Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Få kreft stamcellesfærer fra gynekologiske og brystkreft svulster

Published: March 1, 2020 doi: 10.3791/60022
Automatic Translation
*1,2,3,4, *1,2,3,4,5,6, 1,2,3, 2,7, 1,2,3,4,8, 9, 3,9,10, 1,2,3,4,8
1Institute of Biophysics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 2Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR), area of Environment Genetics and Oncobiology (CIMAGO), Faculty of Medicine, University of Coimbra, 3CNC.IBILI/Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, 4Clinical Academic Center of Coimbra (CACC), 5Universitary Clinic of Gynecology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 6Gynecology A Service, Coimbra Hospital and Universitary Center, 7Institute of Pharmacology & Experimental Therapeutics, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 8Institute of Experimental Pathology, Faculty of Medicine, University of Coimbra, 9Cytometry Operational Management Unit, Clinical Pathology Service, Coimbra Hospital and Universitary Center, 10Polytechnic Institute of Coimbra, ESTESC-Coimbra Health School, Laboratory Biomedical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Målet med denne metodikken er å identifisere kreftstamceller (CSC) i kreftcellelinjer og primære menneskelige tumorprøver med sfæredannende protokoll, på en robust måte, ved hjelp av funksjonelle analyser og fenotypisk karakterisering med flow cytometri og vestlig Blot.

Abstract

Kreft stamceller (CSC) er en liten befolkning med selvfornyelse og plastisitet som er ansvarlig for tumorigenese, motstand mot behandling og tilbakevendende sykdom. Denne populasjonen kan identifiseres med overflatemarkører, enzymatisk aktivitet og en funksjonell profil. Disse tilnærmingene per se er begrenset, på grunn av fenotypisk heterogenitet og CSC plastisitet. Her oppdaterer vi sfæreformingsprotokollen for å få CSC-kuler fra bryst- og gynekologiske kreftformer, vurdere funksjonelle egenskaper, CSC-markører og proteinuttrykk. Kulene oppnås med encellede seeding ved lav tetthet i suspensjonskultur, ved hjelp av et halvsolid metylcellulosemedium for å unngå migrasjon og aggregater. Denne lønnsomme protokollen kan brukes i kreftcellelinjer, men også i primære svulster. Den tredimensjonale ikke-tilhenger suspensjon kultur antatt å etterligne tumor mikromiljøet, spesielt CSC-nisje, er supplert med epidermal vekstfaktor og grunnleggende fibroblast vekstfaktor for å sikre CSC signalering. Med sikte på robust identifisering av CSC foreslår vi en komplementær tilnærming, som kombinerer funksjonell og fenotypisk evaluering. Sfæredannende kapasitet, selvfornyelseog sfæreprojeksjonsområde etablerer CSC funksjonelle egenskaper. I tillegg består karakterisering av flytcytometri evaluering av markørene, representert ved CD44+/CD24- og CD133, og vestlig blot, vurderer ALDH. Den presenterte protokollen ble også optimalisert for primære tumorprøver, etter en prøvefordøyelsesprosedyre, nyttig for translasjonell forskning.

Introduction

Kreftpopulasjoner er heterogene, med celler som presenterer forskjellige morfologer, spredning og invasjonskapasitet, på grunn av differensialgenuttrykk. Blant disse cellene finnes en minoritetspopulasjon kalt kreftstamceller (CSC)1, som har kapasitet til selvfornyelse, rekapitulere heterogeniteten til den primære tumornisjen og produserer avvikende differensierende forfedre som ikke reagerer tilstrekkelig på homeostatiske kontroller2. CSC egenskaper kan oversettes direkte i klinisk praksis, gitt foreningen med hendelser, som tumorigeniitet eller motstand mot kjemoterapi3. Identifisering av CSC kan føre til utvikling av målrettede terapier som kan omfatte blokkering av overflatemarkører, markedsføring av CSC-differensiering, blokkering av CSC-signalbanekomponenter, nisjeødeleggelse og epigenetiske mekanismer4.

Isoleringen av CSC er utført i cellelinjer og i prøver av primære svulster5,6,7,8. Den funksjonelle profilen som er beskrevet for CSC inkluderer klonogen kapasitet, sidepopulasjon og tumorosfæredannelse9. CD44høy/CD24lav fenotype har vært konsekvent forbundet med bryst CSC, som har vist seg å være tumorigen in vivo og har allerede vært forbundet med epitel til mesenchymal overgang5,10. Høy ALDH-aktivitet har også vært forbundet med stemness og epitel til mesenchymal overgang (EMT) i flere typer solide svulster11. ALDH uttrykk har vært forbundet med motstand mot kjemoterapi og csc fenotype in vitro12,13,14,15,16. Flere andre markører har vært knyttet til CSC egenskaper i ulike typer svulster, for eksempel CD133, CD49f, ITGA6, CD1663,4 og andre, som beskrevet i tabell 1.

Tumorsfærene består av en tredimensjonal modell for studiet og utvidelse av CSC. I denne modellen dyrkes cellesuspensjonene fra cellelinjer og fra blod- eller tumorprøver i et medium supplert med vekstfaktorer, nemlig epidermal vekstfaktor (EGF) og grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF), uten føtal storfe serum og i ikke-tilhengerforhold17. Hemming av cellevedheft resulterer i død av anoikis av differensierte celler18. Kuler er avledet fra klonal vekst av en isolert celle. For dette formålet distribueres cellene med lav tetthet for å unngå cellefusjon og aggregasjon19. En annen strategi inkluderer bruk av semisolid metylcellulose20.

Den sfæredannende protokollen fikk popularitet i CSC isolasjon og ekspansjon, på grunn av tid og kostnader og tekniske, lønnsomme og reproduserbare grunner21,22. Til tross for noen reserver på omfanget av hvilken sfæredannelse gjenspeiler CSC, er det en tilbøyelighet til stamceller å vokse i ikke-overholdende forhold med den karakteristiske fenotypen, som ligner den opprinnelige mikromiljøet21. Ingen av metodene som er tilgjengelige for isolering av CSC fra solide svulster har fullstendig effektivitet, og fremhever viktigheten av å utvikle mer spesifikke markører eller kombinasjoner av metoder og markører.

I denne protokollen beskriver vi isoleringen av CSC med sfæredannende protokoll, med prinsippet om encellet vekst i ikke-etterfølgende forhold og evnen til å produsere en differensiert fenotype. En skjematisk representasjon av denne prosedyren er representert i figur 1. Vi beskriver også karakteriseringen med overflatemarkører og ALDH-uttrykk for CSC, både for bryst- og gynekologiske tumorceller linjer og prøver av primære svulster.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen ble utført i samsvar med de etiske retningslinjene til Coimbra Hospital and Universitary Center (CHUC) Tumor Bank, og ble godkjent av CHUCs etikkkomité for helse og av Den portugisiske nasjonale databeskyttelseskommisjonen.

1. Sfæredannende protokoll og avledede tilhengere populasjoner fra kontinuerlige cellekulturer

MERK: Utfør alle prosedyrer under strenge sterile forhold.

  1. Tilberedning av ikke-tilhengeropphengskulturflasker eller plater ved å dekke vekstflaten med poly(2-hydroksyettyl-metakrylat (poly-HEMA)
    1. Forbered en 15 mg/ml oppløsning ved å røre poly-HEMA i absolutt etanol ved 65 °C. Pelscellekulturflasker eller plater med 50 μL/cm2.
    2. La det tørke ved 37 °C i en tørkeovn. Om nødvendig, pakk platene og oppbevar ved romtemperatur.
  2. Utarbeidelse av sfærekuletituringsmediet (SCM)
    1. Forbered en 2% løsning av metylcellulose i ultrarent vann og steriliser i autoklavet. Methylcellulose har en tendens til å være lettere å oppløse ved kjøling; Disperpulveret i vann ved 80 °C og rør til det er avkjølt23.
    2. Forbered en to ganger konsentrert løsning av SCM (lagerløsning). SCM arbeidsløsning inneholder DMEM-F12, supplert med 100 mM putrescine, 1% insulin, transferrin, selen og 1% antibiotika-antimykotisk oppløsning (10.000 U / ml penicillin, 10 mg / ml streptomycin og 25 μg / ml amfotericin B).
    3. For å forberede SCM, bland like volumer av SCM-lagerløsningen med 2% løsningen av metylcellulose.
    4. Fullfør mediet umiddelbart før bruk ved å legge til 10 ng /ml epidermal vekstfaktor (EFG) og 10 ng / ml grunnleggende fibroblast vekstfaktor (bFGF).
    5. Hvis mer kresen cellelinjer er i bruk, supplere mediet med 0,4% storfe serum albumin, noe som kan være en fordel.
  3. Start med en kolbe av MCF7 eller HCC1806 brystkreft eller ECC-1 eller RL95-2 endometriekreftceller (eller andre kreftcellelinjer) med 80% til 90% samløpet.
  4. Kast cellekulturmediene, vask med fosfatbufret saltvannsoppløsning (PBS) og løsne cellene med trypsin-EDTA (1 til 2 ml for en 75 cm2 celle kulturkolbe).
  5. Tilsett cellekulturmedier (2 til 4 ml for en 75 cm2 cellekulturkolbe) og sentrifuge ved 200 x g i 5 min for å forkaste enzymer.
  6. Heng pelleten i et kjent volum av cellekulturmedier og pipette opp og ned for å sikre en enkelt cellesuspensjon. Til dette formålet kan en 40 μm cellesil brukes.
  7. Telle cellene i hemocytometeret og beregne cellekonsentrasjonen av cellesuspensjonen. Dra nytte av dette trinnet for å sikre observasjon av en enkelt celle suspensjon. Forsiktig celletelling er avgjørende for å nøyaktig kvantifisere effekten av behandlinger.
  8. Suspender den bestemte mengden cellesuspensjon i SCM komplett medium og overfør til poly-HEMA belagtretter. Som referanseverdi for såingstetthet, bør du vurdere 500 til 2000 celler/cm2.
    MERK: Optimalisering av seeding tetthet og kulturtid for hver cellelinje anbefales sterkt24.
  9. Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 2 dager uten å forstyrre platene.
  10. Re-etablere konsentrasjonen av vekstfaktorer ved å legge til 10 ng / ml EFG og 10 ng / ml bFGF til cellekultur media. Gjenta dette trinnet annenhver dag.
  11. Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 inntil 5 dager etter plating (dette kan variere fra 3 til 12 dager i henhold til cellelinjen) for å oppnå kuler, som presenterer morfologien til suspensjonballformede cellekolonier.
  12. Bruk eller samle kulene, ved pipettering, for forsøkene.
  13. For å oppnå avledede tilhengere populasjoner, plasser kulene i standard kulturforhold, respektive av cellelinjen som brukes. 1 til 2 dager senere er det mulig å observere et monolayer av celler som vokser rundt tilhengerkuler, som presenterer en morfologi som ligner på opprinnelseslinjen.

2. Sfæredannende protokoll fra humane tumorprøver

MERK: Bruken av menneskelige prøver til forskningsformål må være i samsvar med hvert lands lovgivning, og for å bli godkjent av etikkkomiteen for de involverte institusjonene.

  1. Forbered transportmediet som inneholder DMEM/F12, supplert med 10 % føtal storfeserum (FBS) og 2 % antibiotikaantimykotisk oppløsning (10 000 U/ml penicillin, 10 mg/ml streptomycin og 25 μg/ml amfotericin B).
  2. Forbered fordøyelsesmediene som inneholder DMEM/F12, supplert med 10 % FBS, 1 % antimykotisk løsning, 1 mg/ml type IV kollagenog 100 μg/ml DNAse I.
  3. Forbered enzyminaktiveringsmediet som inneholder DMEM/F12, supplert med 10 % FBS og 1 % antimykotisk oppløsning (10 000 U/ml penicillin, 10 mg/ml streptomycin og 25 μg/ml amfotericin B).
  4. Klargjør SCM som beskrevet i avsnitt 1.2.
  5. Få prøven under den makroskopiske studien av det operative stykket så snart som mulig etter kirurgisk fjerning.
  6. Plasser prøvene i transportmedier og overfør dem til laboratoriet for hvor behandlingen. Prøvebehandling bør begynne innen 1 t etter innsamling for å forbedre suksessraten for prosedyren. Bruk forsiktighet i prøveinnsamling. Håndter prøvene forsiktig. Unngå bruk av nekrotiske eller cauteriserte soner.
  7. Under det sterile strømningskammeret overfører du prøven til en tallerken og skjæres i mindre biter (rundt 1 mm3)med en skalpell.
  8. Inkuber det menneskelige vevet i et rør med fordøyelsesmedia i en roterende shaker opp til 180 min, ved 37 °C. Identifiser dette røret som Rør A.
  9. Skift ut enzymoppløsningen hver 15 min.
    1. Samle fordøyelsesmediene (uten å fjerne vevsfragmenter) og overfør den gjennom en 40 μm cellesil til et nytt rør halvfylt med enzyminaktiveringsmedier. Vedlikehold dette røret ved romtemperatur og identifiser det som Rør B.
    2. Tilsett nye fordøyelsesmedier til Rør A og returner den til den roterende shakeren ved 37 °C.
    3. Ved hver samling, sjekk celle levedyktighet ved hjelp av trypan blå ekskluderingsmetode.
    4. Gjenta denne prosedyren i 180 min eller til celletallet er betydelig lavere.
  10. Inkuber vevsfragmentene i rør A i en annen fordøyelsesløsning som inneholder like deler av accutase og trypsin-EDTA, rør i 10 min ved 37 °C.
  11. Tilsett enzyminaktiveringsmediet til rør A og filtrer innholdet gjennom en 40 μm cellesil i rør B.
  12. Sentrifuge cellesuspensjonen i rør B ved 200 x g i 10 min.
  13. Heng pelleten i SCM og kontroller cellekonsentrasjonen ved hjelp av et hemocytometer.
  14. Suspendere den bestemte mengden cellesuspensjon i SCM og overfør til poly-HEMA belagtretter (se trinn 1.1) med en såing tetthet på 4000 celler / cm2.
  15. Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 2 dager uten å forstyrre platene.
  16. Re-etablere konsentrasjonen av vekstfaktorer ved å legge til 10 ng / ml EFG og 10 ng / ml bFGF til cellekultur media.
    MERK: Du må gjøre dette annenhver dag.
  17. Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 inntil 5 dager etter plating (dette kan variere opptil 12 dager) for å oppnå kuler, som presenterer morfologien til suspensjonballformede cellekolonier.

Figure 1
Figur 1: Få kreft stamceller fra humane endometrietumorprøver (A) og bryst og gynekologisk kreft cellelinjer (B). Menneskelige tumorprøver er fragmentert, enzymatically fordøyd og belagt i sfære kulde medium i poly-HEMA belagt retter. Kreftcellelinjer er løsrevet, cellesuspensjoner telles, og enkeltceller fordeles ved lav tetthet i poly-HEMA belagtplater under passende forhold. Kulene som oppnås, når de plasseres under vanskelige kulturforhold, produserer avledede tilhengere. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

3. Sfæredannende kapasitet, selvfornyelse og sfæreprojeksjonsområde

MERK: Sfæredannende kapasitet er evnen til en tumorcellepopulasjon til å produsere kuler. Selvfornyelse er evnen til sfæreceller til å produsere nye kolonier av sfæriske celler i suspensjon. Sfæreprojeksjonsområdet er representativt for området okkupert av sfæren og derfor uttrykksfulle for deres størrelse og antall celledelinger som er gjennomgått i en viss tidsperiode.

  1. Bestemme sfæredannende kapasitet
    1. Etter ferdigstillelse av sfæreformingsprotokollen, samle kulene i et sentrifugerør og sentrifuge på 125 x g i 5 min.
    2. Kast SCM og forsiktig suspendere pellet i et kjent volum av friske medier. Med sikte på å konsentrere sfærene for å lette tellingen, suspendere kulene i et lite medievolum. Vær forsiktig så du ikke forstyrrer kulene.
    3. Bruk et hemocytometer for å telle kulene med mer enn 40 μm i diameter. Alternativt kan kuler telles direkte på platen ved hjelp av et mikroskop utstyrt med en graticule25 eller ved hjelp av et automatisert system26,27.
    4. Beregn prosentforholdet mellom sfærer oppnådd vs. antall celler i utgangspunktet belagt.
  2. Bestemme selvfornyelse
    1. Etter ferdigstillelse av sfæreformingsprotokollen, samle kulene i et sentrifugerør og sentrifuge på 125 x g i 5 min.
    2. Kast sfæren culturing media og forsiktig suspendere pellet i trypsin-EDTA.
    3. Inkuber opptil 5 min ved 37 °C.
    4. Tilsett enzyminaktiveringsmedier og pipette opp og ned for å sikre en enkelt cellesuspensjon.
    5. Bruk av hemocytometer og trypan blå eksklusjonsmetode, telle levedyktige celler i suspensjonen.
    6. Start sfæreformingsprotokollen som beskrevet i avsnitt 1.
    7. Etter 8 dager, bruk et hemocytometer for å telle kulene med mer enn 40 μm i diameter.
    8. Beregn prosentforholdet mellom sfærer oppnådd vs. antall celler i utgangspunktet belagt.
  3. Bestemme sfæreprojeksjonsområdet
    1. For å evaluere området okkupert av sfærene, få bilder av minst 10 tilfeldige felt per tilstand, i et omvendt mikroskop utstyrt med en bildeoppkjøpsmodul. En forstørrelse på 100X til 400X anbefales.
    2. Analyser bilder ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare, for eksempel ImageJ-programvare28, ved å tegne interesseområder som tilsvarer sfærene og måle området i piksler.
    3. Beregn sfæreprojeksjonsområdet som gjennomsnittlig område av piksler målt.

4. Kreft Stamcelle markør vurdering med Flow Cytometri

MERK: CD44+/CD24-/lav fenotype var konsekvent forbundet med bryst- og gynekologiske kreftstamceller. Prosedyren som er beskrevet, kan brukes til å evaluere denne og andre celleoverflatemarkører.

  1. Etter ferdigstillelse av sfæreformingsprotokollen, samle kulene i et sentrifugerør og sentrifuge på 125 x g i 5 min.
  2. Kast SCM og forsiktig suspendere pellet i trypsin-EDTA.
  3. Inkuber opptil 5 min ved 37 °C.
  4. Tilsett enzyminaktiveringsmedier og pipette opp og ned for å sikre en enkelt cellesuspensjon.
  5. Sentrifuge ved 125 x g i 5 min, kast supernatanten og heng forsiktig cellene i PBS.
  6. La cellene hvile i suspensjon i 30 min for å sikre utvinning av membrankonformasjonen.
  7. Bruk et hemocytometer og trypan blå eksklusjonsmetode, telle cellene i suspensjonen.
  8. Juster celleopphengsvolumet til 106 celler/500 μL.
  9. Inkuber med monoklonale antistoffer i henhold til instruksjonene fra leverandørene (konsentrasjon, tid, temperatur og lys / mørk) og vurderer eksperimentsettet representert i tabell 2 eller markørene gitt i tabell 1.
  10. Umiddelbart etter farging, utfør flow cytometrisk analyse ved hjelp av et strømningscytometer med passende deteksjonsmoduler.
  11. Standardiser stometeroppsett, etter protokoller etablert av EuroFlow Consortium29.
  12. Sett opp primære porter basert på for- og sidescatteren unntatt rusk og døde celler. Dette kan forbedres ved samtidig merking med vedlegg I V og gating negative celler.
  13. Sett fluorescensporter basert på de ufargede prøvene og kompensasjonen for en spektral overlapping ved hjelp av enkeltfargede kontroller.

5. Kreft Stamcelle markør vurdering med Western Blot

MERK: I tillegg til ALDH1 aktivitet, høy uttrykk for denne markøren var konsekvent forbundet med bryst og gynekologisk kreft stamceller13,14. Prosedyren som er beskrevet, kan brukes til å evaluere dette og andre cellemarkører.

  1. Etter ferdigstillelse av sfæreformingsprotokollen, samle kulene i et sentrifugerør og sentrifuge på 125 x g i 5 min.
  2. Forberedelse av hele cellen lysates
    1. Plasser sentrifugerørene på is og kast supernatanten uten å forstyrre pelleten.
    2. Vask pelleten med 1 ml kald PBS og kast ved sentrifugering.
    3. Heng pelleten i et lite volum (200-500 μL) ripa lysisbuffer30 (NaCl 150 mM, Tris-HCl 1,50 mM pH 7,4, Triton-X100 1% vol./vol., natrium deoxycholic acid 0,5% wt./vol., natrium dodecylsulfat 0,5% wt./vol.) supplert med cOmplete Mini og dithiothreitol 1 mM.
    4. Opprettholde prøvene kald (på is), sende dem til vortex og sonikering med en 30% amplitude.
    5. Sentrifuge prøvene for 15 min ved 14.000 x g i en nedkjølt sentrifuge satt til 4 °C.
    6. Overfør supernatants til nye, riktig identifiserte mikrorør.
    7. Bestem proteinkonsentrasjonene ved hjelp av BCA eller Bradford-analyser31.
    8. Lagre om nødvendig prøvene ved -80 °C til ytterligere western blotanalyse.
  3. Utfør prøvedenaturering, elektroforese, elektronoverføring og proteindeteksjon i henhold til standard vestlige blotting protokoller, som beskrevet32,33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den sfæredannende protokollen gjør det mulig å få sfæriske kolonier i suspensjon fra flere endometrie- og brystkreftcellelinjer (figur 2A) eller etter mild enzymatisk fordøyelse av vev fra menneskelige tumorprøver (Figur 2E). I begge tilfeller, noen dager etter plating, oppnås monoklonale sfæriske kolonier i suspensjon. Både endometrie- og brystkreftsfærer gir opphav til en cellemonolayer med lignende morfologi til opprinnelsescellelinjen, 1 til 2 dager etter plating (Figur 2A).

Distinkt avstamning og vev opprinnelse kan sammenlignes med sfæredannende kapasitet, selvfornyelse og projeksjon området. Representative resultater fra brystkreftcellelinjer kan observeres i grafene i figur 2B-D. De hormonelle reseptorpositive brystkreft MCF7 cellene viser høyere sfæredannende kapasitet, selvfornyelse og projeksjon området enn trippel negative brystkreft celler HCC180614. For begge cellelinjene er en liten prosentandel av cellene belagt (mindre enn 3 %) var i stand til å produsere sfærer med vekt på kreftstamceller som en minoritetspopulasjon i tumorcelleheterogenitet. Kreftstamceller selvfornyelse ble patentert av en betydelig annen verdi av sfære selvfornyelse av cellelinjene representert. Sfæreprojeksjonsområde, som et grovt mål på kulenes dimensjon, korrelerer med antall mitotiske sykluser og viser forskjellige tidsintervaller for begge linjene.

Mens bare en liten andel av cellene er i stand til å danne tumorsfærer in vitro og beholde selvfornyelseskapasitet som bærer stamcelleegenskaper, var flere markører forbundet med denne fenotypen.

Flow cytometri protokollen presentert gir mulighet for allsidige eksperimentelle tilnærminger, vurderer overflaten antigener (se tabell 1). Representative resultater, vist i figur 3A-B, gjelder CD44/CD24 og CD133 membranmarkører som har blitt foreslått som tilsvarende en mer kreftstamcellelignende fenotype. Analyse av kuler hentet fra endometrie REGis og ECC-1 cellelinjer tillot fire populasjoner å bli identifisert (Figur 3A). Sfærer hentet fra endometrie RL95-2 besto av en CD44høy/ CD24- befolkning tre ganger større enn foreldrecellelinjen35. I tilfelle av ECC-1 sfærer, CD44høy/ CD24- tilsvarer den store befolkningen, som også er CD133 positiv, mens CD44lav/ CD24-, CD44lav/ CD24+ og CD44-/ CD24+ har negative eller lave CD133 uttrykk.

Vurdering av overflate- og intracellulære markører kan også utføres ved vestlig blot etter mild sfærehøsting og forsiktig proteinprøveforberedelse. Figur 3C viser typiske resultater av ALDH-endring, en markør hvis økt aktivitet eller utvidet proteinuttrykk er forbundet med kreftstamcellefenotype13,14 på kuler og avledede tilhengere celler om endometrial ECC1 cellelinje av opprinnelse.

Figure 2
Figur 2: Endometrial og brystkreftceller, sfærer og avledede tilhengere populasjoner. - Jeg har ikke noe åsi. . Representative bilder av endometrie (RL95-2 og ECC-1) og bryst (MCF7 og HCC1806) kreftcellelinjer, respektive endometrie (ES1) og bryst (MS1) sfærer og avledede tilhengere populasjoner (G1). Representative bilder av RL95-2, ECC-1, MCF7 og HCC1806 kreftcellelinjer ble oppnådd ved en forstørrelse på 200x (Skalabar = 50 μm). Representative bilder av ES1 RL95-2 og ES1 ECC-1 ble innhentet ved en forstørrelse på 200x (Skalabar = 50 μm). Representative bilder av MS1 MCF7 og MS1 HCC1806 ble innhentet ved en forstørrelse på 200x (Skalabar = 100 μm). Representative bilder av G1 RL95-2 og G1 ECC-1 ble innhentet ved en forstørrelse på 200x (Skalabar = 50 μm). Representative bilder av G1 MCF7 og G1 HCC1806 ble innhentet ved en forstørrelse på 200x (Skalabar = 100 μm). - Jeg har ikke noeå si. . Sfæredannende kapasitet, selvfornyelse og sfæreprojeksjonsområde av brystkreftsfærer MCF7 og HCC1806. -Jeg har ikke noe å si. . Representative bilder av kuler hentet fra humane endometrietumorprøver. Disse bildene ble tatt ved en forstørrelse på 200x (Skalabar = 50 μm). En del av dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon med tillatelse fra utgiveren14. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Kombinert evaluering av kreftstamceller markører i endometriekreftceller. - Jeg har ikke noe åsi. . Representative tomter av CD44/ CD24 merking av RL95-2 cellelinjen og av RL95-2 sfæreceller. - Jeg har ikke noe åsi. . Representative histogrammer av CD133 merking av sfæreceller (ES1) hentet fra RL95-2 og ECC-1 cellelinjer. Tetthet representerer et mål på celleantallet. CD44+/CD24-, CD44lav/CD24-, CD44lav/ CD24± og CD44-/ CD24+ populasjoner er malt i grønt, rosa, blått og gult, henholdsvis. C. ALDH uttrykk i ECC-1 cellelinje, sfærer (ES1), og avledet tilhengerpopulasjon (G1). Immunoblot representerer ALDH og actin uttrykk for de respektive eksperimentelle forhold. ALDH-uttrykk ble evaluert med antistoffet ALDH1/2, som oppdager isoforms ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3 og ALDH2 av mus, rotte og menneskelig opprinnelse. En del av dette tallet er endret fra tidligere publikasjoner med tillatelse fra utgiverne13. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Tabell 1: Liste over gynekologiske og brystkreft stamceller markører.

Markør Stamcelle opprinnelse Referanser
CD24 (CD24) Eggstokkreft 60
CD29 (andre) Brystkreft 61
CD44 (CD44) Eggstokkreft 62,63
CD44/CD24-/lav Brystkreft 13,5,3,64
CD44+/CD24-/lav/ESA Brystkreft 65
CD44/ALDH1+/hi Brystkreft 66
CD44/CD24-/lav/ABCG2 Brystkreft 67
CD44/CD24-/lav/ALDH1 Brystkreft 43,68,69
CD44/CD24-/lav/EpCAM Brystkreft 5
CD44/CD24-/lav/SSEA-3 Brystkreft 70
CD44/CD49f/CD133/2 Brystkreft 71
CD44/CD133/ALDH1+/hi Brystkreft 69
CD44/CD117 Eggstokkreft 7
CD44/MyD88 Eggstokkreft 72,73
CD44/E-kadherin-/CD34- Eggstokkreft 74,75
CD44/CD24/Epcam Eggstokkreft 76,77
CD44/CD24- Eggstokkreft 78,79
CD44/CD166 Eggstokkreft 80
CD44/CD24 Livmorhalskreft 81
Cd49f (andre) Brystkreft 4
Livmorhalskreft 82
CD117 eller c-Kit Endometrial kreft 83
Eggstokkreft 62,84
CD133 (andre) Brystkreft 4,85
Eggstokkreft 62,86
Endometrial kreft 13,87,88,89
Livmorhalskreft 82
CD133hei/CXCR4hei/ALDH1hei Brystkreft 90
CD133/ALDH1 Brystkreft 91
Eggstokkreft 60,92
CD133/CXCR4 Endometrial kreft 93
Abcg2 (andre) Brystkreft 65
Livmorhalskreft 82,81
Aldh-1 (Andre) Brystkreft 4
Endometrial kreft 94,95
Livmorhalskreft 82
CXCR4 eller CD184 Brystkreft 96
EpCAM/CD49f Brystkreft 97
EpCAMhi/PROCRhi/SSEA-3 Brystkreft 70
GD2/GD3/GD3Shei Brystkreft 98
Itga6 (andre) Brystkreft 4
PROCR (andre) Brystkreft 43

MERK: Denne tabellen gir en liste over overflateepitoper uttrykt av ulike gynekologiske og brystkreft stamceller; de fleste av disse markørene uttrykkes også av en rekke andre vev. Denne listen tar ikke sikte på å inkludere alle markører rapportert.

Tabell 2: Liste over rør som skal inkluderes i et typisk flytcytometrieksperiment for å evaluere cd24/CD44 fenotypen. Tabellen viser et minimalt sett med prøverør som kreves for et kofargingseksperiment, inkludert nødvendige kontroller.

Tube Tilstand Antigen-fluorophore
1 Ufargede celler Ingen
2 Enkeltbeiset CD44 CD44-PE (andre)
3 Enkeltbeiset CD24 CD24-APC (Cd24-APC)
4 Tofarget CD44/CD24 CD44-PE og CD24-APC

MERK: Dette eksperimentet kan utføres ved å legge til vedlegg i V-FICT til rør 4 og legge til det respektive kontrollrøret for å gate vedlegget I negative celler og utelukke eventuelle celler i apoptose.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver en tilnærming for å få tumorsfærer fra kreftcellelinjer og primære menneskelige prøver. Tumorsfærer er beriket i en underpopulasjon med stamcellelignende egenskaper36. Denne berikelsen i CSC er avhengig av levedyktighet i et forankringsfritt miljø, mens differensierte celler er avhengige av vedhende til et substrat37. Som primær plating av tumorceller i et lavt etterlevelse miljø som pålegger suspensjon sikrer ikke berikelse i CSC per se, gir vi strategier for å evaluere selvfornyelse (sfæredannende kapasitet og selvfornyelse), differensieringskapasitet (avledet tilhengerpopulasjoner) og fenotype csc (med flytcytometri og / eller vestlig blot). Kreft stamceller kan identifiseres via flere bredt beskrevet fenotypiske markører (se tabell 1).

Som menneskelige tumor primære kulturer er ofte utfordrende å etablere og å opprettholde i kultur, sfæredannende protokollen kan gi et verktøy for håndtering av disse prøvene. Den enzymatiske fordøyelsesprosedyren foreslo gitt encellede suspensjoner fra endometrievevsprøver38. Den sfæredannende protokollen gir et betydelig antall CSC, som er vanskelig å få tak i på andre måter. Den tredimensjonale modellen kan være mer effektiv til å etterligne in vivo-situasjonen, nemlig det fysiologiske mikromiljøet og tumorheterogeniteten, enn konvensjonelle monolayer cellekulturer.

Vissheten om monoklonal opprinnelse av tumorsfærer er et kritisk skritt i denne protokollen. Minimere aggregering, som har en tendens til å forekomme i suspensjon kulturer, og en grundig optimalisering av seeding tettheter for å distribuere encellede suspensjoner er avgjørende24. Andre forfattere foreslo plating av en enkelt celle per brønn39,40. For å unngå denne arbeidskrevende prosedyren overvant vi dette problemet ved å sikre at en enkeltcellesuspensjon er belagt i lav tetthet i et metylcelluloseberiket medium. På grunn av sine vannholder og viskositetsforbedrende egenskaper23,gir metylcellulose et semi-solid medium som unngår migrasjon og aggregering, noe som sikrer monoklonaliteten til sfærene oppnådd21. Antall dager i kultur er et annet aspekt som er avhengig av optimalisering, da antall dager som er nødvendige for å oppnå kuler med diametre bedre enn 40 μm, er avhengig av hver celletype doblingstid24. Det lave eller serumfrie mediet er en annen egenskap ved protokollen, da FBS-holdig medium er relevant for differensiert cellevekst i samsvarende forhold41, som i foreldrecellelinjene og i de avledede tilhengercellene. Protokollen avhenger av vedlikehold av en jevn konsentrasjon av de spesifikke vekstfaktorene. EGF signalisering spiller en viktig rolle i vedlikehold av pluripotens veier mens bFGF fungerer som en mitogen bidrar til generering av sfærer42,43.

Sfæredannende protokoll, forbundet med passende teknikker, gir midler til å utvide, isolere og evaluere bestemte populasjoner av CSC21. Flere forfattere har pekt på sin nytte i å vurdere stamcelle genuttrykk44,45,46,47 og stemness i svulster47,48, for å studere epitel-mesenchymal overgang44,49 og tumorigenese45,48, for å evaluere effekten av nye terapier21,50 og narkotikaresistens44, 51, og for å etablere kulturer fra primære prøver21,45,46. Det er imidlertid viktig å huske på at det er et følsomt eksperiment, svært avhengig av tilstrekkelige kulturforhold. I tillegg, sfærene presentere cellulær heterogenitet på grunn av CSC asymmetrisk divisjon52 og representerer ikke en god modell av kompleksiteten i kreft stamcelledannelse og vedlikehold i in vivo nisje46.

I tillegg til sfæreformingsprotokollen har andre funksjonelle analyser blitt brukt til påvisning av CSC. In vivo tumorigeniitet innebærer inokulasjon av lave celletall i immunkompromitterte mus for å oppnå svulster36,53. Dette avhenger av tilgjengeligheten av riktige forhold for å utføre dyrestudier, og på grunn av det ikke-artsspesifikke mikromiljøet kan utvinningen av levende celler være utfordrende. En kolonformingsenhetanalyse som evaluerer celleevnen til å generere kolonier etter at de er belagt ved lav tetthet52,gir lave celletall. Sidepopulasjon er avhengig av fluorescensaktivert cellesortering (FACS) for å isolere en gruppe celler med evnen til å ekstrudere Hoescht 33342-flekken. Denne følsomme metoden er avhengig av uttrykket av ATP bindende kassettprotein (ABC) transportører, ansvarlig for stoffet efflux54. Likevel er sidepopulasjonen forbundet med noen ulemper, nemlig ikke-spesifisitet for noen fenotyper av CSC og egenskapene til farge, som er giftig og i stor grad påvirket av eksperimentelle forhold (temperatur, konsentrasjon)54,55. ALDEFLUOR er en annen flow cytometribasert analyse for identifisering av celler med intracellulær ALDH-aktivitet. Hovedproblemet er mangelen på reproduserbarhet mellom studier som synes å være sterkt påvirket av kulturforholdene54.

Den sfæredannende protokollen kombineres ofte med fenotypisk analyse, som vi foreslo her, med vekt på nytten av komplementære metoder for å identifisere CSC13,14. Vi anbefalte CSC berikelse via sfæredannende protokoll og ytterligere bekreftelse av stemness via vurdering av biokjemiske markører ved flytcytometri og vestlig blot. Flow cytometri studier identifisert heterogene populasjoner innenfor sfærene. Faktisk er det en berikelse i CSC i studiene vist, representert i denne protokollen av CD44høy/ CD24lave celler. På grunn av CSC asymmetrisk selvfornyelse24ble andre cellefenotyper også identifisert. Når det gjelder CD133, viste representative resultater at befolkningen med høyere stemness var positiv i tilfelle av ECC-1-cellelinjen, men negativ i RL95-2 sfærer. Dette peker på mangelen på spesifisitet av noen CSC markører beskrevet, som ikke er unike for disse cellene og kan variere med plastisitet av fenotypen, og til viktigheten av å bruke en kombinasjon av strategier for å bekrefte stemness.

Western blot er en alternativ metodikk som kan være nyttig i visse tilfeller. For eksempel, mens ALDH-aktivitet er bredt brukt, er det nå kjent at flere isoformer bidrar til ALDEFLUOR-metabolisering54. Dermed kan spesifikke antigen-antistoffmetoder være mer pålitelige, og vi viste allerede sammenhengen mellom ALDH proteinuttrykk og stemness13,14.

Sfæredannende kapasitet, selvfornyelse og avledede tilhengere populasjoner representerer kapasiteten til CSC å dele og produsere et differensiert avkom, som klinisk oversettes til hendelser som tilbakefall, metastasering og motstand mot behandling9. Resistens av resistens i CSC kan forklares ved overuttrykk av multidrugresistens (MDR) membranproteiner, ALDH-uttrykk involvert i avgiftningsmekanismer, DNA-reparasjonsmekanismer, beskyttelse mot reaktive oksygenarter og motstand mot apoptose56. CSC har kapasitet til å være quiescent på grunn av deres plastisitet, og dette har dukket opp som en mekanisme for resistens. Denne populasjonen kan spares fra kjemo- og strålebehandling på grunn av cellesyklus arrestert differensierte celler57. Sfærer er en tumorpopulasjon med rapportert motstand mot cytostatiske legemidler som brukes i konvensjonell behandling og har også vært et fokus for kombinasjon med målrettede terapier54,58,59. Følsomheten til kuler kan testes for cytostatika som brukes i bryst- og endometriekreft. I tillegg kan isolasjonen av CSC fra en tumorprøve være en plattform for klinisk bruk av terapi som er spesifikk for hver svulst, forutsi resistens og påfølgende tilbakevendende sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble finansiert av Det portugisiske samfunnet for gynekologi gjennom forskningsprisen for 2016 og av CIMAGO. Cnc. IBILI støttes gjennom Foundation for Science and Technology, Portugal (UID/NEU/04539/2013), og medfinansiert av FEDER-COMPETE (POCI-01-0145-FEDER-007440). Coimbra Hospital and Universitary Center (CHUC) Tumor Bank, godkjent av CHUCs etikkkomité for helse og av den portugisiske nasjonale databeskyttelseskommisjonen, var kilden til endometrieprøver av pasienter fulgt ved institusjonens gynekologitjeneste. Figur 1 ble produsert ved hjelp av Servier Medical Art, tilgjengelig fra www.servier.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute ethanol Merck Millipore 100983
Accutase Gibco A1110501 StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent
ALDH antibody Santa Cruz Biotechnology SC166362
Annexin V FITC BD Biosciences 556547
Antibiotic antimycotic solution Sigma A5955
BCA assay Thermo Scientific 23225 Pierce BCA Protein Assay Kit
Bovine serum albumin Sigma A9418
CD133 antibody Miteny Biotec 293C3-APC Allophycocyanin (APC)
CD24 antibody BD Biosciences 658331 Allophycocyanin-H7 (APC-H7)
CD44 antibody Biolegend 103020 Pacific Blue (PB)
Cell strainer BD Falcon 352340 40 µM
Collagenase, type IV Gibco 17104-019
cOmplete Mini Roche 118 361 700 0
Dithiothreitol Sigma 43815
DMEM-F12 Sigma D8900
DNAse I Roche 11284932001
ECC-1 ATCC CRL-2923 Human endometrium adenocarcinoma cell line
Epidermal growth factor Sigma E9644
Fibroblast growth factor basic Sigma F0291
Haemocytometer VWR HERE1080339
HCC1806 ATCC CRL-2335 Human mammary squamous cell carcinoma cell line
Insulin, transferrin, selenium Solution Gibco 41400045
MCF7 ATCC HTB-22 Human mammary adenocarcinoma cell line
Methylcellulose AlfaAesar 45490
NaCl JMGS 37040005002212
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate Sigma P3932
Putrescine Sigma P7505
RL95-2 ATCC CRL-1671 Human endometrium carcinoma cell line
Sodium deoxycholic acid JMS EINECS 206-132-7
Sodium dodecyl sulfate Sigma 436143
Tris JMGS 20360000BP152112
Triton-X 100 Merck 108603
Trypan blue Sigma T8154
Trypsin-EDTA Sigma T4049
ß-actin antibody Sigma A5316

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardin, H., Zhang, R., Helein, H., Buehler, D., Guo, Z., Lloyd, R. V. The evolving concept of cancer stem-like cells in thyroid cancer and other solid tumors. Laboratory Investigation. 97 (10), 1142 (2017).
  2. Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The Cancer Stem Cell Niche: How Essential Is the Niche in Regulating Stemness of Tumor Cells? Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).
  3. Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells in solid tumours accumulating evidence and unresolved questions. Nature reviews. Cancer. 8, 755-768 (2008).
  4. Allegra, A., et al. The Cancer Stem Cell Hypothesis: A Guide to Potential Molecular Targets. Cancer Investigation. 32 (9), 470-495 (2014).
  5. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  6. Friel, A. M., et al. Functional analyses of the cancer stem cell-like properties of human endometrial tumor initiating cells. Cell Cycle. 7 (2), 242-249 (2008).
  7. Zhang, S., et al. Identification and Characterization of Ovarian Cancer-Initiating Cells from Primary Human Tumors. Cancer Research. 68 (11), 4311-4320 (2008).
  8. Bapat, S. A., Mali, A. M., Koppikar, C. B., Kurrey, N. K. Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer. Cancer research. 65 (8), 3025-3029 (2005).
  9. Carvalho, M. J., Laranjo, M., Abrantes, A. M., Torgal, I., Botelho, M. F., Oliveira, C. F. Clinical translation for endometrial cancer stem cells hypothesis. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (3), 401-416 (2015).
  10. Morel, A. P., Lièvre, M., Thomas, C., Hinkal, G., Ansieau, S., Puisieux, A. Generation of Breast Cancer Stem Cells through Epithelial-Mesenchymal Transition. PLoS ONE. 3 (8), e2888 (2008).
  11. Tirino, V., et al. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. The FASEB Journal. 27 (1), 13 (2013).
  12. Ajani, J. A., et al. ALDH-1 expression levels predict response or resistance to preoperative chemoradiation in resectable esophageal cancer patients. Molecular Oncology. 8 (1), 142-149 (2014).
  13. Carvalho, M. J., et al. Endometrial Cancer Spheres Show Cancer Stem Cells Phenotype and Preference for Oxidative Metabolism. Pathology and Oncology Research. , (2018).
  14. Laranjo, M., et al. Mammospheres of hormonal receptor positive breast cancer diverge to triple-negative phenotype. The Breast. 38, 22-29 (2018).
  15. Cui, M., et al. Non-Coding RNA Pvt1 Promotes Cancer Stem Cell–Like Traits in Nasopharyngeal Cancer via Inhibiting miR-1207. Pathology & Oncology Research. , (2018).
  16. Deng, S., et al. Distinct expression levels and patterns of stem cell marker, aldehyde dehydrogenase isoform 1 ALDH1), in human epithelial cancers. PloS one. 5 (4), e10277 (2010).
  17. Weiswald, L. B., Guinebretière, J. M., Richon, S., Bellet, D., Saubaméa, B., Dangles-Marie, V. In situ protein expression in tumour spheres: development of an immunostaining protocol for confocal microscopy. BMC Cancer. 10 (1), 106 (2010).
  18. Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical Cancer Models in Tumor Biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
  19. Picon-Ruiz, M., et al. Low adherent cancer cell subpopulations are enriched in tumorigenic and metastatic epithelial-to-mesenchymal transition-induced cancer stem-like cells. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
  20. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  21. Ballout, F., et al. Sphere-Formation Assay: Three-Dimensional in vitro Culturing of Prostate Cancer Stem/Progenitor Sphere-Forming Cells. Frontiers in Oncology. 8 (August), 1-14 (2018).
  22. Ishiguro, T., Ohata, H., Sato, A., Yamawaki, K., Enomoto, T., Okamoto, K. Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications. Cancer Science. 108 (3), 283-289 (2017).
  23. Noseda, M., Nasatto, P., Silveira, J., Pignon, F., Rinaudo, M., Duarte, M. Methylcellulose, a Cellulose Derivative with Original Physical Properties and Extended Applications. Polymers. 7 (5), 777-803 (2015).
  24. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  25. Zhou, M., et al. LncRNA-Hh Strengthen Cancer Stem Cells Generation in Twist-Positive Breast Cancer via Activation of Hedgehog Signaling Pathway. Stem cells (Dayton, Ohio). 34 (1), 55-66 (2016).
  26. Ha, J. R., et al. Integration of Distinct ShcA Signaling Complexes Promotes Breast Tumor Growth and Tyrosine Kinase Inhibitor Resistance. Molecular cancer research MCR. 16 (5), 894-908 (2018).
  27. Jurmeister, S., et al. Identification of potential therapeutic targets in prostate cancer through a cross-species approach. EMBO molecular medicine. 10 (3), (2018).
  28. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  29. Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
  30. Peach, M., Marsh, N., Miskiewicz, E. I., MacPhee, D. J. Solubilization of Proteins: The Importance of Lysis Buffer Choice. , 49-60 (2015).
  31. Olson, B. J. S. C. Assays for Determination of Protein Concentration. Current Protocols in Pharmacology. , A.3A.1-A.3A.32 (2016).
  32. Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. Journal of Visualized Experiments. (44), 1-2 (2010).
  33. Silva, J. M., McMahon, M. The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis. Journal of Visualized Experiments. 84 (84), 1-8 (2014).
  34. Oldknow, K. J., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. 8 (93), 1-10 (2014).
  35. Serambeque, B. Células estaminais do cancro do endométrio - a chave para o tratamento personalizado? [Stem Cells of Endometrial Cancer: The Key to Personalized Treatment?]. , University of Coimbra. Master thesis (2018).
  36. Lee, C. H., Yu, C. C., Wang, B. Y., Chang, W. W. Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti-cancer stem cell drugs. Oncotarget. 7 (2), (2015).
  37. De Luca, A., et al. Mitochondrial biogenesis is required for the anchorage-independent survival and propagation of stem-like cancer cells. Oncotarget. 6 (17), (2015).
  38. Masuda, A., et al. An improved method for isolation of epithelial and stromal cells from the human endometrium. Journal of Reproduction and Development. 62 (2), 213-218 (2016).
  39. Del Rio-Tsonis, K., et al. Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (44), 15772-15777 (2004).
  40. Wang, L., Guo, H., Lin, C., Yang, L., Wang, X. I. Enrichment and characterization of cancer stem-like cells from a cervical cancer cell line. Molecular Medicine Reports. 9 (6), 2117-2123 (2014).
  41. Chen, Y. C., et al. High-throughput single-cell derived sphere formation for cancer stem-like cell identification and analysis. Scientific Reports. 6 (April), 1-12 (2016).
  42. Kim, J., Jung, J., Lee, S. J., Lee, J. S., Park, M. J. Cancer stem-like cells persist in established cell lines through autocrine activation of EGFR signaling. Oncology Letters. 3 (3), 607-612 (2012).
  43. Hwang-Verslues, W. W., et al. Multiple Lineages of Human Breast Cancer Stem/Progenitor Cells Identified by Profiling with Stem Cell Markers. PloS one. 4 (12), e8377 (2009).
  44. Feng, Y., et al. Metformin reverses stem cell-like HepG2 sphere formation and resistance to sorafenib by attenuating epithelial-mesenchymal transformation. Molecular Medicine Reports. 18 (4), 3866-3872 (2018).
  45. Wang, H., Paczulla, A., Lengerke, C. Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays. Journal of Visualized Experiments. (95), 1-11 (2015).
  46. Stebbing, J., Lombardo, Y., Coombes, C. R., de Giorgio, A., Castellano, L. Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (97), 1-5 (2015).
  47. Zhao, H., et al. Sphere-forming assay vs. organoid culture: Determining long-term stemness and the chemoresistant capacity of primary colorectal cancer cells. International Journal of Oncology. 54 (3), 893-904 (2019).
  48. Bagheri, V., et al. Isolation and identification of chemotherapy-enriched sphere-forming cells from a patient with gastric cancer. Journal of Cellular Physiology. 233 (10), 7036-7046 (2018).
  49. Kaowinn, S., Kaewpiboon, C., Koh, S., Kramer, O., Chung, Y. STAT1-HDAC4 signaling induces epithelial-mesenchymal transition and sphere formation of cancer cells overexpressing the oncogene, CUG2. Oncology Reports. , 2619-2627 (2018).
  50. Lonardo, E., Cioffi, M., Sancho, P., Crusz, S., Heeschen, C. Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies. Journal of Visualized Experiments. (100), 1-9 (2015).
  51. Lu, H., et al. Targeting cancer stem cell signature gene SMOC-2 Overcomes chemoresistance and inhibits cell proliferation of endometrial carcinoma. EBioMedicine. 40, 276-289 (2019).
  52. Bu, P., Chen, K. Y., Lipkin, S. M., Shen, X. Asymmetric division: a marker for cancer stem cells. Oncotarget. 4 (7), (2013).
  53. Islam, F., Qiao, B., Smith, R. A., Gopalan, V., Lam, A. K. Y. Cancer stem cell: fundamental experimental pathological concepts and updates. Experimental and molecular pathology. 98 (2), 184-191 (2015).
  54. Liu, W., et al. Comparative characterization of stem cell marker expression, metabolic activity and resistance to doxorubicin in adherent and spheroid cells derived from the canine prostate adenocarcinoma cell line CT1258. Anticancer research. 35 (4), 1917-1927 (2015).
  55. Broadley, K. W. R., et al. Side Population is Not Necessary or Sufficient for a Cancer Stem Cell Phenotype in Glioblastoma Multiforme. STEM CELLS. 29 (3), 452-461 (2011).
  56. Cojoc, M., Mäbert, K., Muders, M. H., Dubrovska, A. A role for cancer stem cells in therapy resistance: Cellular and molecular mechanisms. Seminars in Cancer Biology. 31, 16-27 (2015).
  57. Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
  58. Zhang, X. L., Jia, Q., Lv, L., Deng, T., Gao, J. Tumorspheres Derived from HCC Cells are Enriched with Cancer Stem Cell-like Cells and Present High Chemoresistance Dependent on the Akt Pathway. Anti-cancer agents in medicinal chemistry. 15 (6), 755-763 (2015).
  59. Fukamachi, H., et al. CD49fhigh Cells Retain Sphere-Forming and Tumor-Initiating Activities in Human Gastric Tumors. PLoS ONE. 8 (8), e72438 (2013).
  60. Gao, M. Q., Choi, Y. P., Kang, S., Youn, J. H., Cho, N. H. CD24+ cells from hierarchically organized ovarian cancer are enriched in cancer stem cells. Oncogene. 29 (18), 2672-2680 (2010).
  61. Cariati, M., et al. Alpha-6 integrin is necessary for the tumourigenicity of a stem cell-like subpopulation within the MCF7 breast cancer cell line. International Journal of Cancer. 122 (2), 298-304 (2008).
  62. López, J., Valdez-Morales, F. J., Benítez-Bribiesca, L., Cerbón, M., Carrancá, A. Normal and cancer stem cells of the human female reproductive system. Reproductive Biology and Endocrinology. 11 (1), 53 (2013).
  63. Alvero, A. B., et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance. Cell Cycle. 8 (1), 158-166 (2009).
  64. Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., Birnbaum, D. Breast cancer stem cells: tools and models to rely on. BMC Cancer. 9 (1), 202 (2009).
  65. Leccia, F., et al. ABCG2, a novel antigen to sort luminal progenitors of BRCA1- breast cancer cells. Molecular Cancer. 13 (1), 213 (2014).
  66. Croker, A. K., Allan, A. L. Inhibition of aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity reduces chemotherapy and radiation resistance of stem-like ALDHhiCD44+ human breast cancer cells. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (1), 75-87 (2012).
  67. Sun, M., et al. Enhanced efficacy of chemotherapy for breast cancer stem cells by simultaneous suppression of multidrug resistance and antiapoptotic cellular defense. Acta Biomaterialia. 28, 171-182 (2015).
  68. Shao, J., Fan, W., Ma, B., Wu, Y. Breast cancer stem cells expressing different stem cell markers exhibit distinct biological characteristics. Molecular Medicine Reports. 14 (6), 4991-4998 (2016).
  69. Croker, A. K., et al. High aldehyde dehydrogenase and expression of cancer stem cell markers selects for breast cancer cells with enhanced malignant and metastatic ability. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (8b), 2236-2252 (2009).
  70. Cheung, S. K. C., et al. Stage-specific embryonic antigen-3 (SSEA-3) and β3GalT5 are cancer specific and significant markers for breast cancer stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (4), 960-965 (2016).
  71. Meyer, M. J., Fleming, J. M., Lin, A. F., Hussnain, S. A., Ginsburg, E., Vonderhaar, B. K. CD44 pos CD49f hi CD133/2 hi Defines Xenograft-Initiating Cells in Estrogen Receptor–Negative Breast Cancer. Cancer Research. 70 (11), 4624-4633 (2010).
  72. Ahn, S. M., Goode, R. J. A., Simpson, R. J. Stem cell markers: Insights from membrane proteomics? PROTEOMICS. 8 (23-24), 4946-4957 (2008).
  73. Chefetz, I., et al. TLR2 enhances ovarian cancer stem cell self-renewal and promotes tumor repair and recurrence. Cell Cycle. 12 (3), 511-521 (2013).
  74. Alvero, A. B., et al. Stem-Like Ovarian Cancer Cells Can Serve as Tumor Vascular Progenitors. Stem Cells. 27 (10), 2405-2413 (2009).
  75. Yin, G., et al. Constitutive proteasomal degradation of TWIST-1 in epithelial–ovarian cancer stem cells impacts differentiation and metastatic potential. Oncogene. 32 (1), 39-49 (2013).
  76. Wei, X., et al. Mullerian inhibiting substance preferentially inhibits stem/progenitors in human ovarian cancer cell lines compared with chemotherapeutics. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (44), 18874-18879 (2010).
  77. Meirelles, K., et al. Human ovarian cancer stem/progenitor cells are stimulated by doxorubicin but inhibited by Mullerian inhibiting substance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (7), 2358-2363 (2012).
  78. Shi, M. F., et al. Identification of cancer stem cell-like cells from human epithelial ovarian carcinoma cell line. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (22), 3915-3925 (2010).
  79. Meng, E., et al. CD44+/CD24− ovarian cancer cells demonstrate cancer stem cell properties and correlate to survival. Clinical & Experimental Metastasis. 29 (8), 939-948 (2012).
  80. Witt, A. E., et al. Identification of a cancer stem cell-specific function for the histone deacetylases, HDAC1 and HDAC7, in breast and ovarian. Oncogene. 36 (12), 1707-1720 (2017).
  81. Wu, H., Zhang, J., Shi, H. Expression of cancer stem markers could be influenced by silencing of p16 gene in HeLa cervical carcinoma cells. European journal of gynaecological oncology. 37 (2), 221-225 (2016).
  82. Huang, R., Rofstad, E. K. Cancer stem cells (CSCs), cervical CSCs and targeted therapies. Oncotarget. 8 (21), 35351-35367 (2017).
  83. Zhang, X., et al. Imatinib sensitizes endometrial cancer cells to cisplatin by targeting CD117-positive growth-competent cells. Cancer Letters. 345 (1), 106-114 (2014).
  84. Luo, L., et al. Ovarian cancer cells with the CD117 phenotype are highly tumorigenic and are related to chemotherapy outcome. Experimental and Molecular Pathology. 91 (2), 596-602 (2011).
  85. Zhao, P., Lu, Y., Jiang, X., Li, X. Clinicopathological significance and prognostic value of CD133 expression in triple-negative breast carcinoma. Cancer Science. 102 (5), 1107-1111 (2011).
  86. Ferrandina, G., et al. Expression of CD133-1 and CD133-2 in ovarian cancer. International Journal of Gynecologic Cancer. 18 (3), 506-514 (2008).
  87. Rutella, S., et al. Cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the CD133 antigen in human endometrial tumors. Clinical cancer research an official journal of the American Association for Cancer Research. 15 (13), 4299-4311 (2009).
  88. Friel, A. M., et al. Epigenetic regulation of CD133 and tumorigenicity of CD133 positive and negative endometrial cancer cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (1), 147 (2010).
  89. Nakamura, M., et al. Prognostic impact of CD133 expression as a tumor-initiating cell marker in endometrial cancer. Human Pathology. 41 (11), 1516-1529 (2010).
  90. Saha, S. K., et al. KRT19 directly interacts with β-catenin/RAC1 complex to regulate NUMB-dependent NOTCH signaling pathway and breast cancer properties. Oncogene. 36 (3), 332-349 (2017).
  91. LV, X., Wang, Y., Song, Y., Pang, X., Li, H. Association between ALDH1+/CD133+ stem-like cells and tumor angiogenesis in invasive ductal breast carcinoma. Oncology Letters. 11 (3), 1750-1756 (2016).
  92. Ruscito, I., et al. Exploring the clonal evolution of CD133/aldehyde-dehydrogenase-1 (ALDH1)-positive cancer stem-like cells from primary to recurrent high-grade serous ovarian cancer (HGSOC). A study of the Ovarian Cancer Therapy–Innovative Models Prolong Survival (OCTIPS). European Journal of Cancer. 79, 214-225 (2017).
  93. Sun, Y., et al. Isolation of Stem-Like Cancer Cells in Primary Endometrial Cancer Using Cell Surface Markers CD133 and CXCR4. Translational Oncology. 10 (6), 976-987 (2017).
  94. Rahadiani, N., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1) in endometrioid adenocarcinoma and its clinical implications. Cancer Science. 102 (4), 903-908 (2011).
  95. Mamat, S., et al. Transcriptional Regulation of Aldehyde Dehydrogenase 1A1 Gene by Alternative Spliced Forms of Nuclear Factor Y in Tumorigenic Population of Endometrial Adenocarcinoma. Genes & Cancer. 2 (10), 979-984 (2011).
  96. Mukherjee, S. A., et al. Non-migratory tumorigenic intrinsic cancer stem cells ensure breast cancer metastasis by generation of CXCR4+ migrating cancer stem cells. Oncogene. 35 (37), 4937-4948 (2016).
  97. Lim, E., et al. Aberrant luminal progenitors as the candidate target population for basal tumor development in BRCA1 mutation carriers. Nature Medicine. 15 (8), 907-913 (2009).
  98. Liang, Y. J., et al. Interaction of glycosphingolipids GD3 and GD2 with growth factor receptors maintains breast cancer stem cell phenotype. Oncotarget. 8 (29), 47454-47473 (2017).

Tags

Kreftforskning Utgave 157 neoplastiske stamceller brystneoplasmer tumorsfærer gynekologisk kreft sfæredannende protokoll kreftstamcellemarkører
Få kreft stamcellesfærer fra gynekologiske og brystkreft svulster
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Laranjo, M., Carvalho, M. J.,… More

Laranjo, M., Carvalho, M. J., Serambeque, B., Alves, A., Marto, C. M., Silva, I., Paiva, A., Botelho, M. F. Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors. J. Vis. Exp. (157), e60022, doi:10.3791/60022 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter