Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromatographischer Diagnostischer Test für ressourcenbegrenzte Einstellungen mit weiteren molekularen Anwendungen

Summary

Wir präsentieren ein vollständiges Protokoll zur postmortalen Diagnose von Tiertollwut unter Feldbedingungen mit Hilfe eines schnellen immunchromatographischen diagnostischen Tests (RIDT), von der Probenahme der Hirnbiopsie bis zur endgültigen Interpretation. Wir beschreiben auch weitere Anwendungen mit dem Gerät für molekulare Analyse und virale Genotypisierung.

Abstract

Funktionale Tollwutüberwachungssysteme sind von entscheidender Bedeutung, um zuverlässige Daten bereitzustellen und das politische Engagement für die Seuchenbekämpfung zu erhöhen. Bislang müssen Tiere, die als tollwutpositiv verdächtigt werden, mit klassischen oder molekularen Labormethoden einer postmortalen Bestätigung unterzogen werden. Die meisten endemischen Gebiete befinden sich jedoch in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen, in denen die Tiertollwutdiagnose auf zentrale Veterinärlaboratorien beschränkt ist. Die schlechte Verfügbarkeit von Überwachungsinfrastrukturen führt zu einer unzureichenden Meldung von Krankheiten aus entlegenen Gebieten. In jüngster Zeit wurden mehrere Diagnoseprotokolle entwickelt, die wenig technisches Fachwissen erfordern und die Möglichkeit bieten, die Tollwutdiagnose in dezentralen Laboratorien zu erstellen. Wir präsentieren hier ein komplettes Protokoll zur Feldpostmortalendiagnose von Tierischen Tollwut mittels eines schnellen immunchromatographischen diagnostischen Tests (RIDT), von der Hirnbiopsieprobe bis zur endgültigen Interpretation. Wir vervollständigen das Protokoll, indem wir eine weitere Verwendung des Gerätes für molekulare Analysen und virale Genotypisierung beschreiben. RIDT erkennt tollwutinfizierte Viren und andere Lyssaviren in Hirnproben leicht. Das Prinzip solcher Tests ist einfach: Gehirnmaterial wird auf einem Teststreifen aufgetragen, wo goldkonjugierte Antikörper spezifisch an Tollwut-Antigene binden. Die Antigen-Antikörper-Komplexe binden weiter an feste Antikörper auf der Testlinie, was zu einer deutlich sichtbaren violetten Linie führt. Das Virus wird im Teststreifen inaktiviert, aber virale RNA kann anschließend extrahiert werden. Dadurch kann der Teststreifen und nicht die infektiöse Hirnprobe sicher und einfach zur Bestätigung und molekularen Typisierung an ein ausgerüstetes Labor geschickt werden. Basierend auf einer Änderung des Herstellerprotokolls fanden wir eine erhöhte Testempfindlichkeit und erreichten 98% im Vergleich zur Goldstandard-Referenzmethode, dem direkten Immunfluoreszenz-Antikörpertest. Die Vorteile des Tests sind zahlreich: schnell, einfach zu bedienen, kostengünstig und ohne Anforderungen an die Laborinfrastruktur, wie Mikroskopie oder Cold-Chain-Compliance. RIDTs stellen eine nützliche Alternative für Bereiche dar, in denen referenzierte Diagnosemethoden nicht verfügbar sind.

Introduction

Die Tollwut ist die Hauptursache für die menschliche Tollwut, die weltweit für etwa 59.000 Todesfälle pro Jahr verantwortlich ist, fast alle in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen (LMICs) in Asien und Afrika¹. Der wichtigste ätiologische Wirkstoff ist ein neurotroper Canine-assoziiertes klassisches Tollwutvirus (RABV, Familie Rhabdoviridae, Gattung Lyssavirus, Art Tollwut lyssavirus). Andere tollwutbedingte Lyssaviren, die meist bei Fledermausarten zirkulieren, verursachen jedoch auch Krankheit^2,3. In den betroffenen Regionen werden die Überwachung und Kontrolle von Krankheiten häufig durch politisches Engagement auf niedrigem Niveau behindert, das wahrscheinlich auf den Mangel an zuverlässigen Daten^4,5,6zurückzuführen ist. Ein Grund für die Unterberichterstattung von Krankheiten ist das Fehlen einer Labordiagnose, die zum Teil auf den eingeschränkten Zugang zu ausgestatteten Laboratorien und geschultem Personal sowie auf die Schwierigkeiten bei der Verbringung der Proben zurückzuführen ist. Labordiagnostik ist notwendig, um Tollwutfälle zu bestätigen und ermöglicht zusätzlich eine genetische Charakterisierung der beteiligten Stämme, die Einblicke in die Virusübertragung auf regionaler Ebene^4,5,7bietet.

Die aktuellen Goldstandards für die postmortale Tollwutdiagnose, die sowohl von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) als auch von der Weltorganisation für Tiergesundheit (OIE) genehmigt wurden, sind der direkte fluoreszierende Antikörpertest (DFAT), der direkte schnelle Immunhistochemietest (DRIT) und molekulare Methoden (z. B. Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR))^4,8. Aufgrund unzureichender Laboreinrichtungen mit inkonsistenter Stromversorgung, ungekühltem Probentransport und fehlendem Qualitätsmanagementsystem bleibt die ordnungsgemäße Anwendung in LMICs jedoch begrenzt. Da die Tiertollwutdiagnose in der Regel nur in zentralen Veterinärlaboratorien in LMICs durchgeführt wird, spiegeln die vorhandenen Überwachungsdaten hauptsächlich die Tollwutsituation in städtischen Gebieten wider.

Kürzlich entwickelte diagnostische Alternativen mit niedriger Technologie bieten Möglichkeiten zur Erstellung der Tollwutdiagnostik in abgelegenen Gebieten und dezentralen Tollwutlaboratorien^4,8,9. Der schnelle immunchromatographische diagnostische Test (RIDT) ist ein seitlicher Durchflusstest auf Basis der Immunchromatographie mit goldkonjugierten Detektorantikörpern und ist ein sehr vielversprechendes Tollwut-Diagnosewerkzeug^10,11,12,13. Das Prinzip ist einfach: Nach der Verdünnung wird Hirnmaterial in den bereitgestellten Puffer gemischt, und ein paar Tropfen werden auf den Teststreifen aufgetragen, wo goldkonjugierte monoklonale Antikörper spezifisch an Tollwutantigene binden, hauptsächlich die Nukleoproteine (Abbildung 1). Die Antigen-Antikörper-Komplexe durchlaufen dann eine laterale Strömungsmigration, die an der Testlinie (T-Linie) an feste Antikörper gegen Tollwut-Antigene bindet, was zu einer deutlich sichtbaren violetten Linie führt. Die verbleibenden goldkonjugierten Antikörper, die nicht an Tollwut-Antigene gebunden sind, wandern weiter und fixieren sich durch zusätzliche Targeting-Antikörper an die Membran, was zu einer deutlich sichtbaren violetten Kontrolllinie (C-Linie) führt.

Die einstufige, kostengünstige Methode ist schnell, extrem einfach und erfordert keine teure Ausrüstung oder besondere Lagerbedingungen. Mit der Änderung des Herstellerprotokolls zur Vermeidung des Verdünnungsschritts sind fast alle Geräte und Reagenzien, die für die Durchführung der Prüfung erforderlich sind, im Kit¹⁴enthalten. Das Ergebnis wird nach 5-10 Minuten ohne Mikroskop gelesen. Dies ist ein großer Vorteil gegenüber dem DFAT-Test, der ein Fluoreszenzmikroskop und Immunfluoreszenzkonjugat sowie Kühltransport und Probenlagerung erfordert. Selbst der DRIT-Test, der mit einem Lichtmikroskop durchgeführt werden kann, erfordert eine kontinuierliche Kühlkette, um die Tollwut-Antikörper zu speichern, die ebenfalls noch nicht im Handel erhältlich sind. Im Vergleich zum DRIT benötigt das RIDT keine toxischen Chemikalien, ein besonderer Vorteil in Ländern, in denen die Abfallentsorgung schlecht reguliert ist. Der Schnelltest ist weniger zeitaufwändig mit viel einfacherer Interpretation im Vergleich zu den Goldstandard-Tests DFAT und DRIT. Dies ermöglicht Vor-Ort-Tests durch Personal mit begrenztem technischen Know-how.

Basierend auf diesen Testeigenschaften wird eine schnelle Diagnose von Verdächtigen tieren in entlegenen Gebieten möglich, was die Umsetzung der Post-Expositionsprophylaxe (PEP) für exponierte Menschen so schnell wie möglich erleichtert. Darüber hinaus ist der Ferntransport von Tollwutproben nicht erforderlich, was zu einer besseren Probenqualität zum Zeitpunkt der Prüfung führt. Die mit den RIDT-Tests erzielten Ergebnisse sollten jedoch derzeit mit einem Referenzdiagnosetest wie DFAT oder DRIT bestätigt werden.

RIDT-Techniken zum Nachweis von RABV und anderen Lyssaviren wurden evaluiert. Eine der ersten Studien wurde von koreanischen Forschern im Jahr 2007¹⁰durchgeführt. Im Vergleich zur DFAT-Methode zeigte das RIDT in 51 Tierproben und 4 RABV-Isolaten eine Empfindlichkeit und Spezifität von 91,7 % bzw. 100 %. Diese Ergebnisse wurden später mit 110 Tierhirnproben aus Korea bestätigt, mit Empfindlichkeit und Spezifität, verglichen mit DFAT, von 95% bzw. 98,9% bzw.¹⁵. In jüngerer Zeit bewerteten andere Studien die Leistung dieser RIDT unter Verwendung von Virusisolaten und/oder infizierten Hirnproben von verschiedenen Tieren unterschiedlicher geografischer Herkunft. Ein Panel von 21 Proben, darunter afrikanische RABV und andere afrikanische Lyssaviren (Duvenhage Virus (DUVV), Lagos Fledermausvirus (LBV) und Mokola Virus (MOKV)), wurden erfolgreich nachgewiesen, mit einer Empfindlichkeit von 100% im Vergleich zu der DFAT¹⁶. Ähnlich hohe Empfindlichkeit (96,5%) und Spezifität (100%) Die Werte wurden aus einer Gruppe von 115 Hirnproben aus Äthiopien¹⁷gewonnen. Eine weitere Studie bewertete europäische RABV-Isolate, zwei weitere europäische Lyssaviren (Europäische Fledermauslyssavirus Typ 1 (EBLV-1) und Typ 2 (EBLV-2)) und das australische Fledermauslyssavirus (ABLV)¹⁸. Basierend auf der Analyse von 172 Tierhirnproben hatte das RIDT-Kit 88,3% Empfindlichkeit und 100% Spezifität im Vergleich zu DFAT, und die drei Tollwut-bezogenen Lyssaviren wurden erfolgreich nachgewiesen. In dieser Studie, einige der falschen negativen Ergebnisse kamen von Gehirnproben in Glycerin-Puffer gespeichert, was darauf hindeutet, dass unsachgemäße Glycerin-Entfernung beeinflusst Kapillarfluss oder Antikörperbindung. Eine kürzlich durchgeführte Analyse von 43 klinischen Proben von australischen Fledermäusen bestätigte frühere Testergebnisse, mit vollständiger Übereinstimmung mit DFAT¹⁹. Zwei Studien wurden in Indien mit dem RIDT an einer begrenzten Anzahl klinischer Proben (11 und 34 Proben) durchgeführt. Im Vergleich zu DFAT lag die Sensitivität zwischen 85,7% und 91,7% und die Spezifität bei 100%^20,21. Eine weitere Auswertung dieses Kits mit 80 Tierhirnproben aus Afrika, Europa und dem Nahen Osten erhielt eine vollständige Übereinstimmung mit DFAT für spezifität (100%) aber eine höhere Empfindlichkeit (96,9%) im Vergleich zu den vorherigen Studien²². In einem kürzlich durchgeführten interlaborativen Vergleich dieser RIDT, der in 22 verschiedenen Laboratorien mit einer Tafel mit 10 Proben durchgeführt wurde, betrug die Gesamtkonkordanz 99,5 %²³.

Nur eine kürzlich durchgeführte multizentrische Studie zeigte eine unbefriedigende RIDT-Gesamtleistung²⁴. Beispiele aus drei verschiedenen Datensätzen wurden getestet und lieferten variable Empfindlichkeits- und Spezifitätswerte im Vergleich zu DFAT. Beispielsweise ergaben die Mitderalsundie und Spezifität, die mit dem ersten Panel (n=51) und dem zweiten Panel (n=31) von Proben von versuchsinfizierten Tieren gewonnen wurden, die alle im Labor A getestet wurden, eine Empfindlichkeit von 16 % bzw. 43 %, während die Spezifität für beide 100 % betrug. Umgekehrt lieferten die Ergebnisse des dritten Panels (n=30) der vom Labor B analysierten klinischen Feldproben eine vollständige Übereinstimmung mit den Ergebnissen der DFAT, die durch Labor A (85% Empfindlichkeit und 100% Spezifität) weiter fast vollständig bestätigt wurde. Batch-zu-Charge-Variation wurde als mögliche Erklärung für die schwankende relativ geringe Empfindlichkeit mit RIDT²⁴vorgeschlagen.

Gleichzeitig führte eine andere Studie einen ähnlichen Validierungsprozess der oben beschriebenen RIDT durch, mit einer Änderung des vom Hersteller empfohlenen^{Protokolls 14}. Der Vorverdünnungsschritt (1:10) in PBS wurde bei der Vorbereitung des Hirnmaterials weggelassen. Basierend auf diesem einfacher modifizierten Protokoll erhielten die Autoren eine Empfindlichkeit und Spezifität von 95,3 % bzw. 93,3 % im Vergleich zu DFAT, indem sie unter Laborbedingungen einen Datensatz von 73 Tierhirnproben testeten, die natürlich oder experimentell mit verschiedenen RABV-Stämmen infiziert waren. Die Studie präsentierte die erste Bewertung dieses RIDT in einem Feld (Tschad, Afrika). In 48 klinischen Hirnproben betrugen Sensitivität und Spezifität 94,4 % bzw. 100 %. Die Diskrepanzen zwischen DFAT und RIDT waren auf falsch positive Ergebnisse mit DFAT zurückzuführen, die nach Bestätigung mit RT-PCR ermittelt wurden. Als diese Ergebnisse gelöscht wurden, gab es vollständige Übereinstimmung, und es zeigte sich, dass die RIDT zuverlässiger war als DFAT unter diesen Feldbedingungen¹⁴. Mit dem geänderten Protokoll wurde keine Batch-zu-Batch-Variation beobachtet. Als das modifizierte Protokoll auf eine kleine Anzahl der DFAT/RIDT divergenten Proben (n=8) in der Studie von Eggerbauer et al.²⁴angewendet wurde, wurden alle konkordante (100% Empfindlichkeit) gefunden.

Ein weiterer großer Vorteil des RIDT ist die sekundäre Verwendung für den Nachweis viraler RNA, die auf dem Streifen mit molekularen Techniken (wie RT-PCR) und anschließender Genotypisierung^14,24fixiert ist. Nach einem Extraktionsschritt demonstrierten Léchenne et al.¹⁴ virale RNA, die auf der Anigen-Gerätemembran mit RT-PCR mit 86,3% Empfindlichkeit in einem Panel von 51 Proben (darunter 18 Proben getestet und aus dem Tschad bei Umgebungstemperatur) versendet wurde. In 93 % der 14 getesteten Proben war eine nachträgliche Genotypisierung möglich. Es wurden Sanger-Sequenzierungen von PCR-Amplicons von mindestens 500 Nukleotiden verwendet. Zusätzlich zu den RABV-Isolaten wurden im Rahmen eines vollständig konkordanten internationalen Interlaborationstests¹⁴vier weitere Lyssavirus-Arten, DUVV, EBLV-1, EBLV-2 und Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), nachgewiesen. Die Sensitivität der viralen RNA-Erkennung war noch höher (100%) in der Studie von Eggerbauer et al., basierend auf Laborproben Untersuchung²⁴. Die letztgenannte Studie zeigte auch, dass der Puffer, der im RIDT-Kit verwendet wird, inaktiviertes Virus ist. Dadurch können die Geräte einfach und ohne spezifische Biosicherheitsvorkehrungen an Referenzlaboratorien zur molekularen Bestätigung und Genotypisierung geliefert werden.

Basierend auf den bisherigen Auswertungen bieten RIDT-Tools zahlreiche Vorteile für den Einsatz in Feldeinstellungen, insbesondere wenn die Referenzdiagnosetechniken nicht verfügbar sind. Allerdings hat dieser Test auch einige Einschränkungen, insbesondere geringe Empfindlichkeit der Antigen-Erkennung^14,24. Der Test gilt für Proben, die große Mengen an viralen Antigenen enthalten, wie z. B. Hirnproben. Es ist jedoch nicht geeignet für andere Proben wie Speichel oder andere Körperflüssigkeiten. Ein weiterer Nachteil sind die Kosten des Geräts (ca. 5-10 Euro in Europa), die im Vergleich zu den Kosten für die Durchführung von DFAT, RT-PCR oder DRIT günstiger sind, aber für LMICs immer noch hoch bleiben. Die zukünftige Entwicklung und Validierung ähnlicher RIDTs von anderen Unternehmen könnte jedoch zu einem Preisrückgang führen. Eine Studie berichtete batch-to-batch Variationen. Obwohl andere nicht berichtet haben, sollten beim Testen einer neuen Charge strenge Qualitätskontrollen durchgeführt werden, wie bei jedem Reagenz, das in einer Qualitätsmanagementumgebung verwendet wird. Die Verwendung des geänderten Protokolls wurde bei Verwendung verschiedener Batches nicht geändert¹⁴. Bis auf eine Studie zeigten alle, dass die Empfindlichkeit von RDIT im Vergleich zu DFAT hoch war (etwa 90%-95%). Da Tollwut immer tödlich ist, wird weiterhin dringend empfohlen, negative Ergebnisse mit RDIT mit einem Referenzdiagnosetest wie DFAT, DRIT oder RT-PCR¹⁴zu bestätigen.

In diesem Manuskript stellen wir ein vollständiges Protokoll zur Feldpostmortalendiagnose von Tiertollwut vor, basierend auf einem Beispiel einer kommerzialisierten RIDT, von der Entnahme von Hirnproben bis zur Anwendung eines modifizierten Protokolls im Vergleich zu den Herstellerempfehlungen (die zuvor¹⁴validiert wurden) und der anschließenden molekularen Analyse. Dieses Protokoll wurde mehrfach unter Feldbedingungen in West- und Zentralafrika angewendet und validiert, wo das RIDT neben dem DFAT-Test routinemäßig zur Tollwutdiagnose eingesetzt wurde. Zusätzlich zeigen wir eine zweite Anwendung für das Gerät in Laboreinstellungen zur Extraktion und Detektion mit RT-PCR von viraler RNA, die am Gerät befestigt ist.

Protocol

1. Probenentnahme über das Foramen magnum (Occipital Route)²⁵

HINWEIS: Diese Technik kann unter Laborbedingungen oder in Feldeinstellungen implementiert werden. Die Proben sollten so bald wie möglich nach dem Tod des verdächtigen Tieres verarbeitet oder bei kühler Temperatur (gekühlt oder gefroren, wenn möglich) aufbewahrt werden, um eine Zersetzung zu vermeiden, die die Ergebnisse beeinträchtigen könnte. Ähnlich wie bei anderen Referenztechniken, die auf dem Nachweis von Lyssavirus-Antigenen wie DFAT und DRIT basieren, sollten zersetzte Proben nicht getestet werden, da sie das Ergebnis beeinflussen können (Risiko falsch negativer Ergebnisse).

VORSICHT: Alle Proben sollten als potenziell infektiös betrachtet werden. Sicherheitsvorschriften und -verfahren sollten strikt eingehalten werden, auch in Feldeinstellungen⁴. Tragen Sie insbesondere geeignete persönliche Schutzausrüstungen wie Maske, Brille, Handschuhe und einen Labormantel. Verwenden Sie geeignetes Desinfektionsmittel für Material- und Probendekontaminationen (z. B. Natriumhypochlorit mit empfohlenen Herstellerverdünnungen, 70% Alkohol - Ethanol oder Isopropanol, 1% Seifenlösung). Alle Personalproben sollten gegen Tollwut geimpft werden.

1. Entfernen Sie den Tierkopf mit einem Messer vor dem ersten Halswirbel (Atlaswirbel), um auf das Foramenmagnum zuzugreifen.
   HINWEIS: Um infektiöses Aerosol zu minimieren, vermeiden Sie die Verwendung einer manuellen Säge oder eines ähnlichen Werkzeugs.
2. Brainstem (medulla oblongata) Probe mit einer Einweg-Kunststoffpipette (Abbildung 2A), ein Trinkhalm (Abbildung 2B), eine Klemme (Abbildung 2C) oder ein Traber (mit dem RIDT geliefert) (Abbildung 2D).
   HINWEIS: Bei der Entnahme der Probe ist besondere Aufmerksamkeit zu beachten, da dies ein äußerst wichtiger Schritt für die Zuverlässigkeit der Ergebnisse ist. Zusätzlich zu dem zugehörigen Video, das auf einfache Weise zeigt, wie man den Teil des Gehirns von Interesse zu sammeln, ist ein Trainingsschritt sehr zu empfehlen, um sicherzustellen, dass der richtige anatomische Abschnitt zu sammeln.
3. Optional und zusätzlich zu Hirnstamm (medulla oblongata), sammeln andere Teile des Hirnstamms oder des Gehirns (Kleinhirn, Hippocampus, Thalamus und Kortex) durch den gleichen okzipitalen Weg durch Schieben und Drehen der Kunststoffpipette oder Stroh in Richtung der Augenhöhle (Abbildung 3).
4. Wenn Sie ein Stroh oder eine Pipette verwenden, drücken Sie es vorsichtig, um die Hirnprobe (0,5-2 g) in einem Rohr für die nachfolgende Analyse und/oder Biobanking zu deponieren.
   HINWEIS: Die Probenlagerung in Glycerin wird nicht empfohlen, da sie den Kapillarfluss oder den Antikörperbindungsschritt des RIDT¹⁸zu beeinflussen scheint.

2. Ausführung des modifizierten RIDT-Protokolls¹⁴

HINWEIS: Diese Änderung lässt einen Verdünnungsschritt (1:10) in PBS aus, wie im Herstellerprotokoll (alle Versionen) angegeben, und kann unter Labor- oder Feldeinstellungen implementiert werden.

1. Verwenden Sie den Tupfer/Tropfen, um das Äquivalent von einer halben Erdnuss oder Erbse (0,1-0,5 g) Gehirnmaterial zu sammeln und in das Pufferprobenröhrchen zu legen.
   HINWEIS: Für das modifizierte Protokoll sind alle Reagenzien/Verbrauchsmaterialien im Kit enthalten (kein PBS oder zusätzliches Rohr erforderlich) (Abbildung 4). Dokumentieren Sie die Chargennummer des Kits und überprüfen Sie die Gültigkeit des Ablaufdatums.
2. Das Hirnmaterial vorsichtig direkt in der Röhre mit dem Tupfer oder dem Traber ca. 30 s zerkleinern, bis eine homogene Suspension erhalten ist.
   HINWEIS: Die Pufferreaktion inaktiviert die Infektiosität des Virus unter den Bedingungen des Herstellerprotokolls²⁴.
3. Mit dem Tredase vier Tropfen (ca. 100 l) der Suspension im Probeneinlass auf dem Prüfgerät ablagern.
4. Warten Sie auf die vollständige Beispielmigration (1-5 min), bevor Sie das Testgerät lesen. Die Migration sollte nach der Hinterlegung der Probe (1-5 min) schnell beginnen.
5. Im Falle einer Verzögerung (aufgrund der hohen Viskosität Suspension) oder um den Beginn der Migration zu beschleunigen, kratzen Sie vorsichtig den Boden der Ablagerungsstelle des Geräts mit dem Trinse (1-5 mal) und fügen Sie schließlich 1-2 weitere Tropfen hinzu. Die Migration sollte unmittelbar danach beginnen.
6. Lesen Sie das Testergebnis im Erkennungsfenster nach 5-10 min und nicht mehr als 20 min nach dem Ende der Migration.
7. Interpretieren Sie das Ergebnis basierend auf dem Vorhandensein oder Fehlen der Steuerlinie (C-Linie) und der Prüflinie (T-Linie) (violette Linien) im Erkennungsfenster gemäß Abbildung 5. Betrachten Sie das Beispiel positiv, wenn zwei Linien sichtbar sind (Abbildung 5A), negativ, wenn nur die C-Linie vorhanden ist (Abbildung 5B) und ungültig, wenn nur die T-Linie vorhanden ist oder wenn keine Linien sichtbar sind (Abbildung 5C).
   HINWEIS: Ungültige Ergebnisse sollten mindestens einmal wiederholt werden. Andere Techniken sollten ausgeführt werden, wenn die Ergebnisse ungültig bleiben. Negative Ergebnisse, die mit RIDT erzielt wurden, müssen anschließend mit einem Goldstandard-Referenzverfahren wie DFAT, DRIT und molekularen Methoden (Polymerase-Kettenreaktion oder PCR) bestätigt werden. Obwohl die Empfindlichkeit dieses Tests hoch ist (siehe repräsentative Ergebnisse), ist es nicht 100%.
8. Speichern Sie gebrauchte Geräte bei Raumtemperatur oder kühlen/gefrieren Sie, wenn möglich, für die nachfolgende molekulare Analyse (siehe Abschnitt 4). Die verbleibende Probensuspension bei -20 °C/-80 °C im Pufferrohr einfrieren, um den Test bei Bedarf zu wiederholen oder anschließend molekulare Analysen durchzuführen.

3. RNA-Extraktion und -Detektion durch RT-qPCR aus dem RIDT-Gerät

HINWEIS: Dieser Schritt kann nur unter Laborbedingungen mit angepasster Umgebung und geeigneter Ausrüstung für die molekulare Diagnose durchgeführt werden. Es kann kurz nach dem RIDT-Test oder retrospektiv auf archivierten RIDT-Geräten durchgeführt werden, die bei Raumtemperatur (15-30 °C), gekühlt oder gefroren gelagert werden.

1. RNA-Extraktion
   ANMERKUNG: Um den Extraktionsschritt zu überwachen, wird empfohlen, eine interne Kontrolle zu verwenden, die eine endogene mRNA (wie ß-Actin) oder eine exogene Kontrolle (wie eGFP synthetische RNA) sein kann, die während der ersten Schritte der Extraktion direkt in die Probe gespuckt wird^26,27.
   1. Öffnen Sie das Gerät vorsichtig und entfernen Sie das Filterpapier.
   2. Schneiden Sie den Ablagerungsbereich der Probe und legen Sie ihn in ein Rohr mit 1 ml Tri-Reagenz LS. Inkubieren Sie bei RT für 1 Stunde mit sanften regelmäßigen manuellen Rührung.
   3. Führen Sie die Extraktion gemäß den Herstellerempfehlungen, wie zuvor beschrieben²⁷. In diesem Schritt kann die exogene interne Kontrolle hinzugefügt werden.
   4. Während des Prozesses, fügen Sie 2 l Glykogen zur Erleichterung der Ausfällung von RNA, nach den Empfehlungen des Herstellers.
   5. Passen Sie das Endvolumen für die RNA-Resuspension in nukleasefreiem Wasser an, wobei in der Regel ein Volumen von 50 l verwendet wird.
      HINWEIS: Am Ende des Zentrifugationsschritts zur wässrigen und organischen Phasentrennung (nach Zugabe von 200 l Chloroform in das Tri-Reagenz LS) befindet sich das Membranstück des Geräts an der Unterseite des Rohres und stört nicht die Entnahme der oberen wässrigen Phase. Alternativ können auch andere einfache und schnelle Protokolle verwendet werden, z.B. mit phenolbasierten Reagenzien und Kieselsäuremembranen²⁸.
2. Erkennung durch RT-qPCR²⁶
   HINWEIS: Die Detektion potenzieller viraler RNA in extrahierten Proben kann mit verschiedenen molekularen Techniken erfolgen, wie z. B. Reverse-Transkription-PCR, konventionelle (Endpunkt) oder Echtzeit-PCR (qPCR). Es stehen verschiedene Methoden zur Verfügung, wie z.B. herkömmliche RT-PCR^27,29 oder RT-qPCR^26,30, die auf das virale Nukleoprotein oder Polymerase-Gen abzielen. Ein Beispiel wird im Folgenden auf der Grundlage eines kombinierten Panlyssavirus RT-qPCR vorgestellt, das auf eine konservierte Region unter der viralen Polymerase abzielt. Diese RT-qPCR-Technik assoziiert zwei verschiedene RT-qPCR: eine basiert auf der TaqMan-Sondentechnologie (pan-RABV RT-qPCR) und die andere mit der SyBR Green-Erkennung (pan-lyssa RT-qPCR). Darüber hinaus erfolgt der Nachweis einer exogenen internen Kontrolle (eGFP-RNA), die während des Extraktionsprozesses direkt gespickt ist, durch eine spezifische TaqMan-Sonde-basierte RT-qPCR (eGFP RT-qPCR). Eine sorgfältige Vor-Ort-Validierung der molekularen Techniken, die für den Nachweis viraler RNA ausgewählt wurden, ist wichtig, insbesondere um zu überprüfen, ob Primer und Sonden für Echtzeit-RT-PCR für den Nachweis der stämme, die im Interessengebiet zirkulieren, angepasst sind⁴.
   1. RNA-Probe in nukleasefreiem Wasser auf 1:10 verdünnen. Testen Sie jede RNA-Probe in doppelter Ausführung mit einer 96-Well-Reaktionsplatte oder anderen Formaten. Verwenden Sie positive und negative Steuerelemente für jeden Test und Test mindestens in Duplikat.
   2. Bereiten Sie die Master-Mix-Reaktionslösung für die drei verschiedenen RT-qPCR-Assays gemäß Tabelle 1und mit den in Tabelle 2angegebenen Primern/Sonden vor.
   3. Fügen Sie jedem der drei verschiedenen Tests 5 l verdünnte RNA-Proben und 15 l Master-Mix hinzu. Der pan-RABV RT-qPCR Assay und der eGFP RT-qPCR Assay können in derselben Platte zyklisch sein.
   4. Führen Sie die verschiedenen Assays nach den in Tabelle 3angegebenen thermischen Radfahrbedingungen aus. Wenn nur ein PCR-Thermocycler verfügbar ist, beginnen Sie mit dem pan-RABV RT-qPCR und halten Sie die Platte für die pan-lyssa RT-qPCR bis zum Ende des pan-RABV RT-qPCR bei 4 °C.
   5. Analysieren Sie die Ergebnisse, die mit den drei Assays gemäß Tabelle 4erzielt wurden.

4. Genotypisierung nach RNA-Extraktion aus dem RIDT-Gerät

1. Reverse Transkription RT^27,29
   1. Bereiten Sie eine Master-Mischung mit 6 l RNA, 2 l pd(N)6 zufällige Primer (200 g/l) und 2 l nukleasefreies Wasser für ein Endvolumen von 10 l vor.
   2. Bei 65 °C 10 min in einem Wärmeblock inkubieren und dann auf Eis aufbewahren.
   3. Bereiten Sie eine Master-Mischung mit 6 l von 5x First-Strand Buffer, 2 'L von 0,1 M Dithiothreitol (DTT), 1 l (200 U) superscript II Reverse Transkriptase, 2 l (80 U) RNasin, 2 'L dNTP-Mix (10 'M) und komplett mit nukleasefreiem Wasser vor, um ein Endvolumen von 20 l für jede Probe zu erhalten.
   4. Fügen Sie die Master-Mischung (20 l) in die Probe (10 l) (Endvolumen von 30 l) und inkubieren bei 42 °C für 90 min in einem Wärmeblock.
   5. Fahren Sie mit der PCR-Verstärkung mit dem nächsten Schritt fort oder lagern Sie die cDNA bei -20 °C.
2. Konventionelle PCR^27,29,31
   HINWEIS: Für die Genotypisierung stehen verschiedene Techniken der konventionellen PCR zur Verfügung. Zwei werden vorgestellt, beide hemi-nested PCR, die auf einen Teil des Nukleoproteins oder einen Teil des viralen Proteins des Lyssavirus abzielen. Das Protokoll ist für jeden dieser Assays gleich, mit Ausnahme der Primer und Radfahrbedingungen. Positive (positive RNA) und negative (negative cDNA und/oder nukleasefreies Wasser) Kontrollen sollten in jeder Reihe und jeder Runde pcR enthalten sein.
   1. Bereiten Sie für jede Probe in einem 0,2 ml Mikrorohr eine Master-Mix-Reaktionslösung für den ersten PCR-Schritt vor. Diese Mischung enthält 5 l mit 10x NH4-Reaktionspuffer, 2,5 l MgCl_2-Lösung (50 mM), 1 l dNTP-Mix (10 m), 1 l pro Primer (10 m), 0,2 l (1 U) Biotaq-DNA-Polymerase und 37,3 l nukleasefreies Wasser (Endvolumen 48l). Die Primer sind in Tabelle 5angegeben.
   2. Fügen Sie in jeder Röhre 2 l cDNA hinzu und fahren Sie auf einem separaten konventionellen PCR-Thermocycler für jeden Test gemäß Tabelle 6.
   3. Bereiten Sie eine zweite Master-Mix-Reaktionslösung vor, die mit der vorherigen identisch ist, mit den entsprechenden Primern (Tabelle 5) für die hemi-geschachtelte PCR-Reaktion.
   4. Fügen Sie 2 L des ersten RUNDEN PCR-Produkts hinzu und fahren Sie auf einem herkömmlichen PCR-Thermocycler mit den in Tabelle 6angegebenen Zyklusparametern.
   5. Visualisieren Sie die verschiedenen PCR-Produkte (erste und zweite Runde PCR) nach dem Laden auf ein 1% Agarose-Gel (100 ml Tris-Acetat EDTA Puffer 1x - TAE 1x) mit Ethidiumbromid (Endkonzentration um 0,01%) und führen Sie das Gel während 30 min bei 120 V. Ein positives PCR-Ergebnis wird in Form eines hellen Bandes der erwarteten Größe beobachtet (Tabelle 5).
3. Sanger-Sequenzierung
   1. Führen Sie eine Sanger-Sequenzierung der Amplicons durch, die mit dem panlyssavirus-hemi-nested PCR erhalten wurden, und führen Sie die Genotypisierungsanalyse durch.

Representative Results

Wie bei jeder Diagnosemethode ist die Probenentnahme von größter Bedeutung für die Zuverlässigkeit der Ergebnisse, insbesondere wenn sie in Feldeinstellungen ausgeführt wird. Der Sammelprozess muss so einfach wie möglich sein, um die Sammlung hochwertiger Proben zu gewährleisten. Die Sammlung einer Hirnbiopsie (Gehirnstamm mit Medulla oblongata) über den Foramen magnum Weg zur postmortalen Diagnose von Tiertollwut erfüllt diese Anforderung, wie in Abbildung 2A-D²⁵angegeben.

Nach der Entnahme wird die Hirnprobe an das modifizierte Protokoll der RIDT übermittelt, das in Abbildung 6zusammengefasst ist. Wie im Abschnitt Protokoll angegeben, ist die wichtigste Anpassung des vom Hersteller bereitgestellten Protokolls die Unterlassung des Verdünnungsschritts in PBS, der das Verfahren und die erforderlichen Verbrauchsmaterialien/Reagenzien vereinfacht, die alle im Kit enthalten sind (Abbildung 4).

Dieses modifizierte Protokoll wurde in fünf verschiedenen Laboratorien implementiert und evaluiert, darunter ein WHO-Kooperationszentrum für Tollwut (Lab 1, Frankreich), ein FAO-Referenzzentrum für Tollwut (Lab 5, Italien) und drei Referenzlaboratorien in enzootischen afrikanischen Ländern, Tschad (Lab 2), Elfenbeinküste (Lab 3) und Mali (Lab 4). Im Tschad wurde eine Bewertung des RIDT sowohl im Labor als auch im Feld durchgeführt.

Im Vergleich zur Referenztechnik DFAT waren die Empfindlichkeit und Spezifität des RDIT für alle Laboratorien mit 96 % bis 100 % bzw. 93,7 % bis 100 % hoch (Tabelle 7). Die geringste Empfindlichkeit und Spezifität des RDIT wurde für Lab 1 (Frankreich) während des Laborvalidierungsschritts ermittelt. Basierend auf der kumulativen Anzahl der getesteten Proben (n=162) (Ergänzende Tabelle 1) betrug die Gesamtempfindlichkeit und Spezifität gegenüber DFAT 98,2 % bzw. 95,8 % (Tabelle 7). Diese vorläufigen, aber vielversprechenden Ergebnisse wurden jedoch auf einem begrenzten Stichprobendatensatz erzielt und müssen bei einer großen Anzahl positiver und negativer Proben, insbesondere für diejenigen, die in enzootischen Gebieten getestet wurden, weiter bestätigt werden, um eine mögliche Unterschätzung oder Verzerrung aufgrund der aktuellen heterogenen Datensätze zu vermeiden.

Der RIDT-Test eignet sich zum Nachweis von Lyssavirus in Hirnbiopsien von infizierten Tieren, bei denen der Gehalt an Lyssavirus-Antigenen wichtig ist. Die Testgrenze für die Detektion bleibt jedoch hoch, wenn die Suspension des titrierten Virus getestet wird(Tabelle 8; Abbildung 7).

Tabelle 9 (von Léchenne 2016¹⁴) zeigt ein Beispiel für Ergebnisse, die nach dem RNA-Nachweis durch das duale kombinierte Panlyssavirus RT-qPCR erzielt wurden, das auf die virale Polymerase des Lyssavirus abzielt. Getestet wurde eine Gruppe von 51 positiven RIDT-Tests, die unter Laborbedingungen (Labor 1, n=32) oder im Tschad (Lab 2, n=19) durchgeführt und dann bei Umgebungstemperatur an Lab 1 geliefert wurden. Positive Erkennung wurde für 18 (94,7%), 26 (81,2%) und 44 (86,3%) Proben aus Lab 1, Lab 2 bzw. den beiden kombinierten. Darüber hinaus wurde die Genotypisierung für 14 dieser Proben (10 aus Labor 1 und 4 aus Labor 2) mit der hemi-geschachtelten PCR durchgeführt, die auf das partielle Nukleoprotein-Gen abzielte, und war für 13 von ihnen erfolgreich (93%) (von Léchenne et al. 2016¹⁴).

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Struktur eines RIDT für die Tollwutdiagnose. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Beispiele für schnelle einfache Techniken zur Entnahme von Hirnproben (Gehirnstamm mit Medulla oblongata) bei Tieren (Hund hier gezeigt) über das okzipitale Foramen in Feldeinstellungen (Mali). (A) Sammlung mit einer Einweg-Kunststoffpipette (B) Sammlung mit einem Kunststoff-Trinkhalm (C) Sammlung mit einer Klemme (D) Sammlung mit dem Entsorgungstropfen im RIDT-Kit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Längsschnitt anatomisch des Hundekopfes, der die verschiedenen Teile des Gehirns (Gehirnstamm, Kleinhirn, Hippocampus, Thalamus und Kortex) zeigt, die gesammelt werden, wenn in einer Rotationsbewegung eine Einweg-Kunststoffpipette durch den okzipitalen Foramenweg geschoben wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Beschreibung des Inhalts des RIDT-Kits, einschließlich des Geräts, eines Einweg-Kunststoff-Trabers, eines Einwegtupfers und des Assay-Verdünnungsmittels. Das Rohr, in dem die Probe entnommen und gelagert wird, wird nicht zur Verfügung gestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Repräsentative Ergebnisse für die Interpretation des Anigen RIDT. (A) Positive Ergebnisse (sichtbares Vorhandensein von zwei Linien, C-Linie und T-Linie) (B) Negative Ergebnisse (nur sichtbares Vorhandensein von C-Linie) (C) Ungültige Ergebnisse (fehlender sichtbarer C-Linie). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Schematische Darstellung des RIDT-Protokolls, angepasst an Herstelleranweisungen. (A) Geänderte Version des Protokolls, mit Streichung des vom Hersteller empfohlenen Verdünnungsschritts (B) Anfangsprotokoll vom Hersteller empfohlen, mit einem Verdünnungsschritt vor 1:10 in PBS der Hirnproben. Die in der geänderten Version des Protokolls gelöschten Schritte (dargestellt in Abbildung 6A) sind mit einer roten Linie gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Beispiel für die Bestimmung der Nachweisgrenze von RIDT¹⁴. Es wurde eine serielle 10:1-Verdünnung eines titrierten Tollwutvirus des Stammes 9704ARG verwendet. Die auf jedem Gerät abgelagerte Virusmenge wird in FFU (fluoreszierende Fokusbildeinheiten) angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Pan-RABV RT-qPCR Assay
Reagenz	L/Reaktion
2X Reaktionsmix (ein Puffer mit 0,4 mM pro dNTP und 6 mM MgSO4)	10
Nuklease freies Wasser	1.5
Taq3long (Vorwärts) [10 'M]	1
Taq17revlong (Umkehr) [10 'M]	1
RABV4 [10 M]	0.3
RABV5 [10 M]	0.3
MgSO4 [50-mM] (im Kit enthalten)	0.25
ROX-Referenzfarbstoff (25 m) (im Kit enthalten)	0.05
RNasin (40U/L) (Promega)	0.2
SuperScript III RT/Platinum Taq Mix	0.4
Gesamt pro Reaktion	15
eGFP RT-qPCR Assay
Reagenz	L/Reaktion
2X Reaktionsmix (ein Puffer mit 0,4 mM pro dNTP und 6 mM MgSO4)	10
Nuklease freies Wasser	2.8
EGFP1F (Vorwärts) [10 M]	0.5
EGFP2R (Umkehr) [10 m]	0.5
eGFP-Sonde [10 M]	0.3
MgSO4 [50-mM] (im Kit enthalten)	0.25
ROX-Referenzfarbstoff (25 m) (im Kit enthalten)	0.05
RNasin (40U/L) (Promega)	0.2
SuperScript III RT/Platinum Taq Mix	0.4
Gesamt pro Reaktion	15
Pan-lyssa RT-qPCR-Test
Reagenz	L/Reaktion
2x SYBR Grüner Reaktionsmix	10
Nuklease freies Wasser	2.1
Taq5long (Vorwärts) [10 'M]	1
Taq16revlong (Umkehr) [10 'M]	1
MgSO4 [50-mM] (im Kit enthalten)	0.25
ROX-Referenzfarbstoff (25 m)	0.05
RNasin (40U/L) (Promega)	0.2
SuperScript III RT/Platinum Taq Mix	0.4
Gesamt pro Reaktion	15

Tabelle 1: Beschreibung der Master-Mix-Reaktionslösung für die drei verschiedenen RT-qPCR-Assays (Pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR und eGFP RT-qPCR).

RT-qPCR-Test	Namen	Typ	Länge	Sequenz (5'-3')	Sinn	Position
pan-RABV RT-qPCR Assay	Taq3long	Primer	22	ATG AGA AGT GGA AYA AYC ATC A	S	7273-7294a
	Taq17revlong	Primer	25	GAT CTG TCT GAA TAA TAG AYC CAR G	Als	7390-7414a
	RABV4	Sonde (FAM/TAMRA)	29	AAC ACY TGA TCB AGK ACA GAR AAY ACA TC	Als	7314-7342a
	RABV5	Sonde (FAM/TAMRA)	32	AGR GTG TTT TCY AGR ACW CAY GAG TTT TTY CA	S	7353-7384a
Pan-lyssa RT-qPCR-Test	Taq5long	Primer	23	TAT GAG AAA TGG AAC AAY CAY CA	S	7272-7294a
	Taq16revlong	Primer	25	GAT TTT TGA AAG AAC TCA TGK GTY C	Als	7366-7390a
eGFP RT-qPCR Assay	EGFP1F	Primer	20	GAC CAC TAC CAG CAG AAC AC	S	637-656b
	EGFP2R	Primer	19	GAA CTC CAG CAG GAC CAT G	Als	768-750b
	EGFP	Sonde (FAM/TAMRA)	22	AGC ACC CAG TCC GCC CTG AGC A	S	703-724b

Tabelle 2: Beschreibung der Primer/Sonden für die drei verschiedenen RT-qPCR-Assays (pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR und eGFP RT-qPCR). ^a Nach dem Pasteur-Virus (PV) RABV Genomsequenz (GenBank-Beitrittsnummer M13215). ^b Gemäß der Klonvektor-Sequenz pEGFP-1 (GenBank-Beitrittsnummer U55761).

Pan-RABV RT-qPCR und eGFP RT-qPCR Assays
Schritt	Zyklus	Temp	Zeit	Datenerfassung
Reverse Transcription	1	45 °C	15 Min.
RT-Inaktivierung/Erstdenaturierung	1	95 °C	3 Min.
Verstärkung	40	95 °C	15 s
		61 °C	1 Min.	Endpunkt
Pan-lyssa RT-qPCR-Test
Schritt	Zyklus	Temp	Zeit	Datenerfassung
Reverse Transcription	1	45 °C	15 Min.
RT-Inaktivierung/Erstdenaturierung	1	95 °C	3 Min.
Verstärkung	40	95 °C	15 s
		55 °C	1 Min.	Endpunkt
Dissoziationskurve	1	95 °C	15 s	Steigerung um 0,1 °C/s, 55–95 °C
		55 °C	1 Min.
		95 °C	15 s
		55 °C	15 s

Tabelle 3: Beschreibung der thermischen Zyklusbedingungen für die drei verschiedenen RT-qPCR-Assays (Pan-RABV RT-qPCR, pan-lyssa RT-qPCR und eGFP RT-qPCR).

Assay	Analyse	Ergebnisse	Interpretation
eGFP RT-qPCR	Cq im Annahmeintervall	Extraktion validiert	Analyse anderer Assays möglich
	Cq aus dem Annahmeintervall	Extraktion nicht validiert	Testen Sie die Probe erneut (wiederholen Sie den Lauf oder/und die Extraktion), fordern Sie ggf. eine weitere Probe an.
pan-RABV RT-qPCR	Cq <38	Positiv	Positiver Nachweis viraler RNA
	Cq Nr. 38	Negativ	Analyse des panlyssa RT-qPCR-Assays
pan-lyssa RT-qPCR	Schmelzkurve als positiv betrachtet	Positiv	Positiver Nachweis viraler RNA
	Schmelzkurve als negativ betrachtet	Negativ	Fehlende Detektion viraler RNA

Tabelle 4: Gesamtinterpretation des dualen kombinierten Panlyssavirus RT-qPCR-Assays.

Hemi-geschachtelter konventioneller PCR-Assay	PCR-Runde	Namen	Länge	Sequenz (5'-3')	Sinn	PositionierenSie eine	AmpliconGröße (bp)
Hemi-nested PCR, die auf das Polymerase-Gen abzielt	1. Runde	PVO5m	20	ATG ACA GAC AAY YTG AAC AA	S	7170-7189	320
		PVO9	19	TGA CCA TTC CAR CAR GTN G	Als	7471-7489
	2. Runde	PVO5m	20	ATGA CAG ACA AYY TGA ACA A	S	7170-7189	250
		PVO8	22	GGT CTG ATC TRT CWG ARY AAT A	Als	7398-7419
Hemi-nested PCR zielt auf das Nukleoprotein-Gen	1. Runde	N127	20	ATG TAA CAC CTC TAC AAT GG	S	55-74	1532
		N8m	19	CAG TCT CYT CNG CCA TCT C	Als	1568-1586
	2. Runde	N127	20	ATG TAA CAC CTC TAC AAT GG	S	55-74	845
		N829	19	GCC CTG GTT CGA ACA TTC T	Als	881-899

Tabelle 5: Beschreibung der Grundierungen, die für die herkömmliche, mit Halberz geschachtelte PCR verwendet werden.

	Hemi-nested PCR, die auf das Polymerase-Gen abzielt
	Schritt	Zyklus	Temperatur	Zeit
Erste und zweite Runde	Anfängliche Denaturierung	1	94 °C	3 Min.
	Denaturierung	35	94 °C	30 s
	Hybridierung		56 °C	45 s
	Dehnung		72 °C	40 s
	Enddehnung	1	72 °C	3 Min.
	Hemi-nested PCR zielt auf das Nukleoprotein-Gen
	Schritt	Zyklus	Temperatur	Zeit
Erste Runde	Anfängliche Denaturierung	1	94 °C	3 Min.
	Denaturierung	35	94 °C	30 s
	Hybridierung		56 °C	30 s
	Dehnung		72 °C	45 s
	Enddehnung	1	72 °C	3 Min.
Zweite Runde	Anfängliche Denaturierung	1	94 °C	3 Min.
	Denaturierung	35	94 °C	30 s
	Hybridierung		58 °C	30 s
	Dehnung		72 °C	30 s
	Enddehnung	1	72 °C	3 Min.

Tabelle 6: Beschreibung der thermischen Radfahrbedingungen für die herkömmliche, mit Halbwasser geschachtelte PCR.

Labor	Land	Evaluierungszeitraum	Nb von Proben	DFAT-Ergebnisse		RIDT-Ergebnisse		Empfindlichkeit	Spezifität
				Pos	Neg	Pos	Neg
Labor 1	Frankreich	2015	82	50	32	50	32	96%	93.7%
Labor 2	Tschad	2012-2015	44	33	11	33	11	100%	100%
Labor 3	Elfenbeinküste	2017	10	8	2	8	2	100%	100%
Labor 4	Mali	2017	18	15	3	15	3	100%	100%
Labor 6	Italien	2016	8	8	0	8	0	100%	-
Alle		2015-2017	162	114	48	114	48	98.2%	95.8%

Tabelle 7: Bestimmung der intrinsischen Parameter (Empfindlichkeit, Spezifität) des RIDT-Tests im Vergleich zur Referenz-DFAT-Methode, basierend auf der Analyse von insgesamt 162 Proben und unter Beteiligung von 5 verschiedenen Laboratorien.

Virusstamma	Original-Host	Lage	Anfangskonzentration (FFU/ml)b	Nachweisgrenze (FFU/mL)c
9147FRA	Rotfuchs	Frankreich	3,1 x 107	106
Cvs	Laborisolat	-	1,6 x 107	106
8743THA	Menschlichen	Thailand	8,1 x 107	> 8,1 x 106
9508CZK (SAD)	Laborisolat	-	5,4 x 108	107
Pv	Laborisolat	-	4,3 x 107	106
9001FRA	Hund	Französisch-Guayana	2,4 x 106	> 2,4 x 105
9704ARG	Fledermaus	Argentinien	9,5 x 107	105
04030PHI	Menschlichen	Philippinen	2,5 x 107	105

Tabelle 8: Nachweisgrenze des RIDT mit 8 verschiedenen Suspensionen von Titter-Tollwutviren (von Léchenne et al. 2016¹⁴). ^a CVS: Challenge VirusStamm, SAD: Street Alabama Dufferin, PV: Pasteur Virus. ^b Anzahl der fluoreszierenden Fokusbildungseinheiten (FFU) pro ml. ^c Anzahl der auf dem Streifen abgelagerten fluoreszierenden Fokusbildenden Einheiten (FFU).

		RIDT durchgeführt in
		Labor 1			Labor 2			Kombiniert
		Positiv	Negativ	gesamt	Positiv	Negativ	gesamt	Positiv	Negativ	gesamt
Virale RNA-Erkennung	Positiv	18	1	19	26	0	32	44	7	51
	Negativ	0	0	0	0	0	3	0	3	3
	gesamt	18	1	19	26	0	35	44	10	54

Tabelle 9: Nachweis viraler RNA mit RT-qPCR auf dem Anigen-Teststreifen, der unter Laborbedingungen (Labor 1), unter Feldbedingungen und bei Umgebungstemperatur (Labor 2) oder kombiniert (von Léchenne et al. 2016¹⁴) verwendet wird.

Ergänzende Tabelle 1: Beschreibung der 162 Proben, die mit dem RIDT-Test zur Bestimmung ihrer intrinsischen Parameter geprüft wurden, wie in Tabelle 7 dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).

Discussion

Die RIDT ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur postmortalen Tollwutdiagnose und eine vielversprechende Feldalternative zu Labortests. Die Anwendung eines solchen Tests, insbesondere für dezentrale Gebiete in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen, würde das Verständnis der Verbreitung und Übertragung von Tollwutviren auf lokaler und potenziell nationaler Ebene verbessern. In Kombination mit der schnellen Methode zur Entnahme von Hirnproben (ohne vollständige Nekropsie) ist ein großer Vorteil, dass der Test vollständig in der Feldeinstellung durchgeführt werden kann, weg von Laboreinrichtungen. Gehirnproben, die über das Foramen magnum gesammelt werden, können für Tests verwendet werden, daher ist es nicht erforderlich, den Tierschädel vollständig zu öffnen. Der Test ist einfach durchzuführen und zu interpretieren und eignet sich besonders für Feldüberwachungsaktivitäten¹⁴. Weitere Vorteile des RIDT gegenüber der DFAT oder DRIT sind keine positiven und negativen Kontrollen und Kit-Lagerung bei Raumtemperatur. Darüber hinaus erfordert das modifizierte Protokoll, bei dem der Verdünnungsschritt (1:10) in PBS weggelassen wird, keine zusätzlichen Reagenzien, um den Test durchzuführen, und vereinfacht das Verfahren unter Feldbedingungen weiter.

Ein wichtiger Punkt ist die Qualität der Gehirnproben. Proben sollten so bald wie möglich nach dem Tod des verdächtigen Tieres entnommen und getestet oder vor der Prüfung bei kühler Temperatur aufbewahrt werden, um eine Verschlechterung zu vermeiden. Zerlegte Proben sollten nicht getestet werden, da sie das Ergebnis beeinflussen können (Risiko falsch negativer Ergebnisse). Obwohl noch keine Daten über den Verlust der Empfindlichkeit von RIDT im Laufe der Zeit für Gehirnproben verfügbar sind, gehen wir davon aus, dass es im Vergleich zum DFAT-Test ähnlich ist³². Die Zeit zwischen dem Tod des Tieres und der Durchführung des Tests kann jedoch verkürzt werden, da der Test schnell und direkt vor Ort durchgeführt werden kann. Somit besteht im Allgemeinen ein geringeres Risiko für zersetzte Proben.

Ein weiterer wichtiger Schritt innerhalb des Protokolls ist die Migration der Beispielaussetzung. Die Migration sollte direkt nach der Hinterlegung der Probe (1-5 min) beginnen. Eine hohe Viskosität der Aussetzung könnte sich daher negativ auf die Migration auswirken. Sanft kratzen den Boden des Geräts Depot Stelle mit dem Trinseln und Hinzufügen von 1-2 weitere Tropfen löst oft dieses Problem, und die Migration beginnt unmittelbar danach.

Die meisten RIDT-Tests, die in afrikanischen Laboratorien (Tschad, Elfenbeinküste und Mali) durchgeführt wurden, wurden bei Umgebungstemperatur durchgeführt, die 30 °C überschreiten kann, während der vom Hersteller empfohlene Temperaturbereich für die Lagerung und Verwendung 15 °C bis 30 °C beträgt. Obwohl wir keine Auswirkungen der hohen Temperatur auf die RIDT-Testleistung identifiziert haben, ist es notwendig, sie sorgfältiger zu bewerten. In ähnlicher Weise müssen die Auswirkungen hoher Temperaturen während der Lagerung und des Transports des Geräts nach dem Einsatz für virale RNA-Erkennung und Genotypisierung einer zusätzlichen Bewertung bedürfen. Die Empfindlichkeit der viralen RNA-Detektion durch RT-qPCR aus dem RIDT-Streifen kann durch die Qualität der ursprünglich im Test verwendeten Hirnprobe, aber auch durch den Zustand der Speicherung der RIDT-Tests nach Gebrauch beeinflusst werden. Beispielsweise war die Empfindlichkeit des RNA-Nachweises höher, wenn verwendete RIDT-Tests unter kontrollierten Laborbedingungen gespeichert wurden (94,7%) im Vergleich zu Feldbedingungen (z. B. Tschad) (81,2%)¹⁴. Diese Bedingungen können sich auch auf die Integrität (insbesondere die Länge) der auf dem Streifen fixierten RNA auswirken, was möglicherweise die moderate Empfindlichkeit für Genotypisierung auf der Grundlage längerer PCR-Amplicons (z. B. >500 Nukleotide)¹⁴erklärt. Die Empfindlichkeit von RT-qPCR auf dem Teststreifen war niedriger als die mit FTA Whatman Karten (80,6%)¹⁴erhalten. Ähnlich wie bei anderen molekularen Techniken kann die Viruslast auch den Erfolg der Genotypisierung auf Basis von RDIT-Streifen beeinflussen, mit potenziellen negativen Ergebnissen für Proben mit geringer Viruslast¹⁴.

Der Test wird derzeit von der WHO und dem OIE nicht für die routinemäßige Diagnose und Krankheitsüberwachung empfohlen, und ein Ergebnis kann nicht allein als Richtschnur für die PEP-Entscheidungsfindung verwendet werden. Eine weitere Testvalidierung ist noch erforderlich. Eine genaue schnelle Tollwutdiagnose ist jedoch ein entscheidendes Element gut funktionierender kontinuierlicher Tollwutüberwachungssysteme und ist entscheidend für die Stärkung des politischen Engagements, das für eine erfolgreiche nachhaltige Tollwutbekämpfung von großer Bedeutung ist³³. RIDT-Tests bieten in diesem Zusammenhang neue Möglichkeiten der Tollwutdiagnostik und sind ein nützliches Instrument, um die Überwachung von Tollwut in der Praxis in enzootischen Gebieten mit niedrigem oder mittlerem Einkommen auszuweiten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Rabies Nucleocapsid Conjugate (lyophilizied, adsorbed)	Bio-Rad, France	3572112	Fluorescein-5-isothiocyanate (FITC) conjugated polyclonal antibody against the nucleocapsid of rabies virus. Use for the DFAT reference tecnnique.
Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System	Applied Biosystems, France	4351104	Amplification of the viral RNA by RT-qPCR after extraction from the RIDT device.
Disposable plastic pipette, drinking straw, clamp, dropper	-	-	Equipment used for the collection of the brain stem (medulla oblongata) via the foramen magnus (occipital route).
Evans Blue Solution 1%	Bio-Rad, France	3574911	Counter-coloration used for the DFAT to facilite the reading under UV microscope.
Primer eGFPF1	Eurofins Genomics, Germany	-	Forward primer for the amplification of the internal control eGFP by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-GACCACTACCAGCAGAACAC-3'.
Primer eGFPR2	Eurofins Genomics, Germany	-	Reverse primer for the amplification of the internal control eGFP by RT-qPCR after extraction from the RIDT device, sequence: 5'-GAACTCCAGCAGGACCATG-3'.
Primer Taq17 revlong	Eurofins Genomics, Germany	-	Reverse primer for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-ATGAGAAGTGG AAYAAYCATCA-3'.
Primer Taq3 long	Eurofins Genomics, Germany	-	Forward primer for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-GATCTGTCTGAA TAATAGAYCCARG-3'.
Probe eGFP FAM/TAMRA	Eurofins Genomics, Germany	-	Forward primer for the amplification of the internal control by RT-qPCR after extraction from the RIDT device, sequence: 5'-AGCACCCAGT CCGCCCTGAGCA-3'.
Probe RABV4 FAM/TAMRA	Eurofins Genomics, Germany	-	Probe for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-AACACYTGATCBA GKACAGARAAYACATC-3'.
Probe RABV5 FAM/TAMRA	Eurofins Genomics, Germany	-	Probe for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-AGRGTGTTTTCYAG RACWCAYGAGTTTTTYCA-3'.
Rapid Rabies Ag Test Kit	BioNote Inc., Republic of Korea	RG18-01DD	Rapid immunochromatographic diagnostic test (RIDT, also named lateral flow device or LFD) for the post-mortem diagnosis of rabies.
Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor	Promega, USA	N2515	Enzyme used with the kit for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after extraction from the RIDT device.
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit	Invitrogen, France	11732-020	Kit for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after extraction from the RIDT device.
TRIzol Reagent	Invitrogen, France	15596026	Phenol/chloroforme based total RNA extraction using the cellulose membrane of the RIDT.