Summary
Præsenteret her er en protokol til at bruge CRISPR-Cas9 system til at reducere produktionen af et protein i den voksne honningbi hjerne til at teste antistof specificitet.
Abstract
Cluster Regelmæssigt Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associeret protein 9 (Cas9) er et genredigeringsteknik, der i vid udstrækning anvendes i undersøgelser af genfunktion. Vi bruger denne metode i denne undersøgelse til at kontrollere for specificiteten af antistoffer udviklet mod insektet GABAA receptor subunit Resistens over for Dieldrin (RDL) og en metabotropic glutamat receptor mGlutR1 (mGluRA). Antistofferne blev genereret i kaniner mod de konjugerede peptider, der er specifikke for bananfluer (Drosophila melanogaster) samt honningbier (Apis mellifera). Vi brugte disse antistoffer i honningbi hjerne sektioner til at studere fordelingen af receptorer i honningbi hjerner. Antistofferne blev affinitet renset mod peptidet og testet med immunblotting og den klassiske metode til preadsorption med peptid konjugater for at vise, at antistofferne er specifikke for de tilsvarende peptid konjugater, som de blev rejst. Her udviklede vi CRISPR-Cas9-teknikken til test for reduktion af proteinmål i hjernen 48 timer efter CRISPR-Cas9 injektion med guide-RNA'er designet til den tilsvarende receptor. CRISPR-Cas9-metoden kan også bruges i adfærdsanalyser hos de voksne bier, når et eller flere gener skal ændres.
Introduction
Det nyligt opdagede CRISPR/Cas9-system er et kraftfuldt værktøj, der er blevet brugt til at ændre genomisk DNA i forskellige modelsystemer og organismer. Det har fremskyndet biomedicinsk forskning og store teknologiske gennembrud ved at gøre genommodifikation mere effektiv og robust end tidligere metoder1. Hjemmehørende i S. pyogenes bakterier, systemet er afhængig af en Cas9 endonuclease, hvis aktivitet fører til dobbelt-strandede pauser (DSBs) i DNA, og en guide RNA (gRNA), der dirigerer Cas9 protein til en bestemt, sekvens-afhængige placering2. Dobbeltstrengede pauser genereret af CRISPR/Cas9 kan repareres via ikke-homolog sluttilslutning (NHEJ), en fejlbehæftet proces, der kan føre til frameshifts, eller homologi direkte reparation, når en donorskabelon er til stede. GRNA består selv af et målspecifikt CRISPR RNA (crRNA) og et universelt transaktiverende crRNA (tracrRNA), som kan syntetiseres kemisk og leveres med renset Cas9 nuklease som ribonucleoproteinkompleks (RNP)2,3. Fluorescerende mærkning af gRNA eller Cas9 nuclease kan give mulighed for påvisning og intracellulær visualisering af molekylære komponenter via fluorescerende mikroskopi4.
I vores nuværende arbejde udnytter vi CRISPR-Cas9-systemet til at reducere proteinniveauet i voksne honningbihjerner. Vi undersøgte den metabotropic glutamatreceptor (mGluR) og anti-mGlutR1 receptorantistoffer og GABA A-receptorens underenhed RDL og anti-RDL antistoffer. Vi udviklede en enkel metode til at reducere mængden af protein i hjernen hos den voksne honningbi og brugte det til at drive yderligere test af de antistoffer, der er udviklet mod de tilsvarende proteiner. Overvågning af CRISPR-Cas9's fluorescens gjorde det muligt for os at anslå de områder og celler, der er involveret i reduktionen af proteinet.
Ved hjælp af denne metode karakteriserede vi også de anti-mGlutR1 antistoffer, der blev fremstillet i kaniner mod det konjugerede peptid. Honningbigenomet koder en meget bevaret AmGluRA (navngivet mGlutR1 i henhold til NCBI-nomenklaturen) metabotropic glutamatreceptor5. Honningbi mGlutR1-genet har fire forudsagte splejsningsvarianter i henhold til NCBI-databasen. Det er blevet rapporteret, at det er udtrykt i centralnervesystemet (CNS) af både pupal og voksen bi stadier, og det er involveret i langsigtet hukommelse dannelse5. Antistoffer udviklet mod mGlutR1 kan være et vigtigt redskab til at studere det glutamatergic system i læring og hukommelse proces i honningbier.
I vores undersøgelser karakteriserede vi også anti-RDL antistoffer udviklet i kaniner, der er immuniseret med konjugerede peptider fra Apis mellifera RDL-receptorens underenhed. Honeybee Rdl-genet, AmRdl (XM_006565102.3, NCBI-databasen), har 14 forudsagte splejsningsvarianter. Der er rapporteret et delvist klonet fragment i NCBI-databasen AF094822.1. RDL receptor funktion og dens fysiologi er godt undersøgt hos insekter6,7,8, herunder honningbier9,10,11. Antistoffer udviklet mod anti-RDL kan være et vigtigt redskab til at studere GABAergic systemet i læring og hukommelse proces i honningbier.
En tidligere undersøgelse af den rolle, som octopamin- og tyratinreceptorer anvendte RNAi sprøjtes ind i hjernen med en efterfølgende test af mængden af protein ved Western blot12,13. RNAi har dog nogle betydelige begrænsninger. Der er kun et kort tidsrum efter RNAi injektion, inden for hvilket en reduktion af protein opstår13. CRISPR-Cas9 blev for ganske nylig anvendt i honningbiembryoner til at slette eller ændre gener hos hele dyret14,15,16. Vi rapporterede brugen af CRISPR-Cas9 til at reducere mængden af protein i den voksne honningbi. Vi udviklede denne tilgang til honningbier på grund af evnen til at koble den til adfærdsmæssige undersøgelser af læring og hukommelse under kontrollerede laboratorieforhold17.
I dette arbejde udviklede vi antistoffer mod to receptorer og testede dem på de voksne honningbihjernesektioner, efter at proteinet blev reduceret med CRISPR-Cas9 injektion. Samtidig etablerede vi et eksperimentelt design, der tillader brug af metoden til adfærdsmæssige eksperimenter.
Protocol
Protokollen, der er beskrevet her, følger arizona state universitys retningslinjer for dyrepleje.
1. Total Protein Isolation fra hjerner af Apis mellifera
BEMÆRK: Brug Apis mellifera New World Carniolan foragers af ukendt alder for dette eksperiment.
- Placer en aluminium mesh skærm over indgangen til bikuben til at fange forager bier17. Fang hver bi i et hætteglas med et lille hul i hver hætte. Placer hætteglas, der indeholder bierne i is, for at sænke kropstemperaturen og immobilisere dem. Lad bierne stå i is i højst 3 minutter.
- Fastgør de immobiliserede bier i tidligere forberedte metalholdere. Sørg for, at metalholderne er konstrueret således, at bien kan fastgøres med små stykker gaffatape, men stadig har sin rygbrystkasse, vinger og hoved eksponeret.
FORSIGTIG: Sørg for, at bierne er fuldt immobiliseret, før du forsøger at placere dem i indehaverne. - Fodre bierne med en 1 M saccharose opløsning ved hjælp af en 5 ml sprøjte, indtil de ikke længere er sultne. Placer de sikrede bier i en kasse med en våd køkkenrulle for at sikre et fugtigt miljø.
- Dissekere biens hjerne hurtigt ved at skære hovedet af med Barraquer Iris saks (se Tabel over materialer)og bruge saksen til at åbne hovedet forfra.
- Skær hjernen af hovedkapslen, tag hjernen med #5 pincet, og læg den i 100 μL kold (4-8 °C) lysisbuffer. Lysisbufferen består af 120 mM Tris-HCl, 2% natriumdodecylsulfat (SDS), 5% glycerol, 0,2 mM dithiothreitol, 1% Triton X-100 og 1-5 μg/ml af proteasehæmmerne PMSF (phenylmethylsulphonylfluorid), aprotinin, benzamidin (pH 6.8) ved 4 °C. Homogeniser hjernen i lysisopløsningen ved at dreje i en støder i ca. 2 min.
- Prøven centrifugeres ved 12.000 x g i 20 min. Aspirate 90 μL af supernatanten og kassér pellet.
- Tag 1 μL af supernatanten for at slukke det samlede protein ved hjælp af et fluorimeter. Den omtrentlige koncentration af det samlede protein var mellem 2-3 mg/ml pr. bi. Tag 10 μL af supernatantet og tilsæt 10 μL af lysisbufferen og 10 μL af en 6x Laemmli buffer18. Spin kort og kog i 3 min, derefter køle ned på is. Spin i 1 min ved 10.000 x g for at fjerne alt snavs. En tiendedel af en bi hjerne indeholder ca 25 ng af det samlede protein.
2. Western Blotting19
- Lav 30 ml 10% løbende gel indeholdende 12,15 ml ultrarent destilleret vand, 7,5 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 8.8), 0,3 ml 10% SDS, 10 ml 30% acrylamid-bis acrylamidopløsning, 0,15 ml 10% ammoniumpersulfat (APS) og 20 μL tetramethylethylenediamin (TEMED ).
- Gelen kastes mellem to glasplader adskilt af afstandsstykker.
- Lav en 20 ml stabling gel indeholdende 12,1 ml ultrarent destilleret vand, 5,0 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 6.8), 0,2 ml 10% SDS, 2,6 ml acryl-bis acrylamid, 0,1 ml 10% APS og 20 μL TEMED.
- Når den kørende gel størkner hæld en stabling gel. Tilsæt omhyggeligt plastseparatoren for at kaste læssebanen og undgå bobler. Vent 15-30 min, indtil gelen er størknet.
- Begynd at læsse gelen med 5 μL proteinstandarder. Belastning 20 μL af lysatblandingen fra trin 1,8 pr. vognbane, svarende til ~ 1/15 af en bihjerne eller ~16 ng samlet protein pr. vognbane. Prøverne skal køres for 3,5-4 timer i alt ved 16 mA i stablingsgelen og 32 mA i den kørende gel. Stop, når farvestoffet forlader gelen.
- Proteiner overføres til nitrocellulosemembraner i overførselsbuffer (25 mM Tris-HCl, 192 mM glycin, 15% methanol) ved 0,45 mA i 1 time 30 min ved 4 °C.
- For at evaluere effektiviteten af proteinoverførslen efter SDS-PAGE før immunblotting tilsættes Ponceau Staining solution (tilsæt 0,1 g Ponceau S og 5 ml eddikesyre til vand til et endeligt volumen på 100 ml). Opbevares ved 4 °C i 1 min og skylles hurtigt med destilleret vand.
- Mærk hver vognbane med en kuglepen, skær membranen, der indeholder to baner med hjernehomogenat og en vognbane med proteinmarkør, og placer hver i en vestlig pletinkuberingsboks. Vask 3x i 5 minutter hver i fosfat buffered saltvand (PBS) indeholdende 0,1% Tween 20 (PBS-Tw).
- Bloker membranen med 10% NGS (1 ml normalt gedeserum til 10 ml PBS-Tw) i en vestlig pletinkuberingskasse i 1 time. Lav en anti-mGlutR1 fortynding (5 μL antistof i 10 ml 10% NGS). Lav anti-RDL1 og anti-RDL2 fortyndinger (5 μL antistof i 10 ml 10% NGS hver). Blokeringsopløsningen i hver kasse udskiftes med de fortyndede antistoffer, og den fortyndes natten over (16-24 timer) ved 4 °C.
- Vask membranen 3x i 5 min hver i PBS-Tw. Inkuber membranen med anti-kanin IgG HRP-konjugerede sekundære antistoffer ved 1:10.000 i 10% NGS PBS-Tw i 2 timer ved stuetemperatur (RT). Vask membraner 3x i PBS-Tw, derefter 1x i PBS.
- Registrer båndene ved hjælp af det vestlige chemiluminescerende HRP-substrat. Bland to underlag 1:1 (v/v) på RT, læg alle membraner i samme kasse og dæk dem med substratblandingen i 2 min (i et mørkt rum med rødt lys) på RT. Fortsæt til proteindetektion ved hjælp af en autoradiografifilm med flere eksponeringstider. Normalt testes et antistof på en membran, der indeholder den samme fortynding af hjernen, på to eller tre baner og en vognbane med vægtmarkøren.
3. Immuncytokemiske procedurer
- For at dissekere honningbihjerner for immuncytokemi, immobilisere honningbierne i is i 30 s. Efter bierne er immobiliseret, halshugge bien med en saks og placere hovedet i en opløsning på 4% paraformaldehyd i PBS. Arbejde under røghætte.
FORSIGTIG: Kroppen skal bortskaffes omhyggeligt, fordi maven stadig kan stikke efter halshugning. - Fjern omhyggeligt, men hurtigt antennerne, de sammensatte øjne, og skær rundt om toppen exoskelet med Barraquer Iris saks. Lad hovederne sidde i den fiksative opløsning i 10 min. Fjern resten af exoskelet af hovedet og skær alle resterende luftrør.
- Hver hjerne anbringes i et mikrocentrifugerør på 1,5 ml, der indeholder mindst 1 ml stk. 4 % paraformaldehydopløsning, og den foregår natten over ved 4-8 °C.
- Lav en 7,6% agarose opløsning ved at blande 3,8 g agarose og 50 ml destilleret vand i en Erlenmeyer kolbe. Mikrobølgeovn opløsningen, indtil agarose flydende.
BEMÆRK: Et lille stykke silkepapir kan placeres i åbningen af kolben for at forhindre agarose opløsning fra overfyldte under opvarmning. - Placer de faste honningbihjerner (3-4 hjerner) i en 35 mm petriskål, og fjern det overskydende fiksativt med silkepapir. Hæld den flydende agarose opløsning over hjernen. Orienter hjernen i agarose, så antennen lapper vender op. Lad agarose at køle og størkne.
- Efter agarose har størknet, skåret ud blokke af agarose hver indeholder en hjerne.
- Til vibratomeskæring skal der fremstilles en 24 brøndplade med hver brønd, der indeholder en kurv med et hydrofobmesh i bunden. Fyld hver brønd med 600 μL PBS.
- Skær hver blok i 70 μm tværsnit ved hjælp af vibratome maskinen og læg sektionerne i kurven, der indeholder PBS.
BEMÆRK: Sørg for, at sektioner fra samme hjerne placeres i samme kurv. - Vask hjernesektionerne 6x i 10 minutter hver med PBS-TX for at sikre, at der ikke er nogen fiksativ rester i sektionerne. Placer multiwell plade på en orbital shaker og vask hjerner på 210 rpm. Før hver vask skal du sørge for at udskifte PBS-TX-opløsningen med frisk PBS-TX-opløsning. Bloker med 1% normalt æselserum under den sidste vask.
- For at teste det primære antistof til anti-mGlutR1 skal der fremstilles en 1:112 fortynding af antimGlutR1-antistoffer ved at tilføje 9 ml PBS-TX til 80 μL anti-mGlutR1-antistoffer i et 15 ml centrifugerør. Vortex røret kort at blande grundigt. Den fungerende fortynding af antistoffer blev bestemt i indledende forsøg.
- For at teste det primære antistof mod RDL skal der fremstilles en 1:100 fortynding af anti-RDL-antistoffer ved at tilsætte 30 μL anti-RDL peptid 1, 30 μL anti-RDL peptid 2 og 6 ml PBS-TX i et 15 ml centrifugerør. Vortex røret kort at blande grundigt. Den fungerende fortynding af antistoffer blev bestemt i indledende forsøg.
- Tilsæt 800 μL antistofopløsning til hver brønd i pladen. Dæk flerbrøndpladen og pak den ind i aluminiumsfolie for at forhindre nedbrydning fra lyseksponering. Placer pladen pakket ind i aluminiumsfolie på en orbital shaker og ryst ved 210 rpm i 2 timer. Derefter forlade natten over på RT uden at ryste.
- Når hjernesektionerne er blevet efterladt natten over, vaskes med PBS-TX i 10 min. Gentag vasketrin 6x.
- De sekundære antistoffer (antikanin fra æsel) tilberedes ved at foretage en 1:225 fortynding af sekundære antistoffer ved at tilsætte 40 μL sekundære antistoffer til 9 ml PBS-TX.
- Tilsæt 800 μL af den sekundære antistoffortynding til hver brønd. Dæk pladen og pak den ind i aluminiumsfolie. Placer pladen pakket ind i aluminiumsfolie på orbital shaker og ryst på 210 rpm for 2 timer. Så lad det natten over på RT.
- Vask hjernesektionerne 3x i 10 minutter hver med PBS-TX og 3x med almindelig PBS-opløsning.
- Til integrering af sektionerne i diasene skal monteringsmediet/glycerolindlejringsopløsningen, der er modificeret fra Rodriguez et al.20. Der tilsættes 5 g monteringsmedium i 20 ml PBS og rør i 16 timer med en magnetisk omrører. Tilsæt 10 ml glycerol og rør i yderligere 16 timer med en magnetisk omrører. Centrifugei 15 min ved 4.000 x g,tag den flydende homogene supernatant, og aliquot i 1 ml rør. Hold ved -20 °C
- Integrer sektionerne på diasene med en dråbe monteringsmedium, der er forberedt i trin 3.17, og sørg for, at hvert dias indeholder sektioner fra én hjerne.
- Preadsorptionskontrol af immunfarvning med konjugerede peptider
- For anti-RDL og konjugerede peptider inkubere den fungerende fortynding af anti-RDL antistoffer med den tilsvarende peptidkonjugat natten over på RT på shaker: condition 1) 500 μg peptid konjugeret med Nøglehul Limpet Hemocyanin (KLH) via glutaraldehyd; betingelse 2) uden konjugat.
- Centrifuger hver blanding i 10 min ved 10.000 x g, og opsaml supernatanten fra begge forhold (trin 3.19.1).
- Inkubere de serielle dele af honningbihjernen med hver supernatant og proces med de sekundære antistoffer, der er beskrevet ovenfor. Serielle sektioner er sektioner, der følger hinanden under vibratome skæring procedurer, så den samme del af hjernen vil blive udsat for positive og negative kontroller.
- For anti-mGlutR1 og konjugeret peptid inkubere den fungerende fortynding af anti-mGlutR1 antistoffer på RT med KLH konjugerede peptid indeholdende 10-4 M peptid (betingelse 1) og uden konjugat (betingelse 2).
- Centrifuger hver blanding i 10 min ved 10.000 x g, og opsaml supernatanten fra begge kontroller.
- Inkubere de serielle dele af honningbihjernen med supernatant fra både betingelser og proces med de sekundære antistoffer (trin 3.14-3.15).
- Integrer sektioner fra begge betingelser på diaset ved hjælp af integreringsmedier (trin 3.17).
4. Test af RDL og mGlutR1 Protein Ekspression ved immuncytokemi (afsnit 3) i Honningbi hjerne efter injektion af den tilsvarende CRISPR-Cas9 System
- Design guiderne ved hjælp af et online CRISPR-Cas9-designværktøj21 ved hjælp af de genomiske DNA-sekvenser af AmRdl (XM_006565102,3) og sekvenser af mGlutR1 (XM_006566244.3) (tabel 1). Bestil som Cas9 crRNA og Cas-9 tracrRNA med fluorescerende farvestof ATTO550 i 5 'ende. Bestil Cas9 Nuclease V3 (se materialetabellen).
- Forbered komponenterne til CRISPR-Cas 9-systemet ved at lave et 100 μM-lager af hver styrecrRNA og tracrRNA ved hjælp af nuclease-frit vand. Aliquot og opbevares ved -20 °C. Arbejdskoncentrationen af Cas-9-opløsningen tilsat 2,5 μL Cas 9 nuclease V3 (10 mg/ml) til 47,5 μL nukleotidfri buffer for at opnå en endelig koncentration på 0,5 μg/μL. Lav gRNA og RNP til injektion.
- Forbered gRNA kompleks dannelse for hver guide RNA separat (guideRNA:tracrRNAATTO550)
- Der mærkes et reagensglas med navnet på gRNA, tilsæt 92 μL nukleotidfri buffer, 4 μL 100 μM CRISPR-Cas9 tracrRNA- 5'ATTO550 og 4 μL af styrecrRNA-opløsningen. Bland forsigtigt og spin.
BEMÆRK: Eksempel på mærkning af gRNA-rør til RDL: GRDL1, GRDL2, GRDL3 (svarende til RDL-styrene RNA i tabel 1). Eksempel på mærkning af gRNA-rør til mGlutR1: GMGL1, GMGL2, GMGL3 (tabel 1). - Opløsningen opvarmes til 95 °C i 5 minutter for at skabe gRNA. Afkøl blandingen på RT i 10 min.
- Der mærkes et reagensglas med navnet på gRNA, tilsæt 92 μL nukleotidfri buffer, 4 μL 100 μM CRISPR-Cas9 tracrRNA- 5'ATTO550 og 4 μL af styrecrRNA-opløsningen. Bland forsigtigt og spin.
- Forbered RNP kompleks dannelse (gRNA: S.p Cas9Nuclease), levering blandinger, og kontrol.
- Der mærkes et reagensglas med rnpens navn, tilsættes 6 μL gRNA-opløsning og 6 μL 0,5 μg/μL S.p Cas9 Nuclease V3. Opløsningerne blandes forsigtigt og inkuber esved 37 °C i 10 minutter før injektion.
BEMÆRK: Eksempel på RNP-røretiketter: RRDL1, RRDL2, RRDL3. - Lav en RNPRDLmix. Tilsammen tilsættes 4 μL af hver RNP fra RDL. RNP/RDL mix = 4 μL RRDL1 + 4 μL RRDL + 4 μL RRDL3.
- Lav en RNPmGlutR1mix. Bland 4 μL af hver RNP fra mGlutR1 sammen for at forberede den endelige blanding, der anvendes til injektioner (RNPmGlutR1mix) = 4 μL RMG1 + 4 μL RMG2 + 4 μL RMG3.
BEMÆRK: Eksempel på RNP rør etiketter: RMG1, RMG2, RMG3. - Der laves en styringsnoguideRNA-opløsning ved at blande 4 μL tracrRNA, 92 μL buffer og 4 μL vand i stedet for guideRNA (se punkt 4.3). 6 μL af denne noguideRNA-opløsning og 6 μL 0,5 μg/μL Cas9 Nuclease V3 (trin 4.4.1) blandes for at fremstille reguleringsinjektionsopløsningen.
- Der mærkes et reagensglas med rnpens navn, tilsættes 6 μL gRNA-opløsning og 6 μL 0,5 μg/μL S.p Cas9 Nuclease V3. Opløsningerne blandes forsigtigt og inkuber esved 37 °C i 10 minutter før injektion.
5. Injektionsprocedure
- Immobilisere hver bi som beskrevet i trin 1.3 og fodre dem som i trin 1.4. Dernæst forberede to sæt af to trækasser til at frigive bierne i efter injektion: en hvid boks (eksperimentel tilstand) og en sort boks (kontrol). Hver kasse skal indeholde en lille kam og en fodring Petri skål. Den ene side af hver kasse er lavet af glas, så der kan ses observation.
- Gør fodring Petri retter. Tag forsiden af en 35 mm petriskål, placer voks inde i overfladen, og placer den nederste del af petriskålen på voks. Fastgør pladen i kassen.
- Ved hjælp af en 5 ml sprøjte injiceres 1M saccharoseopløsning mellem dækslet og den nederste del af skålen. Bier kan hurtigt sætte deres proboscises mellem de to plader og vil forblive tørre i en 48 timer inkubationstid. Læg en skål i hver kasse.
- For at forberede mikroinjektionssystemet skal kapillærerne fyldes med mineralsk olie uden luftbobler. Kapillærerne anbringes i injektorholderen af mikroinjektionssystemet. For at indlæse kapillærmed den ønskede injektionsopløsning skal du placere en hydrofob film på en flad overflade og pipette opløsningen på den. Tilsprøjt olien fra kapillærerne, og blandingen udskiftes med den tilsvarende RNP-blanding.
- Ved hjælp af mikroinjektionssystemet injiceres 345 nL RNP-blandingsopløsningdirekte i hver bis medianocelli.
- Til RDL-CRISPR-Cas9 injektion injiceres otte bier med RNPRDLmix fremstillet som beskrevet i trin 4.4.2. Fodre dem 1M saccharose efter injektionen. Slip dem i den hvide (eksperimentelle) boks med den lille kam og fodring Petri skål i 48 h. Brug yderligere otte bier som kontrol uden injektioner, fodre dem, og slip dem i den sorte (kontrol) boks.
- For mGlutR1 CRISPR-Cas9 injiceres ni bier med RNPmGlutR1mix fremstillet som beskrevet i trin 4.4.3. Til kontrol injiceres otte bier med RNA-blanding uden styre (RNAmix_noguide) fremstillet som beskrevet i trin 4.4.4. Fodre dem 1M saccharose efter injektionen. Slip bier fra deres holdere i den hvide boks (eksperimentel tilstand) eller den sorte boks (kontrol), der er fremstillet som beskrevet i afsnit 5.1.
- Placer kasserne i en polystyrenbeholder med vådt papir indeni for fugt. Lad bier i 48 timer og observere 2x om dagen for at sikre, at de har nok mad og god luftfugtighed.
- Dissekere hjernen hos hver bi efter 48 h (trin 3.1) og proces for immuncytokemi som beskrevet i afsnit 3. Til anti-mGlutR1-immunfarvninger anvendes trin 3.11 og til anti-RDL-immunfarvninger skal du bruge trin 3.12.
- Udfør konfokal billeddannelse for at vurdere niveauet af fluorescens i immun-farvede hjernen sektioner.
- For at evaluere reduktionen af protein i immunmærkede hjerner, bruge konfokal billedsamling på samme niveau af gevinst for både kontrol og injiceres hjerner.
6. qPCR-baseret Drop-off Assay at evaluere den modificerede genomic RDL DNA 48 H Efter CRISPR Cas9 RNPRDLmix Injektion
- Design primerne, kontrolsonden og afleveringssonden for at vurdere mængden af DNA, der er modificeret ved CRISPR-Cas9-injektion. Hver primer er designet, så den flankerer mindst én CRISPR-Cas 9-guide, og amplikonstørrelsen er 132 bp. De anvendte primere og sonder er angivet nedenfor:
RDL1_For: CTCGGAGTGACCACCGT
RDL1_Rev: CAACGAGGCGAACACCAT
RDL1_control_probe: /5HEX/CGA+C+G+TTT+A+C+CT/3IABkFQ/
RDL1_Drop-off_probe: /56-FAM/CCTA+C+G+T+CA+A+GT/3IABkFQ/- Sørg for, at primerne svarer til unikke sekvenser, der er specifikke for området. Sørg for, at drop-off-sonden er designet til det område, der overlapper med RDL-CRISPR-Cas9-vejledning.
- For at teste, om der er en ændring af gDNA i guideområdet, skal du injicere 12 bier i ocellien med det RNP_RDL mix, der er beskrevet i trin 5.3.1, og bruge otte uinjicerede bier som kontrol.
- Dissekere bihjernerne uden de optiske lapper 48 timer efter injektionerne, og gDNA'en for hver injiceret og kontrolbihjerner (uden optiske lapper) ved hjælp af sættet efter producentens protokol (se Tabel over materialer).
- Vurder mængden, kvaliteten og renheden af det udtrukne gDNA ved hjælp af et spektrofotometer.
- Kvantificere det relative udtryk for modificeret gDNA af AmRDL ved hjælp af qPCR-baserede drop-off protokol og realtid PCR cycler.
- Resuspenderes oligoerne til 100 μM, fortyndes primerne til 10 μM og sonderne til 5 μM.
- PcR-reaktionen i 96-brøndpladen, som vist her for en prøve gDNA (3 gentagelser): 10 μL mastermix (se materialetabel),1 μL fremprimeren, 1 μL omvendt primer, 1 μL kontrolsonde, 1 μL drop-off-sonde, 2 μL gDNA (50 ng), 4 μL nukleasefrit vand for at bringe den endelige reaktionsvolumen op på 20 μL.
BEMÆRK: Betjeningsanordningerne er opløsningen i stedet for prøverne og vandet i stedet for sonderne. - Konfigurer cykelprogrammet som følger for en PCR-cyklus i realtid: 95 °C i 3 minutter efterfulgt af 40 cyklusser på 95 °C i 15 s, 60 °C i 1 min.
- Evaluere den relative genændring ved hjælp af metoden 2-ΔΔCt, hvor
Og
Og
7. Relativ kvantificering af RDL RNA 48 H Efter RNPRDLmix Injektion
- For at teste, om rdl mRNA-mRNA reduceres, injiceres 20 bier i ocellien med RNP_RDL blandes som beskrevet i trin 5.3.1, og brug 12 uinjicerede bier som betjeningsorganer. Dissekere bihjernerne (uden optiske lapper) 48 timer efter injektionerne, udtræk det samlede mRNA fra hver injiceret bi og adskilles ved hjælp af producentens protokol (se Tabel over materialer).
- Fjern eventuelle DNA-rester, der er tilbage i prøven, ved hjælp af et DNA-frit kit (se Materialetabel).
- Vurder kvaliteten og renheden af det udtrukne RNA ved hjælp af et spektrofotometer.
- Kvantificere udtrykket af AmRDL ved hjælp af en kommercielt tilgængelig fluorescerende grøn RT-PCR kit (Tabel over materialer) på en real time PCR cycler ved hjælp af producentens protokol for en 384 brønd plade.
BEMÆRK: I dette eksperiment blev tidligere offentliggjorte primere brugt. For AmRDL (AmRDL_F GGTCGATGGGCTACTACCTG; AmRDL_R TCGATCGACTTGACGTAGGA)22 og actin primere som referencegen [AmActin_F TGCCAACACTGTCCTTTCTG; AmActin_R GAATTGACCCACCAATCCA]23. Det relative genekspression blev beregnet ved hjælp af metoden 2-ΔΔΔCt (trin 6.6).
8. qPCR Baseret drop-off Assay at evaluere den modificerede genomiske DNA 48 H Efter RNPmGlutR1mix Injektion
- Design primere, kontrol og drop-off sonder til at vurdere mængden af DNA modificeret ved CRISPR-Cas9 injektion. Design primerne, så de flankerer mindst én CRISPR-Cas 9-guide, og amplikonstørrelsen er 96 bp.
mGlutR1_For: GGTGAAACGAGAGACGGA
AmGlurR1_Rev: GGAGAGAGGGAGCGAGAA
AmGlurR1_control_probe: /5HEX/CGAGG+G+AAA+CGA+GT/3IABkFQ/
AmGlurR1_Drop-off_probe: /56-FAM/CGA+C+A+C+CG+TC/3IABkFQ/
BEMÆRK: Sørg for, at primere svarer til unikke sekvenser, der er specifikke for det område, der skulle have været ændret. Drop-off-sonden er designet til det område, der overlappede med CRISPR-Cas9-guiden. - For at teste, om der er en ændring af gDNA i guideområdet, skal du injicere 12 bier i ocellimed RNP_ GlutR1-blanding som beskrevet i trin 5.3.1 og bruge otte uinjicerede bier som kontrol.
- Dissekere bihjernerne (uden optiske lapper) 48 timer efter injektionerne og udtræk gDNA'et fra hver injiceret og kontrolbihjerne (uden optiske lapper) ved hjælp af producentens protokol (se Materialetabel).
- Vurder mængden, kvaliteten og renheden af det udtrukne gDNA ved hjælp af et spektrofotometer.
- Kvantificer den relative ændring af gDNA AmGlutR1 ved hjælp af qPCR drop-off protokol og for real time PCR cycler som beskrevet i trin 6.5.
- Evaluere den relative genændring ved hjælp af metoden 2-ΔΔCt, hvor
Og
Og
9. Kvantificering af mGlutR1 RNA 48 h Efter RNPmGlutR1mix Injektion
- For at teste, om der er en reduktion i mGlutR1 RNA mRNA, injicereseks bier i ocelli med RNP_RDL blandes som beskrevet i trin 5.3.2 og bruge seks uinjicerede bier som kontrol. Dissekere bihjernerne (uden optiske lapper) 48 timer efter injektionerne, udtræk det samlede mRNA fra hver injiceret bi og adskilles ved hjælp af producentens protokol for RNA-isolation (se Materialetabel).
- Fjern eventuelle DNA-rester, der er tilbage i prøven, ved hjælp af et DNA-frit kit (se Materialetabel).
- Vurder kvaliteten og renheden af det udtrukne RNA ved hjælp af et spektrofotometer.
- Kvantificere udtrykket af mGlutR1 ved hjælp af en SYBR Green RT-PCR kit (se Tabel over materialer)på en real time PCR cycler med protokollen for 384 godt kit. Brug følgende primere til mGlutR1 (mGlut_F CCTCCTCAACGTCTCCTTCATA; mGlut_R TGCCGTTGTTCCGATTT) og actin primere som referencegen [AmActin_F TGCCAACACTGTCCTTTTCTG; AmActin_R GAATTGACCCACCAATCCA]. Det relative genudtryk beregnes ved hjælp af metoden 2-ΔΔCt (trin 8.6).
Representative Results
Anti-RDL antistoftest
Antistofferne blev fremstillet mod RDL peptidkonjugaterne som vist i figur 1A. Det første skridt i karakterisering af anti-RDL antistoffer er at kontrollere homogenat af proteinet udvundet fra bihjernen ved hjælp af en vestlig skamplet med anti-RDL antistoffer og en HRP-mærket ged anti-kanin IgG sekundære antistof(figur 1A, indsæt). Begge anti-RDL antistoffer anerkendt bandet placeret på ~ 50-60 kD (pil), svarende til den anslåede vægt af RDL underenhed isoform proteiner. For at påvise, at anti-RDL antistoffer anerkendt peptid i hjernen skiver, vi brugte en preadsorption kontrol (Figur 1B,C). Når antistoffer blev præinkuberet med konjugerede peptider, farvning på afsnittet var fraværende. Dette viste, at anti-RDL antistoffer anerkendt konjugerede peptid, som de blev rejst. For at påvise, at anti-RDL antistoffer ne genkender proteinet i det faste hjernevæv, brugte vi CRISPR-Cas9 til at slå RDL-genet ud, der producerer RDL-proteinet i cellerne. Figur 1D1-3, viser kontrol frontal bi hjerne sektioner, der var mærket med anti-RDL antistoffer. Denne bi blev ikke injiceret med RDL-CRISPR-Cas9 RNP. I figur 1D1, anti-RDL etiketter neuropils i den forreste del af bihjernen. Den samme frontale sektion i figur 1D2 viser fraværet af fluorescens fra ATTO550, fordi RDL-CRISPR-Cas9-komplekset ikke blev injiceret.
Figur 1E1-E3 viser en hjernesektion fra en bi, der injiceres med RDL-CRISPR-Cas 9 og derefter behandles med den samme mængde antistoffer som kontrolhjernen i figur 1D1-D3. Anti-RDL-farvningen blev reduceret betydeligt i hele hjernen 48 timer efter injektionen, og fordelingen af ATTO550 farvning i hjernen (figur 1E2) viser succesen med RDL-CRISPR-Cas 9 injektioner i bimedianen ocelli. De mange spredte celler i hjernen udstiller ATTO550. Den vellykkede injektion af RDL-CRISPR-Cas 9 reducerede proteinudtrykket sammenlignet med kontrollen (figur 1E1-3). Fra otte immunplettede bihjerner havde kun én hjerne et højt fordelingsniveau af RDL-CRISPR-Cas9 i cellerne i svampekroppen, protocerebrum og antennellap, mens andre hjerner havde cellefarvning med ATTO550 i champignonkroppencalyx, centralt komplekst, men ikke antennelap. Det er vigtigt at bemærke, at i disse bier var reduktion af anti-RDL-immunfarvning ikke så dramatisk som i hjernen vist i figur 1E1.
Dernæst forat vurdere niveauet af den modificerede RDL gDNA i bierne 48 timer efter RDL-CRISPR-Cas9 injektion, udførte vi en qPCR drop-off test, hvor drop-off sonden var designet til at matche området for en af RDL gRNAs. I disse forsøg svarede den relative reduktion af fluorescensen i bihjernerne, der blev injiceret med RDL-CRISPR-Cas 9, til antallet af modificerede gDNA i prøverne. I vores test var det område, der svarede til denne vejledning i gDNA hos 12 bier injiceret med RDL-CRISPR-Cas9, 64 % ± (gennemsnitlig ± 30 %SD) sammenlignet med gDNA hos ikke-injicerede bier (figur 3A).
Dernæst for at anslå rdl-RNA'ens niveau i bierne 48 timer efter injektionen udførte vi qRT-PCR i en separat gruppe bier (figur 3B). Vi sammenlignede rdl-RNA-niveauet for RDL-CRISPR-Cas 9 injicerede bier (n = 19) med niveauet af RNA hos bier, der ikke blev injiceret (n = 12). I disse forsøg var den relative reduktion af mRNA RDL 59 % ± (gennemsnitlig ± 15 % SE) sammenlignet med RNA-niveauet hos ikke-injicerede bier. Da vi undersøgte rdl-RNA-niveauet i hver enkelt bi hver enkelt bi, viste kun 13 bier ud af 19 bier en betydelig reduktion af RNA. Disse data viser, at injektion af RDL-CRISPR-Cas9 gennem ocellien måske ikke altid når ud til et stort antal hjerneceller, hvilket bekræfter dataene med RDL immunplettede RDL-CRISPR-Cas9 injicerede bier. I disse præparater havde kun én bi ud af 8 RDL CRISPR-Cas9 i mange hjerneceller (champignonkrop, protocerebrum og antennellap) sammenlignet med andre bihjerner, hvor fordelingen af RDL-CRISPR-Cas9 var koncentreret i celler i protocerebrum (champignonkropcalyx og centralt kompleks), men ikke antennellap(figur 4A-D).
Anti-mGlutR1 antistoffer test
Vi brugte anti-mGlutR1 antistoffer produceret i kanin mod konjugerede peptider specifikke for Drosophila melanogaster (figur 2A). Sekvensen af dette peptid viser en 94% identitet med bipeptid (CLSDKTRFDYFARTVPPD) Figur 2A. Først kontrollerede vi antistofferne mod bihjerneproteinet ved hjælp af immunblotting. Bihjernen homogenat blev adskilt af 10% SDS-PAGE og elektrophoretically overført fra til en nitrocellulose membran og farves med anti-mGlutR1. Indlægget i figur 2A viser to bånd med anslåede vægte (103 og 83 kD), der svarer til to isoformer. Da vi testede dette antistof på honningbihjerner, fandt vi ud af, at de mærker neuropilarprofiler og celler i bihjernesektionerne som vist i figur 2B, D. Efter preadsorption af anti-mGlutR1 antistof med konjugeret-mGlutR1 peptid, den specifikke farvning forsvandt i bi hjernen skive (Figur 2C). Dette bekræfter, at anti-mGlutR1 antistoffer genkender peptidet (figur 2C). Dernæst injicerede vi en blanding af mGlutR1-CRISPR-Cas9 i medianen ocelli og brugte kontrol noguideRNA. I kontrolbier (n = 7) var fluorescensen fra ATTO550 ikke koncentreret i cellerne. Nogle hjerner havde spredt fluorescens ATTO550 mærkning. Således viser kontrolpræparatet i figur 2D1-3 anti-mGlutR1 farvning i hjernen, men ikke ATTO550 fluorescens. Når mGlutR1-CRISPR-Cas9 blev injiceret i ocelli og taget op af mange celler, niveauet af fluorescens af de sekundære antistoffer blev væsentligt reduceret i det område, der optager den funktionelle mGlutR1RNP (Figur 2E1-3). Bierne blev overvåget i 48 timer, og en bi fra hver eksperimentel tilstand blev fundet død. I dette eksperiment kontrollerede vi således syv kontrolbier og otte CRISPR-Cas9 bier. Alle bierne injiceret med CRISPR-Cas9 havde celler, der tog i mGlutR1-CRISPR-Cas9. De fleste af disse celler var i champignon kroppen calyx, centrale kompleks, og posterior protocerebrum. Kun to bier ud af syv viste ATTO550 mærkning i mange celler i champignon kroppen, centrale kompleks, og antennal lap. Et eksempel på en af disse bier er vist i figur 2E. Reduktionen af niveauet for mGlutR1 farvning i disse præparater var betydelig. De øvrige fem bier har ATTO550 mærkning svarende til en vellykket levering af mGlutR1 CRISPR-Cas9 i champignon krop og posterior protocerebrum men ikke i antennel lapper.
Dernæst udførte vi for at anslå niveauet af det modificerede mGlutR1 gDNA i bierne 48 timer efter injektionen en qPCR-baseret drop-off-test, hvor drop-off-sonden var designet til at være i området nær mGlutR1-vejledningen. I disse forsøg var den relative ændring af gDNA hos 12 bier 59 % ± (gennemsnitlig ± 33 %SD) sammenlignet med gDNA hos ikke-injicerede bier (figur 3A).
Disse resultater blev også bekræftet af qRT-PCR-test i en anden gruppe bier, hvor vi anslog mGlutR1 RNA-niveauerne ved hjælp af qRT-PCR i bierne 48 timer efter injektioner med RNPmGlutR1mix (Figur 3B). Vi sammenlignede niveauet af mGlutR1 RNA af mGlutR1-CRISPR-Cas9 injicerede bier (n = 6) med RNA-niveauerne i bier, der ikke blev injiceret (n = 6). I disse forsøg var den relative reduktion af mRNA mGlutR1 i injicerede bier 53 % ± (gennemsnitlig ± 18 % SE) sammenlignet med uinjicerede bier (figur 3B).
Afsnittet fra fire forskellige bier, der udtrykte RNP RDL-CRISPR-Cas9 i Kenyon celle champignon krop er vist i figur 4A-D. Eksemplet bi med ATTO550 fluorescens i champignon kroppen og antennal lap er vist i figur 4E,F.
| Guider | Sekvenser | gRNA | RNP |
| [guideRNA:tracrRNA] | [gRNA:Cas9 Nuclease] | ||
| RDL_Guide1 | ACCGTAACGCGACCCCCGCT | GRDL1 | RRDL1 |
| RDL_Guide2 | AACGTCGATCGACTTGACGT | GRDL2 | RRDL2 |
| RDL_Guide3 | CCATGACGAAAACACGTGCCC | GRDL3 | RRDL3 |
| mGlu_Guide 1 | CGAAAGTTATCTGACGGTGTGT | GMGL1 | RMGL1 Delte et år |
| mGlu_Guide 2 | TTCAACGAGAGCAAGTTCAT | GMGL2 | RMGL2 |
| mGlu_Guide 3 | GCAAACGTCGGTAGGAGTGA | GMGL3 | RMGL3 Delte et år. |
Tabel 1: Nukleotid sekvenser af guider designet til RDL og mGlutR1.
Figur 1: Karakterisering af anti-RDL antistoffer. (A) Schematic af RDL-underenheden, hvor de lyserøde cirkler angiver lokaliseringen af peptid 2 (ekstracellulært CVNEKQSYFHIATTSNEFIRI-amid) i N-terminus og peptid 1 (intracellulært CVRFKVHDPKAHSKGGTL-amid) i C-endeinus. Indsætten i A viser båndene i den vestlige blotte af honningbi hjerne ekstrakter behandlet med tilsvarende anti-RDL antistoffer (en med anti-RDL pep1 og anti-RDL pep2). Hver immunoblot viser den tilsyneladende størrelse af proteinet ~ 50-60 kD, svarende til den anslåede vægt af de forskellige isoform af RDL underenheder. (B,C) Preadsorption af anti-RDL antistoffer med konjugeret peptid 1. Billedet i C viser en reduktion i farvning i afsnittet, når antistofferne blev præinkuberet med konjugeret peptid 1. Den fanformede krop (Fb) og Ellipsoid krop (eb) er centrale komplekse strukturer i hjernen. M = mediale lap af champignon krop. (D1-3) Anti-RDL farvning af en kontrol, uinjiceret bi hjerne sektion efter 48 h. Green angiver anti-RDL positiv profil i hjernen. (D2) Denne bi blev ikke injiceret og indeholder ikke ATTO550 fluorescens. (D3) Flettede billeder fra D1 og D3. (E1-3) Injektionen af RDL-CRISPR-Cas9 reducerede anti-RDL farvning efter 48 h. (E2) ATTO550 fluorescens i cellekernerne angivet vellykket RDL-CRISPR-Cas9 levering. (E3) Det flettede billede af anti-RDL (grøn) og ATTO550 (rød). Skalastang = 100 μm (B-E). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Karakterisering af anti-mGlutR1 antistoffer. (A) Schematic af GCPR mGluR, der viser Drosophila melanogaster peptid, der anvendes til immunisering. Til sammenligning er Apis mellifera peptid vist nedenfor. Cirklen angiver lokalisering af peptid i N-terminus af mGlutR1 receptor ekstracellulære domæne. Indsatsen i A viser, at anti-mGlutR1 antistoffer anerkendt to bånd i den vestlige blot af bi hjerner ~ 103 kD og ~ 83 kD, der svarer til de anslåede vægte af kendte isoformer. (B,C) Preadsorption kontrol af anti-mGlutR1 antistof i to på hinanden følgende dele af antennal lap glomeruli. Billede af anti-mGlutR1 i afsnittet antenneglomeruli i C viser reduktionen af farvningen som følge af fordybning af anti-mGlutR1 peptid med anti-mGlutR1 antistof. Denne procedure får antistoffet til at udfælde opløsning, som ophæver farvning i forhold til B (kontrol, fravær af peptid i preinkubationen). (D1) viser farvning af anti-mGlutR1 i en bi hjerneskive efter en kontrolinjektion i medianen ocellus. Denne injektion manglede mGlutR1 gRNA, der gør det muligt at vælte mGlutR1 receptorer ved CRISPR-Cas9, og dermed farvning af anti-mGlutR1 antistof blev ikke reduceret (grøn). (D2) Fraværet af ATTO550 fluorescens indikerer fraværet af funktionel CRISPR-Cas9 i hjernen. (D3) Fusionerede billeder af anti-mGlutR1 og ATTO550. (E1-E3) viser farvning af anti-mGlutR1 i en hjernesektion, hvor mGlutR1 er blevet permanent slået ned 48 timer efter injektion med mGlutR1-CRISPR-Cas 9 i medianen ocellus. Således farvning i denne hjerne er stærkt reduceret på grund af den vellykkede knockout af mGlutR1 i mange celler. (E2) ATTO550 farvning i mange cellekerner i bihjernerne indikerer, at injektionen af mGlut1-CRISPR-Cas 9 var en succes. (E3) Fusioneret billede af ATTO550 (rød) og anti-mGlutR1 (grøn). Skalastang = 10 μm (B,C); 100 μm (D,E). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Evaluering af modificeret gDNA og ekspression af mRNA af RDL og mGlutR1 mRNA i bihjerner 48 timer efter injektion med 345 nL tilsvarende RPN CRISPR-Cas9. (A) Den qPCR-baserede drop-off-analysetest til vurdering af mængden af gDNA med et ændringsområde blev beregnet ved hjælp af 2-ΔΔCt-metoden og normaliseret mod kontrol, uinjicerede hjerner. Dataene udtrykkes som middel + SD. (B) Testen for theqRT-PCR blev anvendt til at vurdere mængden af mRNA i CRISPR-Cas9 injicerede og uinjicerede bier. AmActin blev brugt som referencegen. Det relative genekspression blev beregnet ved hjælp af 2-ΔΔCt-metoder og normaliseret mod kontrol, uinjicerede hjerner. Dataene udtrykkes som middel + SE. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Eksempel på fordelingen af RNP CRISPR-Cas9 i bihjerner via ATTO550 fluorescens. (A-D) Hjernen sektioner fra fire forskellige bier, der udtrykte RNP RDL-CRISPR-Cas9 i Kenyon celle af champignon kroppen. (E,F) Eksempel på to hjerner 48 timer efter injektion med RNPmGlutR1 CRISPR-Cas9. Skalabjælke = 150 μm (A-F). Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Karakterisering af anti-RDL og anti-mGlutR1
Først karakteriserede vi anti-RDL og anti-mGlutR1 antistoffer ved immunblot og pre-adsorption på skiver af faste honningbi hjerner. Hvert antistof blev lavet til at genkende alle sine kendte isoformer, og vestlige analyse viser, at de genkender bands, der svarer til deres forudsagte molekylvægte. Dernæst blev begge antistoffer blokeret af det konjugerede peptid, som de blev produceret på honningbihjernesektioner.
Et af de første mål i vores undersøgelse var at fastslå, at de antistoffer, der produceres mod det specifikke konjugerede peptid, er specifikke for dets protein i fast hjernevæv. Til dette formål benyttede vi os af CRISPR-Cas9-systemet. Vi designede specifikke vejledninger til honningbi RDL og mGlutR1 og brugte hver af dem til at gøre CRISPR-Cas9 mærket med fluorescerende sonden ATTO550. For hver receptor injicerede vi en blanding af tre forskellige CRISPR-Cas9 ribonukleoproteiner i ocellien for at reducere mængden af det målrettede protein i den voksne honningbihjerne ved at eliminere det tilsvarende gen i celler, der tog vores designede Cas9-system. I vores undersøgelse, opnåede vi dette skridt.
Et af de første afgørende skridt for succes af disse eksperimenter er at designe den relevante guide RNA'er. Vi anbefaler at designe op til fem guide DEA'er, der er placeret i begyndelsen, midten og slutningen af gensekvensen. I vores indledende arbejde testede vi dem i forskellige kombinationer på tre til fem bier. Vi har også prøvet forskellige koncentrationer af injektioner, samt tidspunkter efter injektion, og forskellige blandinger af RNP i injektioner. Vi dissekeret ud hjerner og forarbejdede dem ved hjælp af anti-RDL og anti-mGlutR1 antistoffer. I disse indledende tests etablerede vi den rette kombination, postinjektionstid samt koncentrationen og mængden af CRISPR-Cas9 til injektion. Disse indledende test var grundlaget for at oprette de eksperimenter, som vi beskrev i detaljer her.
Målet var dobbelt: 1) at demonstrere i en bi, at vores antistof farvning blev reduceret efter behandling med CRISPR-Cas9 og 2) til at arbejde gennem de bedste eksperimentelle betingelser for adfærdsmæssige undersøgelser. Således viser vi, at hvis mange celle kerner indeholder CRISPR-Cas9 48 h efter injektion, reduktion af anti-RDL og anti-mGlutR1 farvning er betydelig. Derudover, der viser, at de testede antistoffer specifikt genkende mGlut1 og RDL protein i honningbi hjerne forberedelse, og at de kan bruges til lokalisering undersøgelser i honningbi hjernen.
Eksperimentel indstilling CRISPR-Cas9 til adfærdsundersøgelse
Dernæst har vi oprettet eksperimenter, så CRISPR-Cas9 kunne bruges i adfærdsmæssige undersøgelser. Otte eller ni honningbier blev indsamlet til kontrol og eksperimentelle behandlinger. De blev rutinemæssigt testet før og efter injektion, og derefter deres hjerner blev behandlet for ATTO550 og / eller immuncytokemi til at bestemme hjernen regioner, der viste reduktion af målet protein. Her er det vigtigt at bemærke, at antallet af bier, der blev taget for et sæt forsøg, ikke var begrænset til mere end 8-9 bier til kontrol- og forsøgsbetingelserne. På denne måde kan begge betingelser testes samme dag. Også, når vi forberedt CRISPR-Cas9 blandinger til injektion, vi aldrig frøs dem. CRISPR-Cas9-blandingen ændrede sig ikke i styrke, når den blev brugt 3 dage i træk og holdt ved 4-8 °C. Men vi har ikke teste det efter 3 dage.
Som vi beskrev i afsnittet Resultater for begge sæt eksperimentelle injektioner og for begge antistoffer, viste kun tre bier fra 16 testede en stor fordeling ATTO550 i champignonkroppen, protocerebrum og antennelapper. I alle andre bier var fordelingen af CRISPR-Cas9 begrænset til svampekroppen, det centrale kompleks og/eller det bageste protocerebrum. Det er vigtigt at forstå for enhver adfærdsmæssige undersøgelser, at ved hjælp af denne injektion metode reduktion af mål protein vil være begrænset kun til champignon kroppen i de fleste af bierne. Det vil ikke udvide til antennal lap eller subesofageal ganglion. Således injektion teknik, som vi bruger, er egnet til at undersøge effekten af reduktionen af receptorer i champignon kroppen og centrale kompleks i adfærdsmæssige eksperimenter, mens en anden metode til at indføre CRISPR-Cas9 vil være mere hensigtsmæssigt for at studere andre hjerneregioner.
Afslutningsvis viste vores undersøgelse en vellykket anvendelse af CRISPR-Cas9 som en kontrol for antistoffarvning i hjernen. For begge antistoffer (anti-RDL og anti-mGlutR1), når udbredelsen af mGlutR1-CRISPR-Cas9 eller RDL-CRISPR-Cas9 var vellykket, blev niveauet af tilsvarende antistoffarvning også reduceret betydeligt. Det er også vigtigt at bemærke, at injektion i ocelli førte til en fordeling af CRISPR-Cas9 i hjernen, der ikke var homogen. Fordelingen varierede fra et minimalt område omkring ocelli og champignon krop til mange celler i hele hjernen. Cellernes variabilitet af mGlutR1- eller RDL-CRISPR-Cas9-optagelseskyldte varsandsynligvis på grund af variation i injektionerne. Vores data viser, at CRISPR-Cas9-systemet fungerer i honningbier, men injektionsmetoden skal forbedres for at reducere variationen i CRISPR-Cas9-optagelse på tværs af individuelle bihjerner. Inden for disse restriktioner, er det nu muligt at anvende denne teknik til at manipulere gener i voksne bier til adfærdsmæssige eksperimenter.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af følgende priser til BHS: Human Frontiers Science Program; NIH NIGMS (R01 GM113967); NSF Ideas Lab (1556337). Peptidet og antistofferne for DmGluRA blev designet i laboratoriet Dr. Serge Birman (Marseille, Luminy, Frankrig), da IS blev støttet af Programme d'Urgence FRM/Postdocs UFP20060306548 fra Fondation pour la Recherche Medicale. Vi er taknemmelige for Daniela Junqueira Marosi og Alex Hanter fra Integrated DNA Technology (IDT) for hjælp med udformningen af RDL guider og qPCR drop-off analyser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283_100 mL | western blotting |
| Acrylamide-bis Acrylamide | Bio-Rad | 500 mL 1610156 | western blotting |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A0169-250g | used with distilled water to fix honey bee brain in blocks |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Research Laboratories | 711-546-152 | secondary antibody to reveal the primary antibodies from rabbit |
| Alt-R CRISPR-cas9 tracrRNA-5'ATTO | IDT | 1075934 | with desinged guide RNA, it creates gRNA |
| Alt-R S.p. Cas9 nuclease V3 | IDT | 1081058 | enzyme used to make ribonucleoprotein for CRISPR system |
| Ammonium Persulfate | Bio-RAD | 10 g 1610700 | western blotting |
| Anti-mGlutR1 antibodies | Covalab (FRANCE)/21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of mGlut 1 in honey bees |
| Anti-RDL antibodies | 21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of RDL in honey bees |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | Y0001154 | protease inhibitor |
| Barraquer Iris Scissors 7mm Blade Sharp point | World Precision Instruments | 14128-G | used for dissection honey bee brain |
| Benzamidine | Sigma-Aldrich | 12072 | protease inhibitor |
| Blade (breakable) for blade holder | Fine Science Tool | 10050-00 | dissection for western blotting |
| Blade holder and breaker | Fine Science Tool | 15309 | dissection for western blotting |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100 F | for injection procedure |
| Chemiluminescent western blot detection substrate | Bio-Rad | 1705062 | western blotting |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 472476-50mL | RNA isolation |
| Dithiothreitol | Bio-Rad | 1610611 | western blotting |
| DNA easy kit | QIAGEN | 69504 | DNA extractionuj |
| DNA-free kit | INVITROGEN | AM1907 | Used to remove DNA |
| Eppendorf Research plus pipette, 3-pack | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
| Falcon 24 Well Polystyrene Multiwell | Falcon | 351147 | Multiwell |
| Flat Bottom Embedding Capsules, Polyethylene | Electron Microscopy Science | 70021 | basket for brain sections |
| Forceps Dumont #5 (pair) | Fine Science Tool | 11254-20 | for dissection of honey bee brain from the head |
| Forceps Dumont #5S (pair) | Fine Science Tool | 11252-00 | to clean up the brain from trachea befor dissection |
| Gene Expression Master Mix | Integrated DNA Technologies | 1055770 | qPCR drop off assay |
| Glutaraldehyde | EMS | 16220 | used for preparation of peptide conjugates for control peabsorption |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500 mL | western blotting, embedding media |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | western blotting |
| Hydrophobic filtered nylonmesh | Spectrum Labs | 145910 | for bottom of basket for brain sections |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-50mL | RNA isolation |
| Keyhole limpet hemocyanin | Sigma-Aldrich | H7017 | used for preparation of conjugates for control |
| LSM800 cofocal microscope | Zeiss | ||
| mGlu_Guide 1 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
| mGlu_Guide 2 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
| mGlu_Guide 3 | IDT | designed guide RNA for CRISPR. Target mGlutR1 genome sequences | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | western blotting |
| 96-well PCR microplate | Applied biosystem | 4346907 | qPCR drop off assay and qRT-PCR |
| 384-well PCR microplate | Sigma-Aldrich | Z374911 | qRT-PCR |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904_500mL | for injection procedure |
| Model p87 Flaming Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Capillary Preparation | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | for embedding solution |
| Nanoliter 2000 | World Precision Instruments Nanoliter | Injection Apparatus | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Research Laboratories | AB_2337258 | blocking agent for immunocytochemistry |
| Non-immune Goat Serum | Invitrogen | 50-062Z 100 mL | blocking agent for immunoblotting |
| Nuclease-free buffer | IDT | 1072570 | Nuclease-free buffer that is used in the preparation of CRISPR-Cas9 injection |
| Nuclease-free water | IDT | AM9337 | nuclease -free water that is used in preparation of CRISPR-Cas 9 system |
| OrbitalShaker Mp4 | Genemate | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500 g | used with PBS to make fixative for bee brains |
| Phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626-250 mg | protease inhibitor |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | Used with Paraformaldehyde as fixative; buffer for antibodies |
References
- Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current Protocols in Human Genetics. 83 (15), 7-27 (2014).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Kouranova, E., et al. CRISPRs for Optimal Targeting: Delivery of CRISPR Components as DNA, RNA, and Protein into Cultured Cells and Single-Cell Embryos. Human Gene Therapy. 27 (6), 464-475 (2016).
- Schubert, M., et al. Fluorescently labeled tracrRNA provides efficient genome editing while allowing cellular microscopy and FACS analysis. Genome Editing. , www.idtdna.com 1-3 (2017).
- Kucharski, R., Mitri, C., Grau, Y., Maleszka, R. Characterization of a metabotropic glutamate receptor in the honeybee (Apis mellifera): implications for memory formation. Invertebrate Neuroscience. 7 (2), 99-108 (2007).
- Aronstein, K., Auld, V., Ffrench-Constant, R. Distribution of two GABA receptor-like subunits in the Drosophila CNS. Invertebrate Neuroscience. 2 (2), 115-120 (1996).
- Thompson, M., Steichen, J. C., ffrench-Constant, R. H. Conservation of cyclodiene insecticide resistance-associated mutations in insects. Insect Molecular Biology. 2 (3), 149-154 (1993).
- Chung, B. Y., Kilman, V. L., Keath, J. R., Pitman, J. L., Allada, R. The GABA(A) receptor RDL acts in peptidergic PDF neurons to promote sleep in Drosophila. Current Biology. 19 (5), 386-390 (2009).
- Taylor-Wells, J., Hawkins, J., Colombo, C., Bermudez, I., Jones, A. K. Cloning and functional expression of intracellular loop variants of the honeybee (Apis mellifera) RDL GABA receptor. Neurotoxicology. 60, 207-213 (2017).
- Jones, A. K., Sattelle, D. B. The cys-loop ligand-gated ion channel superfamily of the honeybee, Apis mellifera. Invertebrate Neuroscience. 6 (3), 123-132 (2006).
- Dupuis, J. P., et al. Homomeric RDL and heteromeric RDL/LCCH3 GABA receptors in the honeybee antennal lobes: two candidates for inhibitory transmission in olfactory processing. Journal of Neurophysiology. 103 (1), 458-468 (2010).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
- Guo, X., Wang, Y., Sinakevitch, I., Lei, H., Smith, B. H. Comparison of RNAi knockdown effect of tyramine receptor 1 induced by dsRNA and siRNA in brains of the honeybee, Apis mellifera. Journal of Insect Physiology. 111, 47-52 (2018).
- Roth, A., et al. A genetic switch for worker nutrition-mediated traits in honeybees. PLOS Biology. 17 (3), e3000171 (2019).
- Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of Knockout Mutants by CRISPR/Cas9 in the European Honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science (BIOONE). 33 (5), 505-512 (2016).
- Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-Efficiency CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing in Honeybee Apis mellifera Embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
- Smith, B. H., Burden, C. M. A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research. Journal of Visualized Experiments. (91), e51057 (2014).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Protein Blotting Guide. , BIO-RAD. http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_2895.pdf (2019).
- Rodriguez, J., Deinhardt, F. Preparation of a semipermanent mounting medium for fluorescent antibody studies. Virology. 12, 316-317 (1960).
- Custom Alt-R® CRISPR-Cas9 guide RNA. , Integrated DNA Technologies. https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM (2019).
- Bonnafe, E., et al. Effect of a thymol application on olfactory memory and gene expression levels in the brain of the honeybee Apis mellifera. Environmental Science and Pollutant Research (International). 22 (11), 8022-8030 (2015).
- Wang, Y., et al. Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honeybee ovaries. Journal of Experimental Biology. 215 (Pt 1), 124-134 (2012).
