Summary
يقدم هنا بروتوكول لعزل مختلف المجموعات الفرعية من الضامة وغيرها من الخلايا غير المناعية من عضله الدم البشرية والماوس من خلال اعداد تعليق خليه واحده من خلال الهضم الانزيمي. وتعرض أيضا مخططات الصب لتحديد وتوصيف الضامة المعزولة علي أساس التدفق الخلوي.
Abstract
الضامة تمثل الأكثر تجانسا ووفره الخلايا المناعية السكان في القلب وهي مركزيه في القيادة التهاب والاستجابات التعويضية بعد أصابه القلب. كيف المجموعات الفرعية المختلفة من الضامة تنسق الاستجابات المناعية بعد أصابه القلب هي منطقه نشطه من البحوث. المقدمة هنا هو بروتوكول بسيط ان مختبرنا ينفذ بشكل روتيني ، لاستخراج الضامة من الفئران والعينات البشرية عضله العين التي تم الحصول عليها من الافراد الأصحاء والمريضة. باختصار ، ينطوي هذا البروتوكول علي الهضم الانزيمي لأنسجه القلب لتوليد تعليق خليه واحده ، تليها تلطيخ الأجسام المضادة ، وتدفق الخلايا الخلوية. هذه التقنية هي مناسبه لاختبارات وظيفية أجريت علي الخلايا فرزها ، فضلا عن الجزء الأكبر وخليه واحده التسلسل RNA. ومن المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول هو بساطته ، الحد الأدنى من يوم إلى يوم الاختلاف وتطبيق واسعه تسمح التحقيق في تغاير الضام عبر مختلف نماذج الماوس والكيانات البشرية المرض.
Introduction
الضامة تمثل الأكثر وفره من نوع الخلايا المناعية في القلب ، وانها تلعب أدوارا هامه في توليد ردود الفعل التهابيه والتعويضية القوية بعد أصابه القلب1،2،3،4. في السابق ، حددت مجموعتنا مجموعتين رئيسيتين من الضامة في قلب murine مشتقه من أصول تنموية متميزة5،6. علي نطاق واسع ، يمكن تحديد السكان متميزة من الانسجه المقيمين القلب الضامة المجموعات الفرعية استنادا إلى التعبير سطح الخلية من CCR2 (C-C عزر المستقبلات chemokine 2). CCR2الضامة ( التعبير سطح الخلية: CCR2المنخفضة و CCR2-mhciiعاليه) هي من أصل جنيني (السلالات البدائية والحمرة) ، قادره علي التجديد الذاتي ، وتمثل السكان المهيمنة تحت ظروف التماثل المنزلي. CCR2المقيمين + الضامة هي من أصل نهائي الدم ، ويتم الحفاظ عليها من خلال التوظيف من الخلايا الاحاديه المتداولة ، وتمثل السكان القاصرين تحت ظروف التماثل المنزلي. وظيفيا ، CCR2الضامة توليد الحد الأدنى من التهابات وهي حاسمه للتنمية التاجية القلب الوليد التجديد5،7. في المقابل ،CCR2 + الضامة بدء استجابات التهابيه قويه بعد الإهانات القلبية والمساهمة في التبعية عضله الاصابه ، وأعاده عرض سلبيه من البطين الأيسر ، وفشل القلب التقدم8،9.
في الاونه الاخيره ، لقد أظهرنا ان عضله العين البشرية تحتوي أيضا علي مجموعتين فرعيتين متميزتين من الضامة التي تم تعريفها بالمثلاما CCR2 أو CCR2 +8. وكشفت التعبيرات الجينية والتحليلات الوظيفية ان الCCR2البشرية والCCR2 + الضامة تمثل مجموعات فرعيه متباعدة وظيفيا ومشابهه وظيفيالCCR2 والCCR2 + الضامة الموجودة في قلب الماوس. الإنسان CCR2الضامة التعبير عن مستويات قويه من عوامل النمو ، بما في ذلك IGF1 ، Pdgf ، Cyr61 ، و HB-egf. CCR2 + الضامة المخصب في مستقطبات والخلوية التي تعزز التهاب ، مثل il-1b ، آيل-6 ، سي سي-2 ، سي سي-7 ، و tnf-a. حفزCCR2 + الضامة تفرز مستويات اعلي بشكل ملحوظ من التهابات السايسيسين انترلوكين-1Β (IL-1β) في الثقافة. كيف تساهم هذه المجموعات الفرعية بشكل مختلف في إصلاح الانسجه وأعاده عرض البطين الأيسر (LV) في سياق أصابه القلب لا يزال مجالا للبحوث النشطة.
تحليل التدفق الخلوي القائم علي التجانس الضام في الماوس والقلب البشري يتطلب هضم انسجه القلب وتوليد تعليق خليه واحده تليها تحليل تدفق الخلوية أو فرز الخلايا لمزيد من العمليات المصب مثل التسلسل RNA السائبة/خليه واحده الجيش النيبالي التسلسلي التسلسل أو الخلايا لاختبارات وظيفية. البروتوكول الأصلي لاجراء تعليق خليه واحده من قلوب murine وأبلغت لأول مره من قبل مجموعه ناهريندورف في ناهريندورف وآخرون 200710. لدينا مختبر تكييف وتعديل البروتوكول لاستخراج الضامة من عضله العضل البشرية. باستخدام نفس البروتوكول ولكن مع تعديل طفيف في تلطيخ ومخطط النابضة ، ويمكن أيضا انتحصد الخلايا CD45 من عضله الام البشرية. يقدم هنا ، في النص والفيديو ، هو البروتوكول الذي يتم تنفيذه بشكل روتيني لاستخراج الضامة أو اللحمية من عضله الدم البشرية.
يتم الحصول علي عينات الانسجه القلبية من المرضي البالغين الذين يعانون من اعتلال عضله القلب المتوسع (DCM: مجهول الشخص أو العائلي) أو اعتلال العضلة الدماغية (ICM) الذي يخضع لعمليه غرس أو زرع القلب في جهاز مساعده البطين الأيسر (LVAD). القلوب المفسرة أو النوى LVAD هي إينترافاسكولارلي perfused مع المحلول الملحي البارد قبل بدء عمليه الهضم. من المهم ان نلاحظ ان "نوعيه" عينه من الانسجه التي تحدد من حيث درجه من تندب أو تسلل الانسجه الدهنية يمكن ان تؤثر بشكل كبير علي الغلة من الضامة. عينات القلب مع مساحات كبيره من تندب سيكون لها اقل بكثير من الغلة الخلية ويمكن ان تشكل القيود الفنية خطيره عند المطلوب أساليب التحليل المصب تتطلب في المختبر الخلية الخياطة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت جامعه واشنطن في مجلس سانت لويس للاستعراض المؤسسي علي البروتوكول المقدم (#201305086). وتوفر جميع المواد الموافقة المستنيرة قبل جمع العينات وتجري التجارب وفقا لبروتوكول الدراسة المعتمد. يتم تنفيذ البروتوكول المعروض بموافقه اللجنة المؤسسية للعناية بالماشية واستخدامها في كليه الطب بجامعه واشنطن ويتبع المبادئ التوجيهية الموصوفة في دليل المعاهد القومية للصحة لرعاية واستخدام المختبرات الحيوانية.
1. اعداد عينات انسجه القلب البشرية
- مسح القلوب المفسرة عن طريق تعليب الشريان التاجي الأيسر والأيمن اوستيا والحقنت مع 200 مل من المحلول الملحي البارد.
- دافق المناديل الورقية لل lvad قمي عن طريق تعليب السفينة الابيميه و حقنت مع 50 مل من المياه المالحة الباردة.
- تشريح عينه من الانسجه من الجدار الجانبي أو الأفقي للبطين الأيسر في المحلول الملحي البارد أو HBSS باستخدام مقص معقم.
- تشريح بعناية من الدهون الذواقة و قلبي أوتار من العينة باستخدام مقص غرامه.
- تشريح قطع الانسجه إلى قطع تزن حوالي 200 ملغ مع مساعده من شفره معقمه أو مقص.
2. اعداد قلب الماوس
- موت ببطء الماوس بواسطة CO2 اختناق أو خلع عنق الرحم.
- فتح تجويف الصدر بمساعده مقص حاد. استخدام الأرقاء حاده لرفع القلب صعودا. Perfuse القلب مع تلفزيونيه الباردة باستخدام ابره 25 G تعلق علي حقنه 5 مل. Perfuse حتى يظهر القلب مقشر في اللون.
- أزاله القلب ووضع في طبق بيتري معقمه علي الجليد.
3. اعداد تعليق خليه واحده
- وضع قطع انسجه القلب البشرية (~ 200 ملغ) أو القلب murine في طبق بيتري معقمه. فرم النسيج ناعما باستخدام شفره معقمه أو مقص.
- اعداد الهضم:
- استخدام حجم الهضم النهائي من 3 مل لكل قطعه انسجه القلب البشرية (200 ملغ) أو لكل قلب murine واحد. تركيزات الانزيم النهائي هي علي النحو التالي: Collagenase1 (450 U/mL) ، DNase1 (60 U/mL) ، حمض الهيالورونيك (60 U/mL).
- لكل رد فعل الهضم أضافه DMEM وجميع الانزيمات إلى أنبوب مخروطي 15 مل. مع مساعده من ملقط نظيفه ، ووضع الانسجه المفرومة ناعما في كل أنبوب رد فعل. اخلط جيدا بواسطة الفورتكينغ اللطيف.
- هضم ل 1 ح في 37 درجه مئوية في حاضنه تهتز تعيين إلى سرعه الانفعالات منخفضه إلى متوسطه.
- بعد 1 ساعة من الهضم ، وإخراج الأنابيب من الحاضنة ومكان علي الجليد. اعداد 50 mL أنابيب مخروطيه مع مصفاه الخلية 40 μm علي القمه. الرطب المرشحات مع 2 مل من انزيم تعطيل (ED) العازلة.
- إلغاء تنشيط انزيمات الهضم عن طريق أضافه 8 مل من العازلة ED لكل أنبوب الهضم. ثم صب الناتج 13 مل الخليط الكلي من خلال مصفاه الخلية 40 μm في أنابيب مخروطيه 50 mL. نقل العينات مره أخرى في أنبوب مخروطي 15 مل الطازجة. وهذا يتيح التكوير الخلية الأمثل ويقلل من فقدان الخلايا اثناء الطرد.
- تدور العينات في 400 x g لمده 6 دقائق (جهاز الطرد المركزي تعيين في 4 درجه مئوية). تجاهل ماده طافي ترك 0.5 mL من وسائل الاعلام. أعاده تعليق بيليه الخلية بواسطة الأنابيب لطيف وأضافه 1 مل من المخزن المؤقت تحلل ACK. قم بتحريك الأنبوب برفق وحضنه في درجه حرارة الغرفة لمده 5 دقائق لأداء خلايا الدم الحمراء (ربك) تحلل.
- بعد 5 دقائق في المخزن المؤقت ACK ، أضافه 9 مل من DMEM إلى العينة. وضع الغطاء مره أخرى إلى الأنابيب وعكس بلطف أنابيب لخلط ، وتصفيه من خلال مصفاه الخلية 40 μm. جمع الترشيح في 15 مل أنابيب مخروطيه.
- الطرد المركزي الأنابيب في 400 x g لمده 6 دقائق وتجاهل supernatant.
- أضافه 1 مل من المخزن المؤقت FACS وأعاده تعليق بيليه. ثم نقل في الخلايا في المخزن المؤقت FACS إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 mL. الطرد المركزي مره أخرى في 400 x g لمده 5 دقيقه. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 100 μl من المخزن المؤقت facs. تعليق خليه واحده جاهزه الآن لتلطيخ الأجسام المضادة.
4. تلطيخ الأجسام المضادة
- تتكون لوحه الأجسام المضادة البشرية النموذجية من الأجسام المضادة التالية: CD45, CD14, CD64, هلا-د-APC/Cy7, CCR2-APC. يرجى الرجوع إلى الجدول 1. أضافه جميع الأجسام المضادة إلى عينات القلب في 1:50 التخفيف واحتضان ل ~ 30-40 دقيقه في 4 درجه مئوية في الظلام. انتقل إلى الخطوة 4.4 أدناه.
- للخلايا اللحمية (الخلايا البطانية ، الليفية ، خلايا العضلات الملساء) ، أضافه DRAQ5 (1 μM التركيز النهائي) و CD45-percpCy 5.5. يرجى الرجوع إلى الجدول 1. احتضان لمده 30 دقيقه في 4 درجه مئوية في الظلام. انتقل إلى الخطوة 4.4 أدناه.
- بالنسبة للضامة القلب murine أضافه الأجسام المضادة التالية: CD45-بيركبيسي 5.5 ، CD64 ، MHCII-APC/Cy7 ، CCR2 BV421 ، و Ly6G-FITC. يرجى الرجوع إلى الجدول 2. أضافه جميع الأجسام المضادة إلى عينات القلب في 1:100 التخفيف واحتضان ل ~ 30-40 دقيقه في 4 درجه مئوية في الظلام. انتقل إلى الخطوة 4.4 أدناه.
- غسل العينات مرتين في المخزن المؤقت FACS. لكل غسل ، أضافه 1 مل من العازلة FACS ، دوامه بلطف ، والطرد المركزي في 400 x g لمده 5 دقائق ، أعاده التعليق في 350 μl من المخزن المؤقت facs وأضافه dapi (1 μM ، التركيز النهائي). عينات جاهزه الآن ل FACS التحليل/الفرز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
البروتوكول الموصوف يسمح بعزل الضامة من الماوس وعضله الام البشرية. باستخدام نفس البروتوكول ، ولكن مع تلطيخ مختلفه واستراتيجية النابضة ، ويمكن أيضا ان تحصد الخلايا اللحمية من عضله الام البشرية. تم الحصول علي نتائج FACS المعروضة هنا اما علي BD لسريي أو BD FACS ARIA الثالث منصة. تم إنشاء عناصر تحكم التعويض من عينات تحكم لون واحده من خلايا الطحال الملطخة. يظهر الشكل 1 الاساسيه lvad البشرية غير المجهزة والمجهزة. ويبين الشكل 2 مخطط النابضة لفرز تدفق CCR2- وCCR2 + الضامة البشرية. يظهر الشكل 3A مخطط النابضةللخلايا CD45 من عضله العضل البشرية والشكل 3ب يظهر صورا لfacs رايت الملونة فرزهاCD45 + و CD45الخلايا . الشكل 4 يصف مخطط النابضة لفرز الضامة من قلب الماوس.
الشكل 1: جوهر الانسجه البشرية LVAD قبل وبعد المعالجة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مخطط التدفق الخلوي المتدفق المستخدم لتحديد وتوصيف السكان الضامين في القلب في العينات المتوسعة (DCM) أو اعتلال العضلة الدماغية (ICM). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مخطط التدفق الخلوي لعزل CD45- وCD45 + الخلايا اللحمية من العينات البشرية. (ا) مخطط التدفق الخلوي المستخدم لعزل الخلايا CD45اللحمية من اعتلال عضله القلب البشري (ICM) أو العينات المتوسعة لاعتلال عضله القلب (DCM). (B) رايت الملون facs فرزها CD45-وCD45 + الخلايا . قضبان المقياس = 100 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تدفق الخلوية مخطط النابضة لعزل مختلف المجموعات الفرعية الضامة من قلب الماوس. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| Antigen | فلوروفوري | استنساخ | الشركه المصنعه |
| CD45 | الانسجه 5.5 | 2D1 | Biolegend |
| CD64 | FITC | 10.1 | Biolegend |
| CD14 | Pe | M5E2 | Biolegend |
| CCR2 | APC أو BV421 | K036C2 | Biolegend |
| في الآن | APC/Cy7 | L243 | Biolegend |
| DRAQ5 | الحرارية فيشر | ||
| DAPI | الحرارية فيشر |
الجدول 1: لوحه الأجسام المضادة لعينه عضله العين البشرية.
| Antigen | فلوروفوري | استنساخ | الشركه المصنعه |
| CD45 | الانسجه 5.5 | 30-F11 | Biolegend |
| CD64 | Apc | X54-5/7.1 | Biolegend |
| Ly6G | PE/Cy7 | 1A8 | Biolegend |
| Ly6C | FITC | هونج كونج 1.4 | Biolegend |
| CCR2 | BV421 | SA203G11 | Biolegend |
| في الآن | APC/Cy7 | M5/114.15.2 | Biolegend |
| DRAQ5 | الحرارية فيشر | ||
| DAPI | الحرارية فيشر |
الجدول 2: لوحه الأجسام المضادة للعينه القلب الماوس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يسمح البروتوكول لاستخراج المجموعات الفرعية الضامة المختلفة من عضله الام البشرية. البروتوكول بسيط ويستغرق 3 إلى 4 ساعات لاعداد تعليق خليه واحده جاهزه للتحليل FACS. وعلي الرغم من ان تنفيذ البروتوكول بسيط نسبيا ، فان هناك بعض الجوانب التقنية التي يتعين النظر فيها والتي ستقلل من التغير إلى ادني حد. أولا ، العمل في الوقت المناسب مع الانسجه البشرية ضروري لبقاء الخلية الأمثل. من المهم الحفاظ علي الانسجه في المحلول الملحي البارد/HBSS للتقليل من موت الخلايا. ومن الضروري أيضا لأزاله الدهون الابيديميه والانسجه الضامة الأخرى من عينه عضله القلب. النسيج المتناسق وأوقات الهضم ستقلل من العينة لتغير العينة.
وهناك تباين داخل المقايسة وبين المقايسة في هضم الانسجه وغلات الخلايا اللاحقة. هذا هو واحد من القيود في اعداد تعليق خليه واحده من الانسجه. الطريقة الأكثر اهميه للتقليل من هذا هو عن طريق التاكد من الانزيمات هي جديده نسبيا ، ونقلت بشكل صحيح ، وتخزينها في-80 درجه مئوية. يجب استخدام aliquots مره واحده فقط وينبغي عدم حفظها أو تجميدها مره أخرى. الانزيمات المستخدمة حساسة لتجميد دورات ذوبان الجليد. ومن الاعتبارات الأخرى درجه حرارة الهضم وسرعه الاهتزاز. باستخدام شاكر التي تسيطر عليها الحرارة التي توزع بالتساوي الحرارة يساعد علي تقليل تقلب الهضم وتحسين سلامه الخلية.
من المهم ان نذكر ان الغلة المطلقة من الضامة من عضله الام البشرية عموما ليست عاليه جدا. عاده العائد الخلية يختلف من ~ 20,000 إلى 50,000 مجموع الضامة لكل 1200-1500 ملغ من الانسجه. ويصبح هذا الأمر صعبا عندما ينطوي الأسلوب المطلوب للتحليل في المصب علي اختبارات لثقافة الخلية. ويمكن بسهوله القيام بعمليات الإنتاج ، والتحفيز الخلوي ، والقياس ، وتحليلات التعبير الجيني (ميكروصفيف ، وتسلسل الحمض الخلوي الريبي السائب ، وتسلسل الخلية الواحدة). نوعيه الانسجه يحدد أيضا سهوله الهضم والغلة الخلية اللاحقة. إذا كان النسيج ليفي وندوب ، كفاءه الهضم هو دون الأمثل ، والغلة الضامة من المرجح ان تكون منخفضه جدا.
جانب آخر للنظر هو ان الهضم انسجه عضله القلب يؤدي إلى تشكيل الحطام كبيره. وهذا يسبب بيليه لتظهر فضفاضة. التالي ، يجب علي المرء ان يكون حريصا علي عدم التخلص من ماده طافي خلال غسل الخطوات عن طريق الصب بسيطه. من المستحسن استخدام قارورة شفط/فراغ جمع النفايات مع ماصه باستور لجمع ماده طافي. أيضا ، والحفاظ علي جهاز الطرد المركزي في 4 درجه مئوية سوف تساعد علي تقليل وفاه الخلية وفقدان العينة.
علي الرغم من ان هذا البروتوكول يصف طريقه لاستخراج الضامة من عينات انسجه عضله القلب البشرية, العزلة الناجحة من المجموعات الفرعية الضامة يمكن أيضا ان تتحقق من قلوب الماوس دون تغييرات كبيره أو التعديلات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم شيء للكشف عنه.
Acknowledgments
وقد تسني هذا المشروع من خلال التمويل المقدم من معهد اكتشاف الأطفال بجامعه واشنطن ومستشفي سانت لويس للأطفال (CH-II-2015-462 ، CH-II-2017-628) ، ومؤسسه بارنز-المستشفى اليهودي (8038-88) ، و NHLBI (R01 HL138466, R01 HL139714). K.J.L. معتمد من قبل المعاهد القومية للصحة K08 HL123519 و Burخشونه صندوق الترحيب (1014782).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conocal Tubes | Thermo Fisher | 14-959-53A | |
| 40 µm Cell Strainers | Thermo Fisher | 50-828-736 | |
| 50 mL Conical Tubes | Thermo Fisher | 352098 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2058 | |
| Collagenase 1 | Sigma | C0130-1G | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| DMEM 1x | Gibco | 11965-084 | |
| DNAse 1 | Sigma | D4527-20KU | |
| DRAQ5 | Thermo Fisher | 62251 | |
| EDTA 0.5 M pH 8 | Corning | 46-034-CI | |
| Enzyme Deactivating Buffer | 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA | ||
| FACS Buffer | 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4 mL EDTA (0.5 M) | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3840201 | |
| Forceps | VWR | 82027-406 | |
| HBSS 1x | Gibco | 14175-079 | |
| Hemostats | VWR | 63042-052 | |
| Hyaluronidase type 1-s | Sigma | H3506-500MG | |
| PBS 1x | Gibco | 14190-136 | |
| Petri dishes | Thermo Fisher | 172931 | |
| Razor Blade | VWR | 55411-050 | |
| Scissors | VWR | 82027-578 |
References
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Hulsmans, M., et al. Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction. Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).
- Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Dick, S. A., et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction. Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
