Summary
Presentato qui è un protocollo per isolare vari sottoinsiemi di macrofagi e altre cellule non immuni dal miocardio umano e topidano preparando una sospensione a singola cellula attraverso la digestione enzimatica. Vengono inoltre presentati schemi di Gating per l'identificazione e la caratterizzazione basata sulla citometria del flusso di macrofagi.
Abstract
I macrofagi rappresentano le popolazioni di cellule immunitarie più eterogenee e abbondanti nel cuore e sono centrali nel guidare l'infiammazione e le risposte riparative dopo lesioni cardiache. Come vari sottoinsiemi di macrofagi orchestrano le risposte immunitarie dopo lesioni cardiache è un'area attiva di ricerca. Presentato qui è un semplice protocollo che il nostro laboratorio esegue regolarmente, per l'estrazione di macrofagi da campioni di topo e miocardio umano ottenuti da individui sani e malati. In breve, questo protocollo comporta la digestione enzimatica del tessuto cardiaco per generare una singola sospensione cellulare, seguita da colorazione anticorpale, e citometria di flusso. Questa tecnica è adatta per i saggi funzionali eseguiti su cellule ordinate e per il sequenziamento di RNA sfuso e a singola cellula. Uno dei principali vantaggi di questo protocollo è la sua semplicità, la variazione minima giorno per giorno e l'ampia applicabilità che consente lo studio dell'eterogeneità dei macrofaci tra vari modelli murini ed entità di malattie umane.
Introduction
I macrofagi rappresentano il tipo di cellule immunitarie più abbondanti nel cuore, e svolgono un ruolo significativo nel generare robuste risposte infiammatorie e riparative dopo lesioni cardiache1,2,3,4. In precedenza, il nostro gruppo identificava due sottoinsiemi principali di macrofagi nel cuore murino derivati da origini dello sviluppo distinte5,6. In generale, è possibile identificare popolazioni distinte di sottoinsiemi di macrofagi cardiaci residenti in tessuto in base all'espressione della superficie cellulare del CCR2 (recettore chemiochina motivo C-C 2). CCR2- i macrofagi (espressione della superficie cellulare: CCR2-MHCIIbasso e CCR2-MHCIIalto)sono di origine embrionale (linee primitive ed eritromieloidi), in grado di auto-rinnovarsi e rappresentare una popolazione dominante in condizioni omeostatiche. Residenti CCR2- i macrofagi sono di origine ematopoietica definitiva, sono mantenuti attraverso il reclutamento di monociti circolanti e rappresentano una popolazione minore in condizioni omeostatiche. Funzionalmente, CCR2- i macrofagi generano un'infiammazione minima e sono fondamentali per lo sviluppo coronarica cardiaca neonatale5,7. Al contrario, i macrofagi CCR2 avviano robuste risposte infiammatorie a seguito di insulti cardiaci e contribuiscono a lesioni cardiomiociti collaterali, rimodellamento avverso del ventricolo sinistro e progressione dell'insufficienza cardiaca8,9.
Recentemente, abbiamo dimostrato che il miocardio umano contiene anche due distinti sottoinsiemi di macrofagi identificati in modo simile a CCR2- o CCR2-8. L'espressione genica e le analisi funzionali hanno rivelato che i macrofagi CCR2- e CCR2- rappresentano sottoinsiemi funzionalmente divergenti e sono funzionalmente analoghi a CCR2- e CCR2- macrofagi trovati nel cuore del topo. Human CCR2- i macrofagi esprimono solidi livelli di fattori di crescita, tra cui IGF1, PDGF, Cyr61 e HB-EGF. I macrofagi CCR2sono arricchiti in chemiochini e citochine che promuovono l'infiammazione, come IL-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 e TNF-a. I macrofagi stimolati secernono livelli marcatamente più elevati della citochina infiammatoria interleuchina-1 ( IL-1) in coltura. Il modo in cui questi sottoinsiemi contribuiscono in modo differenziale alla riparazione dei tessuti e al rimodellamento ventricolare sinistro (LV) nel contesto delle lesioni cardiache rimane un'area di ricerca attiva.
L'analisi basata sulla citometria del flusso nel mouse e nel cuore umano richiede la digestione del tessuto cardiaco e la generazione di una sospensione a singola cellula seguita dall'analisi citometrica del flusso o dallo smistamento cellulare per ulteriori processi a valle come il sequenziamento di massa di RNA /sequenziamento dell'RNA a singola cellula o la coltura delle cellule per analisi funzionali. Il protocollo originale per la creazione di una sospensione a cella singola da cuori murini è stato riportato per la prima volta dal gruppo Nahrendorf in Nahrendorf et al. 200710. Il nostro laboratorio ha adattato e modificato il protocollo per estrarre i macrofagi dal miocardio umano. Utilizzando lo stesso protocollo, ma con una leggera modifica nello schema di colorazione e gating, CD45- cellule stromali del miocardio umano può anche essere raccolto. Presentato qui, in testo e video, è un protocollo che viene eseguito regolarmente per l'estrazione di macrofagi o stromal dal miocardio umano.
I campioni di tessuto cardiaco sono ottenuti da pazienti adulti con cardiomiopatia dilatata (DCM: idiopatica o familiare) o cardiomiopatia ischemica (ICM) sottoposta a impianto di assistenza ventricolare sinistra (LVAD) impianto o trapianto cardiaco. I cuori esoppiantati o i nuclei LVAD sono intravascolari perfusi con salina fredda prima di iniziare la procedura di digestione. È importante notare che la "qualità" del campione di tessuto determinata in termini di grado di cicatrici o infiltrazione di tessuto adiposo può influenzare notevolmente la resa dei macrofagi. Gli esemplari cardiaci con ampie aree di cicatrici avranno una resa cellulare molto più bassa e possono porre gravi limitazioni tecniche quando i metodi di analisi a valle desiderati richiedono una coltura cellulare in vitro.
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Protocol
Il protocollo presentato è stato approvato dalla Washington University nel St. Louis Institutional Review Board (#201305086). Tutti i soggetti forniscono il consenso informato prima della raccolta dei campioni e gli esperimenti vengono eseguiti in conformità con il protocollo di studio approvato. Il protocollo presentato viene eseguito con l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Washington University School of Medicine e segue le linee guida descritte nella Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Preparazione di campioni di tessuto cardiaco umano
- Sciacquare i cuori espiantati cannulando l'ostia coronarica sinistra e destra e perfondere con 200 mL di salina fredda.
- Lavare i tessuti a nucleo apicale LVAD cannulando un vaso epicardiale e perfuso con 50 mL di salina fredda.
- Estratto di tessuto disseta dalla parete apicale o laterale del ventricolo sinistro in salina fredda o HBSS utilizzando una forbice sterile.
- Sezionare con attenzione il grasso epicardiale e le corde tendinee dal campione usando le forbici fini.
- Pezzi di tessuto dissetato in pezzi del peso di circa 200 mg con l'aiuto di una lama sterile o forbici.
2. Preparazione del cuore del topo
- Eutanasia il topo per asfissia di CO2 o lussazione cervicale.
- Aprire la cavità toracica con l'aiuto di forbici affilate. Utilizzare hemostats smussati per sollevare il cuore verso l'alto. Perfondere il cuore con PBS freddo utilizzando un ago da 25 G attaccato a una siringa da 5 mL. Perfuso fino a quando il cuore appare sbollentato di colore.
- Togliere il cuore e mettere in una sterile piastra Petri sul ghiaccio.
3. Preparazione della sospensione a cella singola
- Posizionare blocchi di tessuto cardiaco umano (200 mg) o cuore murino in una parabola Petri sterile. Tritare finemente il tessuto utilizzando una lama sterile o forbici.
- Impostare le digestione:
- Utilizzare un volume di digestione finale di 3 mL per pezzo di tessuto cardiaco umano (200 mg) o per un cuore murino. Le concentrazioni finali di enzimi sono le seguenti: Collagenase1 (450 U/mL), DNase1 (60 U/mL), Hyaluronidase (60 U/mL).
- Per ogni reazione di digestione aggiungere DMEM e tutti gli enzimi a un tubo conico da 15 mL. Con l'aiuto di pinze pulite, posizionare il tessuto finemente macinato in ogni tubo di reazione. Mescolare bene con vortice delicato.
- Digerire per 1 h a 37 gradi centigradi in un'incubatrice agitazione impostata su una velocità di agitazione da bassa a media.
- Dopo 1 h di digestione, togliere i tubi dall'incubatrice e metterli sul ghiaccio. Impostare tubi conici da 50 ml con un colino a celle da 40 m in cima. Sorrida i filtri con 2 mL di buffer di disattivazione degli enzimi (ED).
- Disattivare gli enzimi di digestione aggiungendo 8 mL di buffer ED a ciascun tubo di digestione. Quindi versare la miscela totale risultante 13 mL attraverso il colino da 40 m nei tubi conici da 50 mL. Trasferire i campioni in un tubo conico fresco da 15 mL. Ciò consente una pelletazione cellulare ottimale e riduce al minimo la perdita di cellule durante la centrifugazione.
- Girare i campioni a 400 x g per 6 min (Centrifuge impostato a 4 gradi centigradi). Scartare il super-atterrante lasciando 0,5 mL di media. Risospendere il pellet cellulare mediante un delicato pipettaggio e aggiungere 1 mL di buffer di lisi ACK. Ruotare delicatamente il tubo e incubare a temperatura ambiente per 5 min per eseguire lisa dei globuli rossi (RBC).
- Dopo 5 min nel buffer ACK, aggiungere 9 mL di DMEM al campione. Rimettere il coperchio sui tubi e invertire delicatamente i tubi per mescolare, e filtrare attraverso un colino cellulare di 40 m. Raccogliere il filtrato in tubi conici da 15 mL.
- Centrifugare i tubi a 400 x g per 6 min e scartare il supernatante.
- Aggiungere 1 mL di buffer FACS e sospendere nuovamente il pellet. Trasferire quindi nelle celle nel buffer FACS in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL. Centrifuga di nuovo a 400 x g per 5 min. Scartare il supernatante e risospendere il pellet in 100 l di FACS Buffer. Una sospensione a singola cellula è ora pronta per la colorazione degli anticorpi.
4. Colorazione anticorpale
- Un tipico pannello anticorpale umano è costituito dai seguenti anticorpi: CD45-PercpCy5.5, CD14-PE, CD64-FITC, HLA-DR-APC/Cy7, CCR2-APC. Si prega di fare riferimento alla tabella 1. Aggiungere tutti gli anticorpi ai campioni di cuore a 1:50 di diluizione e incubare per 30-40 min a 4 gradi centigradi al buio. Procedere al passaggio 4.4 riportato di seguito.
- Per le cellule stromali (cellule endoteliali, fibroblaste, cellule muscolari lisce), aggiungere DRAQ5 (1 concentrazione finale m) e CD45-percpCy5.5. Si prega di fare riferimento alla tabella 1. Incubare per 30 min a 4 gradi centigradi al buio. Procedere al passaggio 4.4 riportato di seguito.
- Per i murini cardiaci i macrofagi aggiungono i seguenti anticorpi: CD45-PercpCy5.5, CD64-APC, MHCII-APC/Cy7, CCR2-BV421 e Ly6G-FITC. Si prega di fare riferimento alla tabella 2. Aggiungere tutti gli anticorpi ai campioni di cuore a 1:100 di diluizione e incubare per 30-40 min a 4 gradi centigradi al buio. Procedere al passaggio 4.4 riportato di seguito.
- Lavare i campioni due volte nel buffer FACS. Per ogni lavaggio, aggiungere 1 mL di tampone FACS, vortice delicato, e centrifugare a 400 x g per 5 min, respendere in 350 : L di tampone FACS e aggiungere DAPI (1 M, concentrazione finale). I campioni sono ora pronti per l'analisi/smistamento FACS.
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Representative Results
Il protocollo descritto consente l'isolamento dei macrofagi dal topo e dal miocardio umano. Utilizzando lo stesso protocollo, ma con una diversa strategia di colorazione e gating, le cellule stromali possono anche essere raccolte dal miocardio umano. I risultati FACS qui presentati sono stati acquisiti sulla piattaforma BD LSRII o BD FACS ARIA III. I controlli di compensazione sono stati generati da campioni di controllo del colore singolo provenienti da splenociti macchiati. Figura 1 Mostra core LVAD umano non elaborato ed elaborato. La figura 2 mostra lo schema di gating per lo smistamento del flusso di CCR2- e CCR2- macrofagi umani. Figura 3A mostra lo schema di gating per CD45- cellule stromali da miocardio umano e Figura 3B mostra immagini di Wright macchiato FACS ordinato CD45e CD45- cellule. Figura 4 descrive lo schema di gating per ordinare i macrofagi da un cuore di topo.
Figura 1: Il nucleo del tessuto LVAD umano prima e dopo l'elaborazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schema di gating della citometria di flusso utilizzato per identificare e caratterizzare le popolazioni di macrofagi cardiaci in campioni di cardiomiopatia dilatati (DCM) o cardiomiopatia ischemica (ICM). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Schema di gating della citometria di flusso per isolare CD45- e CD45- cellule stromali da campioni umani. (A) Schema di gating della citometria di flusso utilizzato per isolare CD45- cellule stromali da cardiomiopatia ischemica umana (ICM) o cardiomiopatia dilatata (DCM). (B) Wright ha macchiato FACS ordinato CD45- e CD45- cellule. Barre di scala : 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Schema di gating della citometria di flusso per isolare vari sottoinsiemi di macrofagi dal cuore del topo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Antigene | Fluoroforo | Clone | Produttore |
| CD45 (informazioni in stato indue) | PercpCy5,5 | 2D1 (in questo modo) | Bioleggenda |
| CD64 (informazioni in inglese) | Fitc | 10.1 | Bioleggenda |
| CD14 (informazioni in due) | Pe | M5E2 (in questo stato del sistema) | Bioleggenda |
| CCR2 | APC o BV421 | K036C2 | Bioleggenda |
| MHCII | APC/Ci7 | L243 (in questo stato del sistema) | Bioleggenda |
| Funzione DRAQ5 | Thermo Fisher | ||
| Dapi | Thermo Fisher |
Tabella 1: Pannello anticorpale per il campione di miocardio umano.
| Antigene | Fluoroforo | Clone | Produttore |
| CD45 (informazioni in stato indue) | PercpCy5,5 | 30-F11 | Bioleggenda |
| CD64 (informazioni in inglese) | Apc | X54-5/7.1 | Bioleggenda |
| Ly6G | PE/Ci7 | 1A8 (in questo stato del sistema) | Bioleggenda |
| Ly6C | Fitc | HK1.4 | Bioleggenda |
| CCR2 | BV421 (in questo | SA203G111 | Bioleggenda |
| MHCII | APC/Ci7 | M5/114.15.2 | Bioleggenda |
| Funzione DRAQ5 | Thermo Fisher | ||
| Dapi | Thermo Fisher |
Tabella 2: Pannello anticorpo per l'esemplare di cuore del topo.
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Discussion
Il protocollo consente l'estrazione di vari sottoinsiemi di macrofafi dal miocardio umano. Il protocollo è semplice e richiede da 3 a 4 ore per preparare le sospensioni a cella singola pronte per l'analisi FACS. Anche se il protocollo è relativamente semplice da eseguire, ci sono alcuni aspetti tecnici che devono essere considerati che ridurrà al minimo la variabilità. In primo luogo, lavorare in modo tempestivo con il tessuto umano è necessario per una vitalità cellulare ottimale. È importante mantenere il tessuto in salina fredda/HBSS per ridurre al minimo la morte delle cellule. È anche necessario rimuovere il grasso epicardico e altro tessuto connettivo dal campione miocardio. La mintura costante dei tessuti e i tempi di digestione ridurranno la variazione del campione al campione.
C'è sia la variabilità intra-saggio che quella tra saggi nelle digestione tissutali e nei rendimenti cellulari successivi. Questa è una delle limitazioni nella preparazione di una singola sospensione cellulare dai tessuti. Il modo più importante per ridurre al minimo questo è assicurandosi che gli enzimi siano relativamente nuovi, correttamente aliquotizzati e conservati a -80 gradi centigradi. Gli aliquote devono essere utilizzati una sola volta e non devono essere salvati o congelati di nuovo. Gli enzimi utilizzati sono sensibili al congelamento dei cicli di disgelo. Un'altra considerazione è la temperatura di digestione e la velocità di agitazione. L'utilizzo di uno shaker a ccomandita con termostato che distribuisce uniformemente il calore aiuta a ridurre al minimo la variabilità di digestione e migliorare la vitalità cellulare.
È importante ricordare che la resa assoluta di macrofagi dal miocardio umano non è generalmente molto alta. Di solito la resa cellulare varia da 20.000 a 50.000 macrofagi totali per 1.200-1,500 mg di tessuto. Questo diventa impegnativo quando il metodo a valle desiderato di analisi coinvolge i saggi di coltura cellulare. È possibile eseguire facilmente la produzione di fagocitosi/citochine/citochine, la stimolazione cellulare, la morfometria e l'espressione genica (microarray, sequenziamento dell'RNA di massa e sequenziamento dell'RNA a cella singola). La qualità del tessuto determina anche la facilità di digestione e la successiva resa cellulare. Se il tessuto è fibroso e sfregiato, l'efficienza della digestione è non ottimale e la resa dei macrofafi è probabilmente molto bassa.
Un altro aspetto da considerare è che la digestione del tessuto miocardico porta alla formazione significativa di detriti. In questo modo il pellet appare allentato. Quindi, si deve fare attenzione a non scartare il supernatante durante i passaggi di lavaggio con semplice decantazione. È consigliabile utilizzare un pallone di raccolta dei rifiuti di aspirazione/vuoto con una pipetta Pasteur per raccogliere il supernatante. Inoltre, mantenere la centrifuga a 4 gradi centigradi contribuirà a ridurre al minimo la morte cellulare e la perdita di campioni.
Anche se questo protocollo descrive un modo per estrarre macrofagi da campioni di tessuto miocardico umano, l'isolamento di successo di sottoinsiemi di macrofagi può essere raggiunto anche dai cuori del topo senza modifiche o modifiche significative.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo progetto è stato reso possibile dai finanziamenti forniti dal Children's Discovery Institute della Washington University e dal St. Louis Children's Hospital (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), dalla Fondazione del Barnes-Jewish Hospital (8038-88) e dal NHLBI (R01) HL138466, R01 HL139714). K.J.L. è supportato da NIH K08 HL123519 e Burroughs Welcome Fund (1014782).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5 M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0.5 M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petri dishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Hulsmans, M., et al. Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction. Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).
- Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Dick, S. A., et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction. Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
