Summary
כאן, אנו מתארים שיטה לגרום דלקת קרום הגרון דרך מסלול הזיהום התאיים בעכברים למבוגרים. אנו מציגים צעד אחר צעד פרוטוקול של דלקת קרום הגרון מתוך הכנת האיסיס לזיהום התאיים; לאחר מכן להקליט את ההישרדות בעלי חיים ולהעריך את העומסים חיידקי ברקמות murine.
Abstract
מנינגוקוקוס הוא מיקרואורגניזם בטווח הצר, המזוהה באופן גלובלי כגורם המוביל לדלקת קרום הגרון החיידקית. מנינגוקוקוס הוא הקולוניאליסט ארעי של האף האנושי האדם של כ 10% של נושא בריא. בנסיבות מסוימות, היא מקבלת יכולת פולשנית לחדור אל מכשול המוקוסל ופולשת למחזור הדם הגורם לספטיתרמיה. במקרה האחרון, אלח דם שתוללת יכול להיווצר גם ללא ההתפתחות הסוגר של דלקת קרום המוח. לעומת זאת, חיידקים יכולים להתרבות בצורה גרועה במחזור הדם, לחצות את מכשול המוח בדם, להגיע למערכת העצבים המרכזית, המובילה לדלקת קרום הדם הרועמת. מודלים murine של דלקת הקרום החיידקי מייצגים כלי שימושי כדי לחקור את האינטראקציות המארחים הפתוגן ולנתח את המנגנונים הפתוגנטיים האחראים למחלה קטלנית זו. למרות, מספר מערכות מודל ניסיוני הוערכו בעשורים האחרונים, אף אחד מהם לא הצליחו לשחזר את האירועים הפתולוגיים האופייניים של מחלת קרום הגרון. בפרוטוקול ניסיוני זה, אנו מתארים הליך מפורט עבור אינדוקציה של דלקת קרום הגרון במודל העכבר מבוסס על החיסון התאיים של חיידקים. הסימנים השונים של דלקת קרום המוח האנושי נרשמו במארח murine באמצעות הערכה של פרמטרים קליניים (למשל, טמפרטורה, משקל הגוף), הערכה של שיעור ההישרדות, ניתוח מיקרוביולוגית ובדיקה היסטולוגית של פגיעה מוחית. בעת שימוש ב-תאיים (i. ושכב.), מסירה מלאה לגמרי ישירות לתוך cisterna מגנה, המובילה לשכפול מאוד יעיל של קרום המוח ברקמת המח. גידול 1,000 מקפלים של ספירה קיימא של חיידקים הוא נצפתה כ 18 h. יתר על כן, מניגוקוצ'י נמצאים גם בטחול, ובכבד של עכברים נגועים, הרומז כי הכבד עשוי לייצג איבר יעד עבור שכפול קרום הגרון.
Introduction
מנינגקוקוס היא β שלילית-פרוטקוביום מוגבל לפונדקאי האנושי, ידוע בהיותו אחד הגורמים השכיחים ביותר של דלקת קרום הגוף ואלח דם באוכלוסייה האנושית ברחבי העולם. הוא מקולוניא את מערכת הנשימה העליונה (האף והגרון) של נשאים בריאים ואסימפטומטיים (2-30% מהאוכלוסייה), אבל החיידק מתחמק לפעמים שונים הגנות החיסון העצמי מתפשט ממחזור הדם למוח גרימת מקומי בלתי מבוקרת דלקת, הידועה בשם. דלקת קרום הגרון שילוב של גורמים מארחים וחיידקיים מופיע כדי לתרום את המעבר מן הקומנדציה להתנהגות פולשנית1.
(ש ע) מנינגטידיס , מתמחה באופן בלעדי בקולוניזציה אנושית וזיהום. יש לו טווח מארח צר, ולכן, יש מוגבל במחקרים vivo בפתוגנזה בשל העדר מודלים בעלי חיים מתאימים השעתקים מחלת הקרום האנושי. כתוצאה מכך, היא הובילה לפערים בסיסיים בהבנת הפתוגנזה של ספטטימיה ודלקת קרום הגרון שנגרמו מחיידק הקרום. בעשורים האחרונים, התפתחות של מערכות מבחנה רבות אפשרה זיהוי של מספר גורמים התקפה אלימה של הקרום2,3,4. למרות מחקרים יקרי ערך אלה סיפקו תובנות חשובות כדי להבין את התפקיד של גורמים אלה עבור זיהום קרום הגרון מוצלח, מודלים אלה לא אפשרו הערכה של ההשלכות של אינטראקציות חיידקי עם המוסר והסלולר מערכת החיסונית ואפילו פחות עם הרקמה כולה. במודלים של בעלי חיים vivo של זיהום הם בעלי רלוונטיות רבה גם עבור הערכה של תואר הגנה הענקת על ידי ניסוחים החיסון. כפתוגן אנושי-טרופי, מנינגוקוקוס בעלי דטרמיניזם מתאים הכרחי לזיהום מוצלח כגון מבני פני השטח (כלומר, הקלד IV והאטימות חלבונים) ומערכות ספיגה ברזל עבור קולטנים אנושיים וחלבונים הובלה (כלומר, transferrin ו-lactoferrin)5,6,7 כדי לדבוק כראוי, לשרוד ולפלוש הפונדקאי האנושי. לבסוף, את היכולות הגנטיות וריאציה של הפתוגן להתחמק ו/או לחסום את התגובה החיסונית האנושית עוד לתרום הזנים הגבוהים tropism8,9. לכן, העדר גורמים מארחים מסוימים, המעורבים באינטראקציה, יכולים לחסום את הצעדים של מחזור החיים של הפתוגן, הקמת קשיים משמעותיים בפיתוח של מודלים בעלי חיים קטנים המסכמים את מחזור החיים של קרום הגרון.
במהלך העשורים האחרונים פותחו מספר גישות כדי לשפר את הבנתנו את המחזור הזיהומיות של קרום הגרון. זיהומים של שני דגם בעלי חיים, עכבר ועכברוש, או intraperitoneally (כיתה) או intranasally (i.n.), פותחו כדי לשחזר את מחלת קרום הגרון10,11,12,13,14 ,15,16,17. עכבר המעבדה הוא כנראה אחד החיות תכליתי יותר עבור גרימת זיהום קרום הגרון ניסיוני.
עם זאת, הדרך הקומתי של זיהום מוביל להתפתחות של אלח דם חמורים למרות שהוא לא לחקות את התוואי הטבעי של זיהום, בעוד התוואי i.n. של זיהום היה שימושי כדי להעריך פתוגנזה מעיים, למרות שזה עלול לגרום לדלקת ריאות לפני אלח דם10,11,12,13,14,15,16,17.
מודל העכבר כאיי היה אינסטרומנטלי להעריך את ההגנה מפני האתגר של קרום הגרון10,11,12. מודל העכבר של הקולוניזציה מחלת הקרום מבוסס על תוואי i.n. של זיהום פותחה עם עכברים התינוק, כפי שהם רגישים יותר קרום הגרון, כדי לשכפל זיהום פולשני מחקה את הקורס של מחלת קרום הגרון בבני אדם 13,14,15,16,17. יתר על כן, כדי לקדם את שכפול קרום הגרון במארח murine, מספר גדל והולך של אסטרטגיות טכניות יושמו גם כולל את הניהול של הברזל לבעלי חיים כדי לשפר את הזיהום, השימוש בחיידקים גבוהים בקטריות, העכבר מאמץ חיידקי בקטריאלי, כמו גם את התעסוקה של התינוק או בעלי חיים מארחים חיסוני10,13,15,18,19. ביטוי של גורמים אנושיים ספציפיים כמו CD4620 או transferrin21 הגביר את הרגישות של עכברים לחיידק זה אנושי-טרופי; התעסוקה של העור האנושי מודל מבע של זיהום גם היה שימושי כדי להעריך את היכולת הדבקה של מניגוקוצ'י לאנדותל האנושי22,23. באופן קולקטיבי, ההתפתחות האחרונה של עכברים טרנסגניים הומניזציה שיפרה את ההבנה של הפתוגנזה קרום הגרון ואת האינטראקציות המארחות שלה.
בעבר, פיתחנו מודל murine של דלקת קרום הגרון שבו החיסונים של חיידקים בוצעה לתוך cisterna מגנה של עכברים מבוגרים עם העכבר-passaged חיידקים24. פרמטרים קליניים ושיעור ההישרדות של עכברים נגועים הפגינו הקמתה של דלקת קרום המוח עם מאפיינים הדומים לאלה שנראו בפונדקאי האנושי, כמו גם, ניתוח מיקרוביולוגי היסטולוגית של המוח. מן העכברים הנגועים האלה, החיידק היו, גם, התאושש דם, כבד, טחול, ו חיידקים עומסים של איברים היקפיים בקורלציה עם המינון זיהומיות. בפרט, מודל זה הועסק כדי להעריך את התקפה אלימה של זן מוטציה איזוגניים פגום ב-L-גלוטמט המשלח GltT24. לאחרונה, באמצעות מודל העכבר שלנו של קרום הגרון המבוסס על i. ושכב. המסלול עם קבוצת המיורית C זן 93/42862,24 ו מוטציה איזוגנית פגום בקידוד cssa ב-UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase25, ניתחנו את התפקיד של חומצה סילית חשופה בהקמת של מחלות בעכברים.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה ישירה כדי לגרום לדלקת קרום הגרון ניסויים בהתבסס על ה-i. ושכב. מסלול של זיהום בעכבר למבוגרים Balb/c. שיטה זו שימושית במיוחד לאפיון של זיהום קרום הגרון במארח מורכי, כמו גם להערכת התקפה אלימה בין מסוג פראי התייחסות זנים מוטציות איזוגניים. התוואי הפנים-cisternal של זיהום מבטיח משלוח שלם של קרום הגרון ישירות לתוך cisterna מגנה, אשר בתורו מקלה שכפול בקטריאלי בנוזל השדרה (שדרתי) ומעורר דלקת קרום הצורה עם תכונות המחקים אותם הנוכחים בבני אדם2,24,25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה נערך כדי למזער את הסבל בעלי חיים ולהקטין את מספר העכברים בהתאם להנחיות מועצת הקהילות האירופיות של 24 בנובמבר 1986 (86/609/EEC). ב vivo ניסויים שדווחו במחקר זה אושרו על ידי טיפול בעלי חיים אתית והשתמש הוועדה (פרוט. מספר 2, 14 בדצמבר 2012) ו משרד הבריאות האיטלקי (פרוט. מספר 0000094-A-03/01/1/2013). כל ההליכים יש לבצע בתוך הקבינט Biosafety טיחות 2 (BSC2) בחדר BSL2, ואת הפסולת הנגועה פוטנציאל צריך להיות מושלך מכולות ייעודי.
1. זיהום של עכברים עם N. הזנים של הקבוצה C מאמץ
זהירות: נ. מנינגטידיס היא פוטנציאל פתוגן מזיק וכל אמצעי הזהירות הנחוצים יש לנקוט בעת טיפול במיקרואורגניזם הזה. כל הניסויים מחייבים בידוד ברמה 2 (BSL2). החוקר המעורב בלימודי בעלי חיים צריך ללבוש ציוד הגנה אישי חד פעמי (PPE) למשך הניסוי.
- הכנת חיידקים לvivo במחקרים מזיהום
- בחר מושבה אחת מן התרבות Neisseria טרי ב-GC (Gonococcal) לוחית אגר שיושלם עם 1% (vol/vol) תוסף Polyvitox ב 10 מ ל של ציר GC.
- לגדל את החיידקים ב 37 ° c בחממה שייקר מסלולית עם מהירות של 220 rpm. תמשיך לבדוק את מנת היתר. של התרבות בעזרת ספקטרוסקופיה לגדל את התרבות עד השלב האקספוננציאלי המוקדם בצפיפות אופטית OD600nm של 0.7, המתאים ≈ 7 x 108 cfu/mL.
- לאחר מנת יתר הנדרש מתקבל, לעשות מניות קפוא על ידי הוספת 10% גליצרול. לתת 1 מ ל של תרבות בהקפאה. אחסן את הבקבוקונים ב-80 ° צ' עד השימוש.
הערה: למרות שעדיף להשתמש בתרבות חיידקים טריים, מניות קפואות שימשו כדי לפשט ולתקנן את הניסוי vivo. בדרך כלל מניות קפוא כבר מועסקים בתוך כ 6 חודשים מן ההכנה. - לפני הזיהום, להפשיר חיידקים קפואים בטמפרטורת החדר.
- לקצור את התאים החיידקיים על ידי צנטריפוגה עבור 15 דקות ב 1,500 x g ו להשעות מחדש 1 מ ל של מרק חדש GC המכיל תוספי ברזל (5 מ"ג/ק"ג).
הערה: ציר GC מוכן עם תוספת של תוספי ברזל (5 מ"ג/ק"ג) על מנת להעדיף את השכפול של מניגוקוצ'י ברקמה המארחת14,18,27. - לפני השימוש, לבצע ספירות קיימא של חיידקים כדי לקבוע את המספר המדויק של CFU לזיהום. כדי לעשות זאת, להרים 10 μL של הבולם החיידקי ולהמשיך עם דילול סדרתי ולהפיץ כל דילול על לוחות GC אגר ו-דגירה ב 37 ° צ' עם 5% CO2, עבור 18-24 h.
- הזרקת עכברים פנים-cisternal
הערהההליך כולו מבוצע בארון הזרימה למינארי כדי לשמור על תנאים אספטי.- עכברי מעבדה בבית (8 שבועות, נקבה Balb/c) תחת תנאים מסוימים הפתוגן חינם. מספקים כדורי מזון ומים libitum המודעה.
- ליישב את החיות בסביבה החדשה במשך שבוע אחד לפני תחילת הניסוי.
- לפני תחילת הניסוי, שוקלים ומעריכים את טמפרטורת הגוף שלהם.
הערה: עכבר Balb/c הטבעי הנשי של בן שמונה שבועות שוקל ממוצע של כ 19 g. הטמפרטורה הממוצעת של עכברי מעבדה מבחינה פיזיולוגית החל מ 36-38 ° c24. - סקרף החיה מן הצוואר, לנקות את אזור הבטן עם 70% אתנול והזרקת כדור הארץ ברזל (מומס 1% פוספט מאגר מלוחים, 250 mg/ק"ג) ברביע הימני התחתון של הבטן murine באמצעות מחט 25 גרם 0.5 mm x 16 מ"מ , כ 2-3 h לפני הזיהום.
הערה: הזריקה התוך הצפק בוצעה ברבע הימני התחתון של הבטן murine כדי למנוע פגיעה באיברים הבטן כגון שלפוחית השתן, cecum, וכו '. הניהול של מקור ברזל אקסוגני, בצורה של dextran ברזל, לבעלי חיים לפני הזיהום מעדיף את הכפל חיידקי במחשב המארח14,18,27. - לאחר 2-3 h, לבצע הרדמה בעלי חיים עם קטמין (50 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (3 מ"ג/ק"ג) וחומר סיכה אופטלמולוגי.
- בדוק את עומק ההרדמה על ידי הבטחת היעדר תגובה כאב על צובט את הבוהן.
- מיקום העכבר בתוך הלחץ הסטראלי ובזהירות למתוח את הגפיים ואת עמוד השדרה הצווארי כדי לשמור על העמודה החוליות במצב ישר.
- בעדינות לערבב את ההשעיה חיידקי לשמור על השעיה עקבית לפני טעינת מזרק של 30 G מחט x 8 מ"מ.
הערה: הכינו את ההשעיה החיידקית קרוב ככל האפשר לזמן ההזרקה; בינתיים, אחסן אותו בטמפרטורת החדר. - בהתבסס על הצבת סיכוייו חיידקי (cfu/mL), להמשיך עם החישוב של cfu הכולל לשמש, ביחס למספר הכולל של בעלי חיים להיות נגועים (מינון בקטריאלי cfu למספר בעלי חיים). להמשיך עם החישוב של הנפח המדויק להילקח מן המבחנה כדי לקבל את cfu הכולל החלת שיעור בין הצבת סיכוייו חיידקי (cfu/mL) ו-cfu הכולל שימושי עבור הזיהום של n עכברים (הודעה הצבה החוצה בקטריאלי חיידקים cfu : ml = סה כ CFU: x). לבסס את הכרך הסופי ביחס למספר הכולל של בעלי חיים להידבק.
הערה: בניסויים אלה, מגוון רחב של סיכוייו מ-104 עד 109 לכל בעל חיים שימש. - לנקות את האזור כירורגי עם 70% אתנול.
- לזהות את נקודת ההזרקה בעזרת מחט ולהזריק את cfu הוקמה של הקרום (סוג פראי זן מוטציה להתאמץ), או ציר GC שיושלם עם תוספי ברזל (5 מ"ג/ק"ג) כמו שליטה, בנפח כולל של 10 μl לתוך cisterna מגנה של עכברים דרך חור בגולגולת העורף באמצעות מחט 30 גרם x 8 מ"מ.
- לבצע את הcisternal אוקיים על ידי הצבת המחט בצומת הגולגולת צוואר הרחם, במיוחד בחלל הסוברהארכאניד. ונטרופלקס הראש כדי להפוך את החלל הזה נגיש28.
- בקצרה, מניחים את בעל החיים בתוך שכיבה לרוחב, להחזיק את האוזניים מתוך הדרך ולהגמיש את הצוואר במתינות (90 כדי 100 °). ודא כי קו האמצע של הצוואר והראש (מהאף אל הocciput) נמצאים במצב מקביל לחלוטין לשולחן השולחן.
- לגעת כנפי האטלס ולוודא שהם חופפים, ביטול סיבוב צירית. כניסה טבעית יכול בדרך כלל להיות נגע על קו האמצע שבו המחט היא הסיכוי הטוב ביותר להיכנס לחור העורף.
- להשליך את המזרק ואת המחט בבטחה לאחר הזרקת עכברים עם Neisseria.
- הנח את החיה בכלוב והמתן להתעוררות ולהתאוששות מלאה של התנועה.
- שמרו על הכלובים עם עכברים נגועים תחת ארון זרימה למינארי.
- לעקוב אחר עכברים, 24 h לאחר זיהום, עבור סימנים קליניים של תרדמת על פי קנה מידה של תרדמת29. בקנה מידה: 1 = תרדמת, 2 = אינו עומד זקוף לאחר הפעלת על הגב, 3 = עומד זקוף בתוך 30 s, 4 = עומד זקוף בתוך 5 s, פעילויות אמבולטוריות מינימלי, 5 = נורמלי.
הערה: כאשר בבעלי חיים הוקלט כאב, כאבים מלוקסיעם (5 מ"ג/ק"ג כיתה למשך הלימודים) היה מנוהל. - המשך להישרדות בעלי חיים או CFU מונה את הערך על בעלי חיים נגועים כמפורט בשלב 2.
- לבצע המתת חסד של עכברים עם ציון של 2 על ידי פריקה צוואר הרחם להקליט מת לניתוח סטטיסטי.
2. הישרדות בעלי חיים וספירות CFU
-
הישרדות בעלי חיים
- הכנת בקטריאלי חיידקים במינונים שונים (החל 104 כדי 109 cfu לכל עכבר) כדי להדביק בעלי חיים על ידי ה-i. ושכב. נתיב (ראה שלב 1.2).
- הנחסן שליטה עכברים עם ציר GC, שיושלם עם תוספי ברזל (5 מ"ג/ק"ג), באותו אופן.
- ניטור בעלי חיים לתסמינים קליניים: פרווה מלאה, מראה כפופות, היפותרמיה, הרזיה, עייפות, או מוריבנד24,25,26,30, כל יום במהלך הניסוי כולו עבור 168 h (7 ימים) לפחות פעמיים ביום למשך הניסוי.
- מדדו את משקל הגוף והטמפרטורה באמצעות איזון דיגיטלי ומדחום רקטלי, בהתאמה כל יום.
- להקליט את ההישרדות של עכברים במשך שבוע.
הערה: הקלט את המוות הטבעי של זיהום בעלי חיים בעוד החיות להגיע לערך התרדמת של 2 או כי לשרוד מעל 168 h של התבוננות יהיה מורדמים. - עכברים מורדם עם ערך תרדמת של 2 או ששרדו על זמן התצפית עם קטמין (50 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (3 מ"ג/ק"ג) ולהחיל משחה אופטלמולוגית.
- בדוק כי תגובת הכאב נעדר על ידי צביטה בבוהן.
- לבצע המתת חסד של עכברים על ידי פריקה צוואר הרחם ולהקליט מת לניתוח סטטיסטי.
-
הערכה של יחידות ליצירת מושבה (CFU) ספירות באיברים היקפיים
- השתמש במינון תת-קטלני בקטריאלי (5 x 105cfu/עכברים) על בסיס תוצאות ההישרדות של בעלי חיים על ידי הושכב. תוואי (ראה סעיף קטן 1.2).
- לפקח על טמפרטורת פי הטבעת כל יום במהלך הזיהום ולבצע הרדמה של בעלי חיים ב 48 h לאחר הזיהום כאמור בשלב 2.
- המשך עם 70% לחיטוי אתנול של החזה ונסיגה 600-700 μL של דם על ידי ניקוב לב של חלל החזה באמצעות מחט של 25 גרם 0.5 mm x 16 מ"מ.
- לאסוף את הדם בצינור המכיל 3.8% נתרן ציטראט וחנות ב-80 ° צ' עבור ספירות תא חיידקי קיימא מאוחר יותר.
- לבצע נקע בצוואר הרחם כדי להקריב את החיות. לאשר את הקלטת המוות את היעדר פעימות הלב, לאחר הקרבת העכבר על פי כל ההנחיות המוסדי והאתיות הרלוונטיות.
- הנח את העכבר במצב פרקדן ולהשתמש מספריים מלקחיים כדי להמשיך עם החתך של הפרווה לאורך מישור משונן של הגוף. לתקן את העור עם הפרווה על צידי הגוף עם סיכות.
- חתכו את קרום הצפק. בעזרת מספריים חדים השימוש במספריים ומלקחיים חד פעמיים כדי לבלו את האיברים (למשל, הטחול והכבד) ולשים כל אחד בצלחת פטרי סטרילית עם 1 מ ל של ציר GC בתוספת 10% (vol/vol) גליצרול.
- להיפטר בבטחה את גוף העכבר לפי הנחיות IACUC.
- המגון האיברים מכנית בטמפרטורת החדר עם הבוכנה של מזרק 5 מ"ל עבור כ 2-3 דקות עד השעיה תא יחיד נוצר ולהעביר אותו בצינור.
- שימי את הצינור עם דגימת העור. המנועלת מיד על הקרח היבש
הערה: דגימות ניתן לאחסן ב-80 ° c ב-2 מ"ל צינור סטרילי לביצוע ספירת תאים בקטריאלי קיימא הערכה בנקודות מאוחרות יותר. - להפוך לוחות GC אגר עם אנטיביוטיקה כאשר נדרש. לייבש את הצלחות לפני השימוש מראש מקדם הדגירה ב 37 ° c עבור 2-3 h.
- להכין מדלל סדרתי 10 מקפלים של דגימות בציר GC מכל רקמה הומוגניים לוחית על לוחות GC אגר. דגירה לילה ב 37 ° צ' עם 5% CO2.
3. הכנת רקמות מוח לספירת CFU
- השתמש במינון תת-קטלני בקטריאלי (5 x 105 cfu/עכברים) על בסיס תוצאות ההישרדות של בעלי חיים על ידי הושכב. תוואי (ראה סעיף קטן 1.2).
- לבצע הרדמה של בעלי חיים בזמן זיהום הוקמה כפי שהוזכר בשלב 2.
- לבצע המתת חסד של בעלי חיים על ידי פריקת צוואר הרחם.
- לנקות את האזור כירורגי עם 70% אתנול.
- לחתוך את הראש של העכבר באמצעות מספריים גדולים.
- לכרות את הפרווה ואת העור בעזרת מספריים כירורגי קטן מלקחיים פלדה משופעת, ממשיך לכיוון העליון של הגולגולת כדי להיות מסוגל בבירור לראות את התפרים כדי להנחות את הפתיחה של הגולגולת.
- הכניסו את קצה המספריים הזעירות דרך מגנום האמן כדי לפתוח את הגולגולת.
- חותכים לכיוון מרכז הגולגולת ומעבר לקו האמצע של עצם הקודקוד לצדו הנגדי של הגולגולת. חותכים בעדינות את השפה הצדדית. של התפר המדוליד
- הרם את הגולגולת החל בפינה הקודקודית האחורי ומשוך אותו באלכסון כלפי מעלה כדי לגלות את המוח, באמצעות מלקחיים משופעת עדין.
- ודא שרקמת המוח אינה מחוברת לעצם של הראש, כאשר הגולגולת מוסר.
- השתמש מלקחיים חד פעמיים כדי להסיר את כל רקמת החיבור בין הגולגולת והמוח, כדי להבטיח כי רקמת המוח הוסר יחד עם הגולגולת.
- אל תאפשר לרקמת המוח. להתייבש יותר מדי מניחים את המוח, באמצעות מלקחיים חד פעמיים, בצלחת פטרי עם 1 מ ל של ציר GC בתוספת 10% (vol/vol) גליצרול.
- המגון מכנית את המוח עם הבוכנה של מזרק 5 מ ל (ראה שלב 2.2.9). העבר את הדגימות לתוך שפופרת סטרילי 2 מ ל וחנות-80 ° c עבור הערכה מאוחר יותר של תא חיידקי קיימא ההערכה כפי שנדונו בשלב 2.2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הישרדות של עכברים נגועים ב -N. מנינגטידיס מסוג פראי וזנים מוטנטים איזוגניים.
זנים neisseria בשימוש בתוצאות אלה הנציגים הם קבוצת המסרוט C התייחסות מאמץ 93/4286 (ET-37) ואת המוטציה האיזוגנית שלו 93/4286Ωcssa שהושגו על ידי insertional איון פעלה של הגן cssa , קידוד עבור ה-UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase, כי מפות ב סינתזה הקפסולה לוקוס25. כדי להעריך את הרמה התקפה אלימה של מאמץ פגום Cssaבמודל murine הנוכחי, את המינון הקטלני מסוגל לקבוע את מותם של 50% של בעלי חיים נגועים (LD50) הוערך. למטרה זו שלוש קבוצות של בעלי חיים היו נגועים בתוך מינונים בין 104 כדי 106 cfu של זן סוג פראי 93/4286 עם מינונים של זן מוטציה 93/4286Ωcfu בין 107 אל 109 cfu . באופן כללי, הפחתת הפרמטרים הקליניים (למשל, משקל גוף וטמפרטורה) והגדלת שיעור התמותה התרחשה בתוך 72 h הראשון לאחר ההדבקה. LD50 עבור זן סוג פראי התכתב האתגר קרום הגרון של 104 cfu, בעוד שיעור התמותה עם המינון של 105 cfu היה שווה ל 83.4% ו עם 106 Cfu של 100% (איור 1a). לעומת זאת, כדי להשיג את LD50 עבור זן מוטציה 93/4286Ωcssa, יש צורך במינון של 108 cssa (איור 1b), כמות של 10,000 קפלי גבוה יותר לעומת זן סוג פראי.
הערכה של N. מנינגטידיס קיימא cfu ברקמות המוח של העכבר.
כדי לעקוב אחר הקינטיקה של זיהום ברקמת המוח של בעלי חיים נגועים, הטיפול בקורס זמן בוצע עם סוג פראי או Cssa מוטציה זן25. . אחרי הושכב הזרקה עם 5x105 cfu של 93/4286 או 93/4286Ωcfu זנים, היתה עלייה מהירה של חיידקים סוג פראי ברקמת המוח להגיע למספרים הגבוהים ביותר בסביבות 24 h לאחר הזיהום (איור 2a); לעומת זאת במוח של עכברים מאותגרים עם המוטציות האיזוגניים Cssa-פגומים, ספירות קיימא ירד בהדרגה לאורך זמן עד 2.026 יומן רישום cssa ± 1.774 72 h לכתוב זיהום (איור 2a). הניסוי הראה כי 33.3% של עכברים תיגר מוטציה הראה סיווג חיידקי מהאתר זיהום, בעוד זיהום עם זן סוג פראי מעולם לא להימחק מהמוח של בעלי חיים.
הערכה של עומס קרום הגרון בטחול ובכבד 48h לאחר האתגר.
ניסוי זה בוצע כדי להעריך את הסיווג של חיידקים מפני עכברים נגועים 48 h לאחר אתגר באיברים היקפיים. למטרה זו, שתי קבוצות של עכברים נדבקו 5 x 105 cfu של או 93/4286 או 93/4286Ωcfu זנים, וספירות קיימא חיידקי הוערכו הטחול והכבד של עכברים נגועים25 (איור 2b). בעקבות 48 h מתוך הזרקת קרום הגרון, מוטציה פגומה Cssaהיה נקי לחלוטין הטחול והכבד, בעוד בעלי החיים נגוע זן סוג פראי הציגו מסגרת מתמשכת מערכתית זיהום. הערכים ממוצע של CFU לאחר 48 h אכן היו עדיין 3.212 יומן CFU ± 3.354 ו6.949 היומן CFU ± 1.37 בטחול ובכבד, בהתאמה. ההבדל בחיידקים עומסים ברקמת הכבד של שתי קבוצות בעלי חיים היה משמעותי מבחינה סטטיסטית (עם P < 0.001).
איור 1: הישרדות של עכברים נגועים עם 93/4286 סוג פראי או cssa-פגומים N. מנינגטידיס זנים. (א) שלוש קבוצות של עכברים balb/c (n = 6/מינון) נדבקו i. ושכב. עם 104, 105, ו 106 cfu/העכבר של סוג פראי זן 93/4286 ו (ב) עם 107, 108, ו 109 cfu/העכבר של החשבונאי איזוגניים cfu-פגום. עכברים היו מנוטרים במשך שבוע, והישרדות הוקלטה. תוצאות מבוטא הישרדות אחוז במינונים שונים לאורך זמן, הערך p דירוג היומן היה < 0.05 עבור עכברים נגועים במתח סוג פראי. דמות זו שונתה מ Colicchio ואח '.25. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הערכה של העומסים חיידקי לאורך זמן עכברים מחוסן עם 93/4286 או 93/4286ΩCssa זנים. (A) מסלול הזמן של חיידקים נטען ברקמות המוח לאחר הושכב. זיהום. שתי קבוצות של עכברים Balb/c (n = 20/קבוצה) נדבקו על ידי ה-i. ושכב. נתיב עם 5 x 105 cfu של או סוג פראי זן 93/4286 או המוטציה cfu-פגום. בעלי חיים הוקרב 4, 24, 48, ו 72 h לאחר הידבקות. מוחות נקצרו, הומוגניים מכנית המומנת ב-GC בינונית, וספירות קיימא נקבעו. תוצאות מבוטא כממוצע ± SD יומן של מספרי CFU לכל איבר בנקודות זמן שונות לאחר החיסון. כוכביות מציינות משמעות סטטיסטית (* *, P < 0.01). (ב) חיידקי טוען לאורך זמן בטחול ובכבד. שתי קבוצות של עכברים Balb/c (n = 5/קבוצה) היו נגועים i. ושכב. עם 5 x 105 cfu של או סוג פראי זן 93/4286 או המוטציה cfu-פגום. בעלי חיים הורדמים 48 h לאחר ההדבקה. מכני וכבדים נקצרו, הומוגניים מכנית, וספירות קיימא נקבעו. תוצאות מבוטא כמספרי CFU יומן לכל איבר. פסים אופקיים מצביעים על. יומני ממוצע של מזהמים בקטריאליים כוכביות מציינות משמעות סטטיסטית (* * *, P < 0.001). דמות זו שונתה מ Colicchio ואח '.25. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול ניסיוני לגרום דלקת קרום הגרון בעכברים למבוגרים על ידי i. ושכב. חיסון. של חיידקים מקרום הגרון לידיעתך, אין מודל אחר של קרום הגרון שפותחה בעכברי מעבדה נגועים על ידי i. ושכב. דרך בעבר, בדרך זו נחקרו כדי לספק מודלים של דלקת קרום הגרון בשני עכברוש31 ו ארנב32. זה ידוע כי השיעור הגבוה ביותר של מחלת קרום הגרון נמצא בין ילדים צעירים, מתבגרים, ומבוגרים צעירים33,34,35; מסיבה זו, במודל העכבר הדלקת הקרום שלנו, במקום להתמקד בבעלי חיים תינובי או תינוקות, המועסקים 8 בעלי חיים בעלי שבוע.
במודל הניסיוני שלנו, החלטנו להשתמש ושכב. משום שהיא מבטיחה שחרור של קרום הגרון ישירות לתוך cisterna מגנה כך הקלה על שכפול חיידקי ב שדרתי. מסלול זה של החיסון הינו מבחינה פיזיולוגית יותר28 ופחות טראומטי מאשר תוואי תת-גולגולתי, שכבר נעשה בו שימוש לפיתוח דלקת קרום הראש עקב סטרפטוקוקוס. 36,37. למרות שהוא אינו מייצג את הדרך הטבעית של זיהום של קרום הגרון, הזרקה של חיידקים באזור זה היה אינסטרומנטלי עבור אינדוקציה של דלקת קרום הגרון, כפי שמוצג על ידי הישרדות העכבר, חיידקים טוען, פרמטרים קליניים, וגם על ידי ניתוח היסטולוגית24,25,26. מעניין, התייחסות זן 93/4286 המושרה דלקת קרום הגוף עם תכונות יסטופתולוגיות לחקות אלה שנצפו במחלה האנושית24,25,26.
כדי ליצור זיהום מורטין מתוקננת ולהבטיח את הבטיחות של החוקרים, זה היה המועדף להתחיל ממלאי קפוא טיטרציה של חיידקים במקום צמיחה בקטריאלי טרי24,25,30, 38, יתר על כן, החלטנו להשתמש במינון תת קטלני של מניגוקוצ'י לחיות עם המטרה להגביל תוצאה קטלנית מהירה ולאפשר פיתוח של נזק מוחי2,24,25,26. למרות זאת, כדי לקבוע מינון זיהומיות מתאים לזנים שונים, יש לבצע ניסויים ראשוניים. במחקר הנוכחי, בדקנו קבוצת ה4286Ω C התייחסות זן 93/4286 וזן מוטציה איזוגניים 93/Cssa עם מנה של 5 x 105 cssa/עכברים.
למרות שמודל זה אינו מחקה את השלבים הראשוניים של הקולוניזציה והפלישה של מנינגוקוקוס, הבידוד החיידקי גדל גם לא רק ב שדרתי, אבל הוא גם מסוגל להישאר בתאי הטחול והכבד. במהלך השלב ההיפופרמיק של זיהום neisserial, רוב הברזל heme-נגזר נשאר בשילוב עם ferritin הכבד. כמו ferritin יכול לשמש מניגוקוצ'י כדי להשיג ברזל39, הכבד מהווה איבר יעד עבור שכפול חיידקי.
בהליך ניסיוני זה, הלחץ הטבעי Balb/c העכבר נעשה שימוש בהחלפת של מאמץ CD-1 החיצוני שהיה מועסק במקור כדי לפתח את מודל דלקת קרום הגרון24. עכברים מיושן האופיינים על ידי שונות גנטית רחב, כי יכול להיות מתאים יותר לחשוף מספר אפקטים בתוך משתנה כגון האוכלוסייה האנושית40,41. עם זאת, השתנות זו זקוקה לגודל דגימה גבוה יותר להשגת משמעות סטטיסטית מספקת ועלולה לשבש את התקינה של נהלים ומחקרים ייעודיים.
למרות טווח מארח צר של קרום הגרון, כדי להבטיח את השכפול של חיידקים במארח murine ולשפר את התקפה אלימה של מניגוקוצ'י, תוספי ברזל היה מנוהל בעלי חיים לפני הזיהום6,14. לבסוף, בהשוואה למודל ניסיוני אחר של דלקת קרום החיים, לא טופלו חיות מסוימות עם אנטיביוטיקה כלשהי, כדי לא להשפיע על מהלך המחלה ו/או הפרופיל של התגובה הדלקתית26.
עד היום, המחקרים שלנו. הדגישו שושכב המודל הוא פונקציונלי כדי לגרום הן דלקת קרום הגרון פולשנית מחלת הקרום לעומת כיתה או i.n. מודלים של זיהום, אשר מאופיינים על ידי התרחשות של אלח דם ו בקטמיה לפני דלקת קרוםהרוח הוקמה 10,11 ,12,13,14,15,16,17. לכן, זה מודל זיהום המבוסס על אינדוקציה של דלקת קרום הצורה במארח murine, יכול להיות שימושי לא רק כדי להעריך אסטרטגיה טיפולית חדשנית כדי למנוע שכפול חיידקי ישירות לתוך שדרתי, אבל גם לנתח את היעילות של החיסון פסיבי אפשרי טיפול נגד פתוגנים אנושיים.
עם זאת זיהום קרום המוח הוא תהליך רב שלבים, הכולל מושבת האף, גישה למחזור הדם, המעבר של מכשול המוח בדם והתפשטות לבסוף בלתי מבוקרת של שדרתי, המודל שלנו רק מתרבה כמה היבטים של זיהום קרום הגרון, כדי לחתור בחלק מגבלות אלה המודל החי הטרנסגניים עשוי להועיל כדי לחקות את הפתוגנזה האנושית של מחלת קרום הגרון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחקרים היו נתמכים בחלק על ידי מ2012 [מספר מענק 2012wjsx8k]: "מארח-חיידק אינטראקציה מודלים זיהומים רירית: פיתוח של אסטרטגיות טיפוליות הרומן" ועל ידי מורה 2017 [2017sfbfer]: "גישה משולבת להתמודד עם הגומלין בין הסתגלות, תנאים מלחיצים ועמידות מיקרוביאלית של פתוגנים מאתגרים ".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,8 Skirted Cryovial With external thread | Starlab | E3090-6222 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | 30 mm x 115 mm |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | Stainless Steel |
| Alarm-Thermometer | TESTO | 9000530 | |
| BactoTM Proteose Peptone | BD | 211693 | |
| BD Micro Fine syringe | BD | 320837 | U-100 Insulin |
| BD Plastipak syringe 1 mL 25 G 5/8 inch | BD | 300014 | 05 mm x 16 mm |
| BD Plastipak syringe 5 mL | BD | 308062 | 07 mm x 30 mm |
| BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINET | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
| BioPhotometer | Eppendorf | Model #6131 | |
| Bottle D | Tecniplast | D | Graduated up to: 400 mL, Total Volume 450 mL, 72 mm x 72 mm x 122 mm |
| C150 CO2 Incubator | Binder | 9040-0078 | |
| Cage Body Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267 x 207 x 140 mm3, Floor area 370 cm2 |
| Cell Culture Petri Dish With Lid | Thermo Scientific | 150288 | Working Volume: 5 mL |
| Centrifuge | Eppendorf | Microcentrifuge 5415R | |
| Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
| di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Carlo erba | 471767 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysis | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
| Diete Standard Certificate | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | Food pellet for animal |
| Dumont Hp Tweezers 5 Stainless Steel | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0.10 x 0.06 mm2 tip |
| Electronic Balance | Gibertini | EU-C1200 | Max 1200 g, d = 0.01 g, T = -1200 g |
| Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock | Eppendorf | T3545-1000EA | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25 g |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | Stainless Steel |
| Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clamps | Tecniplast | 1264C400SUC | |
| GC agar base | OXOID | CM0367 | |
| Gillies Forceps 1 x2 teeth | F.S.T. | 11028-15 | Stainless Steel |
| Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1 L |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | Serrated Tip Width: 0.8 mm |
| Inner lid | Tecniplast | 1264C116 | |
| Iron dextran solution | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
| Ketamine | Intervet | ||
| Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class II | Faster | BH-EN 2004 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | BRAND | PP780751 | screw cap PP, grad |
| Mouse Handling Forceps | F.S.T. | 11035-20 | Serrated rubber; Gripping surface: 15 mm x 20 mm |
| Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000 mL |
| Natural Latex Gloves | Medica | M101 | |
| New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker | PBI international | C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker | |
| Petri PS Dishes | VWR | 391-0453 | 90 x 14.2 mm2 |
| Pipetman Classic P20 | Gilson | F123600 | 2-20 μL |
| Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200 μLL |
| Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1,000 μL |
| Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250 g |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1 kg |
| PS Disposible forceps | VWR | 232-0191 | |
| Removable Divider | Tecniplast | 1264C812 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon | 352063 | 5 mL |
| Sodium Chloride | MOLEKULA | 41272436 | |
| SS retainer and Polyester FilterSheet | Tecniplast | 1264C | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12 | Stainless |
| Stevens Tenotomy Scissors | F.S.T. | 14066-11 | Stainless Steel |
| Surgical Scissor - ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | Stainless |
| Touch N Tuff disposible nitrile gloves | Ansell | 92-500 | |
| Ultra Low Temperature (ULT) Freezer | Haier | DW-86L288 | Volume = 288 L |
| Wagner Scissors | F.S.T. | 14070-12 | Stainless Steel |
| Xylazine | Intervet |
References
- van Deuren, M., Brandtzaeg, P., van der Meer, J. W. Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management. Clinical Microbiology Reviews. 13, 144-166 (2000).
- Colicchio, R., et al. Fitness Cost of Rifampin Resistance in Neisseria meningitidis: In vitro Study of Mechanisms Associated with rpoB H553Y Mutation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7637-7649 (2015).
- Talà, A., et al. Serogroup-specific interaction of Neisseria meningitidis capsular polysaccharide with host cell microtubules and effects on tubulin polymerization. Infection and Immunity. 82, 265-274 (2014).
- Pagliarulo, C., et al. Regulation and differential expression of gdhA encoding NADP-specific glutamate dehydrogenase in Neisseria meningitidis clinical isolates. Molecular Microbiology. 51, 1757-1772 (2004).
- Plant, L., Jonsson, A. B. Contacting the host: insights and implications of pathogenic Neisseria cell interactions. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 608-613 (2003).
- Schryvers, A. B., Stojiljkovic, I. Iron acquisition systems in the pathogenic Neisseria. Molecular Microbiology. 32, 1117-1123 (1999).
- Virji, M., Makepeace, K., Ferguson, D. J., Watt, S. M. Carcinoembryonic antigens (CD66) on epithelial cells and neutrophils are receptors for Opa proteins of pathogenic neisseriae. Molecular Microbiology. 22, 941-950 (1996).
- de Vries, F. P., van Der Ende, A., van Putten, J. P., Dankert, J. Invasion of primary nasopharyngeal epithelial cells by Neisseria meningitidis is controlled by phase variation of multiple surface antigens. Infection and Immunity. 64, 2998-3006 (1996).
- Tinsley, C. R., Heckels, J. E. Variation in the expression of pili and outer membrane protein by Neisseria meningitidis during the course of the meningococcal infection. Journal of General Microbiology. 132, 2483-2490 (1986).
- Gorringe, A. R., et al. Experimental disease models for the assessment of meningococcal vaccines. Vaccine. 23, 2214-2217 (2005).
- Newcombe, J., et al. Infection with an avirulent phoP mutant of Neisseria meningitidis confers broad cross-reactive immunity. Infection and Immunity. 72, 338-344 (2004).
- Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 26, 75-82 (1999).
- Salit, I. E., Tomalty, L. Experimental meningococcal infection in neonatal mice: differences in virulence between strains isolated from human cases and carriers. Canadian Journal of Microbiology. 30, 1042-1045 (1984).
- Salit, I. E., Tomalty, L. A neonatal mouse model of meningococcal disease. Clinical and Investigative Medicine. 9, 119-123 (1986).
- Mackinnon, F. G., Gorringe, A. R., Funnell, S. G., Robinson, A. Intranasal infection of infant mice with Neisseria meningitidis. Microbial Pathogenesis. 12, 415-420 (1992).
- Mackinnon, F. G., et al. Demonstration of lipooligosaccharide immunotype and cap- sule as virulence factors for Neisseria meningitidis using an infant mouse intranasal infection model. Microbial Pathogenesis. 15, 359-366 (1993).
- Yi, K., Stephens, D. S., Stojiljkovic, I. Development and evaluation of an improved mouse model of meningococcal colonization. Infection and Immunity. 71 (4), 1849-1855 (2003).
- Holbein, B. E., Jericho, K. W. F., Likes, G. C. Neisseria meningitidis infection in mice: influence of iron, variations in virulence among strains, and pathology. Infection and Immunity. 24, 545-551 (1979).
- Saukkonen, K. Experimental meningococcal meningitis in the infant rat. Microbial Pathogenesis. 4, 203-211 (1988).
- Johansson, L., et al.
- Zarantonelli, M. L., et al. Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection. Infection and Immunity. 75, 5609-5614 (2007).
- Join-Lambert, O., et al. Meningococcal interaction to microvasculature triggers the tissular lesions of purpura fulminans. Journal of Infection Disease. 208, 1590-1597 (2013).
- Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Duménil, G. Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model. PLoS Pathogen. 9, 1003139 (2013).
- Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77, 3578-3587 (2009).
- Colicchio, R., et al. Virulence traits of serogroup C meningococcus and isogenic cssA mutant, defective in surface-exposed sialic acid, in a murine model of meningitis. Infection and Immunity. , 00688-00718 (2019).
- Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726 (2014).
- Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. Comparison of the abilities of different protein sources of iron to enhance Neisseria meningitidis infection in mice. Infection and Immunity. 57, 2425-2429 (1989).
- Beverly, K. S. Chapter 105 - Cerebrospinal Fluid Sampling Small Animal. Critical Care Medicine. , 448-452 (2009).
- Liechti, F. D., Grandgirard, D., Leppert, D., Leib, S. L. Matrix metalloproteinase inhibition lowers mortality and brain injury in experimental pneumococcal meningitis. Infection and Immunity. 82, 1710-1718 (2014).
- Pagliuca, C., et al. Novel Approach for Evaluation of Bacteroides fragilis Protective Role against Bartonella henselae Liver Damage in Immunocompromised Murine Model. Frontiers in Microbiology. 7, 1750 (2016).
- Trampuz, A., Steinhuber, A., Wittwer, M., Leib, S. L. Rapid diagnosis of experimental meningitis by bacterial heat production in cerebrospi- nal fluid. BMC Infectious Diseases. 7, 116 (2007).
- Tuomanen, E. I., Saukkonen, K., Sande, S., Cioffe, C., Wright, S. D. Reduction of inflammation, tissue damage, and mortality in bacterial meningitis in rabbits treated with monoclonal antibodies against adhesion-promoting receptors of leukocytes. Journal of Experimental Medicine. 170, 959-969 (1989).
- Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. I. The role of humoral antibodies. Journal of Experimental Medicine. 129, 1307-1326 (1969).
- Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. II. Development of natural immunity. Journal of Experimental Medicine. 129, 1327-1348 (1969).
- World Health Organization. Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae: WHO manual, 2nd Edition. World Health Organization. , Geneva: WHO. (2011).
- Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiolology. 4, 36 (2004).
- Zhang, S., et al. Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model. Journal of Visualized Experiments. (1), e137 (2018).
- Pagliuca, C., et al. Evidence of Bacteroides fragilis protection from Bartonella henselae-induced damage. PLoS One. 7, 49653 (2012).
- Larson, J. A., Howie, H. L., So, M. Neisseria meningitidis accelerates ferritin degradation in host epithelial cells to yield an essential iron source. Molecular Microbiology. 53, 807-820 (2004).
- Festing, M. F. W. Phenotypic variability of inbred and outbred mice. Nature. 263, 230-232 (1976).
- Festing, M. F. W. Warning: the use of heterogeneous mice may seriously damage your research. Neurobiology of Aging. 20, 237-244 (1999).
