Summary
Ici, nous présentons une méthode fiable, mini-invasive et rentable pour enregistrer et interpréter les électrocardiogrammes chez les poissons zèbres adultes anesthésiés vivants.
Abstract
Les formes d'onde d'électrocardiogramme du poisson zèbre adulte et ceux des humains sont remarquablement semblables. Ces similitudes d'électrocardiogramme augmentent la valeur du poisson zèbre non seulement comme modèle de recherche pour l'électrophysiologie cardiaque humaine et les myopathies mais également comme modèle de substitution dans le criblage pharmaceutique à haut débit pour les cardiotoxicités potentielles à humains, tels que la prolongation de QT. En tant que tel, l'électrocardiographie in vivo pour le poisson zèbre adulte est un outil de phénotypage électrique qui est nécessaire, sinon indispensable, pour les caractérisations électrophysiologiques intertransversales ou longitudinales in vivo. Cependant, trop souvent, l'absence d'une méthode d'enregistrement fiable, pratique et rentable demeure un défi majeur empêchant cet outil de diagnostic in vivo de devenir plus facilement accessible. Ici, nous décrivons une approche pratique et directe de l'électrocardiographie in vivo pour les poissons zèbres adultes à l'aide d'un système à faible entretien, rentable et complet qui donne des enregistrements cohérents et fiables. Nous illustrons notre protocole utilisant le poisson zèbre mâle adulte en bonne santé de 12-18 mois. Nous introduisons également une stratégie d'interprétation rapide en temps réel pour la validation de la qualité afin d'assurer l'exactitude et la robustesse des données dès le début du processus d'enregistrement des électrocardiogrammes.
Introduction
Le cœur de poisson zèbre (Danio rerio) est situé antéroventrally à la cavité thoracique entre l'operculum et les ceintures pectorales. Le cœur est enfermé assez lâchement dans un sac péricardique de couleur argentée. Anatomiquement, le cœur de poisson zèbre est différent des cœurs humains et autres mammifères à quatre chambres en raison de son échelle diminutive (100 fois plus petite que le cœur humain) et de sa structure à deux chambres composée d'un seul atrium et d'un ventricule. Néanmoins, les formes d'onde de l'électrocardiogramme (ECG) et la durée de l'intervalle QT des deux espèces sont remarquablement similaires (figure 1). En conséquence, le poisson zèbre a émergé comme un modèle populaire pour étudier les arythmies héréditaires humaines1,2,3 et pour le dépistage des médicaments à haut débit des cardiotoxicités humaines potentielles4,5 , comme la prolongation qT.
Dans l'évaluation systématique des maladies cardiaques humaines, l'ECG de surface du corps est devenu l'outil de diagnostic non invasif de première ligne le plus largement utilisé depuis son invention par Einthoven en 1903. En revanche, depuis la première adaptation de la méthode d'enregistrement ECG de surface du corps pour le poisson zèbre adulte en 20066 et plusieurs modifications par la suite7, cette technique est restée largement inaccessible à de nombreux chercheurs dans le domaine malgré la popularité de ce modèle animal. Pour d'autres chercheurs qui ont effectué l'interrogatoire in vivo d'ECG pour le poisson zèbre adulte, de grandes variations parmi des opérateurs ont mené à l'incohérence dans des résultats d'ECG de différentes études. Les raisons les plus courantes comprennent les dispositifs et logiciels spécialisés encombrants et coûteux, le faible rapport signal-bruit et la confusion concernant le placement des électrodes, toutes aggravées par une compréhension incomplète des caractéristiques adultes de l'ECG du poisson zèbre et mécanismes tissulaires sous-jacents. Étant donné que l'ECG in vivo est le seul outil de diagnostic pour phénotypeélectriqueélectriquer le poisson zèbre vivant, il est clair qu'il faut une méthode normalisée pour améliorer la sensibilité et la spécificité, la reproductibilité et l'accessibilité.
Ici, nous présentons une approche pratique, fiable et validée pour enregistrer et interpréter les zèbres dans les électrocardiogrammes in vivo (Figure 2). À l'aide d'un seul plomb bipolaire dans le plan frontal, nous avons étudié les changements dans les formes d'ondes ECG et les durées d'intervalle du poisson zèbre adulte ab adulte vivant anesthésié en bonne santé.
Protocol
Toutes les expériences de cette étude ont été menées conformément au National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals des États-Unis. Tous les protocoles sur les animaux de cette étude ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'UCLA.
1. Préparation de la mise en place expérimentale
- Maintenir le poisson zèbre dans des systèmes d'aquarium fluides sur une lumière de 14 h, une photopériode sombre de 10 h à 28 oC et 0,5 oC. Nourrissez-vous quotidiennement avec des flocons et des crevettes saumurées vivantes (Artemia nauplii) deux fois par jour. Les poissons zèbres de cette étude ont été maintenus et nourris par le noyau de poissons zèbres de l'UCLA.
- Le jour de l'expérience, transportez le poisson zèbre de l'aquarium au laboratoire.
- Configurez le système d'enregistrement In vivo ECG en connectant les pièces essentielles de l'équipement et en insérant les trois électrodes en acier inoxydable codées en couleur dans les trois portails d'accès assortis à la couleur de l'amplificateur (Figure 3). Démarrez le système au début d'une session d'enregistrement et/ou d'analyse ECG.
- Procurez-vous les outils nécessaires, tels qu'une minuterie/chronomètre, une éponge humide avec une égorgement pour tenir le poisson, les forceps, les ciseaux, les pipettes Pasteur et les plats de culture (100 mm x 20 mm).
2. Induction d'anesthésie
- Préparer l'anesthésie d'immersion pour le contrôle de la douleur et l'immobilisation des poissons afin d'éviter les artefacts de mouvement lors de l'acquisition de données ECG. La plupart des laboratoires utilisent la tricaine d'immersion (éthyle 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222).
- Pour faire la solution de bouillon tricaine 0,4%, combiner les éléments suivants dans une bouteille en verre foncé à capuchon : 400 mg de poudre de tricaine, 98 ml d'eau double distillée et 2 ml de 1 M Tris (pH 9). Ajuster au pH 7.0 en utilisant 1 N NaOH ou 1 N HCl au besoin8.
- Pour faire la solution finale d'immersion de tricaine, déterminez la concentration minimale qui est appropriée pour l'âge de9, taille, état métabolique, contrainte, modèle de maladie, objectifs scientifiques, et durée procédurale.
- Effectuer une étude de concentration-réponse tricaine, en titrant vers le haut ou vers le bas de la concentration recommandée de 168 mg/L (ou 0,0168%)9 si nécessaire, pour atteindre le niveau 4 de l'anesthésie dans les 3 minutes avec le moins de toxicités cardiorespiratoires possibles. Par exemple, dans cette étude, l'immersion de poissons-zèbres AB de type sauvage de 12 à 18 mois dans une solution tricaine de 0,02 à 0,04 % induira le niveau 4 de l'anesthésie dans les 3 minutes.
REMARQUE : Au niveau 4 de l'anesthésie, l'équilibre et le tonus musculaire sont complètement perdus et le taux de mouvement opericulaire est réduitde 8. - Si nécessaire, consultez le vétérinaire du Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (CCIO) pour obtenir des conseils supplémentaires sur la pertinence de la sélection des anesthésiques et de la voie d'administration.
- Immerger un poisson zèbre adulte dans un plat contenant une solution de tricaine de la concentration la plus basse prédéterminée et approuvée par l'IACUC (p. ex., 0,02-0,04 % dans cette étude) pour induire le niveau 4 de l'anesthésie dans les 3 minutes (figure2).
- Pour la survie du protocole ECG, gardez la session d'enregistrement ECG aussi brève que possible (moins de 10 min). Pour de brèves séances d'enregistrement ECG d'une durée inférieure à 15 minutes, l'entretien de l'anesthésie n'est pas nécessaire.
- Pour de longues sessions d'enregistrement ECG d'une durée d'heures, utilisez un paralytique intramusculaire à action prolongée et un système de perfusion orale pour fournir une hydratation et une oxygénation suffisantes6.
3. Placement de plomb ECG
- Une fois que le poisson zèbre maintient le niveau 4 de l'anesthésie pendant 3 s, utilisez une paire de forceps émoussés pour transférer le poisson immédiatement sur la fente humide de l'éponge avec sa surface ventrale la plus haute pour le placement des électrodes de plomb ECG (figure 4).
- Insérez délicatement les trois électrodes de plomb ECG dans la musculature du poisson à environ 1 mm de profondeur pour établir un plomb bipolaire dans le plan frontal qui est parallèle à l'orientation crânienne caudale-droite gauche de l'axe principal cardiaque.
- Placez l'électrode positive (rouge) dans la ligne médiane ventrale au niveau du bulbus arteriosus, c'est-à-d., à 1-2 mm au-dessus d'une ligne imaginaire reliant les deux bords inférieurs des oculums (figure 4A).
- Placez l'électrode négative (noir) caudally et 0.5-1.0 mm gauche latéralement à l'électrode positive, à une distance supérieure à la longueur apicobasal maximale du ventricule adulte de poisson zèbre (figure 4A).
- Placez l'électrode de référence (verte) caudally, près de la région anale.
REMARQUE : Étant donné que l'axe principal cardiaque varie quelque peu d'un poisson à l'autre, afin de maximiser les amplitudes des ondes R et T, ajustez les positions de plomb en ne faisant que de petits changements systématiques par essais et erreurs. Par exemple, modifiez une électrode (positive ou négative), au lieu des deux électrodes, à la fois et effectuez des changements graduels dans une direction spécifiée avant de changer dans une autre direction au lieu d'effectuer des changements erratiques dans des directions aléatoires.
4. Enregistrement ECG
- Ouvrez le programme d'acquisition de données ECG. Sélectionnez un paramètre souhaité à partir des menus déroulants pour la plage, le passage bas et le passage élevé. Par exemple, le réglage suivant dans le système d'enregistrement In vivo ECG utilisé dans cette expérience donne un rapport signal-bruit cohérent et satisfaisant pour un poisson zèbre adulte normal : plage « 2 mV », passage bas « 120 Hz » et passage élevé « 0,03 s ».
- Appuyez Sur Démarrer pour commencer l'enregistrement continu sans espace ECG à un taux d'échantillonnage de 1 kHz.
- Afin d'optimiser le positionnement du plomb pour un rapport signal-bruit maximal, appuyez sur Stop pour arrêter l'enregistrement ECG et examinez la trace ECG peu de temps après la toute première tentative d'enregistrement pour chaque cœur. Pour diagnostiquer qu'un eCG adulte de poisson zèbre est normal, confirmez que tous les quatre critères de validation suivants sont remplis (figure 1) :
- Critère 1 : Veiller à ce que toutes les formes d'ondes ECG (P, QRS et T) soient distinctes et facilement visibles.
- Critère 2 : Assurez-vous que la vague P est positive.
- Critère 3 : Assurez-vous que le complexe QRS net est positif (c.-à-d. l'amplitude de l'onde R est plus grande que la somme des amplitudes d'onde Q et S).
- Critère 4 : Assurez-vous que la vague T est positive.
- Si un ECG normal est prévu, repositionner les électrodes (essayez d'abord l'électrode négative) si nécessaire, jusqu'à ce que les quatre critères de validation soient remplis.
- Si une onde T normale est prévue, mais que l'onde T est trop petite, repositionner les électrodes pour maximiser l'amplitude de l'onde T.
- Reprenez l'enregistrement ECG après avoir optimisation le positionnement au plomb. Enregistrer les balayages ECG pour l'analyse ultérieure.
5. Récupération de l'anesthésie
- À la fin de la séance d'enregistrement de l'ECG, retirez soigneusement les électrodes sans blesser le poisson. Transférer le poisson dans de l'eau de poisson fraîche et oxygénée exempte de tricaine.
- Pour faciliter le rétablissement de l'anesthésie, gicler l'eau sur les branchies vigoureusement avec une pipette Pasteur jusqu'à ce que le poisson reprenne le mouvement régulier des branchies ou la natation.
- Surveiller le poisson pour un rétablissement complet de l'anesthésie (généralement 1-2 min), comme l'indique la capacité du poisson à nager debout pendant au moins 5 s.
6. Interprétation de l'ECG
- Définir les paramètres d'analyse.
- Connaître l'interface logicielle (Tableau des matériaux) en lisant le manuel d'exploitation du logiciel d'analyse de données ECG.
REMARQUE: Bien que les instructions ci-dessous sont spécifiques au logiciel commercial utilisé dans notre laboratoire, les tâches de base à accomplir sont essentiellement les mêmes dans n'importe quel logiciel pour l'analyse ECG. - Ouvrez le programme d'analyse des données ECG. Dans le menu Fichier, sélectionnez Ouvrez pour ouvrir le fichier ECG d'intérêt et affichez la trace ECG complète. Utilisez la souris pour faire glisser une section d'intérêt dans la trace ECG à analyser.
- Dans le menu d'analyse ECG, sélectionnez Paramètres ECG pour ouvrir une boîte de dialogue afin de prédéfinir divers paramètres pour l'analyse automatique logicielle (Figure 5A).
- Connaître l'interface logicielle (Tableau des matériaux) en lisant le manuel d'exploitation du logiciel d'analyse de données ECG.
- Analyser le rythme cardiaque et le rythme.
REMARQUE : La fréquence cardiaque dépend de plusieurs facteurs, y compris l'âge et la souche du poisson zèbre, les agents d'anesthésie (p. ex. tricaine, isoflurane, etc.) et la concentration, l'utilisation de l'anesthésie (agent unique5,7 contre les agents combinés5) et temps d'exposition5. Par exemple, dans cette étude, la fréquence cardiaque du poisson-zèbre AB de type sauvage de 12 à 18 mois après 3-5 min d'immersion dans la solution tricaine de 0,02-0,04 % était de 116 à 17 battements par minute(n - 9), ce qui correspond aux rapports de littérature sur la fréquence cardiaque de ce groupe d'âge et anesthésique5,7.- Déterminer si le rythme cardiaque est sinus ou non, régulier ou irrégulier.
REMARQUE : La présence (ou l'absence) du rythme des sinus est basée sur la présence (ou l'absence) d'une onde P verticale précédant chaque QRS par un intervalle normal de PR (par exemple, 60-65 ms pour Liu et al.'s 10-12 mois-vieux7 et 12-18 mois-type sauvage AB zèbre dans cette étude). La régularité auriculaire et ventriculaire du rythme (ou irrégularité) est basée sur la régularité (ou l'irrégularité) des intervalles successifs de PP ou de RR, respectivement. - Pour déterminer la fréquence cardiaque, assurez-vous que le logiciel identifie correctement toutes les ondes P et R. Sur la base de ces identifications automatiques (ou corrections manuelles) des ondes P et R, le logiciel mesure automatiquement tous les intervalles PP et RR dans la sélection ECG, calcule les moyennes d'intervalle pour générer le taux auriculaire et ventriculaire.
REMARQUE : Le taux auriculaire est l'intervalle moyen de PP tandis que le taux ventriculaire est l'intervalle moyen de RR. Pour déterminer la fréquence cardiaque, une identification correcte des ondes P et R est essentielle. - Corriger les erreurs d'auto-identification en déplaçant les curseurs égarés vers les ondes P et R appropriées (figure 5B).
REMARQUE : Si le cœur est dans le rythme de sinus, le taux auriculaire et le taux ventriculaire sont les mêmes en raison de la correspondance un-à-un entre les ondes de P de sinus et les complexes de QRS. Cependant, dans le cas de la dissociation atrioventriculaire (p. ex., dans la tachycardie ventriculaire ou le bloc atrioventriculaire au troisième degré), cette correspondance individuelle entre les ondes P et les complexes QRS est perdue; par conséquent, il y a deux fréquences cardiaques parce que le taux auriculaire est différent du taux ventriculaire. - Déterminez la fréquence cardiaque en fonction d'au moins cinq cycles cardiaques complets consécutifs si le rythme cardiaque est régulier, ou une bande d'au moins six secondes si le rythme cardiaque est irrégulier.
- Déterminer si le rythme cardiaque est sinus ou non, régulier ou irrégulier.
- Calculer les intervalles et les durées des vagues.
- Aller à l'analyse ECG 'gt; Vue moyenne de concatenate n (par exemple, 5) cycles cardiaques consécutifs en un seul signal moyen (Figure 5C).
REMARQUE : Si les formes d'onde d'ECG d'un cycle cardiaque individuel divergent sensiblement du signal moyen, étudiez ce cycle cardiaque séparément sans concatenation. - Assurez-vous que le logiciel identifie correctement le début et la fin de l'onde P, du complexe QRS et de l'onde T affichée s'affiche dans la fenêtre Averaging View (Figure 5C). Sur la base de ces identifications automatiques (ou corrections manuelles) de ces ondes et intervalles, le logiciel mesure automatiquement les durées telles que définies conventionnellement.
REMARQUE : L'intervalle PR s'étend du début de l'onde P au début du complexe QRS (ou du complexe RS si l'onde Q n'est pas visible). La durée qRS s'étend du début de l'onde Q (ou de l'onde R si l'onde Q n'est pas visible) à la fin de l'onde S (c.-à-d. le point J ; Figure 1). L'intervalle QT s'étend du début de l'onde Q (ou de l'onde R si l'onde Q n'est pas visible) à la fin de l'onde T. Par conséquent, pour calculer les intervalles et les durées, l'identification correcte du début et de la fin de l'onde P, du complexe QRS et de l'onde R est essentielle. - Corrigez toute erreur d'auto-identification en déplaçant les curseurs égarés vers les positions appropriées.
- Sélectionnez le pic négatif de l'onde S comme la fin du complexe QRS7 parce que le point J de poisson zèbre qui signale la fin de l'onde S peut être particulièrement difficile à identifier avec précision. Cela entraînera une légère sous-estimation de la durée réelle QRS.
REMARQUE : Le logiciel d'analyse ECG corrige automatiquement l'intervalle QT au taux ventriculaire (ou intervalle RR) pour générer l'intervalle QT QTc corrigé en utilisant la méthode présélectionnée par l'utilisateur à l'étape 6.1.3, par exemple, Bazett (Figure 5A). La formule de Bazett (1920) QTc - QT / RR est la plus populaire et la première de plusieurs méthodes proposées pour corriger l'intervalle QT humain pour la fréquence cardiaque. Parce que l'exactitude de la formule de Bazett a été remise en question, se référer à d'autres méthodes proposées pour les humains10,11 et le poisson zèbre6 (Figure 5D).
- Aller à l'analyse ECG 'gt; Vue moyenne de concatenate n (par exemple, 5) cycles cardiaques consécutifs en un seul signal moyen (Figure 5C).
- Interpréter les anomalies de l'ECG en reconnaissant des exceptions pour les quatre critères de validation à l'étape 4.3.
- Reconnaître les exceptions pour le critère 1. En l'absence de toutes les ondes De (ce qui indique l'absence de rythme des sinus), s'appuyer sur les intervalles RR et la durée QRS pour diagnostiquer le rythme cardiaque. Par exemple, si les intervalles de RR sont irréguliers, diagnostiquez la fibrillation auriculaire; si les intervalles RR sont réguliers et que le QRS est normalement étroit, diagnostiquez le rythme d'évasion de jonction; d'autre part, si les intervalles de RR sont réguliers et le QRS est anormalement prolongé, diagnostiquez le rythme ventriculaire d'évasion.
- Reconnaître les exceptions pour le critère 2. Lorsque l'onde P est négative (ou inversée), diagnostiquez l'activation auriculaire rétrograde d'un stimulateur cardiaque ectopique (comme un site auriculaire en aval du nœud sinus, du nœud atrioventriculaire ou du ventricule).
- Reconnaître les exceptions pour le critère 3. Lorsque les ondes Q hautes et étroites présentent des ondes P et T négatives, diagnostiquez l'inversion du plomb en raison d'un changement erroné des positions d'électrodes positives et négatives parce que ces ondes Q hautes et étroites étaient de véritables ondes R inversées par erreur (figure6D ). En revanche, quand les ondes larges de Q présentent avec les ondes positives de P suivant l'infarctus significatif de coeur, diagnostiquent l'infarctus du myocarde parce que ces vagues larges de Q sont les ondes pathologiques vraies de Q.
- Reconnaître les exceptions pour le critère 4. Lorsque l'onde T est inversée, inspectez l'activation ventriculaire pour déterminer si l'anomalie de la répolarisation ventriculaire est primaire ou secondaire. S'appuyer sur le scénario clinique pour réduire le diagnostic correct à partir d'une liste différentielle d'anomalie de repolarisation ventriculaire primaire (des effets de drogue ou de l'ischémie myocardique ; Figure 6C) contre l'anomalie de repolarisation ventriculaire secondaire (due à l'activation ventriculaire aberrante de la pré-excitation, de l'ectotortoy ventriculaire, ou du rythme ventriculaire).
- Exportation ECG résultats.
- Sélectionnez Table View pour examiner toutes les mesures ECG. Sélectionnez les mesures d'intérêt à copier et coller dans le document désiré (p. ex., feuille de calcul Excel).
- Pour exporter une trace ECG, mettez en évidence une section d'intérêt dans le balayage ECG à l'aide de l'icône de grossissement. Copier et coller dans le document désiré (p. ex., Word ou PowerPoint).
Representative Results
La figure 1 illustre la pertinence clinique de la méthode présentée ici. L'électrocardiographie de surface in vivo pour le poisson zèbre adulte est un outil de phénotypage électrique essentiel en raison des similitudes remarquables entre le poisson zèbre et l'ECG humain malgré leurs grandes différences anatomiques. Le cœur de poisson zèbre n'a qu'un atrium et un ventricule contrairement au cœur humain avec deux oreillettes et deux ventricules (rangée supérieure; droite et gauche, respectivement). Cependant, en dépit de sa simplicité anatomique apparente, le cœur de poisson zèbre partage plusieurs caractéristiques D'ECG avec le cœur humain (rangée inférieure; droite et gauche, respectivement) Par conséquent, le cœur de poisson zèbre a émergé comme un modèle de substitution pour le cardiaque humain électrophysiologie5,12,13. La figure 1 illustre une petite mais distincte vague Q d'un poisson zèbre vivant et en bonne santé de 14 mois. Cependant, chez le poisson zèbre ECG, le positionnement du plomb n'est pas généralement optimisé pour démontrer la vague Q. Par conséquent, l'onde Q est généralement invisible, et un complexe RS est plus souvent vu que le complexe QRS complet dans le poisson zèbre ECG.
La figure 2 résume les quatre mesures essentielles pour effectuer une électrocardiographie in vivo mini-invasive chez le poisson zèbre adulte. Après l'induction d'anesthésie (étape 1) et le placement d'électrodes (étape 2), nous avons enregistré des signaux de base d'ECG (étape 3) du poisson zèbre ab sauvage en bonne santé de 12 à 18 mois (n - 9). Notre technique d'insertion d'électrode n'était que très peu invasive parce que nous n'avions pas besoin d'éplucher des écailles de poisson ou d'effectuer une péricardiotomie. Après l'acquisition de données, nous avons examiné et vérifié manuellement chaque enregistrement ECG (étape 4) afin d'éviter une mauvaise interprétation potentielle par l'analyse automatique du logiciel.
La figure 3 montre les trois composants indispensables d'un système typique d'acquisition et de traitement de données ECG : un matériel d'acquisition de données haute performance, un amplificateur différentiel à gain élevé et un ordinateur téléchargé avec un logiciel pour les données ECG. l'acquisition et l'analyse. Dans notre laboratoire, nous avons adapté un système d'enregistrement eCG commercial in vivo existant conçu à l'origine pour les petits modèles de mammifères (comme les souris, les rats et les lapins) pour accueillir le modèle adulte de poisson zèbre.
La figure 4 démontre qu'un bon placement du plomb nécessite l'alignement du plomb sur l'axe principal cardiaque présumé. Dans l'enregistrement in vivo de l'ECG par le poisson zèbre, parce qu'un seul plomb est utilisé, il est essentiel de bien positionner le plomb pour maximiser simultanément les amplitudes des ondes R et T. Pour maximiser les amplitudes d'onde de R et de T, nous avons aligné les électrodes positives et négatives de plomb avec l'axe principal cardiaque, vraisemblablement dans le caudal gauche à l'orientation crânienne droite. Après la thoracotomie et la péricardiotomie pour ouvrir le sac péricardique et exposer le cœur, l'axe principal cardiaque devient apparent (figure4B ligne pointillée blanche). En fait, la péricardiotomie pour exposer le cœur est une stratégie couramment utilisée pour augmenter le rapport signal-bruit7 au prix de la conversion de l'enregistrement ECG d'un minimum invasif en une procédure très invasive.
La figure 5 illustre les étapes critiques de l'analyse de l'ECG. Tout d'abord, nous avons prédéfini les différents paramètres pour l'analyse automatique du logiciel à l'aide de la boîte de dialogue ECG Paramètres (Figure 5A). Étant donné que nous réexpons un équipement d'enregistrement ECG existant conçu pour les modèles de mammifères pour accueillir les poissons zèbres adultes, le cadre de détection et d'analyse pour le poisson zèbre n'est pas disponible. Nous avons choisi le Preset humain à la place, étant donné la similitude remarquable du poisson zèbre ECG à l'eCG humain (Figure 5A). Deuxièmement, nous avons vérifié manuellement l'identification automatique du logiciel ECG (en noir) des pics d'ondes R et corrigeons (en rouge) toutes les erreurs d'auto-identification des ondes R avant de commander au logiciel de recalculer le taux ventriculaire moyen. Par exemple, dans la figure 5B, une grande onde P par rapport à l'onde R a trompé le logiciel en identifiant mal les ondes R, ce qui a conduit à l'erreur de calcul automatique subséquente de l'intervalle RR ou du taux ventriculaire. Par conséquent, la vérification humaine et les corrections appropriées au besoin sont essentielles dans l'analyse de l'ECG. Troisièmement, nous avons rapidement évalué la régularité du rythme et calculé la durée moyenne des ondes et des intervalles à l'aide de la vue moyenne (figure5C)pour concatenate plusieurs cycles cardiaques consécutifs (vert) en un seul signal moyen (noir). Ici, dans la figure 5C, l'écart négligeable entre chacun des neuf cycles cardiaques et le signal moyen plaide pour l'excellente régularité rythmique de ce cœur de poisson zèbre. Enfin, nous avons permis au logiciel de corriger automatiquement l'intervalle QT pour la fréquence cardiaque à l'aide de Bazett, l'une des sept méthodes différentes disponibles (Figure 5D).
Figure 6A -C démontre comment la profondeur du placement des électrodes affecte les amplitudes des signaux ECG. Lorsque nous avons incorrectement inséré les électrodes trop superficiellement dans le derme (Figure 6A), le plomb était "indirect" comme (plus de deux diamètres cardiaques du cœur, semblable à la norme indirecte eCG membre humain conduit I, II, et III) et la tension signaux étaient faibles. Lorsque nous avons correctement inséré les électrodes 1 mm plus profondément dans la musculature pectoralis (Figure 6B), le plomb est devenu «semidirect» (à proximité, mais pas en contact direct avec le cœur) et les signaux de tension ont augmenté. Les formes d'onde ECG sont devenues facilement visibles. Cependant, lorsque nous avons incorrectement inséré les électrodes encore plus profondément dans le ventricule (Figure 6C), le plomb est devenu «direct» (en contact direct avec le cœur) et les signaux de tension ont augmenté davantage. L'amplitude de la vague R à la figure 6C a été multipliée par huit par rapport à la figure 6A et par quatre par rapport à la figure 6B. Cependant, la trace d'ECG dans la figure 6C a indiqué de nouveaux signes de dommages au myocarde ventriculaire, tels que la nouvelle dépression de ST et l'inversion nouvelle d'onde de T.
La figure 6D montre comment les inversions inhabituelles de toutes les formes d'ondes ECG (P, Q, R, S et T) devraient signaler une erreur d'inversion de plomb, dans laquelle les électrodes positives et négatives ont changé de place. Notez que par définition Q et S sont toujours négatifs alors que R est toujours positif.
Figure 6E -F montre comment une profondeur d'anesthésie inappropriée peut nuire à la qualité de l'enregistrement in vivo ECG. Dans la figure 6E, une anesthésie inadéquate (0,017% tricaine) a conduit à l'échec d'immobiliser complètement le poisson zèbre. Les artefacts de mouvement qui en ont résulté ont abaissé le rapport signal-bruit en contaminant le signal (astérisque) et en augmentant le bruit (flèches). En revanche, dans la figure 6F, l'anesthésie surdosée (0,08% de tricaine) a induit la bradyarrhythmie sinus sévère ainsi que des changements du segment ST et de l'onde T.
Figure 1 : Anatomie contrastante et ECG des cœurs humains et de poissons zèbres. Contrairement au cœur humain avec deux oreillettes et deux ventricules, le cœur de poisson zèbre n'a qu'un atrium et un ventricule (rangée supérieure). Abréviations: RA, atrium droit; LA, atrium gauche; RV, ventricule droit; LV: ventricule gauche. Le cœur de poisson zèbre partage plusieurs caractéristiques communes ECG avec le cœur humain (rangée inférieure). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Protocole d'enregistrement ECG in vivo mini-invivo. Un diagramme schématique de flux illustre quatre étapes critiques d'action en menant un interrogatoire in vivo d'ECG : induire l'anesthésie, placer des électrodes de plomb d'ECG, enregistrer ECG, et analyser les enregistrements d'ECG. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Système d'acquisition et de traitement des données ECG. Les trois composants clés d'un système intégré d'enregistrement ECG in vivo comprennent un matériel pour acquérir des données, un amplificateur et un logiciel informatique pour l'acquisition et l'analyse de données. L'amplificateur est livré avec trois microélectrodes en acier inoxydable prêt à l'emploi de 29 calibres. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Placement de plomb ECG. Trois électrodes en acier inoxydable codées de couleur de 29 calibres sont insérées solidement dans la musculature du poisson jusqu'à environ 1 mm de profondeur. Le placement de l'électrode négative (noir) et de l'électrode positive (rouge) établit un plomb bipolaire dans le plan frontal, le long d'une orientation crânienne gauche à droite. Abréviation: ref, électrode de référence S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : C ritical dans l'analyse ECG. (A) Prédéfinir les différents paramètres pour l'analyse automatique du logiciel. (B) Corriger manuellement (rouge) deux erreurs d'identification automatiques par le logiciel (noir) des ondes P et R pour corriger l'erreur de calcul du logiciel du taux atrial et ventriculaire. (C) Concatenate neuf cycles cardiaques consécutifs (vert) en un seul signal moyen (noir) pour évaluer rapidement les régularités/irrégularités rythmiques et calculer la durée moyenne des ondes et des intervalles. (D) Corriger l'intervalle QT pour la fréquence cardiaque en utilisant l'une des différentes méthodes, telles que Bazett. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Effets du placement du plomb et de la profondeur de l'anesthésie sur les signaux ECG. Deux étapes les plus critiques qui déterminent le succès de l'enregistrement in vivo ECG sont le placement de plomb (A-D) et la profondeur d'anesthésie (E-F). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
Lors de l'enregistrement in vivo ECG pour le poisson zèbre adulte au moyen d'une seule piste comme nous l'avons démontré dans cette étude, il ya un certain nombre de mises en garde concernant la qualité et la validité des résultats de l'enregistrement ECG. Tout d'abord, en choisissant les anesthésiques appropriés et en déterminant la concentration, la profondeur et la durée minimales requises en matière d'anesthésie, équilibrez les cardiotoxicités anesthésiques par rapport à la nécessité critique de supprimer les artefacts de mouvement et la détermination a priori pour une conception expérimentale de survie vs terminale. Capitaliser sur la puissance synergique d'une combinaison d'anesthésiques multiples provenant de différentes classes de médicaments5,14 et paralytiques1,6 pour abaisser la dose d'agents individuels5 ou l'administration une faible dose d'entretien à la suite d'une dose d'induction plus élevée sont des stratégies typiques. Cependant, malgré ses toxicités cardiorespiratoires potentielles bien connues, y compris la mort8, la tricaine est toujours la plus largement utilisée, la meilleure disponible, et le seul anesthésique approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis pour le poisson zèbre Anesthésie. Tricaine a été populairement utilisé dans l'enregistrement ECG de poissons zèbres adultes soit comme un agent unique ou en combinaison avec d'autres anesthésiques ou paralytiques.
Deuxièmement, l'exactitude du placement du plomb peut être assurée au moins pour les poissons zèbres normaux en bonne santé en utilisant nos quatre critères de validation pour un eCG adulte normal de poisson zèbre. Sur les quatre critères de validation que nous proposons ici, les deux derniers critères confirment ensemble la concordance fondamentale entre la polarité de la vague R et celle de la vague T dans un ECG normal5,7,15. Cette concordance d'onde de R et De est une similitude fortuite, mais critique, entre le poisson zèbre et l'homme16,17 ECG normal qui contribue à la pertinence clinique du modèle de coeur de poisson-zèbre en tant que substitut pour le cardiaque humain Électrophysiologie. Cependant, plusieurs conditions bénignes ou malignes peuvent invalider l'un des quatre critères de validation. Par exemple, la concordance des ondes R et T est perdue dans l'ischémie myocardique7,15. Cette perte de concordance d'onde de R et de T dans l'ischémie myocardique est une autre ressemblance frappante entre le poisson zèbre et l'ECG humain qui contribue à la pertinence clinique du modèle d'infarctus du myocarde de poisson-zèbre.
Enfin, nous recommandons une pratique standard dans l'analyse ECG. Avec l'avènement de la technologie, le logiciel d'analyse ECG peut générer une interprétation eCG automatique. Cependant, nous recommandons fortement que les humains formés devraient toujours réinterpréter et vérifier tous les ECG basés sur le scénario clinique respectif menant à l'enregistrement d'ECG. Il est déconseillé de trop dépendre de façon courante uniquement de l'interprétation automatique par un logiciel d'analyse ECG, en particulier en présence de variantes normales courantes d'ECG, de pathologies cardiaques ou de placement de plomb sous-optimal.
Cette étude se concentre sur la méthode mini-invasive pour de brèves sessions d'enregistrement ECG. Cependant, si le besoin se fait sentir pour des sessions d'enregistrement ECG prolongées terminales durant desheures, des modifications sont nécessaires pour fournir l'oxygénation, l'hydratation, et l'anesthésie proportionnels par perfusion continue 6.
En outre, améliorez le rapport signal-bruit d'au moins trois façons. Le choix d'un amplificateur plus puissant est souvent une option coûteuse, voire peu pratique. Ouvrir le sac péricardique pour réduire le conducteur de volume est une approche raisonnable, bien qu'invasive, qui a été adoptée7. Le placement stratégique du plomb pour aligner l'axe de plomb dans une direction parallèle à l'axe cardiaque principal (figure 4B) maximisera les signaux de tension ECG, mais peut nécessiter des essais et des erreurs, surtout en l'absence de péricardiotomie.
La méthode d'interrogatoire In vivo ECG pour le poisson zèbre adulte que nous avons présenté ici offre quatre principaux avantages. Tout d'abord, notre approche mini-invasive ne nécessite que l'insertion d'électrodes, mais pas d'élimination de l'échelle de poisson ou de la thoracotomie-péricardiotomie. Par conséquent, en minimisant la douleur pour les poissons, notre approche permet des interrogatoires répétés ECG dans des études de survie longitudinale. Deuxièmement, lorsque les anesthésiques suppriment adéquatement le mouvement des poissons, le système d'enregistrement In vivo ECG dans notre étude donne constamment un rapport signal-bruit satisfaisant avec des signaux bruts sans bruit. Troisièmement, la validation de la qualité en quatre critères que nous proposons ici assure l'exactitude et la robustesse des données dès le début de l'acquisition de données ECG et minimise les variations dépendantes des opérateurs. Enfin, en particulier, notre dernier critère de validation (l'onde T normale est verticale) résume la concordance de la vague R et de la vague T, une caractéristique humaine importante de l'ECG normal de poisson zèbre (Figure 1).
Cependant, il existe encore quatre limitations majeures à la méthodologie actuelle in vivo ECG pour les poissons zèbres adultes par notre groupe et d'autres.
Tout d'abord, le manque de coopération du sujet nécessite la nécessité d'une anesthésie avec ses conséquences limitantes de toxicité cardiorespiratoire. Pour l'interrogatoire in vivo d'ECG, alors que les patients humains n'ont jamais besoin de sédation, le poisson zèbre a toujours besoin d'anesthésiques ou de paralytiques, qui causent tous des toxicités cardiorespiratoires variables.
Deuxièmement, la nécessité de fixer les pistes ECG attachées augmente légèrement l'invasivité d'une procédure autrement non invasive. Alors que le placement de plomb dans l'enregistrement Delg de la surface du corps de l'homme est entièrement non-invasif parce que les électrodes adhèrent à l'épiderme humain, le placement de plomb pour l'enregistrement in vivo d'ECG du poisson zèbre est plus invasif parce que, au minimum, les électrodes en acier doivent perforer la peau du poisson pour une insertion sûre dans la musculature du poisson.
Les deux dernières limitations découlent des contraintes anatomiques de la poitrine et du cœur du poisson zèbre. Troisièmement, la taille minuscule du cœur adulte de poisson zèbre nécessite une réduction drastique du nombre de fils d'ECG. Alors que les humains accueillent facilement douze pistes dans un enregistrement ECG standard, le poisson zèbre adulte ne peut généralement accueillir qu'un seul plomb unipolaire ou bipolaire. La ramification d'un seul plomb ECG est le défi d'optimiser simultanément les amplitudes des trois ondes P, R et T. Par conséquent, on ne saurait trop insister sur l'importance d'un placement optimal et précis du plomb dans les interrogatoires eCG du poisson zèbre. Chez le poisson zèbre, la vague T présente un défi de détection unique parce qu'elle est souvent la plus petite de ces trois vagues. Par conséquent, l'amplitude des ondes T du poisson zèbre devrait recevoir une priorité d'optimisation sur les ondes P et R généralement plus grandes.
Quatrièmement, il peut être difficile de déterminer l'axe cardiaque principal du poisson zèbre pour maximiser l'amplitude des ondes R. La raison en est que le cœur de poisson zèbre a plus de liberté de mouvement dans son sac péricardique lâche par rapport au cœur humain dans son péricarde de gant-ajustage de forme.
Dans l'ensemble, ces limites stimuleront l'innovation future en matière de méthode. Avec l'avènement de l'impression 3D et de l'électronique déformable18, il ya de l'espoir pour l'implantation directe de plomb un jour dans éveillé, alerte, la natation des poissons zèbres à l'aide d'une «chaussette cardiaque» de capteurs d'électrodes sans fil.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health R01 HL141452 à TPN. ADInstruments a gentiment fourni un financement généreux pour couvrir le coût de la publication en libre accès, mais n'a joué aucun rôle dans la conception expérimentale, l'acquisition de données, l'analyse des données de cette étude ou tout accès au manuscrit avant la publication.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture dishes | Fisher Scientific | FB087571 | 100 mm x 20 mm |
| Dumont Forceps | Fine Sciense Tools | 11253-20 | 0.1 x 0.06 mm |
| FE136 Animal Bio Amp | AD Instruments | FE231 | |
| Iris Forceps | Fine Sciense Tools | 11064-07 | 0.6 x 0.5 mm |
| LabChart 8 Pro | AD Instruments | Software with ECG Module | |
| Needle electrodes for Animal Bio Amp | AD Instruments | MLA1213 | 29 gauge |
| Plastic Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | 6 in., 1.2 mL |
| PowerLab 4/35 | AD Instruments | 4//35 | |
| Scissors | Fine Sciense Tools | 15000-08 | 2.5 mm, 0.075 mm |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | MS-222 |
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