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Cancer Research

Beschaffung von Krebsstammzellkugeln aus gynäkologischen und Brustkrebstumoren

Published: March 1, 2020 doi: 10.3791/60022
Automatic Translation
*1,2,3,4, *1,2,3,4,5,6, 1,2,3, 2,7, 1,2,3,4,8, 9, 3,9,10, 1,2,3,4,8
1Institute of Biophysics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 2Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR), area of Environment Genetics and Oncobiology (CIMAGO), Faculty of Medicine, University of Coimbra, 3CNC.IBILI/Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, 4Clinical Academic Center of Coimbra (CACC), 5Universitary Clinic of Gynecology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 6Gynecology A Service, Coimbra Hospital and Universitary Center, 7Institute of Pharmacology & Experimental Therapeutics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 8Institute of Experimental Pathology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 9Cytometry Operational Management Unit, Clinical Pathology Service, Coimbra Hospital and Universitary Center, 10Polytechnic Institute of Coimbra, ESTESC-Coimbra Health School, Laboratory Biomedical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Ziel dieser Methodik ist es, Krebsstammzellen (CSC) in Krebszelllinien und primären menschlichen Tumorproben mit dem kugelbildenden Protokoll auf robuste Weise zu identifizieren, wobei funktionelle Assays und phänotypische Charakterisierung mit Durchflusszytometrie und western Fleck.

Abstract

Krebsstammzellen (CSC) sind eine kleine Population mit Selbsterneuerung und Plastizität, die für Tumorgenese, Resistenz gegen Behandlung und wiederkehrende Krankheiten verantwortlich sind. Diese Grundgesamtheit kann durch Oberflächenmarker, enzymatische Aktivität und ein funktionelles Profil identifiziert werden. Diese Ansätze an sich sind aufgrund der phänotiver Heterogenität und CSC-Plastizität begrenzt. Hier aktualisieren wir das kugelbildende Protokoll, um CSC-Kugeln aus Brust- und gynäkologischen Krebsarten zu erhalten und funktionelle Eigenschaften, CSC-Marker und Proteinexpression zu bewerten. Die Kugeln werden mit einzelliger Aussaat bei geringer Dichte in Suspensionskultur unter Verwendung eines halbfesten Methylcellulosemediums gewonnen, um Migration und Aggregate zu vermeiden. Dieses profitable Protokoll kann in Krebszelllinien, aber auch in Primärtumoren verwendet werden. Die dreidimensionale nicht-haftende Suspensionskultur, die die Tumormikroumgebung, insbesondere die CSC-Nische, imitiert, wird durch einen epidermalen Wachstumsfaktor und einen grundlegenden Fibroblasten-Wachstumsfaktor ergänzt, um die CSC-Signalisierung zu gewährleisten. Mit dem Ziel einer robusten Identifizierung von CSC schlagen wir einen komplementären Ansatz vor, der funktionale und phänotypische Evaluierung kombiniert. Kugelbildende Kapazität, Selbsterneuerung und Kugelprojektionsfläche etablieren CSC-Funktionseigenschaften. Darüber hinaus umfasst die Charakterisierung die Flow-Zytometrie-Auswertung der Marker, dargestellt durch CD44+/CD24- und CD133 und Western Blot, unter Berücksichtigung von ALDH. Das vorgestellte Protokoll wurde auch für primäre Tumorproben optimiert, nach einem Probenverdauungsverfahren, das für die translationale Forschung nützlich ist.

Introduction

Krebspopulationen sind heterogen, wobei Zellen aufgrund der differenziellen Genexpression unterschiedliche Morphologien, Proliferations- und Invasionsfähigkeit darstellen. Unter diesen Zellen existiert eine Minderheitspopulation namens Krebsstammzellen (CSC)1, die die Fähigkeit zur Selbsterneuerung haben, die Heterogenität der primären Tumornische rekapitulieren und abnorm differenzierende Vorläufer produzieren, die nicht angemessen auf homöostatische Kontrollen reagieren2. CSC-Eigenschaften können direkt in der klinischen Praxis übersetzt werden, da die Assoziation mit Ereignissen, wie Tumorigenität oder Resistenz gegen Chemotherapie3. Die Identifizierung von CSC kann zur Entwicklung gezielter Therapien führen, die die Blockade von Oberflächenmarkern, die Förderung der CSC-Differenzierung, die Blockierung von CSC-Signalwegkomponenten, Nischenzerstörung und epigenetische Mechanismen umfassen können4.

Die Isolierung von CSC wurde in Zelllinien und in Proben von Primärtumoren5,6,7,8durchgeführt. Das für CSC beschriebene funktionelle Profil umfasst clonogene Kapazität, Seitenpopulation und Tumorkugelbildung9. Der CD44high/CD24low phänotyp wurde konsequent mit Brust-CSC assoziiert, das sich in vivo als tumoriogen erwiesen hat und bereits mit epitheliadem zu mesenchymalem Übergang5,10assoziiert wurde. Hohe ALDH-Aktivität wurde auch mit Stammheit und epitheliale mesenchymale Minase (EMT) bei verschiedenen Arten von soliden Tumoren11assoziiert. Die ALDH-Expression wurde mit einer Resistenz gegen Chemotherapie und CSC-Phänotyp in vitro12,13,14,15,16assoziiert. Mehrere andere Marker wurden mit CSC-Eigenschaften in verschiedenen Tumorarten verknüpft, wie CD133, CD49f, ITGA6, CD1663,4 und andere, wie in Tabelle 1beschrieben.

Die Tumorsphären bestehen aus einem dreidimensionalen Modell für die Untersuchung und Expansion von CSC. In diesem Modell werden die Zellsuspensionen aus Zelllinien und aus Blut- oder Tumorproben in einem Medium kultiviert, das mit Wachstumsfaktoren ergänzt wird, nämlich epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), ohne fetales Rinderserum und unter nicht haftenden Bedingungen17. Hemmung der Zelladhäsion führt zum Tod durch Anoikis von differenzierten Zellen18. Kugeln werden aus dem klonalen Wachstum einer isolierten Zelle abgeleitet. Zu diesem Zweck werden die Zellen mit geringer Dichte verteilt, um Zellfusion und Aggregation zu vermeiden19. Eine weitere Strategie umfasst die Verwendung von halbkonsolidierter Methylcellulose20.

Das kugelbildende Protokoll gewann an Popularität in Derise und Erweiterung von CSC, aufgrund von Zeit und Kosten und technischen, profitablen und reproduzierbaren Gründen21,22. Trotz einiger Reserven, deren Ausmaß die Kugelbildung CSC widerspiegelt, besteht eine Neigung von Stammzellen, unter nicht anhaftenden Bedingungen mit dem charakteristischen Phänotyp zu wachsen, der der nativen Mikroumgebung ähnelt21. Keine der verfügbaren Methoden zur Isolierung von CSC von soliden Tumoren hat eine vollständige Effizienz, was die Bedeutung der Entwicklung spezifischerer Marker oder Kombinationen von Methoden und Markern unterstreicht.

In diesem Protokoll beschreiben wir die Isolierung von CSC mit dem kugelbildenden Protokoll, mit dem Prinzip des einzelzelligen Wachstums unter nicht haftenden Bedingungen und der Fähigkeit, einen differenzierten Phänotyp zu erzeugen. Eine schematische Darstellung dieser Prozedur ist in Abbildung 1dargestellt. Wir beschreiben auch die Charakterisierung mit Oberflächenmarkern und ALDH-Expression für CSC, sowohl für Brust- als auch für gynäkologische Tumorzellenlinien und Proben von Primärtumoren.

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Protocol

Dieses Protokoll wurde gemäß den ethischen Richtlinien der Tumorbank des Coimbra Hospital and Universitary Center (CHUC) durchgeführt und von der ChuC-Ethikkommission für Gesundheit und der portugiesischen Nationalen Datenschutzkommission genehmigt.

1. Sphere-forming Protocol und Derived Adherent Populations from Continuous Cell Cultures

HINWEIS: Führen Sie alle Verfahren unter strengen sterilen Bedingungen durch.

  1. Herstellung von nicht haftenden Suspensionskulturkolben oder Platten durch Beschichten der Wachstumsfläche mit Poly(2-Hydroxyethyl-Methacrylat (Poly-HEMA)
    1. Bereiten Sie eine 15 mg/ml-Lösung vor, indem Sie Poly-HEMA in absolutem Ethanol bei 65 °C rühren. Mantelzellkulturkolben oder Platten mit 50 l/cm2.
    2. Bei 37 °C im Trockenschrank trocknen lassen. Falls erforderlich, die Platten einwickeln und bei Raumtemperatur lagern.
  2. Vorbereitung der Kugelkultivierungsmedien (SCM)
    1. Eine 2%ige Methylcelluloselösung in Reinstwasser zubereiten und im Autoklaven sterilisieren. Methylcellulose ist tendenziell leichter durch Abkühlen zu verrechnen; Daher das Pulver in Wasser bei 80 °C verteilen und rühren, bisgekühlt 23.
    2. Bereiten Sie eine zweifache konzentrierte Lösung von SCM (Lagerlösung) vor. SCM Arbeitslösung enthält DMEM-F12, ergänzt mit 100 mM Putrescin, 1% Insulin, Transferrin, Selen und 1% antimykotische Lösung (10.000 U/ml Penicillin, 10 mg/ml Streptomycin und 25 g/ml Amphotericin B).
    3. Zur Herstellung des SCM gleiche Volumina der SCM-Lagerlösung mit der 2%-Lösung von Methylcellulose zu mischen.
    4. Vervollständigen Sie das Medium unmittelbar vor der Verwendung, indem Sie 10 ng/ml epidermalen Wachstumsfaktor (EFG) und 10 ng/ml Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) hinzufügen.
    5. Wenn mehr straffzellige Zelllinien verwendet werden, ergänzen Sie das Medium mit 0,4% Rinderserumalbumin, was ein Vorteil sein könnte.
  3. Beginnen Sie mit einem Kolben von MCF7 oder HCC1806 Brustkrebs oder ECC-1 oder RL95-2 Endometriumkrebszellen (oder anderen Krebszellen der Wahl) mit 80% bis 90% Zusammenfluss.
  4. Entsorgen Sie die Zellkulturmedien, waschen Sie sie mit Phosphatgepufferter Salinelösung (PBS) und lösen Sie die Zellen mit Trypsin-EDTA (1 bis 2 ml für einen 75 cm2 Zellkulturkolben).
  5. Fügen Sie Zellkulturmedien (2 bis 4 ml für einen 75 cm2 Zellkulturkolben) und Zentrifugen bei 200 x g für 5 min hinzu, um Enzyme zu entsorgen.
  6. Setzen Sie das Pellet in einem bekannten Volumen von Zellkulturmedien und Pipetten nach oben und unten aus, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten. Zu diesem Zweck kann ein 40-m-Zellsieb verwendet werden.
  7. Zählen Sie die Zellen im Hämozytometer und berechnen Sie die Zellkonzentration der Zellsuspension. Nutzen Sie diesen Schritt, um die Beobachtung einer Einzelzellsuspension sicherzustellen. Sorgfältige Zellzählung ist wichtig, um die Auswirkungen von Behandlungen genau zu quantifizieren.
  8. Setzen Sie die ermittelte Menge der Zellsuspension in SCM komplettes Medium und übertragen Sie auf poly-HEMA beschichtete Gerichte. Als Referenzwert für die Saatdichte betrachten Sie 500 bis 2000 Zellen/cm2.
    HINWEIS: Die Optimierung der Saatdichte und Der Kulturzeit für jede Zelllinie wird sehr empfohlen24.
  9. Bei 37 °C und 5%CO2 für 2 Tage inkubieren, ohne die Platten zu stören.
  10. Wiederherstellung der Konzentration von Wachstumsfaktoren durch Zugabe von 10 ng/mL EFG und 10 ng/mL bFGF zu den Zellkulturmedien. Wiederholen Sie diesen Schritt alle zwei Tage.
  11. Inkubieren Sie bei 37 °C und 5%CO2 bis 5 Tage nach der Beschichtung (dies kann je nach Zelllinie von 3 bis 12 Tagen variieren), um Kugeln zu erhalten, die die Morphologie von Suspensionskugel-förmigen Zellkolonien darstellen.
  12. Verwenden oder sammeln Sie die Kugeln, durch Pipettieren, für die Experimente.
  13. Um abgeleitete Anhängerpopulationen zu erhalten, platzieren Sie die Kugeln in Standardkulturbedingungen, bzw. der verwendeten Zelllinie. 1 bis 2 Tage später ist es möglich, eine Monoschicht von Zellen zu beobachten, die um anhängliche Sphären wachsen, was eine Morphologie ähnlich der Zelllinie des Ursprungs darstellt.

2. Kugelbildner-Protokoll aus menschlichen Tumorproben

HINWEIS: Die Verwendung menschlicher Proben zu Forschungszwecken muss den Rechtsvorschriften der einzelnen Länder entsprechen und von der Ethikkommission der beteiligten Institutionen genehmigt werden.

  1. Bereiten Sie die Transportmedien vor, die DMEM/F12 enthalten, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 2% antimykotischer Lösung (10.000 U/ml Penicillin, 10 mg/ml Streptomycin und 25 g/ml Amphotericin B).
  2. Bereiten Sie die Verdauungsmedien mit DMEM/F12 vor, ergänzt mit 10% FBS, 1% antimykotischer Lösung, 1 mg/ml Typ IV Kollagenase und 100 g/ml DNAse I.
  3. Bereiten Sie das Enzym-Inaktivierungsmedium vor, das DMEM/F12 enthält, ergänzt durch 10% FBS und 1% antimykotische Lösung (10.000 U/ml Penicillin, 10 mg/ml Streptomycin und 25 g/ml Amphotericin B).
  4. Bereiten Sie den SCM wie in Abschnitt 1.2 beschrieben vor.
  5. Erhalten Sie die Probe während der makroskopischen Untersuchung des operativen Stückes so schnell wie möglich nach chirurgischer Entfernung.
  6. Legen Sie die Proben in Transportmedien und übertragen Sie sie an das Labor für die Verarbeitung. Die Probenverarbeitung sollte innerhalb von 1 h nach der Entnahme beginnen, um die Erfolgsrate des Verfahrens zu verbessern. Wenden Sie bei der Probensammlung Vorsicht walten. Behandeln Sie die Proben sorgfältig. Vermeiden Sie die Verwendung von nekrotischen oder kauterisierten Zonen.
  7. Unter der sterilen Durchflusskammer die Probe auf eine Schale geben und mit einem Skalpell in kleinere Stücke (ca. 1 mm3)schneiden.
  8. Inkubieren Sie das menschliche Gewebe in einem Rohr mit Verdauungsmedien in einem rotierenden Shaker bis zu 180 min bei 37 °C. Identifizieren Sie diese Röhre als Tube A.
  9. Ersetzen Sie die Enzymlösung alle 15 min.
    1. Sammeln Sie die Verdauungsmedien (ohne Gewebefragmente zu entfernen) und übertragen Sie es durch ein 40-m-Zellsieb auf eine neue Tube, die halb gefüllt mit Enzym-Inaktivierungsmedien ist. Bewahren Sie dieses Rohr bei Raumtemperatur auf und identifizieren Sie es als Tube B.
    2. Fügen Sie Tube A neue Verdauungsmedien hinzu und geben Sie sie bei 37 °C an den rotierenden Shaker zurück.
    3. Überprüfen Sie bei jeder Sammlung die Zelllebensfähigkeit mithilfe der Trypan-Blue-Ausschlussmethode.
    4. Wiederholen Sie diesen Vorgang für 180 min oder bis die Zellzahl deutlich niedriger ist.
  10. Inkubieren Sie die Gewebefragmente in Tube A in einer zweiten Verdauungslösung, die gleiche Teile von Accutase und Trypsin-EDTA enthält, unter Rühren für 10 min bei 37 °C.
  11. Fügen Sie das Enzym-Inaktivierungsmedium zu Tube A hinzu und filtern Sie den Inhalt durch ein 40-m-Zellsieb in Tube B.
  12. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension in Tube B bei 200 x g für 10 min.
  13. Setzen Sie das Pellet im SCM aus und überprüfen Sie die Zellkonzentration mit einem Hämozytometer.
  14. Setzen Sie die ermittelte Menge der Zellsuspension in SCM aus und übertragen Sie sie auf poly-HEMA-beschichtete Schalen (siehe Schritt 1.1) mit einer Sädichte von 4000Zellen/cm2.
  15. Bei 37 °C und 5%CO2 für 2 Tage inkubieren, ohne die Platten zu stören.
  16. Wiederherstellung der Konzentration von Wachstumsfaktoren durch Zugabe von 10 ng/mL EFG und 10 ng/mL bFGF zu den Zellkulturmedien.
    HINWEIS: Sie müssen dies alle zwei Tage tun.
  17. Bei 37 °C und 5% CO2 bis 5 Tage nach der Beschichtung (dies kann bis zu 12 Tage variieren) zu brüten, um Kugeln zu erhalten, die die Morphologie von Suspensionskugel-förmigen Zellkolonien darstellen.

Figure 1
Abbildung 1: Gewinnung von Krebsstammzellen aus menschlichen Endometriumtumorproben (A) und Brust- und gynäkologischen Krebszelllinien (B). Menschliche Tumorproben werden fragmentiert, enzymatisch verdaut und in Kugelbaumittel zu poly-HEMA-beschichteten Schalen verfliegt. Krebszelllinien werden getrennt, Zellsuspensionen gezählt und einzelne Zellen werden bei geringer Dichte unter geeigneten Bedingungen in poly-HEMA-beschichtete Platten verteilt. Die erhaltenen Sphären, wenn sie unter anhaftenden Kulturbedingungen platziert werden, erzeugen abgeleitete Anhängerpopulationen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Kugelbildende Kapazität, Selbsterneuerung und Kugelprojektionsbereich

HINWEIS: Die kugelbildende Kapazität ist die Fähigkeit einer Tumorzellpopulation, Kugeln zu erzeugen. Selbsterneuerung ist die Fähigkeit von Kugelzellen, neue Kolonien von kugelförmigen Zellen in Suspension zu produzieren. Die Kugelprojektionsfläche ist repräsentativ für die von der Kugel besetzte Fläche und damit ausdrucksstark für ihre Größe und die Anzahl der Zellteilungen, die in einem bestimmten Zeitraum durchlaufen wurden.

  1. Bestimmung der kugelbildenden Kapazität
    1. Nach Abschluss des kugelbildenden Protokolls die Kugeln in einem Zentrifugenrohr und zentrifugieren bei 125 x g für 5 min sammeln.
    2. Entsorgen Sie den SCM und hängen Sie das Pellet vorsichtig in einem bekannten Volumen von frischen Medien aus. Mit dem Ziel, die Sphären zu konzentrieren, um das Zählen zu erleichtern, die Kugeln in einem kleinen Medienvolumen auszusetzen. Achten Sie darauf, die Kugeln nicht zu stören.
    3. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Kugeln mit einem Durchmesser von mehr als 40 m zu zählen. Alternativ können Kugeln direkt auf der Platte gezählt werden, indem ein mikroskopisch mit einem Graticule25 oder mit einem automatisierten System26,27ausgestattet verwendet wird.
    4. Berechnen Sie das Prozentuale Verhältnis der erhaltenen Kugeln im Vergleich zur Anzahl der anfangs plattierten Zellen.
  2. Bestimmen der Selbsterneuerung
    1. Nach Abschluss des kugelbildenden Protokolls die Kugeln in einem Zentrifugenrohr und zentrifugieren bei 125 x g für 5 min sammeln.
    2. Entsorgen Sie die Kugelkultivierungsmedien und hängen Sie das Pellet vorsichtig in Trypsin-EDTA aus.
    3. Bis zu 5 min bei 37 °C inkubieren.
    4. Fügen Sie Enzyminaktivierungsmedien und Pipetten nach oben und unten hinzu, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten.
    5. Mit einem Hämozytometer und der Trypan-Blau-Ausschlussmethode zählen Sie die lebensfähigen Zellen in der Suspension.
    6. Initiieren Sie das kugelbildende Protokoll, wie in Abschnitt 1 beschrieben.
    7. Verwenden Sie nach 8 Tagen ein Hämozytometer, um die Kugeln mit einem Durchmesser von mehr als 40 m zu zählen.
    8. Berechnen Sie das Prozentuale Verhältnis der erhaltenen Kugeln im Vergleich zur Anzahl der anfangs plattierten Zellen.
  3. Bestimmung der Kugelprojektionsfläche
    1. Um den von den Kugeln belegten Bereich auszuwerten, erhalten Sie Bilder von mindestens 10 zufälligen Feldern pro Zustand in einem invertierten Mikroskop, das mit einem Bildaufnahmemodul ausgestattet ist. Eine Vergrößerung von 100X bis 400X wird empfohlen.
    2. Analysieren Sie Bilder mit Bildgebungssoftware, wie z. B. ImageJ-Software28, indem Sie den Kugeln entsprechende Bereiche zeichnen und deren Fläche in Pixelmessen messen.
    3. Berechnen Sie die Kugelprojektionsfläche als durchschnittliche Fläche der gemessenen Pixel.

4. KrebsStammzellmarker-Bewertung mit Durchflusszytometrie

HINWEIS: CD44+/CD24-/low phänotyp wurde konsequent mit Brust- und gynäkologischen Krebsstammzellen assoziiert. Das beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um diese und andere Zelloberflächenmarker auszuwerten.

  1. Nach Abschluss des kugelbildenden Protokolls die Kugeln in einem Zentrifugenrohr und zentrifugieren bei 125 x g für 5 min sammeln.
  2. Entsorgen Sie den SCM und hängen Sie das Pellet vorsichtig in Trypsin-EDTA aus.
  3. Bis zu 5 min bei 37 °C inkubieren.
  4. Fügen Sie Enzyminaktivierungsmedien und Pipetten nach oben und unten hinzu, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten.
  5. Zentrifugieren Sie bei 125 x g für 5 min, entsorgen Sie den Überstand und hängen Sie die Zellen in PBS sanft aus.
  6. Lassen Sie die Zellen 30 min in Suspension ruhen, um die Rückgewinnung der Membrankonformation zu gewährleisten.
  7. Zählen Sie die Zellen in der Suspension mit einem Hämozytometer und der Trypan-Blau-Ausschlussmethode.
  8. Stellen Sie das Volumen der Zellsuspension auf 106 Zellen/500 l ein.
  9. Inkubieren Sie mit den monoklonalen Antikörpern gemäß den Anweisungen der Lieferanten (Konzentration, Zeit, Temperatur und Licht/Dunkel) und unter Berücksichtigung des in Tabelle 2 dargestellten Versuchssatzes oder der in Tabelle 1angegebenen Marker.
  10. Führen Sie unmittelbar nach der Färbung die zytometrische Durchflussanalyse mit einem Durchflusszytometer mit geeigneten Detektionsmodulen durch.
  11. Standardisieren Sie die Zytometer-Einrichtung nach Denkprotokollen des EuroFlow-Konsortiums29.
  12. Richten Sie primäre Tore basierend auf der vorwärts- und seitenstreuenden Basis ein, ausgenommen Schutt und abgestorbene Zellen. Dies kann durch die gleichzeitige Kennzeichnung mit Anhang V und das Gating negativer Zellen verbessert werden.
  13. Setzen Sie Fluoreszenztore basierend auf den ungefärbten Proben und kompensation für eine spektrale Überlappung mit einzelnen gebeizten Kontrollen.

5. Krebs Stammzell Marker Bewertung mit Western Blot

HINWEIS: Zusätzlich zur ALDH1-Aktivität wurde eine hohe Expression dieses Markers konsequent mit Brust- und gynäkologischen Krebsstammzellen13,14assoziiert. Das beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um diese und andere Zellmarker auszuwerten.

  1. Nach Abschluss des kugelbildenden Protokolls die Kugeln in einem Zentrifugenrohr und zentrifugieren bei 125 x g für 5 min sammeln.
  2. Vorbereitung der gesamten Zelle lysiert
    1. Legen Sie die Zentrifugenrohre auf Eis und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
    2. Das Pellet mit 1 ml kaltem PBS waschen und durch Zentrifugation entsorgen.
    3. Setzen Sie das Pellet in einem kleinen Volumen (200-500 l) ripA-Lysepuffer30 (NaCl 150 mM, Tris-HCl 1,50 mM pH 7,4, Triton-X100 1% vol./vol., Natriumdesoxycholsäure 0,5% Wt./Vol., Natriumdodecylsulfat 0,5% Wt./Vol.) ergänzt mit cOmplete Mini und Dithiothreitol 1 mM.
    4. Halten Sie die Proben kalt (auf Eis), unterwerfen Sie sie Wirbel und Beschallung mit einer 30% Amplitude.
    5. Zentrifugieren Sie die Proben für 15 min bei 14.000 x g in einer auf 4 °C eingestellten gekühlten Zentrifuge.
    6. Übertragen Sie die Überräube auf neue, richtig identifizierte Mikroröhren.
    7. Bestimmen Sie die Proteinkonzentrationen mit den BCA- oder Bradford-Assays31.
    8. Bewahren Sie die Proben bei Bedarf bei -80 °C bis zur weiteren Western-Blot-Analyse auf.
  3. Durchführung von Probendenaturierung, Elektrophorese, Elektronentransfer und Proteindetektion nach Standard-Western-Blotting-Protokollen, wiebeschrieben 32,33,34.

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Representative Results

Das kugelbildende Protokoll ermöglicht es, kugelförmige Kolonien in Suspension aus mehreren Endometrium- und Brustkrebszelllinien (Abbildung 2A) oder nach sanfter enzymatischer Vergärung von Gewebe aus menschlichen Tumorproben (Abbildung 2E) zu erhalten. In beiden Fällen werden einige Tage nach der Beschichtung monoklonale sphärische Kolonien in Suspension erhalten. Sowohl Endometrium- als auch Brustkrebssphären führen zu einer Zellmonoschicht mit ähnlicher Morphologie wie die Zelllinie des Ursprungs, 1 bis 2 Tage nach der Beschichtung (Abbildung 2A).

Unterschiedliche Abstammung und Gewebeherkunft können durch die kugelbildende Kapazität, Selbsterneuerung und Projektionsfläche verglichen werden. Repräsentative Ergebnisse von Brustkrebszelllinien können in den Schaubildern in Abbildung 2B-Dbeobachtet werden. Die hormonhormonen Rezeptor-positiven Brustkrebs MCF7-Zellen zeigen eine höhere Kugelbildner-Kapazität, Selbsterneuerung und Projektionsfläche als die dreifach negativen Brustkrebszellen HCC180614. Bei beiden Zelllinien ist ein kleiner Prozentsatz der plattierten Zellen (weniger als 3%) war in der Lage, Sphären zu produzieren, die Krebsstammzellen als Minderheitspopulation innerhalb der Heterogenität von Tumorzellen betonen. Die Selbsterneuerung von Krebsstammzellen wurde durch einen deutlich anderen Wert der Kugelselbsterneuerung der dargestellten Zelllinien patentiert. Die Kugelprojektionsfläche korreliert als grobes Maß für die Dimension der Kugeln mit der Anzahl der mitotischen Zyklen und zeigt unterschiedliche Zeitintervalle für beide Linien an.

Während nur ein kleiner Teil der Zellen in der Lage ist, Tumorsphären in vitro zu bilden und die Selbsterneuerungskapazität beizubehalten, die Stammzelleneigenschaften trägt, wurden mehrere Marker mit diesem Phänotyp assoziiert.

Das vorgestellte Flow-Zytometrie-Protokoll ermöglicht vielseitige experimentelle Ansätze unter Berücksichtigung von Oberflächenantigenen (siehe Tabelle 1). Repräsentative Ergebnisse, die in Abbildung 3A-Bdargestellt sind, betreffen CD44/CD24 und CD133 Membranmarker, die als einem krebsstammzellähnlichen Phänotyp entsprechen. Die Analyse von Kugeln aus endometrialen RL95-2- und ECC-1-Zelllinien ermöglichte die Identifizierung von vier Populationen (Abbildung 3A). Kugeln, die aus dem Endometrium RL95-2 gewonnen wurden, bestanden aus einer CD44-Hoch-/CD24-Population, die dreimal größer war als die Elternzelllinie35. Im Falle von ECC-1 Kugeln entspricht die CD44hoch/CD24- der Hauptpopulation, die auch CD133 positiv ist, während die CD44low/CD24-, CD44low/CD24+ und CD44-/CD24+ negative oder niedrige CD133-Expression haben.

Die Beurteilung von Oberflächen- und intrazellulären Markern kann auch durch Western Blot nach schonender Kugelernte und sorgfältiger Proteinprobenvorbereitung durchgeführt werden. Abbildung 3C zeigt typische Ergebnisse der ALDH-Änderung, eines Markers, dessen erhöhte Aktivität oder erweiterte Proteinexpression mit dem Krebsstammzellphänotyp13,14 auf Kugeln und abgeleiteten anhaftenden Zellen in Bezug auf die Endometrium-ECC1-Zelllinie des Ursprungs verbunden ist.

Figure 2
Abbildung 2: Endometrium- und Brustkrebszellen, Sphären und abgeleitete anhimante Populationen. (A) . Repräsentative Bilder von Endometrium (RL95-2 und ECC-1) und Brust (MCF7 und HCC1806) Krebszelllinien, jeweiligen Endometrium (ES1) und Brust (MS1) Sphären und abgeleiteten Anhängerpopulationen (G1). Repräsentative Bilder von KREBSzelllinien RL95-2, ECC-1, MCF7 und HCC1806 wurden bei einer Vergrößerung von 200x (Scale bar = 50 m) erhalten. Repräsentative Bilder von ES1 RL95-2 und ES1 ECC-1 wurden bei einer Vergrößerung von 200x (Scale bar = 50 m) erhalten. Repräsentative Bilder von MS1 MCF7 und MS1 HCC1806 wurden bei einer Vergrößerung von 200x (Scale bar = 100 m) erhalten. Repräsentative Bilder von G1 RL95-2 und G1 ECC-1 wurden bei einer Vergrößerung von 200x (Scale bar = 50 m) erhalten. Repräsentative Bilder von G1 MCF7 und G1 HCC1806 wurden bei einer Vergrößerung von 200x (Scale bar = 100 m) erhalten. (B-D) . Kugelbildende Kapazität, Selbsterneuerung und Kugelprojektionsfläche der Brustkrebssphären MCF7 und HCC1806. (E) . Repräsentative Bilder von Kugeln, die aus menschlichen Endometriumtumorproben gewonnen wurden. Diese Bilder wurden bei einer Vergrößerung von 200x aufgenommen (Scale bar = 50 m). Ein Teil dieser Abbildung wurde von einer früheren Publikation mit Genehmigung des Herausgebers14geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Kombinierte Bewertung von Krebsstammzellenmarkern in Endometriumkrebszellen. (A) . Repräsentative Parzellen der CD44/CD24-Kennzeichnung der RL95-2-Zelllinie und der RL95-2-Kugelzellen. (B) . Repräsentative Histogramme der CD133-Kennzeichnung von Kugelzellen (ES1) aus RL95-2- und ECC-1-Zelllinien. Die Dichte stellt ein Maß für die Zellanzahl dar. CD44+/CD24-, CD44low/CD24-, CD44low/CD24und CD44-/CD24+ Populationen sind in Grün, Rosa, Blau und Gelb lackiert. C. ALDH-Expression in ECC-1-Zelllinie, Kugeln (ES1) und abgeleiteter Anhängerpopulation (G1). Der Immunoblot stellt die ALDH- und Aktinexpression für die jeweiligen Versuchsbedingungen dar. Die ALDH-Expression wurde mit dem Antikörper ALDH1/2 ausgewertet, der die Isoformen ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3 und ALDH2 aus der Spezies mouse, rat und human detektiert. Ein Teil dieser Zahl wurde von früheren Veröffentlichungen mit Genehmigung der Herausgeber13geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Liste der gynäkologischen und Brustkrebs-Stammzellenmarker.

Marker Stammzellherkunft Verweise
CD24 Eierstockkrebs 60
CD29 Brustkrebs 61
CD44 Eierstockkrebs 62,63
CD44/CD24-/niedrig Brustkrebs 13,5,3,64
CD44+/CD24-/niedrig/ESA Brustkrebs 65
CD44/ALDH1+/hi Brustkrebs 66
CD44/CD24-/niedrig/ABCG2 Brustkrebs 67
CD44/CD24-/niedrig/ALDH1 Brustkrebs 43,68,69
CD44/CD24-/niedrig/EpCAM Brustkrebs 5
CD44/CD24-/niedrig/SSEA-3 Brustkrebs 70
CD44/CD49f/CD133/2 Brustkrebs 71
CD44/CD133/ALDH1+/hi Brustkrebs 69
CD44/CD117 Eierstockkrebs 7
CD44/MyD88 Eierstockkrebs 72,73
CD44/E-Cadherin-/CD34- Eierstockkrebs 74,75
CD44/CD24/Epcam Eierstockkrebs 76,77
CD44/CD24- Eierstockkrebs 78,79
CD44/CD166 Eierstockkrebs 80
CD44/CD24 Gebärmutterhalskrebs 81
CD49f Brustkrebs 4
Gebärmutterhalskrebs 82
CD117 oder c-Kit Endometriumkrebs 83
Eierstockkrebs 62,84
CD133 Brustkrebs 4,85
Eierstockkrebs 62,86
Endometriumkrebs 13,87,88,89
Gebärmutterhalskrebs 82
CD133hi/CXCR4hi/ALDH1hi Brustkrebs 90
CD133/ALDH1 Brustkrebs 91
Eierstockkrebs 60,92
CD133/CXCR4 Endometriumkrebs 93
ABCG2 Brustkrebs 65
Gebärmutterhalskrebs 82,81
ALDH-1 Brustkrebs 4
Endometriumkrebs 94,95
Gebärmutterhalskrebs 82
CXCR4 oder CD184 Brustkrebs 96
EpCAM/CD49f Brustkrebs 97
EpCAMhi/PROCRhi/SSEA-3 Brustkrebs 70
GD2/GD3/GD3Shi Brustkrebs 98
ITGA6 Brustkrebs 4
PROCR Brustkrebs 43

HINWEIS: Diese Tabelle enthält eine Liste der Oberflächenepitope, die von verschiedenen gynäkologischen und Brustkrebsstammzellen ausgedrückt werden; die meisten dieser Marker werden auch durch eine Reihe anderer Gewebe ausgedrückt. Diese Liste soll nicht alle gemeldeten Marker enthalten.

Tabelle 2: Liste der Röhren, die in ein typisches Durchflusszytometrieexperiment aufgenommen werden sollen, um den Cd24/CD44-Phänotyp zu bewerten. Die Tabelle zeigt einen minimalen Satz von Probenröhrchen, die für ein Co-Färbeexperiment erforderlich sind, einschließlich der erforderlichen Kontrollen.

Tube Zustand Antigen-Fluorophor
1 Unbefleckte Zellen nichts
2 Einzelgebeizt CD44 CD44-PE
3 Einzelgebeizt CD24 CD24-APC
4 Doppelbefleckte CD44/CD24 CD44-PE und CD24-APC

HINWEIS: Dieses Experiment kann durchgeführt werden, indem Anhang in V-FICT zu Tube 4 hinzugefügt und das entsprechende Steuerrohr hinzugefügt wird, um die Nebenzellen V-Negativzellen zu gaten und eventuelle Zellen in der Apoptose auszuschließen.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur Gewinnung von Tumorsphären aus Krebszelllinien und primären menschlichen Proben. Tumorsphären werden in einer Unterpopulation mit Stammzell-ähnlichen Eigenschaften angereichert36. Diese Anreicherung in CSC ist abhängig von der Lebensfähigkeit in einer ankerfreien Umgebung, während differenzierte Zellen auf die Haftung auf einem Substrat angewiesen sind37. Da die primäre Beschichtung von Tumorzellen in einer Umgebung mit geringer Haftung, die eine Suspension vorschreibt, keine Anreicherung in CSC an sich gewährleistet, bieten wir Strategien zur Bewertung der Selbsterneuerung (kugelbildende Kapazität und Selbsterneuerung), der Differenzierungskapazität (abgeleitete Anhängerpopulationen) und des Phänotyps von CSC (mit Durchflusszytometrie und/oder Western-Blot). Krebsstammzellen können über mehrere breit beschriebene phänotyptische Marker identifiziert werden (siehe Tabelle 1).

Da menschliche Tumorprimärkulturen oft eine Herausforderung darstellen, um sie in der Kultur zu etablieren und zu pflegen, könnte das kugelbildende Protokoll ein Werkzeug für den Umgang mit diesen Proben sein. Das enzymatische Verdauungsverfahren schlug vor, einzellige Suspensionen aus Endometriumgewebeproben38. Das kugelbildende Protokoll liefert eine erhebliche Anzahl von CSC, die auf andere Weise nur schwer zu erhalten sind. Das dreidimensionale Modell könnte die in vivo-Situation, nämlich die physiologische Mikroumgebung und die Tumorheterogenität, effizienter nachahmen als herkömmliche monolayer Zellkulturen.

Die Gewissheit über den monoklonalen Ursprung von Tumorsphären ist ein entscheidender Schritt dieses Protokolls. Die Minimierung der Aggregation, die in Suspensionskulturen auftritt, und eine gründliche Optimierung der Sädichten zur Verteilung einzelliger Suspensionen sind entscheidend24. Andere Autoren schlugen die Beschichtung einer einzelnen Zelle pro Brunnen39,40vor. Um dieses mühsame Verfahren zu vermeiden, haben wir dieses Problem überstanden, indem wir sicherstellen, dass eine einzellige Suspension in geringer Dichte in einem methylcelluloseangereicherten Medium plattiert wird. Aufgrund seiner Wasserhaltung und Viskosität verbessernden Eigenschaften23, Methylcellulose bietet ein halbfestes Medium, das Migration und Aggregation vermeidet, die Monoklonalität der erhaltenen Kugeln21zu gewährleisten. Die Anzahl der Tage in der Kultur ist ein weiterer Aspekt, der von der Optimierung abhängt, da die Anzahl der Tage, die notwendig sind, um Kugeln mit Durchmessern von mehr als 40 m zu erhalten, von jedem Zelltyp, derdie Verdoppelungszeit 24beträgt, abhängt. Das niedrige oder serumfreie Medium ist ein weiteres Merkmal des Protokolls, da das FBS-haltige Medium für das differenzierte Zellwachstum in anhaftenden Bedingungen41relevant ist, wie in den elternhaften Zelllinien und in den abgeleiteten haftenden Zellen. Das Protokoll hängt von der Aufrechterhaltung einer stetigen Konzentration der spezifischen Wachstumsfaktoren ab. EGF-Signalisierung spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Pluripotenz Wege, während bFGF fungiert als Mitogen beitrage zur Erzeugung von Kugeln42,43.

Das mit geeigneten Techniken verbundene kugelbildende Protokoll bietet die Möglichkeit, bestimmte Populationen von CSC21zu erweitern, zu isolieren und zu bewerten. Mehrere Autoren haben auf ihren Nutzen bei der Beurteilung der Stammzellgenexpression44,45,46,47 und Der Stammheit in Tumoren47,48, zur Untersuchung epitheliaal-mesenchymaler Übergänge44,49 und Tumorigenese45,48, zur Bewertung der Wirkung neuer Therapien21,50 und Medikamentenresistenz44, 51, und Kulturen aus Primärproben zu etablieren21,45,46. Es ist jedoch wichtig zu bedenken, dass es sich um ein sensibles Experiment handelt, das in hohem Maße von angemessenen Kulturbedingungen abhängig ist. Darüber hinaus stellen die Sphären aufgrund der CSC-Asymmetrischen Teilung52 eine zelluläre Heterogenität dar und stellen kein gutes Modell für die Komplexität der Bildung und Erhaltung von Krebsstammzellen in der in vivo Nische46dar.

Neben dem kugelbildenden Protokoll wurden weitere funktionelle Assays zum Nachweis von CSC verwendet. In vivo Tumorigenizität beinhaltet die Impfung von niedrigen Zellzahlen in immungeschwächten Mäusen, um Tumore zu erhalten36,53. Dies hängt von der Verfügbarkeit geeigneter Bedingungen für die Durchführung von Tierstudien ab, und aufgrund der nicht artspezifischen Mikroumgebung könnte die Wiederherstellung lebender Zellen eine Herausforderung darstellen. Ein Kolonie bildender Einheitentest, der die Zellfähigkeit bewertet, Kolonien zu erzeugen, nachdem sie mit niedriger Dichte52plattiert wurden, liefert niedrige Zellzahlen. Die Side-Population beruht auf der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS), um eine Gruppe von Zellen zu isolieren, mit der Fähigkeit, den Hoescht 33342-Fleck zu extrudieren. Diese empfindliche Methode beruht auf der Expression von ATP-Bindungskassettenprotein (ABC) Transportern, verantwortlich für das Medikament Efflux54. Nichtsdestotrotz ist die Seitenpopulation mit einigen Nachteilen verbunden, nämlich der Unspezifität einiger Phänotypen von CSC und der Eigenschaften des Farbstoffs, der toxisch ist und weitgehend durch experimentelle Bedingungen (Temperatur, Konzentration) beeinflusst wird54,55. ALDEFLUOR ist ein weiterer auf Flusszytometrie basierender Assay zur Identifizierung von Zellen mit intrazellulärer ALDH-Aktivität. Das Hauptproblem ist die fehlende Reproduzierbarkeit zwischen Studien, die stark von den Kulturbedingungen beeinflusst zu sein scheinen54.

Das kugelbildende Protokoll wird oft mit einer phänotienden Analyse kombiniert, wie wir hier vorgeschlagen haben, wobei der Nutzen komplementärer Methoden zur Identifizierung von CSC13,14betont wird. Wir empfahlen die CSC-Anreicherung über das kugelbildende Protokoll und eine weitere Bestätigung der Stammfähigkeit durch Bewertung biochemischer Marker durch Durchflusszytometrie und Western Blot. Studien zur Durchflusszytometrie identifizierten heterogene Populationen innerhalb der Sphären. Tatsächlich gibt es eine Anreicherung in CSC in den gezeigten Studien, dargestellt in diesem Protokoll durch die CD44high/CD24Low Cells. Aufgrund der asymmetrischen Selbsterneuerung von CSCwurdenauch andere Zellphänotypen identifiziert. Im Fall von CD133 zeigten repräsentative Ergebnisse, dass die Population mit höherer Stammkraft im Falle der ECC-1-Zelllinie positiv, in RL95-2-Sphären jedoch negativ war. Dies weist auf den Mangel an Spezifität einiger beschriebener CSC-Marker hin, die nicht nur für diese Zellen gelten und mit der Plastizität des Phänotyps variieren können, und auf die Bedeutung der Verwendung einer Kombination von Strategien zur Bestätigung der Stammfähigkeit.

Western Blot ist eine alternative Methode, die in bestimmten Fällen nützlich sein könnte. Während beispielsweise die ALDH-Aktivität weit verbreitet ist, ist es nun bekannt, dass mehrere Isoformen zur ALDEFLUOR-Metabolisierung54beitragen. So könnten spezifische Antigen-Antikörper-Methoden zuverlässiger sein und wir haben bereits den Zusammenhang zwischen ALDH-Proteinexpression und Stammheit13,14gezeigt.

Sphärenbildende Kapazität, Selbsterneuerung und abgeleitete Anhängerpopulationen stellen die Fähigkeit von CSC dar, sich auf unbestimmte Zeit zu teilen und eine differenzierte Nachkommenschaft zu erzeugen, was klinisch zu Ereignissen wie Rückfall, Metastisierung und Resistenz gegen Behandlung9übersetzt wird. Die Arzneimittelresistenz in CSC kann durch Überexpression von Multidrug Resistance (MDR) Membranproteinen, ALDH-Expression, die an Entgiftungsmechanismen beteiligt ist, DNA-Reparaturmechanismen, Schutz vor reaktiven Sauerstoffspezies und Resistenz gegen Apoptose56erklärt werden. CSC haben die Fähigkeit, aufgrund ihrer Plastizität still zu sein, und dies hat sich als ein Mechanismus der Arzneimittelresistenz herausgestellt. Diese Population kann durch zellzyklushafte differenzierte Zellen von Chemo- und Strahlentherapie verschont bleiben57. Sphären sind eine Tumorpopulation mit berichteter Resistenz gegen zytostatische Medikamente, die in konventioneller Behandlung verwendet werden und waren auch ein Fokus für die Kombination mit gezielten Therapien54,58,59. Die Empfindlichkeit von Kugeln kann auf Zytostatika getestet werden, die bei Brust- und Endometriumkrebs verwendet werden. Darüber hinaus kann die Isolierung von CSC aus einer Tumorprobe eine Plattform für die klinische Anwendung der Therapie sein, die für jeden Tumor spezifisch ist, um Resistenzen und daraus resultierende wiederkehrende Erkrankungen vorherzusagen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Studie wurde von der Portugiesischen Gesellschaft für Gynäkologie durch den Forschungspreis 2016 und von CIMAGO finanziert. Cnc. IBILI wird von der Foundation for Science and Technology, Portugal (UID/NEU/04539/2013) unterstützt und von FEDER-COMPETE (POCI-01-0145-FEDER-007440) kofinanziert. Die Tumorbank des Coimbra Hospital and Universitary Center (CHUC), die von der Ethikkommission für Gesundheit des CHUC und der portugiesischen Nationalen Datenschutzkommission genehmigt wurde, war die Quelle von Endometriumproben von Patienten, die beim Gynäkologiedienst der Einrichtung durchgeführt wurden. Abbildung 1 wurde mit Servier Medical Art erstellt, erhältlich bei www.servier.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 100983
Accutase Gibco A1110501 StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent
ALDH antibody Santa Cruz Biotechnology SC166362
Annexin V FITC BD Biosciences 556547
Antibiotic antimycotic solution Sigma A5955
BCA assay Thermo Scientific 23225 Pierce BCA Protein Assay Kit
Bovine serum albumin Sigma A9418
CD133 antibody Miteny Biotec 293C3-APC Allophycocyanin (APC)
CD24 antibody BD Biosciences 658331 Allophycocyanin-H7 (APC-H7)
CD44 antibody Biolegend 103020 Pacific Blue (PB)
Cell strainer BD Falcon 352340 40 µM
Collagenase, type IV Gibco 17104-019
cOmplete Mini Roche 118 361 700 0
Dithiothreitol Sigma 43815
DMEM-F12 Sigma D8900
DNAse I Roche 11284932001
ECC-1 ATCC CRL-2923 Human endometrium adenocarcinoma cell line
Epidermal growth factor Sigma E9644
Fibroblast growth factor basic Sigma F0291
Haemocytometer VWR HERE1080339
HCC1806 ATCC CRL-2335 Human mammary squamous cell carcinoma cell line
Insulin, transferrin, selenium Solution Gibco 41400045
MCF7 ATCC HTB-22 Human mammary adenocarcinoma cell line
Methylcellulose AlfaAesar 45490
NaCl JMGS 37040005002212
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate Sigma P3932
Putrescine Sigma P7505
RL95-2 ATCC CRL-1671 Human endometrium carcinoma cell line
Sodium deoxycholic acid JMS EINECS 206-132-7
Sodium dodecyl sulfate Sigma 436143
Tris JMGS 20360000BP152112
Triton-X 100 Merck 108603
Trypan blue Sigma T8154
Trypsin-EDTA Sigma T4049
ß-actin antibody Sigma A5316

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