDNA-värdet med hjälp av en spektrofotometer.
- Kvantifiera det relativa uttrycket för modifierat gDNA av AmRDL med hjälp av qPCR-baserade drop-off-protokollet och PCR-cykelcykeln i realtid.
- Omblanda oligos till 100 μM, späd grundfärger till 10 μM och sonderna till 5 μM.
- Ställ in PCR-reaktionen i 96-brunnsplattan enligt bilden för ett prov av gDNA (3 repetitioner): 10 μl mastermix (se Materialtabell),1 μL framåtprimer, 1 μL omvänd primer, 1 μL kontrollsond, 1 μL avlämningssond, 2 μl gDNA (50 ng), 4 μl nucleasefritt vatten för att få den slutliga reaktionsvolymen till 20 μl.
Kontroller är lösningen i stället för prover och vatten i stället för sonderna. - Ställ in cykelprogrammet enligt följande för pcr-cykelcykeln i realtid: 95 °C i 3 minuter följt av 40 cykler på 95 °C i 15 s, 60 °C i 1 min.
- Utvärdera den relativa genmodifieringen med hjälp av2-ΔΔCt-metoden, där
Och
Och
7. Relativ kvantifiering av RDL RNA 48 H Efter RNPRDLmix Injektion
- För att testa om det finns en minskning av RDL mRNA, injicera 20 bin i ocelli med RNP_RDL blanda enligt beskrivningen i steg 5.3.1 och använd 12 oinjicerade bin som kontroller. Dissekera bihjärnorna (utan optiska lober) 48 timmar efter injektionerna, extrahera den totala mRNA från varje injicerat bi och separera med tillverkarens protokoll (se Materialförteckning).
- Avlägsna eventuella DNA-rester som finns kvar i provet med hjälp av ett DNA-fritt kit (se Materialtabell).
- Utvärdera kvaliteten och renheten hos de extraherade RNA med hjälp av en spektrofotometer.
- Kvantifiera amrdl-uttrycket med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt fluorescerande grönt RT-PCR-kit(Materialförteckning)på en PCR-cykeltur i realtid med tillverkarens protokoll för en 384-brunnsplatta.
Obs: I detta experiment användes tidigare publicerade primers. För AmRDL (AmRDL_F GGTCGATGGGCTACTACCTG; AmRDL_R TCGATCGACTTGACGTAGGA)22 och ställin primers som referensgen [AmActin_F TGCCAACACTGTCCTTTCTG; AmActin_R GAATTGACCCACCAATCCA]23. Det relativa genuttrycket beräknades med hjälp av metoden 2-ΔΔCt (steg 6.6).
8. qPCR-baserad avlämningsanalys för att utvärdera modifierat genomiskt DNA 48 H Efter RNPmGlutR1mix Injection
- Designa primers, kontroll och drop-off sonder för att utvärdera mängden DNA som modifierats av CRISPR-Cas9 injektion. Designa primers så att de flankerar minst en CRISPR-Cas 9 guide och amplicon storlek är 96 bp.
mGlutR1_For: GGTGAAACGAGAGAGAGAGAGA
AmGlurR1_Rev: GGAGAGAGGGAGCGAGAA
AmGlurR1_control_probe: /5HEX/CGAGG+G+AAA+CGA+GT/3IABKFQ/
AmGlurR1_Drop-off_probe: /56-FAM/CGA+C+A+C+CG+TC/3IABkFQ/
Kontrollera att grundfärger motsvarar unika sekvenser som är specifika för det område som borde ha ändrats. Avlämningssonden är utformad för det område som överlappade CRISPR-Cas9-guiden. - För att testa om det finns en modifiering av gDNA i styrområdet, injicera 12 bin i ocelli med RNP_ GlutR1 blandning som beskrivs i steg 5.3.1 och använda åtta oinjicerade bin som kontroller.
- Dissekera bihjärnorna (utan optiska lober) 48 timmar efter injektionerna och extrahera gDNA från varje injicerad och kontrollera bins hjärna (utan optiska lober) med hjälp av tillverkarens protokoll (se Materialtabell).
- Utvärdera mängden, kvaliteten och renheten hos det extraherade gDNA-värdet med hjälp av en spektrofotometer.
- Kvantifiera den relativa ändringen av gDNA AmGlutR1 med hjälp av qPCR drop-off-protokollet och pcr-cykelcykeln i realtid enligt beskrivningen i steg 6.5.
- Utvärdera den relativa genmodifieringen med hjälp av2-ΔΔCt-metoden, där
Och
Och
9. Kvantifiering av mGlutR1 RNA 48 h Efter RNPmGlutR1mix Injektion
- För att testa om det finns en minskning av mGlutR1 RNA mRNA, injicera sex bin i ocelli med RNP_RDL blandningen enligt beskrivningen i steg 5.3.2 och använd sex oinjicerade bin som kontroller. Dissekera bihjärnorna (utan optiska lober) 48 timmar efter injektionerna, extrahera den totala mRNA från varje injicerat bi och separera med hjälp av tillverkarens protokoll för RNA-isolering (se Materialtabell).
- Avlägsna eventuella DNA-rester som finns kvar i provet med hjälp av ett DNA-fritt kit (se Materialtabell).
- Utvärdera kvaliteten och renheten hos de extraherade RNA med hjälp av en spektrofotometer.
- Kvantifiera uttrycket av mGlutR1 med hjälp av ett SYBR Green RT-PCR-kit (se Materialförteckning)på en PCR-cykelväg i realtid med det protokoll som föreskrivs för 384-brunnssatsen. Använd följande grundfärger för mGlutR1 (mGlut_F CCTCCTCAACGTCTCCTTCATA; mGlut_R TGCCGTGTTCCGATTT) och ställin primers som referensgen [AmActin_F TGCCAACACTGTCCTTTCTG; AmActin_R GAATTGACCCACCAATCCA]. Beräkna det relativa genuttrycket med hjälp av metoden 2-ΔΔCt (steg 8.6).
Representative Results
Anti-RDL antikroppstester
Antikropparna tillverkades mot RDL peptidkonjugat som visas i figur 1A. Det första steget i att karakterisera anti-RDL antikroppar är att kontrollera homogenatet av proteinet utvinns ur bihjärnan med hjälp av en västerländsk fläck med anti-RDL antikroppar och en HRP-märkt get anti-kanin IgG sekundär antikropp(figur 1A, infoga). Båda anti-RDL antikroppar kände igen bandet ligger på ~ 50-60 kD (pil), vilket motsvarar den beräknade vikten av RDL subunit isoform proteiner. För att visa att anti-RDL antikroppar kände igen peptid i hjärnan skivor, använde vi en preadsorption kontroll(Figur 1B, C). När antikroppar preincubated med konjugerade peptider, färgning på avsnittet var frånvarande. Detta visade att anti-RDL antikroppar kände igen konjugerade peptid mot vilken de höjdes. För att visa att anti-RDL antikroppar känner igen proteinet i den fasta hjärnvävnaden, använde vi CRISPR-Cas9 att slå ut RDL genen som producerar RDL protein i cellerna. Figur 1D1-3, visar kontroll frontalbee hjärnan sektioner som var märkta med anti-RDL antikroppar. Detta bi injicerades inte med RDL-CRISPR-Cas9 RNP. I figur 1D1,anti-RDL etiketter neuropils i den främre delen av bihjärnan. Samma frontalavsnitt i figur 1D2 visar frånvaron av fluorescens från ATTO550, eftersom RDL-CRISPR-Cas9-komplexet inte injicerades.
Figur 1E1-E3 visar en hjärndel från ett bi injicerat med RDL-CRISPR-Cas 9 och bearbetas sedan med samma mängd antikroppar som kontrollhjärnan i figur 1D1-D3. Anti-RDL-färgningen minskade signifikant i hela hjärnan 48 h efter injektionen, och fördelningen av ATTO550 färgning i hjärnan(figur 1E2) visar framgången för RDL-CRISPR-Cas 9 injektioner i bi median ocelli. De många spridda cellerna i hjärnan uppvisar ATTO550. Den framgångsrika injektionen av RDL-CRISPR-Cas 9 minskade proteinuttrycket jämfört med kontrollen (figur 1E1-3). Från åtta immunostained bihjärnor, bara en hjärna hade en hög distributionsnivå av RDL-CRISPR-Cas9 i cellerna i svamp kropp, protocerebrum, och antennal lob, medan andra hjärnor hade cell färgning med ATTO550 i svamp kroppen calyx, centralt komplex, men inte antennal lob. Det är viktigt att notera att i dessa bin, minskning anti-RDL immunfärgning var inte lika dramatisk som i hjärnan som visas i figur 1E1.
För att uppskatta nivån på den modifierade RDL gDNA i bina 48 h efter RDL-CRISPR-Cas9 injektion, utförde vi en qPCR drop-off test, där drop-off sonden var avsedd att matcha området för en av RDL gRNAs. I dessa experiment, i bihjärnor injiceras med RDL-CRISPR-Cas 9, motsvarade den relativa minskningen av fluorescensan antalet modifierade gDNA i proverna. I våra tester var det område som motsvarar denna vägledning i gDNA hos 12 bin som injicerats med RDL-CRISPR-Cas9 64 % ± (medelvärde ± 30 %SD) jämfört med gDNA hos icke injicerade bin(figur 3A).
För att uppskatta nivån på RDL RNA i bina 48 timmar efter injektion, utförde vi qRT-PCR i en separat grupp av bin(figur 3B). Vi jämförde nivån av RDL RNA av RDL-CRISPR-Cas 9 injicerade bin (n = 19) med nivån av RNA hos bin som inte injicerades (n = 12). I dessa experiment var den relativa minskningen av mRNA RDL 59 % ± (medelvärde ± 15 % SE) jämfört med nivån av RNA hos icke injicerade bin. När vi undersökte nivån på RDL RNA i varje bi individuellt, endast 13 bin av 19 bin visade en betydande minskning av RNA. Dessa data tyder på att injektion av RDL-CRISPR-Cas9 genom ocelli kanske inte alltid når ett stort antal hjärnceller, vilket bekräftar data med RDL immun-färgade RDL-CRISPR-Cas9 injicerade bin. I dessa preparat hade endast ett bi av 8 RDL CRISP-Cas9 i många hjärnceller (svampkropp, protocerebrum och antennal lob) jämfört med andra bihjärnor, där fördelningen av RDL-CRISPR-Cas9 var koncentrerad till celler i protocerebrum (svampkroppen calyx och centralt komplex) men inte antennal lob (figur 4A-D).
Anti-mGlutR1 antikroppar tester
Vi använde anti-mGlutR1 antikroppar som produceras hos kanin mot konjugerade peptider specifika för Drosophila melanogaster (figur 2A). Sekvensen av denna peptid visar en 94% identitet med bipeptid (CLSDKTRFDYFARTVPPD) Figur 2A. Först kollade vi antikropparmot bihjärnan protein med immunoblotting. Bihjärnan homogenat e separerades med 10% SDS-PAGE och elektroforiskt överförs från till en nitrocellulosa membran och färgas med anti-mGlutR1. Insatsen i figur 2A visar två band med uppskattade vikter (103 och 83 kD) motsvarande två isoformer. När vi testade denna antikropp på honungsbina hjärnor, fann vi att de etikett neuropilar profiler och celler i bi hjärnan avsnitt som illustreras i figur 2B, D. Efter preadsorption av anti-mGlutR1 antikropp med konjugerad-mGlutR1 peptid, den specifika färgning försvann i bi hjärnan skiva (Figur 2C). Detta bekräftar att anti-mGlutR1 antikroppar känner igen peptid (Figur 2C). Därefter injicerade vi en blandning av mGlutR1-CRISPR-Cas9 i medianocelli och använde kontrollnoguideRNA. Hos kontrollbin (n = 7) koncentrerades inte fluorescensen från ATTO550 till cellerna. Vissa hjärnor hade spridda fluorescens ATTO550 märkning. Kontrollpreparatet i figur 2D1-3 visar således anti-mGlutR1 färgning i hjärnan men inte ATTO550 fluorescens. När mGlutR1-CRISPR-Cas9 injicerades i ocelli och togs upp av många celler minskade fluorescensnivån hos de sekundära antikropparna signifikant i det område som tar upp den funktionella mGlutR1RNP(figur 2E1-3). Bina övervakades för 48 h, och ett bi från varje experimentellt tillstånd hittades död. Således, i detta experiment, kontrollerade vi sju kontroll bin och åtta CRISPR-Cas9 bin. Alla bin som injicerades med CRISPR-Cas9 hade celler som tog i mGlutR1-CRISPR-Cas9. De flesta av dessa celler var i svampkroppen foder, centrala komplex och bakre protocerebrum. Endast två bin av sju visade ATTO550 märkning i många celler i svampkroppen, centrala komplex, och antennal lob. Ett exempel på ett av dessa bin visas i figur 2E. Minskningen av nivån av mGlutR1 färgning i dessa preparat var betydande. De övriga fem bina har ATTO550 märkning som motsvarar en lyckad leverans av mGlutR1 CRISPR-Cas9 i svampkroppen och bakre protocerebrum men inte i antennal loberna.
För att beräkna nivån på den modifierade mGlutR1 gDNA i bina 48 h efter injektion, utförde vi ett qPCR-baserat drop-off-test, där avlämningssonden var avsedd att vara i området nära mGlutR1-guiden. I dessa experiment, i de bihjärnor som injicerats med mGlutR1-CRISPR-Cas 9, var den relativa modifieringen av gDNA hos 12 bin 59% ± (medelvärde ± 33 %SD) jämfört med gDNA hos icke injicerade bin(figur 3A).
Dessa resultat bekräftades också av qRT-PCR-tester i en annan grupp av bin, där vi uppskattade mGlutR1 RNA-nivåerna med qRT-PCR hos bina 48 timmar efter injektioner med RNPmGlutR1mix(figur 3B). Vi jämförde nivån av mGlutR1 RNA av mGlutR1-CRISPR-Cas9 injicerade bin (n = 6) med RNA-nivåerna hos bin som inte injicerades (n = 6). I dessa experiment var den relativa minskningen av mRNA mGlutR1 hos injicerade bin 53% ± (medelvärde ± 18% SE) jämfört med oinjicerade bin(figur 3B).
Avsnittet från fyra olika bin som uttryckte RNP RDL-CRISPR-Cas9 i Kenyon cell svamp kropp visas i figur 4A-D. Exemplet bee med ATTO550 fluorescens i svampkroppen och antennal loben visas i figur 4E, F.
| Guider | Sekvenser | gRNA (på 488) | Rnp (olika) |
| - Jag har inte tid med det här. | -Jag har inte tid med det här. | ||
| RDL_Guide1 | ACCGTAACGCGACCCCCGCT | Grdl1 (på 1960-) | RRDL1 (på 1960-) |
| RDL_Guide2 | AACGTCGATCGACTTGACGT | Grdl2 (på 4766) | RRDL2 (på 4700-) |
| RDL_Guide3 | CcatgacgAAACACGTGCCC | Grdl3 (på 1960-) | RRDL3 (på 1960-) |
| mGlu_Guide 1 | CGAAAGTTATCTGACGGTGT | GMGL1 (på 1960-) | Rmgl1 (på 1960-) |
| mGlu_Guide 2 | TTCAACGAGAGCAAGTTCAT | Gmgl2 (på 1960-) | Rmgl2 (på 1960-) |
| mGlu_Guide 3 | GcaaACGTCGGTAGGAGTGA | Gmgl3 (på 1960-) | Rmgl3 (på 1960-) |
Tabell 1: Nukleotidsekvenser av styrskenor avsedda för RDL och mGlutR1.
Figur 1: Karakterisering av anti-RDL-antikroppar. (A)Schematiskt för RDL-underenheten, där de rosa cirklarna indikerar lokaliseringen av peptid 2 (extracellulärt CVNEKQSYFHIATTSNEFIRI-amide) i N-ändstationen och peptid 1 (intracellulära CVRFKVHDPKAHSKGGTL-amide) i C-ändstationen. Insatsen i A visar banden i den västra fläcken av honungsbina hjärnextrakt bearbetas med motsvarande anti-RDL antikroppar (en med anti-RDL pep1 och anti-RDL pep2). Varje immunoblot visar den skenbara storleken på proteinet ~ 50-60 kD, vilket motsvarar de uppskattade vikterna i de olika isoformen av RDL-underenheterna. (B,C) Preadsorption av anti-RDL antikroppar med konjugerad peptid 1. Bilden i C visar en minskning av färgning i avsnittet när antikropparna var preincubated med konjugerad peptid 1. Den fläktformade kroppen (Fb) och Ellipsoid kroppen (eb) är centrala komplexa strukturer i hjärnan. M = medial lob av svamp kropp. (D1-3) Anti-RDL färgning av en kontroll, oinjicerade bi hjärnan avsnitt efter 48 h. Green indikerar anti-RDL positiv profil i hjärnan. (D2) Detta bi injicerades inte och innehåller inte ATTO550 fluorescens. (D3) Sammanfogade bilder från D1 och D3. (E1-3) Injektionen av RDL-CRISPR-Cas9 minskade anti-RDL-färgning efter 48 h. (E2) ATTO550 fluorescens i cellkärnorna indikerade framgångsrik RDL-CRISPR-Cas9-leverans. (E3) Den sammanslagna bilden av anti-RDL (grön) och ATTO550 (röd). Skalstång = 100 μm (B-E). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Karakterisering av anti-mGlutR1 antikroppar. (A)Schematisk gcpr mGluR som visar Drosophila melanogaster peptid som används för immunisering. Som jämförelse visas Apis mellifera peptid nedan. Cirkeln indikerar lokaliseringen av peptid i N-ändstationen för mGlutR1-receptorn extracellulär domän. Insatsen i A visar att anti-mGlutR1 antikroppar kände igen två band i västra fläckav bihjärnor ~ 103 kD och ~ 83 kD som motsvarar de uppskattade vikterna av kända isoformer. (B,C) Preadsorption kontroll av anti-mGlutR1 antikroppar i två på varandra följande delar av antennal lob glomeruli. Bilden av anti-mGlutR1 i den antennalglomeruli sektionen i C visar minskningen av färgning en följd av preinkubation av anti-mGlutR1 peptid med anti-mGlutR1 antikropp. Detta förfarande orsakar antikroppen att utlösa ur lösningen, som avskaffar färgning i jämförelse med B (kontroll, avsaknad av peptid i preinkubationen). (D1) visar färgning av anti-mGlutR1 i en bihjärnskiva efter en kontrollinjektion i medianocellus. Denna injektion saknade mGlutR1 gRNA som möjliggör att mGlutR1-receptorer knackade på mGlutR1-receptorer med CRISPR-Cas9, och därmed reducerades inte färgningen av antimGlutR1-antikroppen (grön). (D2) Frånvaron av ATTO550 fluorescens indikerar frånvaron av funktionella CRISPR-Cas9 i hjärnan. (D3) Sammanslagna bilder av anti-mGlutR1 och ATTO550. (E1-E3) visar färgning av anti-mGlutR1 i en hjärnavdelning där mGlutR1 har slagits ned 48 timmar permanent efter injektion med mGlutR1-CRISPR-Cas 9 i medianocellus. Således är färgningen i denna hjärna kraftigt reducerad på grund av den framgångsrika knockout en mGlutR1 i många celler. (E2) ATTO550 färgning i många cell kärnor i bi hjärnor indikerar att injektion av mGlut1-CRISPR-Cas 9 var framgångsrik. (E3) Sammanslagen bild av ATTO550 (röd) och anti-mGlutR1 (grön). Skalstång = 10 μm (B,C); 100 μm (D,E). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Utvärdering av modifierad gDNA och uttryck för mRNA av RDL och mGlutR1 mRNA i bins hjärnor 48 timmar efter injektion med 345 nL motsvarande RPN CRISPR-Cas9. (A) Det qPCR-baserade drop-off-analystestet för att utvärdera mängden gDNA med ett modifierat område beräknades med 2-ΔΔCt-metoden och normaliserades mot kontroll, oinjicerade hjärnor. Uppgifterna uttrycks som medelvärde + SD. (B) TheqRT-PCR-testet användes för att utvärdera mängden mRNA hos CRISPR-Cas9 injicerade och oinjicerade bin. AmActin användes som referensgen. Det relativa genuttrycket beräknades med 2-ΔΔCt-metoder och normaliserades mot kontroll, oinjicerade hjärnor. Uppgifterna uttrycks som medelvärde + SE. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Exempel på fördelningen av RNP CRISPR-Cas9 i bihjärnor via ATTO550 fluorescens. - Jag har intetid med det här. Hjärnan delar upp från fyra olika bin som uttryckte RNP RDL-CRISPR-Cas9 i Kenyon cellen i svampkroppen. - Jag har intetid med det här. Exempel på två hjärnor 48 timmar efter injektion med RNPmGlutR1 CRISPR-Cas9. Skalstång = 150 μm (A-F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Karakterisering av anti-RDL och anti-mGlutR1
Först karakteriserade vi anti-RDL och anti-mGlutR1 antikroppar genom immunoblot och pre-adsorption på skivor av fasta honungsbin hjärnor. Varje antikropp gjordes för att känna igen alla dess kända isoformer, och västerländsk analys visar att de känner igen band som motsvarar deras förutspådda molekylvikter. Därefter blockerades båda antikropparna av den konjugerade peptid mot vilken de producerades på honungsbina hjärnsektioner.
Ett av de första målen i vår studie var att fastställa att de antikroppar som produceras mot den specifika konjugerade peptid är specifika för dess protein i fast hjärnvävnad. För detta ändamål drog vi nytta av CRISPR-Cas9-systemet. Vi designade specifika guider för honungsbina RDL och mGlutR1 och använde var och en av dem för att göra CRISPR-Cas9 märkt med fluorescerande sonden ATTO550. För varje receptor injicerade vi en blandning av tre olika CRISPR-Cas9 ribonucleoproteiner i ocelli för att minska mängden av det riktade proteinet i den vuxna honungsbina hjärnan genom att eliminera motsvarande gen i celler som tog upp vårt designade Cas9-system. I vår studie, vi åstadkommit detta steg.
Ett av de första avgörande stegen för att lyckas med dessa experiment är att utforma lämplig guide RNAs. Vi rekommenderar att du utformar upp till fem guide RNAs, som ligger i början, mitten och slutet av gensekvensen. I vårt preliminära arbete testade vi dem i olika kombinationer på tre till fem bin. Vi försökte också olika koncentrationer av injektioner, liksom gånger efter injektion, och olika blandningar av RNP i injektionerna. Vi dissekerade ut hjärnor och bearbetade dem med anti-RDL och anti-mGlutR1 antikroppar. I dessa inledande tester fastställde vi lämplig kombination, efter injektionstiden, liksom koncentrationen och mängden CRISPR-Cas9 för injektion. Dessa inledande tester var grunden för att inrätta de experiment som vi beskrev i detalj här.
Målet var dubbelt: 1) att på ett bi visa att vår antikroppsfärgning reducerades efter behandling med CRISPR-Cas9 och 2) för att arbeta igenom de bästa experimentella förutsättningarna för beteendestudier. Således visar vi att om många cell kärnor innehåller CRISPR-Cas9 48 h efter injektion, är minskningen av anti-RDL och anti-mGlutR1 färgning betydande. Dessutom, som visar att de testade antikropparna specifikt känner igen mGlut1 och RDL protein i honungsbina hjärnan beredning och att de kan användas för lokalisering studier i honungsbiet hjärnan.
Experimentell inställning CRISPR-Cas9 för beteendestudier
Därefter satte vi upp experimenten så att CRISPR-Cas9 kan användas i beteendestudier. Åtta eller nio honungsbin samlades in för kontroll och experimentella behandlingar. De testades beteendemässigt före och efter injektion, och sedan deras hjärnor bearbetades för ATTO550 och/ eller immunocytokemi för att bestämma hjärnan regioner som visade minskning av målproteinet. Här är det viktigt att notera att antalet bin som togs för en uppsättning experiment var begränsat till högst 8-9 bin för kontroll och experimentella förhållanden. På så sätt kan båda förhållandena testas samma dag. Också, när vi förberett CRISPR-Cas9 blandningar för injektion, frös vi aldrig dem. CRISPR-Cas9-blandningen förändrades inte i styrka när den användes 3 dagar i rad och förvarades vid 4–8 °C. Men vi har inte testa det efter 3 dagar.
Som vi beskrev i resultatsektionen för båda uppsättningarna experimentella injektioner och för båda antikropparna visade endast tre bin från 16 testade en stor fördelning ATTO550 i svampkroppen, protocerebrum och antennallober. I alla andra bin var distributionen av CRISPR-Cas9 begränsad till svampkroppen, det centrala komplexet och/eller bakre protocerebrum. Det är viktigt att förstå för alla beteendestudier att använda denna injektionsmetod minskningen av målprotein kommer att begränsas endast till svampkroppen i de flesta bina. Det kommer inte att sträcka sig till antennal lob eller subesophageal ganglion. Således är injektionstekniken som vi använder lämplig att studera effekten av minskningen av receptorer i svampkroppen och det centrala komplexet i beteendeexperiment, medan en annan metod för att införa CRISPR-Cas9 kommer att vara lämpligare för att studera andra hjärnregioner.
Sammanfattningsvis visade vår studie en framgångsrik tillämpning av CRISPR-Cas9 som en kontroll för antikroppsfärgning i hjärnan. För båda antikropparna (anti-RDL och anti-mGlutR1) var nivån på motsvarande antikroppsfärgning också signifikant när upptaget av mGlutR1-CRISPR-CAS9 eller RDL-CRISPR-Cas9 lyckades. Det är också viktigt att notera att injektion i ocelli ledde till en fördelning av CRISPR-Cas9 i hjärnan som inte var homogen. Fördelningen varierade från ett minimalt område som omger ocelli och svamp kropp till många celler i hela hjärnan. Variabiliteten hos upptaget av mGlutR1- eller RDL-CRISPR-Cas9 av cellerna berodde sannolikt på variation i injektionerna. Våra data visar att CRISPR-Cas9-systemet fungerar i honungsbin, men injektionsmetoden måste förbättras för att minska variationen i CRISPR-Cas9-upptaget i enskilda bins hjärnor. Inom dessa begränsningar är det nu möjligt att använda denna teknik för att manipulera gener hos vuxna bin för beteendeexperiment.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av följande utmärkelser till BHS: Human Frontiers Science Program; NIH NIGMS (R01 GM113967); NSF Idéer Lab (1556337). Peptid och antikroppar för DmGluRA utformades i laboratoriet Dr Serge Birman (Marseille, Luminy, Frankrike) när IS stöddes av Programme d'Urgence FRM / Postdocs UFP20060306548 från Fondation pour la Recherche Medicale. Vi är tacksamma för Daniela Junqueira Marosi och Alex Hanter från Integrated DNA Technology (IDT) för hjälp med utformningen av RDL guider och qPCR drop-off analyser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283_100 mL | western blotting |
| Acrylamide-bis Acrylamide | Bio-Rad | 500 mL 1610156 | western blotting |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A0169-250g | used with distilled water to fix honey bee brain in blocks |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Research Laboratories | 711-546-152 | secondary antibody to reveal the primary antibodies from rabbit |
| Alt-R CRISPR-cas9 tracrRNA-5'ATTO | IDT | 1075934 | with desinged guide RNA, it creates gRNA |
| Alt-R S.p. Cas9 nuclease V3 | IDT | 1081058 | enzyme used to make ribonucleoprotein for CRISPR system |
| Ammonium Persulfate | Bio-RAD | 10 g 1610700 | western blotting |
| Anti-mGlutR1 antibodies | Covalab (FRANCE)/21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of mGlut 1 in honey bees |
| Anti-RDL antibodies | 21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of RDL in honey bees |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | Y0001154 | protease inhibitor |
| Barraquer Iris Scissors 7mm Blade Sharp point | World Precision Instruments | 14128-G | used for dissection honey bee brain |
| Benzamidine | Sigma-Aldrich | 12072 | protease inhibitor |
| Blade (breakable) for blade holder | Fine Science Tool | 10050-00 | dissection for western blotting |
| Blade holder and breaker | Fine Science Tool | 15309 | dissection for western blotting |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100 F | for injection procedure |
| Chemiluminescent western blot detection substrate | Bio-Rad | 1705062 | western blotting |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 472476-50mL | RNA isolation |
| Dithiothreitol | Bio-Rad | 1610611 | western blotting |
| DNA easy kit | QIAGEN | 69504 | DNA extractionuj |
| DNA-free kit | INVITROGEN | AM1907 | Used to remove DNA |
| Eppendorf Research plus pipette, 3-pack | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
| Falcon 24 Well Polystyrene Multiwell | Falcon | 351147 | Multiwell |
| Flat Bottom Embedding Capsules, Polyethylene | Electron Microscopy Science | 70021 | basket for brain sections |
| Forceps Dumont #5 (pair) | Fine Science Tool | 11254-20 | for dissection of honey bee brain from the head |
| Forceps Dumont #5S (pair) | Fine Science Tool | 11252-00 | to clean up the brain from trachea befor dissection |
| Gene Expression Master Mix | Integrated DNA Technologies | 1055770 | qPCR drop off assay |
| Glutaraldehyde | EMS | 16220 | used for preparation of peptide conjugates for control peabsorption |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500 mL | western blotting, embedding media |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | western blotting |
| Hydrophobic filtered nylonmesh | Spectrum Labs | 145910 | for bottom of basket for brain sections |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-50mL | RNA isolation |
| Keyhole limpet hemocyanin | Sigma-Aldrich | H7017 | used for preparation of conjugates for control |
| LSM800 cofocal microscope | Zeiss | ||
| mGlu_Guide 1 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
| mGlu_Guide 2 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
| mGlu_Guide 3 | IDT | designed guide RNA for CRISPR. Target mGlutR1 genome sequences | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | western blotting |
| 96-well PCR microplate | Applied biosystem | 4346907 | qPCR drop off assay and qRT-PCR |
| 384-well PCR microplate | Sigma-Aldrich | Z374911 | qRT-PCR |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904_500mL | for injection procedure |
| Model p87 Flaming Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Capillary Preparation | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | for embedding solution |
| Nanoliter 2000 | World Precision Instruments Nanoliter | Injection Apparatus | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Research Laboratories | AB_2337258 | blocking agent for immunocytochemistry |
| Non-immune Goat Serum | Invitrogen | 50-062Z 100 mL | blocking agent for immunoblotting |
| Nuclease-free buffer | IDT | 1072570 | Nuclease-free buffer that is used in the preparation of CRISPR-Cas9 injection |
| Nuclease-free water | IDT | AM9337 | nuclease -free water that is used in preparation of CRISPR-Cas 9 system |
| OrbitalShaker Mp4 | Genemate | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500 g | used with PBS to make fixative for bee brains |
| Phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626-250 mg | protease inhibitor |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | Used with Paraformaldehyde as fixative; buffer for antibodies |
References
- Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current Protocols in Human Genetics. 83 (15), 7-27 (2014).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Kouranova, E., et al. CRISPRs for Optimal Targeting: Delivery of CRISPR Components as DNA, RNA, and Protein into Cultured Cells and Single-Cell Embryos. Human Gene Therapy. 27 (6), 464-475 (2016).
- Schubert, M., et al. Fluorescently labeled tracrRNA provides efficient genome editing while allowing cellular microscopy and FACS analysis. Genome Editing. , www.idtdna.com 1-3 (2017).
- Kucharski, R., Mitri, C., Grau, Y., Maleszka, R. Characterization of a metabotropic glutamate receptor in the honeybee (Apis mellifera): implications for memory formation. Invertebrate Neuroscience. 7 (2), 99-108 (2007).
- Aronstein, K., Auld, V., Ffrench-Constant, R. Distribution of two GABA receptor-like subunits in the Drosophila CNS. Invertebrate Neuroscience. 2 (2), 115-120 (1996).
- Thompson, M., Steichen, J. C., ffrench-Constant, R. H. Conservation of cyclodiene insecticide resistance-associated mutations in insects. Insect Molecular Biology. 2 (3), 149-154 (1993).
- Chung, B. Y., Kilman, V. L., Keath, J. R., Pitman, J. L., Allada, R. The GABA(A) receptor RDL acts in peptidergic PDF neurons to promote sleep in Drosophila. Current Biology. 19 (5), 386-390 (2009).
- Taylor-Wells, J., Hawkins, J., Colombo, C., Bermudez, I., Jones, A. K. Cloning and functional expression of intracellular loop variants of the honeybee (Apis mellifera) RDL GABA receptor. Neurotoxicology. 60, 207-213 (2017).
- Jones, A. K., Sattelle, D. B. The cys-loop ligand-gated ion channel superfamily of the honeybee, Apis mellifera. Invertebrate Neuroscience. 6 (3), 123-132 (2006).
- Dupuis, J. P., et al. Homomeric RDL and heteromeric RDL/LCCH3 GABA receptors in the honeybee antennal lobes: two candidates for inhibitory transmission in olfactory processing. Journal of Neurophysiology. 103 (1), 458-468 (2010).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
- Guo, X., Wang, Y., Sinakevitch, I., Lei, H., Smith, B. H. Comparison of RNAi knockdown effect of tyramine receptor 1 induced by dsRNA and siRNA in brains of the honeybee, Apis mellifera. Journal of Insect Physiology. 111, 47-52 (2018).
- Roth, A., et al. A genetic switch for worker nutrition-mediated traits in honeybees. PLOS Biology. 17 (3), e3000171 (2019).
- Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of Knockout Mutants by CRISPR/Cas9 in the European Honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science (BIOONE). 33 (5), 505-512 (2016).
- Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-Efficiency CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing in Honeybee Apis mellifera Embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
- Smith, B. H., Burden, C. M. A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research. Journal of Visualized Experiments. (91), e51057 (2014).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Protein Blotting Guide. , BIO-RAD. http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_2895.pdf (2019).
- Rodriguez, J., Deinhardt, F. Preparation of a semipermanent mounting medium for fluorescent antibody studies. Virology. 12, 316-317 (1960).
- Custom Alt-R® CRISPR-Cas9 guide RNA. , Integrated DNA Technologies. https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM (2019).
- Bonnafe, E., et al. Effect of a thymol application on olfactory memory and gene expression levels in the brain of the honeybee Apis mellifera. Environmental Science and Pollutant Research (International). 22 (11), 8022-8030 (2015).
- Wang, Y., et al. Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honeybee ovaries. Journal of Experimental Biology. 215 (Pt 1), 124-134 (2012).
