Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Erhålla Cancer Stem Cell Spheres från gynekologiska och bröstcancertumörer

Published: March 1, 2020 doi: 10.3791/60022
Automatic Translation
*1,2,3,4, *1,2,3,4,5,6, 1,2,3, 2,7, 1,2,3,4,8, 9, 3,9,10, 1,2,3,4,8
1Institute of Biophysics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 2Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR), area of Environment Genetics and Oncobiology (CIMAGO), Faculty of Medicine, University of Coimbra, 3CNC.IBILI/Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, 4Clinical Academic Center of Coimbra (CACC), 5Universitary Clinic of Gynecology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 6Gynecology A Service, Coimbra Hospital and Universitary Center, 7Institute of Pharmacology & Experimental Therapeutics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 8Institute of Experimental Pathology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 9Cytometry Operational Management Unit, Clinical Pathology Service, Coimbra Hospital and Universitary Center, 10Polytechnic Institute of Coimbra, ESTESC-Coimbra Health School, Laboratory Biomedical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Syftet med denna metod är att identifiera cancerceller (CSC) i cancer cellinjer och primära mänskliga tumör prover med sfärbildande protokollet, på ett robust sätt, med hjälp av funktionella analyser och fenotypiska karakterisering med flöde cytometri och västra Blot.

Abstract

Cancerceller (CSC) är en liten population med självförnyelse och plasticitet som är ansvariga för tumorigenesis, resistens mot behandling och återkommande sjukdom. Denna population kan identifieras med ytmarkörer, enzymatisk aktivitet och en funktionell profil. Dessa metoder i sig är begränsade, på grund av fenotypisk heterogenitet och CSC plasticitet. Här uppdaterar vi sfärbildande protokollet för att få CSC sfärer från bröst- och gynekologiska cancerformer, bedömer funktionella egenskaper, CSC-markörer och proteinuttryck. Sfärerna erhålls med encellig sådd vid låg täthet i suspensionskulturen, med hjälp av ett halvfast metylcellulosamedium för att undvika migration och aggregat. Detta lönsamma protokoll kan användas i cancer cellinjer men också i primära tumörer. Den tredimensionella icke-anhängare suspension kultur trodde att efterlikna tumör mikromiljö, särskilt CSC-nisch, kompletteras med epidermal tillväxtfaktor och grundläggande fibroblast tillväxtfaktor för att säkerställa CSC signalering. Som syftar till en robust identifiering av CSC föreslår vi ett kompletterande tillvägagångssätt som kombinerar funktionell och fenotypisk utvärdering. Sfärformande kapacitet, självförnyelse och sfärprojektionsområde etablerar CSC funktionella egenskaper. Dessutom består karakterisering en flödescytometri utvärdering av markörer, representerad av CD44+/CD24- och CD133, och västra blot, med tanke på ALDH. Det presenterade protokollet var också optimerat för primära tumörprover, efter ett prov matsmältningsförfarande, användbart för translationell forskning.

Introduction

Cancerceller är heterogena, med celler som presenterar olika morfosologier, spridning och invasion kapacitet, på grund av differentiella genuttryck. Bland dessa celler finns en minoritetspopulation som heter cancerceller (CSC)1, som har kapacitet för självförnyelse, rekapitulation heterogenitet en primär tumör nisch och producerar avvikande differentierande förfäder som inte svarar tillräckligt på homeostatiska kontroller2. CSC egenskaper kan översättas direkt i klinisk praxis, med tanke på sambandet med händelser, såsom tumorigenicity eller resistens mot kemoterapi3. Identifiering av CSC kan leda till utveckling av riktade terapier som kan omfatta blockering av ytmarkörer, främjande av CSC-differentiering, blockering av CSC-signaleringsvägkomponenter, nischförstörelse och epigenetiska mekanismer4.

Isoleringen av CSC har utförts i celler linjer och i prover av primära tumörer5,6,7,8. Den funktionella profil som beskrivs för CSC inkluderar clonogen kapacitet, sida befolkning och tumorosphere bildning9. CD44hög/ CD24låg fenotyp har konsekvent förknippats med bröst CSC, som har visat sig vara tumorigenic in vivo och har redan förknippats med epitel till mesenchymal övergång5,10. Hög ALDH aktivitet har också associerats med stemness och epitel till mesenchymal övergång (EMT) i flera typer av fasta tumörer11. ALDH uttryck har associerats med resistens mot kemoterapi och CSC fenotyp in vitro12,13,14,15,16. Flera andra markörer har kopplats till CSC egenskaper i olika typer av tumörer, såsom CD133, CD49f, ITGA6, CD1663,4 och andra, som beskrivs i tabell 1.

Tumorspheresna består av en tredimensionell modellerar för studien och utvidgningen av CSC. I denna modell odlas cellsuspensionerna från cellinjer och från blod- eller tumörprover i ett medium kompletterat med tillväxtfaktorer, nämligen epidermala tillväxtfaktor (EGF) och grundläggande fibroblasttillväxtfaktor (bFGF), utan fetalt bovinserum och i icke-anhängarevillkor 17. Hämning av cellviddhesion resulterar i död av anoikis av differentierade celler18. Sfärer kommer från klonaltillväxt av en isolerad cell. För detta ändamål distribueras cellerna med låg densitet för att undvika cellfusion och aggregering19. En annan strategi omfattar användning av halvsolid metylcellulosa20.

Det sfärbildande protokollet blev populärt i CSC-isolering och expansion, på grund av tid och kostnad och tekniska, lönsamma och reproducerbara skäl21,22. Trots vissa reserver om vars omfattning sfärbildning återspeglar CSC, finns det en benägenhet stamceller att växa i icke-anhängare villkor med den karakteristiska fenotyp, som liknar den inhemska mikromiljön21. Ingen av de metoder som finns för isolering av CSC från fasta tumörer har fullständig effektivitet, belyser vikten av att utveckla mer specifika markörer eller kombinationer av metoder och markörer.

I detta protokoll beskriver vi isoleringen av CSC med sfärbildande protokollet, med principen om encellig tillväxt under icke-anhängare förhållanden och förmåga att producera en differentierad fenotyp. En schematisk representation av detta förfarande representeras i figur 1. Vi beskriver också karakterisering med ytmarkörer och ALDH uttryck för CSC, både för bröst och gynekologiska tumörceller linjer och prover av primära tumörer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta protokoll utfördes i enlighet med de etiska riktlinjerna för Coimbra Hospital och Universitary Center (CHUC) Tumor Bank, och godkändes av CHUC: s etikkommitté för hälsa och av den portugisiska nationella dataskyddskommissionen.

1. Sfärbildande protokoll och härledda anhängare från kontinuerliga cellkulturer

OBS: Utför alla procedurer under strikta sterila förhållanden.

  1. Beredning av icke-anhängare suspension kultur flaskor eller plattor genom beläggning tillväxtytan med poly (2-hydroxyethyl-metakrylat (poly-HEMA)
    1. Förbered en lösning på 15 mg/ml genom att röra om poly-HEMA i absolut etanol vid 65 °C. Coat cell odlingsflaskor eller plattor med 50 μL/cm2.
    2. Låt torka vid 37 °C i en torkugn. Om det behövs, linda plattorna och förvara i rumstemperatur.
  2. Beredning av sfärodlingsmedier (SCM)
    1. Förbered en 2% lösning av metylcellulosa i ultraren vatten och sterilisera i autoklaven. Metylcellulosa tenderar att vara lättare att slubilisera genom kylning; förskingra därför pulvret i vatten vid 80 °C och rör om tills kylt23.
    2. Förbered en tvåfaldig koncentrerad lösning av SCM (lagerlösning). SCM arbetslösning innehåller DMEM-F12, kompletterad med 100 mM putrescine, 1% insulin, transferrin, selen och 1% antibiotika-antimykotisk lösning (10,000 U/mL penicillin, 10 mg/mL streptomycin och 25 μg/mL amphotericin B).
    3. För att förbereda SCM, blanda lika stora volymer av SCM lagerlösning med 2% lösning av metylcellulosa.
    4. Fyll i mediet omedelbart före användning genom att lägga till 10 ng/ml epidermal tillväxtfaktor (EFG) och 10 ng/ml grundläggande fibroblast tillväxtfaktor (bFGF).
    5. Om mer kräsna cellinjer används, komplettera mediet med 0,4% bovin serum albumin, vilket kan vara en fördel.
  3. Börja med en kolv av MCF7 eller HCC1806 bröstcancer eller ECC-1 eller RL95-2 livmodercancer cancerceller (eller annan cancer cel linje val) med 80% till 90% sammanflödet.
  4. Kassera cellodlingsmediet, tvätta med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och lossa cellerna med trypsin-EDTA (1 till 2 ml för en 75 cm2 cellodlingskolv).
  5. Tillsätt cellodlingsmedier (2 till 4 ml för en 15 cmlång cellodlingskolv) och centrifugera vid 200 x g i 5 min för att kassera enzymer.
  6. Häng upp pelleten i en känd volym cellkulturmedia och pipett upp och ner för att säkerställa en enda cellfjädring. För detta ändamål kan en 40 μm cell sil användas.
  7. Räkna cellerna i hemocytometern och beräkna cellkoncentrationen av cellsuspensionen. Dra nytta av detta steg för att säkerställa observation av en enda cellsuspension. Noggrann cellräkning är viktigt att exakt kvantifiera effekterna av behandlingar.
  8. Häng upp den fastställda mängden cellfjädring i SCM komplett medium och överför till poly-HEMA-belagda rätter. Som referensvärde för sådddensitet, överväga 500 till 2000 celler/cm2.
    Obs: Optimering av sådd densitet och tid för kultur för varje cellinje rekommenderas starkt24.
  9. Inkubera vid 37 °C och 5 % CO2 i 2 dagar utan att störa plattorna.
  10. Återupprätta koncentrationen av tillväxtfaktorer genom att lägga till 10 ng/ml EFG och 10 ng/mL bFGF till cellkulturmedierna. Upprepa det här steget varannan dag.
  11. Inkubera vid 37 °C och 5% CO2 fram till 5 dagar efter plätering (detta kan variera från 3 till 12 dagar enligt cellinjen) för att få sfärer, som presenterar morfologi suspensionbollformade cellkolonier.
  12. Använd eller samla in sfärerna, genom pipetting, för experimenten.
  13. För att erhålla härledda anhängare populationer, placera sfärerna i standardodlingsförhållanden, respektive av den celllinje som används. 1 till 2 dagar senare är det möjligt att observera ett monolayer av celler som växer runt anhängare sfärer, som presenterar en morfologi som liknar cellinjen av ursprung.

2. Sfärbildande protokoll från humana tumörprover

OBS: Användningen av mänskliga prover för forskningsändamål måste följa varje lands lagstiftning och godkännas av etikkommittén för de berörda institutionerna.

  1. Förbered transportmediet som innehåller DMEM/F12, kompletterat med 10% fetalt bovinserum (FBS) och 2% antibiotikaantimykotisk lösning (10 000 U/mL penicillin, 10 mg/mL streptomycin och 25 μg/mL amphotericin B).
  2. Förbered matsmältningsmediet som innehåller DMEM/F12, kompletterat med 10% FBS, 1% antibiotikaantimykotisk lösning, 1 mg/ml typ IV kollagen och 100 μg/ml DNAse I.
  3. Förbered enzyminaktiveringsmedia som innehåller DMEM/F12, kompletterat med 10% FBS och 1% antibiotikaantimykotisk lösning (10 000 U/mL penicillin, 10 mg/mL streptomycin och 25 μg/mL amphotericin B).
  4. Förbered SCM enligt beskrivningen i avsnitt 1.2.
  5. Få provet under makroskopiska studien av det operativa verket så snart som möjligt efter kirurgiskt avlägsnande.
  6. Placera proverna i transportmedia och överför dem till laboratoriet för var bearbetningen. Provbehandling bör påbörjas inom 1 h efter insamling för att förbättra framgången för förfarandet. Var försiktig i provinsamlingen. Hantera proverna noggrant. Undvik användning av nekrotiska eller kauterade zoner.
  7. Under den sterila flödeskammaren överför du provet till en maträtt och skär i mindre bitar (ca 1 mm3)med en skalpell.
  8. Inkubera den mänskliga vävnaden i ett rör med matsmältningsmedier i en roterande shaker upp till 180 min, vid 37 °C. Identifiera röret som rör A.
  9. Byt ut enzymlösningen var 15:e minut.
    1. Samla matsmältningsmediet (utan att ta bort några vävnadsfragment) och överför det genom en 40 μm cellsil till ett nytt rör halvfyllt med enzyminaktiveringsmedia. Håll detta rör i rumstemperatur och identifiera det som rör B.
    2. Tillsätt nya matsmältningsmedier i rör A och returnera det till den roterande skakapparaten vid 37 °C.
    3. Kontrollera celllönsamheten vid varje samling med hjälp av trypanblå undantagsmetoden.
    4. Upprepa proceduren i 180 min eller tills antalet celler är betydligt lägre.
  10. Inkubera vävnadsfragmenten i rör A i en andra matsmältningslösning som innehåller lika delar av accutase och trypsin-EDTA under omrörning i 10 min vid 37 °C.
  11. Tillsätt enzyminaktiveringsmediet i rör A och filtrera innehållet genom en 40 μm cellsil i rör B.
  12. Centrifugera cellsuspensionen i rör B vid 200 x g i 10 min.
  13. Häng upp pelleten i SCM och kontrollera cellkoncentrationen med hjälp av en hemocytometer.
  14. Häng upp den fastställda mängden cellfjädring i SCM och överför till poly-HEMA-belagda rätter (se steg 1.1) med en såddtäthet på 4000 celler/cm2.
  15. Inkubera vid 37 °C och 5 % CO2 i 2 dagar utan att störa plattorna.
  16. Återupprätta koncentrationen av tillväxtfaktorer genom att lägga till 10 ng/ml EFG och 10 ng/mL bFGF till cellkulturmedierna.
    OBS: Du måste göra detta varannan dag.
  17. Inkubera vid 37 °C och 5% CO2 fram till 5 dagar efter plätering (detta kan variera upp till 12 dagar) för att få sfärer, som presenterar morfologi av fjädring bollformade cellkolonier.

Figure 1
Figur 1: Erhålla cancerceller stamceller från mänskliga livmodercancer tumör prover (A) och bröst och gynekologisk cancer cellinjer (B). Mänskliga tumörprover är fragmenterade, enzymatiskt smälta och pläterade i sfärodlingsmedel i poly-HEMA-belagda rätter. Cancercellinjer är fristående, cellsuspensioner räknas och enstaka celler fördelas vid låg densitet i poly-HEMA-belagda plattor under lämpliga förhållanden. De områden som erhålls, när de placeras under anhängare kulturförhållanden, producerar härledda anhängare populationer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

3. Sfärbildande kapacitet, självförnyelse och sfärprojektionsområde

OBS: Sfärbildande kapacitet är förmågan hos en tumörcellpopulation att producera sfärer. Självförnyelse är sfärcellernas förmåga att producera nya kolonier av sfäriska celler i suspension. Sfärprojektionsområdet är representativt för det område som upptas av sfären och uttrycks i deras storlek och antalet celluppdelningar som har genomgåtts under en viss tidsperiod.

  1. Bestämma sfärformanskapaciteten
    1. Efter avslutad sfärbildande protokoll, samla in sfärerna i ett centrifugrör och centrifugera vid 125 x g i 5 min.
    2. Kassera SCM och häng försiktigt fast pelleten i en känd volym av färskt medium. I syfte att koncentrera sfärerna för att underlätta inventeringen, häng upp sfärerna i en liten medievolym. Var noga med att inte störa sfärerna.
    3. Använd en hemocytometer för att räkna sfärerna med mer än 40 μm i diameter. Alternativt kan sfärer räknas direkt på plattan med hjälp av ett mikroskop utrustat med en graticule25 eller med hjälp av ett automatiserat system26,27.
    4. Beräkna procentförhållandet för de områden som erhållits kontra antalet celler som ursprungligen pläterades.
  2. Bestämma självförnyelse
    1. Efter avslutad sfärbildande protokoll, samla in sfärerna i ett centrifugrör och centrifugera vid 125 x g i 5 min.
    2. Kasta sfären sprutande medier och försiktigt avbryta pelleten i trypsin-EDTA.
    3. Inkubera upp till 5 min vid 37 °C.
    4. Tillsätt enzym inaktiveringsmedia och pipett upp och ner för att säkerställa en enda cellsuspension.
    5. Med hjälp av en hemocytometer och trypan blå uteslutningsmetod, räkna de livskraftiga cellerna i suspensionen.
    6. Initiera sfärbildande protokollet enligt beskrivningen i avsnitt 1.
    7. Efter 8 dagar, använd en hemocytometer för att räkna sfärerna med mer än 40 μm i diameter.
    8. Beräkna procentförhållandet för de områden som erhållits kontra antalet celler som ursprungligen pläterades.
  3. Bestämma sfärprojektionsområdet
    1. För att utvärdera det område som upptas av sfärerna, få bilder av minst 10 slumpmässiga fält per villkor, i ett inverterat mikroskop utrustat med en bildförvärvsmodul. En förstoring av 100X till 400X rekommenderas.
    2. Analysera bilder med hjälp av bildåtergivningsprogram, såsom ImageJ-programvara28, genom att rita intresseområden som motsvarar sfärerna och mäta dess område i pixlar.
    3. Beräkna sfärprojektionsområdet som medelområdet för uppmätta pixlar.

4. Cancer Stem Cell Markör Bedömning med Flow Cytometry

OBS: CD44+/CD24-/låg fenotyp var konsekvent förknippad med bröst och gynekologisk cancer stamceller. Den beskrivna proceduren kan användas för att utvärdera detta och andra cellytmarkörer.

  1. Efter avslutad sfärbildande protokoll, samla in sfärerna i ett centrifugrör och centrifugera vid 125 x g i 5 min.
  2. Kassera SCM och dra försiktigt in pelleten i trypsin-EDTA.
  3. Inkubera upp till 5 min vid 37 °C.
  4. Tillsätt enzym inaktiveringsmedia och pipett upp och ner för att säkerställa en enda cellsuspension.
  5. Centrifugera vid 125 x g i 5 min, kasta överhavet och försiktigt hänga cellerna i PBS.
  6. Låt cellerna vila i suspension i 30 min för att säkerställa återhämtning av membrankonformationen.
  7. Räkna cellerna i suspensionen med hjälp av en hemocytometer och trypanblå undantagsmetod.
  8. Justera cellsuspensionsvolymen till 106 celler/500 μL.
  9. Inkubera med monoklonala antikroppar enligt leverantörernas anvisningar (koncentration, tid, temperatur och ljus/mörker) och med tanke på experimentuppsättningen som representeras i tabell 2 eller markörerna i tabell 1.
  10. Omedelbart efter färgning, utför flödet cytometrisk analys med hjälp av ett flöde cytometer med lämpliga detektionsmoduler.
  11. Standardisera cytometerinställning, enligt protokoll som fastställts av EuroFlow Consortium29.
  12. Ställ in primära grindar baserat på den främre och sidospridning utom skräp och döda celler. Detta kan förbättras genom samtidig märkning med annexin V och gating negativa celler.
  13. Ställ fluorescensgrindar baserat på ofärgade prover och kompensation för en spektral överlappning med hjälp av enkelfärgade kontroller.

5. Cancer Stem Cell Markör Bedömning med västra Blot

OBS: Förutom ALDH1 aktivitet, hög uttryck för denna markör var konsekvent förknippas med bröst och gynekologiska cancerceller stamceller13,14. Den beskrivna proceduren kan användas för att utvärdera den här och andra cellmarkörerna.

  1. Efter avslutad sfärbildande protokoll, samla in sfärerna i ett centrifugrör och centrifugera vid 125 x g i 5 min.
  2. Beredning av hela cellen lysater
    1. Placera centrifugrören på isen och kassera supernatanten utan att störa pelleten.
    2. Tvätta pelleten med 1 ml kall PBS och kassera genom centrifugering.
    3. Häng pelleten i en liten volym (200-500 μL) ripa lysbuffert30 (NaCl 150 mM, Tris-HCl 1,50 mM pH 7,4, Triton-X100 1% vol./vol., natriumdeoxycholic syra 0,5% wt./vol., natrium dodecyl sulfat 0,5% wt./vol.) kompletteras med cOmplete Mini och dithiothreitol 1 mM.
    4. Underhålla proverna kallt (på is), skicka dem till virvel och ultraljud med en 30% amplitud.
    5. Centrifugera proverna i 15 min vid 14 000 x g i en kyld centrifug som är inställd på 4 °C.
    6. Överför supernatanterna till nya, korrekt identifierade mikrorör.
    7. Bestäm proteinkoncentrationerna med hjälp av BCA- eller Bradford-assays31.
    8. Om det behövs, förvara proverna på -80 °C tills vidare västra blot analys.
  3. Utför provdenaturering, elektrofores, elektronöverföring och proteindetektering enligt vanliga västerländska blotting protokoll, enligt beskrivningen32,33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det sfärbildande protokollet gör det möjligt att erhålla sfäriska kolonier i suspension från flera livmodercancer och bröstcancercellinjer (figur 2A) eller efter mild enzymatisk matsmältning av vävnad från humana tumörprover (figur 2E). I båda fallen, några dagar efter plätering, monoklonala sfäriska kolonier i suspension erhålls. Både endometrie- och bröstcancersfärer ger upphov till en cellmonolayer med liknande morfologi till cellinjen av ursprung, 1 till 2 dagar efter plätering(figur 2A).

Distinkta härstamnings- och vävnadsursprung kan jämföras med sfärformande kapacitet, självförnyelse och projektionsområde. Representativa resultat från bröstcancer cellinjer kan observeras i diagrammen i figur 2B-D. Den hormonella receptor-positiva bröstcancer MCF7 celler visar högre sfärbildande kapacitet, självförnyelse och projektion område än trippel negativa bröstcancerceller HCC180614. För båda cellinjerna har en liten andel av de celler som pärpmerats (mindre än 3 %) kunde producera sfärer betonar cancerceller som en minoritetspopulation inom tumörcellheterogenitet. Cancerceller självförnyelse patenterades av ett betydligt annorlunda värde av sfären självförnyelse av cellinjerna representerade. Sfärprojektionsområde, som ett grovt mått på sfärernas dimension, korrelerar med antalet mitotiska cykler och visar olika tidsintervall för båda härstamningar.

Medan endast en liten andel av cellerna kan bilda tumorspheres in vitro och behålla självförnyelse kapacitet som transporterar stamceller egenskaper, flera markörer var associerade med denna fenotyp.

Flödet cytometri protokoll presenteras möjliggör mångsidiga experimentella metoder, med tanke på ytantigener (se tabell 1). Representativa resultat, som visas i figur 3A-B, gäller CD44/CD24 och CD133 membran markörer som har föreslagits som motsvarar en mer cancer stamceller-liknande fenotyp. Analys av sfärer som erhållits från livmodercancer RL95-2 och ECC-1 cellinjer gjorde det möjligt att identifiera fyra populationer(figur 3A). Sfärer som erhållits från livmodercancer RL95-2 bestod av en CD44hög/ CD24- befolkning tre gånger större än föräldrarnas cellinje35. När det gäller ECC-1 sfärer motsvarar CD44high/CD24- den största populationen, som också är CD133 positiv, medan CD44låg/CD24-CD44låg/CD24+ och CD44-/CD24+ har negativa eller låga CD133-uttryck.

Bedömning av yt- och intracellulära markörer kan också utföras av västra blot efter skonsam sfärskörd och noggrann proteinprovberedning. Figur 3C visar typiska resultat av ALDH förändring, en markör vars ökade aktivitet eller förstärkt protein uttryck är associerad med cancer stamceller fenotyp13,14 på sfärer och härledda anhängare celler om livmodercancer ECC1 cell en smitta ursprung.

Figure 2
Figur 2: Endometrial och bröstcancerceller, sfärer och härledda anhängare populationer. A) . Representativa bilder av endometrie (RL95-2 och ECC-1) och bröst (MCF7 och HCC1806) cancercellinjer, respektive livmodercancer (ES1) och bröstsfärer (MS1) och härledda anhängare (G1). Representativa bilder av RL95-2, ECC-1, MCF7 och HCC1806 cancercellinjer erhölls vid en förstoring av 200x (Skala bar = 50 μm). Representativa bilder av ES1 RL95-2 och ES1 ECC-1 erhölls vid en förstoring av 200x (Skala bar = 50 μm). Representativa bilder av MS1 MCF7 och MS1 HCC1806 erhölls vid en förstoring av 200x (Scale bar = 100 μm). Representativa bilder av G1 RL95-2 och G1 ECC-1 erhölls vid en förstoring av 200x (Skala bar = 50 μm). Representativa bilder av G1 MCF7 och G1 HCC1806 erhölls vid en förstoring av 200x (Skala bar = 100 μm). (B-D) . Sfärbildande kapacitet, självförnyelse och sfärprojektionsområde av bröstcancersfärer MCF7 och HCC1806. (E) . Representativa bilder av sfärer som erhållits från mänskliga livmodercancer tumör prover. Dessa bilder togs vid en förstoring av 200x (Skala bar = 50 μm). En del av det här problemet har ändrats från en tidigare publikation med tillstånd från utgivaren14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Kombinerad utvärdering av cancerceller markörer i livmodercancer cancerceller. A) . Representativa tomter cd44/CD24-märkning av RL95-2-cellinjen och av RL95-2-sfärcellerna. B) . Representativa histogram cd133-märkning av sfärceller (ES1) som erhållits från RL95-2- och ECC-1-cellinjer. Densitet representerar ett mått på antalet celler. CD44+/CD24-, CD44låg/CD24-, CD44låg/CD24± och CD44-/CD24+ populationer är målade i grönt, rosa, blått och gult, respektive. C. ALDH-uttryck i ECC-1-cellinje, sfärer (ES1) och härledd anhängare (G1). Immunoblot representerar ALDH och actin uttryck för respektive experimentella villkor. ALDH-uttrycket utvärderades med antikroppen ALDH1/2, som upptäcker isoforms ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3 och ALDH2 av mus, råtta och mänskligt ursprung. En del av denna siffra har ändrats från tidigare publikationer med tillstånd från förlagen13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: Lista över gynekologiska och bröstcancerstamceller markörer.

Markör Ursprung i stamceller Referenser
CD24 Äggstockscancer 60
CD29 Bröstcancer 61
CD44 Äggstockscancer 62,63
CD44/CD24-/låg Bröstcancer 13,5,3,64
CD44+/CD24-/låg/ESA Bröstcancer 65
CD44/ALDH1+/hi Bröstcancer 66
CD44/CD24-/låg/ABCG2 Bröstcancer 67
CD44/CD24-/låg/ALDH1 Bröstcancer 43,68,69
CD44/CD24-/låg/EpCAM Bröstcancer 5
CD44/CD24-/låg/SSEA-3 Bröstcancer 70
CD44/CD49f/CD133/2 Bröstcancer 71
CD44/CD133/ALDH1+/hi Bröstcancer 69
CD44/CD117 Äggstockscancer 7
CD44/MyD88 Äggstockscancer 72,73
CD44/E-cadherin-/CD34- Äggstockscancer 74,75
CD44/CD24/Epcam Äggstockscancer 76,77
CD44/CD24- Äggstockscancer 78,79
CD44/CD166 Äggstockscancer 80
CD44/CD24 Livmoderhalscancer 81
CD49f (cd49f) Bröstcancer 4
Livmoderhalscancer 82
CD117 eller c-Kit Livmodercancer cancer 83
Äggstockscancer 62,84
CD133 Bröstcancer 4,85
Äggstockscancer 62,86
Livmodercancer cancer 13,87,88,89
Livmoderhalscancer 82
CD133hej/ CXCR4hej/ ALDH1hej Bröstcancer 90
CD133/ALDH1 Bröstcancer 91
Äggstockscancer 60,92
CD133/CXCR4 Livmodercancer cancer 93
ABCG2 Bröstcancer 65
Livmoderhalscancer 82,81
ALDH-1 Bröstcancer 4
Livmodercancer cancer 94,95
Livmoderhalscancer 82
CXCR4 eller CD184 Bröstcancer 96
EpCAM/CD49f Bröstcancer 97
EpCAMhi/PROCRhi/SSEA-3 Bröstcancer 70
GD2/GD3/GD3Shej Bröstcancer 98
ITGA6 Bröstcancer 4
PROCR Bröstcancer 43

OBS: Denna tabell ger en lista över ytan epitoper uttryckt aekologiska och bröstcancer stamceller; de flesta av dessa markörer uttrycks också av en rad andra vävnader. Den här listan syftar inte till att inkludera alla markörer som rapporteras.

Tabell 2: Lista över rör som ska ingå i ett typiskt experiment med flödescytometri för att utvärdera CD24/CD44 fenotyp. Tabellen visar en minimal uppsättning provrör som krävs för ett samfärgningsexperiment, inklusive nödvändiga kontroller.

Tube Villkor Antigen-fluoroffor
1 Ofärgade celler Ingen
2 Enkel färgade CD44 CD44-PE
3 Enkel färgade CD24 CD24-APC
4 Dubbelfärgade CD44/CD24 CD44-PE och CD24-APC

OBS: Detta experiment kan utföras lägga annexi V-FICT till röret 4 och lägga till respektive kontrollrör för att utfärda annexeni V negativa celler och utesluta eventuella celler i apoptos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll detaljer en metod för att få tumorspheres från cancer cellinjer och primära mänskliga prover. Tumorspheres berikas i en sub-population med stamceller-liknande egenskaper36. Denna berikning i CSC är beroende av lönsamhet i en förankringsfri miljö medan differentierade celler är beroende av vidhäftning till ett substrat37. Som primär plätering av tumörceller i en låg följsamhet miljö som inför suspension säkerställer inte anrikning i CSC i sig, vi tillhandahåller strategier för att utvärdera självförnyelse (sfär-formning kapacitet och självförnyelse), differentiering kapacitet (härledda anhängare populationer), och fenotyp av CSC (med flöde cytometri och / eller västra blot). Cancerceller kan identifieras via flera brett beskrivna fenotypiska markörer (se tabell 1).

Som mänskliga tumör primära kulturer är ofta utmanande att etablera och att upprätthålla i kulturen, kan sfärbildande protokollet ge ett verktyg för att hantera dessa prover. Den enzymatiska matsmältningen förfarandet föreslog förutsatt encelliga suspensioner från livmodercancer vävnadprover38. Det sfärbildande protokollet ger ett betydande antal CSC, som är svåra att få på annat sätt. Den tredimensionella modellen kan vara mer effektiv på att härma in vivo situationen, nämligen den fysiologiska mikromiljö och tumör heterogenitet, än konventionella monolayer cellkulturer.

Säkerheten om tumorspheres monoklonala ursprung är ett kritiskt steg i detta protokoll. Minimera aggregering, som tenderar att förekomma i suspension kulturer, och en grundlig optimering av sådd tätheter att distribuera encelliga suspensioner är avgörande24. Andra författare föreslog plätering av en enda cell per brunn39,40. För att undvika detta mödosamma förfarande, övervann vi denna fråga genom att säkerställa en enda cell suspension är pläterad i låg densitet i en metylcellulosa-berikad medium. På grund av dess vattenhållning och viskositet förbättra egenskaper23,metylcellulosa ger ett halvfast medium som undviker migration och aggregering, säkerställa monoklonalitet av de områden som erhållits21. Antalet dagar i kulturen är en annan aspekt som är beroende av optimering, eftersom antalet dagar som krävs för att få sfärer med diametrar som är överlägsna 40 μm är beroende av varje celltyp fördubbling tid24. Det låga eller serumfria mediet är en annan egenskap hos protokollet, eftersom FBS-innehållande medium är relevant för differentierad celltillväxt under vidhäftande förhållanden41, som i föräldracellinjerna och i de härledda anföljande cellerna. Protokollet beror på upprätthållandet av en stadig koncentration av de specifika tillväxtfaktorerna. EGF signalering spelar en viktig roll i upprätthållandet av pluripotens vägar medan bFGF fungerar som en mitogen bidrar till generering av sfärer42,43.

Det sfärbildande protokollet, som är associerat med lämpliga tekniker, ger möjlighet att expandera, isolera och utvärdera specifika populationer av CSC21. Flera författare har pekat på dess nytta vid bedömningen stamceller genuttryck44,45,46,47 och stamceller i tumörer47,48, att studera epitelial-mesenchymal övergång44,49 och tumorigenesis45,48, för att utvärdera effekten av nya terapier21,50 och läkemedelsresistens44, 51,och att etablera kulturer från primära prover21,45,46. Det är dock viktigt att komma ihåg att det är ett känsligt experiment, som är starkt beroende av lämpliga kulturförhållanden. Dessutom de områden som presenterar cellulär heterogenitet på grund av CSC asymmetrisk division52 och representerar inte en bra modell av komplexiteten i cancer stamcellsbildning och underhåll i in vivo nisch46.

Förutom sfärbildande protokollet har andra funktionella analyser använts för att upptäcka CSC. In vivo tumorigenicity innebär inokulering av låga cellnummer i immunkomprometterade möss för att få tumörer36,53. Detta beror på tillgången till lämpliga förhållanden för att utföra djurstudier, och på grund av den icke-artspecifika mikromiljön kan återhämtningen av levande celler vara en utmaning. En koloni bildar enhet analys, utvärdera cell förmåga att generera kolonier efter att de är pläterade vid låg densitet52, ger låga cellnummer. Side-population enär förlitar sig på fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) för att isolera en grupp celler med möjlighet att extrudering Hoescht 33342 fläcken. Denna känsliga metod bygger på uttryck för ATP bindande kassettprotein (ABC) transportörer, ansvarig för läkemedel efflux54. Ändå är sidopopulationen förknippad med vissa nackdelar, nämligen icke-specificitet för vissa fenotyper av CSC och färgämnets egenskaper, som är giftigt och till stor del påverkat av experimentella förhållanden (temperatur, koncentration)54,55. ALDEFLUOR är ett annat flöde cytometri-baserad analys för identifiering av celler med intracellulära ALDH aktivitet. Den viktigaste frågan är bristen på reproducerbarhet mellan studier som verkar vara starkt påverkade av kulturförhållandena54.

Det sfärbildande protokollet kombineras ofta med fenotypisk analys, som vi föreslog här, betonar nyttan av kompletterande metoder för att identifiera CSC13,14. Vi rekommenderade CSC anrikning via sfärbildande protokollet och ytterligare bekräftelse av stamhet via bedömning av biokemiska markörer genom flöde cytometri och västra blot. Flödescytometristudier identifierade heterogena populationer inom sfärerna. I själva verket finns det en berikning i CSC i de studier som visas, representeras i detta protokoll av CD44höga/ CD24låga celler. På grund av CSC asymmetrisk självförnyelse24,andra cell fenotyper identifierades också. När det gäller CD133 visade representativa resultat att befolkningen med högre stamhet var positiv när det gäller Cel-Cel-cellinjen, men negativ i RL95-2-sfärerna. Detta pekar på bristen på specificitet hos vissa CSC markörer som beskrivs, som inte är unika för dessa celler och kan variera med plasticitet av fenotyp, och vikten av att använda en kombination av strategier för att bekräfta stemness.

Western blot är en alternativ metod som kan vara användbar i vissa fall. Till exempel, medan ALDH aktivitet används i stor utsträckning, är det nu känt att flera isoformer bidrar till ALDEFLUOR metabolisering54. Således kan specifika antigen-antikroppar metoder vara mer tillförlitliga och vi redan visade sambandet mellan ALDH proteinuttryck och stemness13,14.

Sfärbildande kapacitet, självförnyelse och härledda anhängare representerar CSC:s förmåga att på obestämd tid dela upp och producera en differentierad avkomma, som kliniskt översätts till händelser som återfall, metastisering och resistens mot behandling9. Läkemedelsresistens i CSC kan förklaras av överuttryck av multidrug resistens (MDR) membran proteiner, ALDH uttryck som deltar i avgiftning mekanismer, DNA reparation mekanismer, skydd mot reaktiva syrearter och motståndskraft mot apoptos56. CSC har kapacitet att vara quiescent på grund av sin plasticitet och detta har framträtt som en mekanism för läkemedelsresistens. Denna population kan skonas från cellgifter- och strålbehandling på grund av cell-cykel arresterade differentierade celler57. Sfärer är en tumörpopulation med rapporterad resistens mot cytostatiska läkemedel som används vid konventionell behandling och har också varit ett fokus för kombination med riktade terapier54,58,59. Känsligheten hos sfärer kan testas för cytostatika som används i bröstcancer och livmodercancer. Dessutom kan isoleringen av CSC från ett tumörprov vara en plattform för klinisk tillämpning av terapi som är specifik för varje tumör, förutsäga resistens och därav följande återkommande sjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna studie finansierades av det portugisiska gynekologisällskapet genom forskningspriset 2016 och cimago. Cnc. IBILI stöds genom Stiftelsen för vetenskap och teknik, Portugal (UID/NEU/04539/2013), och samfinansieras av FEDER-COMPETE (POCI-01-0145-FEDER-007440). Coimbra Hospital och Universitary Center (CHUC) Tumor Bank, godkänd av CHUC: s etikkommitté för hälsa och av den portugisiska nationella dataskyddskommissionen, var källan till livmodercancer prover av patienter som följdes vid institutionens gynekologi service. Figur 1 producerades med Servier Medical Art, tillgänglig från www.servier.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 100983
Accutase Gibco A1110501 StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent
ALDH antibody Santa Cruz Biotechnology SC166362
Annexin V FITC BD Biosciences 556547
Antibiotic antimycotic solution Sigma A5955
BCA assay Thermo Scientific 23225 Pierce BCA Protein Assay Kit
Bovine serum albumin Sigma A9418
CD133 antibody Miteny Biotec 293C3-APC Allophycocyanin (APC)
CD24 antibody BD Biosciences 658331 Allophycocyanin-H7 (APC-H7)
CD44 antibody Biolegend 103020 Pacific Blue (PB)
Cell strainer BD Falcon 352340 40 µM
Collagenase, type IV Gibco 17104-019
cOmplete Mini Roche 118 361 700 0
Dithiothreitol Sigma 43815
DMEM-F12 Sigma D8900
DNAse I Roche 11284932001
ECC-1 ATCC CRL-2923 Human endometrium adenocarcinoma cell line
Epidermal growth factor Sigma E9644
Fibroblast growth factor basic Sigma F0291
Haemocytometer VWR HERE1080339
HCC1806 ATCC CRL-2335 Human mammary squamous cell carcinoma cell line
Insulin, transferrin, selenium Solution Gibco 41400045
MCF7 ATCC HTB-22 Human mammary adenocarcinoma cell line
Methylcellulose AlfaAesar 45490
NaCl JMGS 37040005002212
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate Sigma P3932
Putrescine Sigma P7505
RL95-2 ATCC CRL-1671 Human endometrium carcinoma cell line
Sodium deoxycholic acid JMS EINECS 206-132-7
Sodium dodecyl sulfate Sigma 436143
Tris JMGS 20360000BP152112
Triton-X 100 Merck 108603
Trypan blue Sigma T8154
Trypsin-EDTA Sigma T4049
ß-actin antibody Sigma A5316

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardin, H., Zhang, R., Helein, H., Buehler, D., Guo, Z., Lloyd, R. V. The evolving concept of cancer stem-like cells in thyroid cancer and other solid tumors. Laboratory Investigation. 97 (10), 1142 (2017).
  2. Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The Cancer Stem Cell Niche: How Essential Is the Niche in Regulating Stemness of Tumor Cells? Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).
  3. Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells in solid tumours accumulating evidence and unresolved questions. Nature reviews. Cancer. 8, 755-768 (2008).
  4. Allegra, A., et al. The Cancer Stem Cell Hypothesis: A Guide to Potential Molecular Targets. Cancer Investigation. 32 (9), 470-495 (2014).
  5. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  6. Friel, A. M., et al. Functional analyses of the cancer stem cell-like properties of human endometrial tumor initiating cells. Cell Cycle. 7 (2), 242-249 (2008).
  7. Zhang, S., et al. Identification and Characterization of Ovarian Cancer-Initiating Cells from Primary Human Tumors. Cancer Research. 68 (11), 4311-4320 (2008).
  8. Bapat, S. A., Mali, A. M., Koppikar, C. B., Kurrey, N. K. Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer. Cancer research. 65 (8), 3025-3029 (2005).
  9. Carvalho, M. J., Laranjo, M., Abrantes, A. M., Torgal, I., Botelho, M. F., Oliveira, C. F. Clinical translation for endometrial cancer stem cells hypothesis. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (3), 401-416 (2015).
  10. Morel, A. P., Lièvre, M., Thomas, C., Hinkal, G., Ansieau, S., Puisieux, A. Generation of Breast Cancer Stem Cells through Epithelial-Mesenchymal Transition. PLoS ONE. 3 (8), e2888 (2008).
  11. Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. The FASEB Journal. 27 (1), 13 (2013).
  12. Ajani, J. A., et al. ALDH-1 expression levels predict response or resistance to preoperative chemoradiation in resectable esophageal cancer patients. Molecular Oncology. 8 (1), 142-149 (2014).
  13. Carvalho, M. J., et al. Endometrial Cancer Spheres Show Cancer Stem Cells Phenotype and Preference for Oxidative Metabolism. Pathology and Oncology Research. , (2018).
  14. Laranjo, M., et al. Mammospheres of hormonal receptor positive breast cancer diverge to triple-negative phenotype. The Breast. 38, 22-29 (2018).
  15. Cui, M., et al. Non-Coding RNA Pvt1 Promotes Cancer Stem Cell–Like Traits in Nasopharyngeal Cancer via Inhibiting miR-1207. Pathology & Oncology Research. , (2018).
  16. Deng, S., et al. Distinct expression levels and patterns of stem cell marker, aldehyde dehydrogenase isoform 1 ALDH1), in human epithelial cancers. PloS one. 5 (4), e10277 (2010).
  17. Weiswald, L. B., Guinebretière, J. M., Richon, S., Bellet, D., Saubaméa, B., Dangles-Marie, V. In situ protein expression in tumour spheres: development of an immunostaining protocol for confocal microscopy. BMC Cancer. 10 (1), 106 (2010).
  18. Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical Cancer Models in Tumor Biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
  19. Picon-Ruiz, M., et al. Low adherent cancer cell subpopulations are enriched in tumorigenic and metastatic epithelial-to-mesenchymal transition-induced cancer stem-like cells. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
  20. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  21. Ballout, F., et al. Sphere-Formation Assay: Three-Dimensional in vitro Culturing of Prostate Cancer Stem/Progenitor Sphere-Forming Cells. Frontiers in Oncology. 8 (August), 1-14 (2018).
  22. Ishiguro, T., Ohata, H., Sato, A., Yamawaki, K., Enomoto, T., Okamoto, K. Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications. Cancer Science. 108 (3), 283-289 (2017).
  23. Noseda, M., Nasatto, P., Silveira, J., Pignon, F., Rinaudo, M., Duarte, M. Methylcellulose, a Cellulose Derivative with Original Physical Properties and Extended Applications. Polymers. 7 (5), 777-803 (2015).
  24. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  25. Zhou, M., et al. LncRNA-Hh Strengthen Cancer Stem Cells Generation in Twist-Positive Breast Cancer via Activation of Hedgehog Signaling Pathway. Stem cells (Dayton, Ohio). 34 (1), 55-66 (2016).
  26. Ha, J. R., et al. Integration of Distinct ShcA Signaling Complexes Promotes Breast Tumor Growth and Tyrosine Kinase Inhibitor Resistance. Molecular cancer research MCR. 16 (5), 894-908 (2018).
  27. Jurmeister, S., et al. Identification of potential therapeutic targets in prostate cancer through a cross-species approach. EMBO molecular medicine. 10 (3), (2018).
  28. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  29. Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
  30. Peach, M., Marsh, N., Miskiewicz, E. I., MacPhee, D. J. Solubilization of Proteins: The Importance of Lysis Buffer Choice. , 49-60 (2015).
  31. Olson, B. J. S. C. Assays for Determination of Protein Concentration. Current Protocols in Pharmacology. , A.3A.1-A.3A.32 (2016).
  32. Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. Journal of Visualized Experiments. (44), 1-2 (2010).
  33. Silva, J. M., McMahon, M. The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis. Journal of Visualized Experiments. 84 (84), 1-8 (2014).
  34. Oldknow, K. J., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. 8 (93), 1-10 (2014).
  35. Serambeque, B. Células estaminais do cancro do endométrio - a chave para o tratamento personalizado? [Stem Cells of Endometrial Cancer: The Key to Personalized Treatment?]. , University of Coimbra. Master thesis (2018).
  36. Lee, C. H., Yu, C. C., Wang, B. Y., Chang, W. W. Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti-cancer stem cell drugs. Oncotarget. 7 (2), (2015).
  37. De Luca, A., et al. Mitochondrial biogenesis is required for the anchorage-independent survival and propagation of stem-like cancer cells. Oncotarget. 6 (17), (2015).
  38. Masuda, A., et al. An improved method for isolation of epithelial and stromal cells from the human endometrium. Journal of Reproduction and Development. 62 (2), 213-218 (2016).
  39. Del Rio-Tsonis, K., et al. Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (44), 15772-15777 (2004).
  40. Wang, L., Guo, H., Lin, C., Yang, L., Wang, X. I. Enrichment and characterization of cancer stem-like cells from a cervical cancer cell line. Molecular Medicine Reports. 9 (6), 2117-2123 (2014).
  41. Chen, Y. C., et al. High-throughput single-cell derived sphere formation for cancer stem-like cell identification and analysis. Scientific Reports. 6 (April), 1-12 (2016).
  42. Kim, J., Jung, J., Lee, S. J., Lee, J. S., Park, M. J. Cancer stem-like cells persist in established cell lines through autocrine activation of EGFR signaling. Oncology Letters. 3 (3), 607-612 (2012).
  43. Hwang-Verslues, W. W., et al. Multiple Lineages of Human Breast Cancer Stem/Progenitor Cells Identified by Profiling with Stem Cell Markers. PloS one. 4 (12), e8377 (2009).
  44. Feng, Y., et al. Metformin reverses stem cell-like HepG2 sphere formation and resistance to sorafenib by attenuating epithelial-mesenchymal transformation. Molecular Medicine Reports. 18 (4), 3866-3872 (2018).
  45. Wang, H., Paczulla, A., Lengerke, C. Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays. Journal of Visualized Experiments. (95), 1-11 (2015).
  46. Stebbing, J., Lombardo, Y., Coombes, C. R., de Giorgio, A., Castellano, L. Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (97), 1-5 (2015).
  47. Zhao, H., et al. Sphere-forming assay vs. organoid culture: Determining long-term stemness and the chemoresistant capacity of primary colorectal cancer cells. International Journal of Oncology. 54 (3), 893-904 (2019).
  48. Bagheri, V., et al. Isolation and identification of chemotherapy-enriched sphere-forming cells from a patient with gastric cancer. Journal of Cellular Physiology. 233 (10), 7036-7046 (2018).
  49. Kaowinn, S., Kaewpiboon, C., Koh, S., Kramer, O., Chung, Y. STAT1-HDAC4 signaling induces epithelial-mesenchymal transition and sphere formation of cancer cells overexpressing the oncogene, CUG2. Oncology Reports. , 2619-2627 (2018).
  50. Lonardo, E., Cioffi, M., Sancho, P., Crusz, S., Heeschen, C. Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies. Journal of Visualized Experiments. (100), 1-9 (2015).
  51. Lu, H., et al. Targeting cancer stem cell signature gene SMOC-2 Overcomes chemoresistance and inhibits cell proliferation of endometrial carcinoma. EBioMedicine. 40, 276-289 (2019).
  52. Bu, P., Chen, K. Y., Lipkin, S. M., Shen, X. Asymmetric division: a marker for cancer stem cells. Oncotarget. 4 (7), (2013).
  53. Islam, F., Qiao, B., Smith, R. A., Gopalan, V., Lam, A. K. Y. Cancer stem cell: fundamental experimental pathological concepts and updates. Experimental and molecular pathology. 98 (2), 184-191 (2015).
  54. Liu, W., et al. Comparative characterization of stem cell marker expression, metabolic activity and resistance to doxorubicin in adherent and spheroid cells derived from the canine prostate adenocarcinoma cell line CT1258. Anticancer research. 35 (4), 1917-1927 (2015).
  55. Broadley, K. W. R., et al. Side Population is Not Necessary or Sufficient for a Cancer Stem Cell Phenotype in Glioblastoma Multiforme. STEM CELLS. 29 (3), 452-461 (2011).
  56. Cojoc, M., Mäbert, K., Muders, M. H., Dubrovska, A. A role for cancer stem cells in therapy resistance: Cellular and molecular mechanisms. Seminars in Cancer Biology. 31, 16-27 (2015).
  57. Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
  58. Zhang, X. L., Jia, Q., Lv, L., Deng, T., Gao, J. Tumorspheres Derived from HCC Cells are Enriched with Cancer Stem Cell-like Cells and Present High Chemoresistance Dependent on the Akt Pathway. Anti-cancer agents in medicinal chemistry. 15 (6), 755-763 (2015).
  59. Fukamachi, H., et al. CD49fhigh Cells Retain Sphere-Forming and Tumor-Initiating Activities in Human Gastric Tumors. PLoS ONE. 8 (8), e72438 (2013).
  60. Gao, M. Q., Choi, Y. P., Kang, S., Youn, J. H., Cho, N. H. CD24+ cells from hierarchically organized ovarian cancer are enriched in cancer stem cells. Oncogene. 29 (18), 2672-2680 (2010).
  61. Cariati, M., et al. Alpha-6 integrin is necessary for the tumourigenicity of a stem cell-like subpopulation within the MCF7 breast cancer cell line. International Journal of Cancer. 122 (2), 298-304 (2008).
  62. López, J., Valdez-Morales, F. J., Benítez-Bribiesca, L., Cerbón, M., Carrancá, A. Normal and cancer stem cells of the human female reproductive system. Reproductive Biology and Endocrinology. 11 (1), 53 (2013).
  63. Alvero, A. B., et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance. Cell Cycle. 8 (1), 158-166 (2009).
  64. Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., Birnbaum, D. Breast cancer stem cells: tools and models to rely on. BMC Cancer. 9 (1), 202 (2009).
  65. Leccia, F., et al. ABCG2, a novel antigen to sort luminal progenitors of BRCA1- breast cancer cells. Molecular Cancer. 13 (1), 213 (2014).
  66. Croker, A. K., Allan, A. L. Inhibition of aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity reduces chemotherapy and radiation resistance of stem-like ALDHhiCD44+ human breast cancer cells. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (1), 75-87 (2012).
  67. Sun, M., et al. Enhanced efficacy of chemotherapy for breast cancer stem cells by simultaneous suppression of multidrug resistance and antiapoptotic cellular defense. Acta Biomaterialia. 28, 171-182 (2015).
  68. Shao, J., Fan, W., Ma, B., Wu, Y. Breast cancer stem cells expressing different stem cell markers exhibit distinct biological characteristics. Molecular Medicine Reports. 14 (6), 4991-4998 (2016).
  69. Croker, A. K., et al. High aldehyde dehydrogenase and expression of cancer stem cell markers selects for breast cancer cells with enhanced malignant and metastatic ability. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (8b), 2236-2252 (2009).
  70. Cheung, S. K. C., et al. Stage-specific embryonic antigen-3 (SSEA-3) and β3GalT5 are cancer specific and significant markers for breast cancer stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (4), 960-965 (2016).
  71. Meyer, M. J., Fleming, J. M., Lin, A. F., Hussnain, S. A., Ginsburg, E., Vonderhaar, B. K. CD44 pos CD49f hi CD133/2 hi Defines Xenograft-Initiating Cells in Estrogen Receptor–Negative Breast Cancer. Cancer Research. 70 (11), 4624-4633 (2010).
  72. Ahn, S. M., Goode, R. J. A., Simpson, R. J. Stem cell markers: Insights from membrane proteomics? PROTEOMICS. 8 (23-24), 4946-4957 (2008).
  73. Chefetz, I., et al. TLR2 enhances ovarian cancer stem cell self-renewal and promotes tumor repair and recurrence. Cell Cycle. 12 (3), 511-521 (2013).
  74. Alvero, A. B., et al. Stem-Like Ovarian Cancer Cells Can Serve as Tumor Vascular Progenitors. Stem Cells. 27 (10), 2405-2413 (2009).
  75. Yin, G., et al. Constitutive proteasomal degradation of TWIST-1 in epithelial–ovarian cancer stem cells impacts differentiation and metastatic potential. Oncogene. 32 (1), 39-49 (2013).
  76. Wei, X., et al. Mullerian inhibiting substance preferentially inhibits stem/progenitors in human ovarian cancer cell lines compared with chemotherapeutics. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (44), 18874-18879 (2010).
  77. Meirelles, K., et al. Human ovarian cancer stem/progenitor cells are stimulated by doxorubicin but inhibited by Mullerian inhibiting substance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (7), 2358-2363 (2012).
  78. Shi, M. F., et al. Identification of cancer stem cell-like cells from human epithelial ovarian carcinoma cell line. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (22), 3915-3925 (2010).
  79. Meng, E., et al. CD44+/CD24− ovarian cancer cells demonstrate cancer stem cell properties and correlate to survival. Clinical & Experimental Metastasis. 29 (8), 939-948 (2012).
  80. Witt, A. E., et al. Identification of a cancer stem cell-specific function for the histone deacetylases, HDAC1 and HDAC7, in breast and ovarian. Oncogene. 36 (12), 1707-1720 (2017).
  81. Wu, H., Zhang, J., Shi, H. Expression of cancer stem markers could be influenced by silencing of p16 gene in HeLa cervical carcinoma cells. European journal of gynaecological oncology. 37 (2), 221-225 (2016).
  82. Huang, R., Rofstad, E. K. Cancer stem cells (CSCs), cervical CSCs and targeted therapies. Oncotarget. 8 (21), 35351-35367 (2017).
  83. Zhang, X., et al. Imatinib sensitizes endometrial cancer cells to cisplatin by targeting CD117-positive growth-competent cells. Cancer Letters. 345 (1), 106-114 (2014).
  84. Luo, L., et al. Ovarian cancer cells with the CD117 phenotype are highly tumorigenic and are related to chemotherapy outcome. Experimental and Molecular Pathology. 91 (2), 596-602 (2011).
  85. Zhao, P., Lu, Y., Jiang, X., Li, X. Clinicopathological significance and prognostic value of CD133 expression in triple-negative breast carcinoma. Cancer Science. 102 (5), 1107-1111 (2011).
  86. Ferrandina, G., et al. Expression of CD133-1 and CD133-2 in ovarian cancer. International Journal of Gynecologic Cancer. 18 (3), 506-514 (2008).
  87. Rutella, S., et al. Cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the CD133 antigen in human endometrial tumors. Clinical cancer research an official journal of the American Association for Cancer Research. 15 (13), 4299-4311 (2009).
  88. Friel, A. M., et al. Epigenetic regulation of CD133 and tumorigenicity of CD133 positive and negative endometrial cancer cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (1), 147 (2010).
  89. Nakamura, M., et al. Prognostic impact of CD133 expression as a tumor-initiating cell marker in endometrial cancer. Human Pathology. 41 (11), 1516-1529 (2010).
  90. Saha, S. K., et al. KRT19 directly interacts with β-catenin/RAC1 complex to regulate NUMB-dependent NOTCH signaling pathway and breast cancer properties. Oncogene. 36 (3), 332-349 (2017).
  91. LV, X., Wang, Y., Song, Y., Pang, X., Li, H. Association between ALDH1+/CD133+ stem-like cells and tumor angiogenesis in invasive ductal breast carcinoma. Oncology Letters. 11 (3), 1750-1756 (2016).
  92. Ruscito, I., et al. Exploring the clonal evolution of CD133/aldehyde-dehydrogenase-1 (ALDH1)-positive cancer stem-like cells from primary to recurrent high-grade serous ovarian cancer (HGSOC). A study of the Ovarian Cancer Therapy–Innovative Models Prolong Survival (OCTIPS). European Journal of Cancer. 79, 214-225 (2017).
  93. Sun, Y., et al. Isolation of Stem-Like Cancer Cells in Primary Endometrial Cancer Using Cell Surface Markers CD133 and CXCR4. Translational Oncology. 10 (6), 976-987 (2017).
  94. Rahadiani, N., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1) in endometrioid adenocarcinoma and its clinical implications. Cancer Science. 102 (4), 903-908 (2011).
  95. Mamat, S., et al. Transcriptional Regulation of Aldehyde Dehydrogenase 1A1 Gene by Alternative Spliced Forms of Nuclear Factor Y in Tumorigenic Population of Endometrial Adenocarcinoma. Genes & Cancer. 2 (10), 979-984 (2011).
  96. Mukherjee, S. A., et al. Non-migratory tumorigenic intrinsic cancer stem cells ensure breast cancer metastasis by generation of CXCR4+ migrating cancer stem cells. Oncogene. 35 (37), 4937-4948 (2016).
  97. Lim, E., et al. Aberrant luminal progenitors as the candidate target population for basal tumor development in BRCA1 mutation carriers. Nature Medicine. 15 (8), 907-913 (2009).
  98. Liang, Y. J., et al. Interaction of glycosphingolipids GD3 and GD2 with growth factor receptors maintains breast cancer stem cell phenotype. Oncotarget. 8 (29), 47454-47473 (2017).

Tags

Cancer Forskning neoplastiska stamceller brösttumörer tumorspheres gynekologisk cancer sfärbildande protokoll cancer stamceller markörer
Erhålla Cancer Stem Cell Spheres från gynekologiska och bröstcancertumörer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Laranjo, M., Carvalho, M. J.,… More

Laranjo, M., Carvalho, M. J., Serambeque, B., Alves, A., Marto, C. M., Silva, I., Paiva, A., Botelho, M. F. Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors. J. Vis. Exp. (157), e60022, doi:10.3791/60022 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter