Summary
Häri, ett protokoll för att genomföra Morris vatten labyrint tester för att utvärdera förmågan av inlärning och minne av Alzheimers sjukdom modell möss och för att bedöma effekten av manuell akupunktur för behandling av dem beskrivs.
Abstract
En Morris vatten labyrint (MWM) experiment tvingar försöksdjur att simma och lära sig att hitta en plattform gömd i vattnet. Det används ofta i vetenskaplig forskning för att bedöma inlärning och minne av djur. På grund av den omfattande användningen av MWM-testet är visuella experimentella protokoll viktiga för forskarna. Detta manuskript använder de senaste studierna för att introducera protokollet för MWM-testet. Alzheimers sjukdom (AD) kännetecknas av en progressiv förlust av minne och kognitiv funktion. En alternativ och kompletterande behandling som används för AD är manuell akupunktur (MA). För att bedöma inlärnings-och minnesförmågan hos AD Model-möss genomfördes MWM-testet. Den synliga plattformen rättegång, dolda plattform rättegång, PROBE Trial, och återföring Trial av MWM användes för att utvärdera spatial inlärning och minne förmåga. I den synliga plattformen rättegången var simning hastighet och flykt fördröjning av möss i olika grupper inte signifikant annorlunda. I den dolda plattformen och återförings försök visade annonsgruppen en lång flykt fördröjning. Flykt latensen minskade betydligt efter behandling med MA. Lågt plattforms delnings nummer och andelen tid i SW-kvadranten i sond prövningen ökade efter behandling med MA (p < 0,05 eller p < 0,01). Resultaten av MWM-testerna tyder på att MA effektivt kan förbättra spatiala inlärnings-och minnes förmågor hos AD Model-möss. Rigorösa experimentella operationer gav garantier för tillförlitligheten i resultaten.
Introduction
För närvarande har MWM experimentet blivit den mest använda och standard beteendemässiga experiment för att utvärdera den rumsliga inlärning och minne av djur1. Den ritades ursprungligen av den brittiske psykologen Richard G. Morris och har hela tiden förbättrats. Många fördelar såsom minimal utbildning, Cross-Art Utility, okänslighet för skillnader i kroppsvikt, och upprepad testning förmåga MWM göra det den bästa metoden för att bedöma kognitiv funktion2. Alzheimers sjukdom (AD) är ett stort medicinskt problem, främst kännetecknas av en minskning av minnes behandling och kognitiv funktion3. MWM är ett oumbärligt experiment medel för att utvärdera inlärnings-och minnesförmågan hos annons modell djur och interventions Metodernas effektivitet. MWM-experiment är i allmänhet tidskrävande (6 – 11 dagar) och involverar många variabla faktorer4. Även om det finns många artiklar om vatten labyrint experiment, i praktiken, saknar forskare ett sammanhängande protokoll. Därför är ett intuitivt och rigoröst protokoll process video särskilt viktigt. Med hjälp av ett tidigare experiment som exempel5beskrivs alla steg i MWM. Med hjälp av MWM föreslog tidigare studier att akupunktur skulle kunna lindra symtomen på möss med AD-modell5,6,7.
Häri beskrivs MWM-protokollet som används i en nyligen studie5 för att ge en enkel och synlig metod för forskare att bedöma den rumsliga inlärning och minne av annons modell djur.
Protocol
Detta protokoll godkändes av den Djuretiska kommittén vid Beijings universitet i kinesisk medicin, och det var i enlighet med alla riktlinjer för vård och användning av laboratoriedjur i Kina. Det fanns ingen oavsiktlig död situation under försöksförfarandet, och inga djur behövde euthanized i denna studie.
1. förberedelser
- Köp 30 manliga SAMP8 möss och 10 manliga SAMR1 möss (ålder: 8 månader).
- Hus möss individuellt i enskilda ventilations burar vid en temperatur av 24 ± 2 ° c och en 12 h mörker/ljus cykel.
- Mata mössen med en vanlig pelletsdieten tillgänglig AD libitum och tillhandahåll sterilt dricksvatten.
- Acclimate alla möss till miljön för 5 dagar före experimenterande.
2. gruppering av djur
- Dela slumpmässigt 30 SAMP8 möss i tre grupper (n = 10/grupp): annonsgruppen, manuell akupunktur (MA) grupp och medicin (M) grupp.
- Använd 10 SAMR1 möss som den normala kontrollgruppen (N)6.
3. administrering av donepezil hydrokloridtabletter
- Krossa en donepezil hydroklorid-tablett (5 mg/tablett) och lös upp den i 50 mL destillerat vatten.
- Leverera läkemedlet som bereds i steg 3,1 vid doser på 1 mg/kg till möss med hjälp av en oral Sonat en gång om dagen8 under hela experimentet, inklusive de dagar då ma behandling och MWM tester utförs.
4. administration av manuell akupunktur
- Immobilize möss i MA-gruppen i mus påsar.
- Använd disponibel sterila akupunktur nålar (0,25 mm x 13 mm) och tillämpa den platta Thorn metod för MA på Baihui (GV20) och Yintang (GV29)5 mot näsan för 20 min. se till att nålens djup är 0,2 – 0,3 cm.
- Dubbelriktat virvel manipulation inom 90 ° vid en hastighet av ca 180 r/min varje 5 min för ~ 15 s varje gång under hela experimentet, inklusive dagar när MA behandling och MWM tester utförs.
5. MWM-test
Obs: vid 24 h efter 15 dagar i följd av behandlingen, försöks möss i de fyra grupperna till MWM test. Genomför den synliga plattformen rättegång, dolda plattform rättegång, PROBE Trial, och återföring rättegång i ordning.
- Förbered dig för MWM-testet.
- Placera MWM-enheten och signal insamlings-och behandlingssystemet i ett experiment rum som är utformat för att bibehålla ljudisoleringen.
- Sätt en cirkulär vit tank (diameter = 90 cm, höjd = 50 cm) omgiven av en ogenomskinlig trasa i mitten av MWM-enheten.
- Fäst en videokamera i taket på MWM-enheten och Anslut den till en videobandspelare med ett automatiserat spårningssystem för att samla in data.
- Dela vatten labyrint tanken lika i fyra lika regioner med två ömsesidigt vinkelräta linjer, märkt norr (N), Syd (S), öster (E), och väst (W). Dela upp poolområdet konceptuellt i fyra kvadranter av samma storlek (NE, NW, SW, och SE).
- Placera visuella signaler i olika former på väggen i varje kvadrant som visuella referenser (t. ex., kvadrater, trianglar och cirklar) inom räckhåll för musen.
Anmärkning: distala signaler är djurens navigations referenspunkter för lokalisering av plattformen. Flytta dem därför inte under testet. Positionen av forskaren är en potentiell distala Cue och kan påverka MWM. Därför bör forskaren hålla sig utanför åsynen av möss i väntan på djuret att utföra testet. - Fyll den cirkulära behållaren med vatten till ett djup av 30 cm och behåll vid 22 ± 2 ° c med en elektrisk värmare.
- Göra vattnet ogenomskinligt med ca 150 g mjölkpulver.
- Utför den synliga plattforms testversionen.
- Placera en cirkulär plattform av plast (diameter = 9,5 cm; höjd = 28 cm) 1 cm över vattenytan i valfri kvadrant slumpmässigt.
- Sätt en svart flagga på plattformen.
- Släpp varje mus försiktigt i vattnet på vattennivå från en av de fyra startplatser som vetter mot tankväggen. Tappa inte musen i vattnet.
- Aktivera dator spårningsprogrammet så snart som musen släpps ut i vattnet.
- Ge varje mus 60 s för att söka efter plattformen. I slutet av varje prov, placera varje mus på plattformen och låt den stanna på den för 10 – 30 s.
- Observera simning banor av möss på datorn, registrera den tid då musen tog för att hitta plattformen som Escape latens, och analysera simning hastighet.
- Torka varje mus med handdukar och värm den med en elektrisk värmare. Var noga med att använda en lämplig värmekälla för att förhindra att djuret överhettas.
Obs: Placera varje mus i poolen vid var och en av de fyra olika start kvadranter för fyra prövningar, flytta plattformen till en annan plats med varje efterföljande rättegång. Intervallet mellan två försök med varje mus är 15 – 20 min.
- Utför den dolda plattformen Trial/Place navigering test.
- Placera samma plattform utan en flagga i SE-kvadranten.
- Slumpmässigt Placera musen i poolen från var och en av de fyra kvadranter (NE, NW, SW, N) mot poolväggen för fyra prövningar. Använd ett tidsintervall på 15 – 20 minuter mellan två prövningar.
- Ge varje mus 60 s för att söka efter den dolda plattformen.
- Registrera Escape latency för varje försök efter att musen klättrar upp till plattformen för efterföljande analys.
- Torka varje mus med handdukar och värm den med en elektrisk värmare.
Observera: genomför den dolda plattforms testperioden från dagar 2 − 6. Om musen inte kan hitta plattformen i 60 s, leda musen för att klättra upp till plattformen och låta den stanna där för 10 – 30 s i slutet av varje rättegång. Utför fyra försök/dag för varje mus i 5 dagar i följd, med plattformen och de visuella ledtrådar vid konstanta positioner.
- Utför sonden rättegång.
Notera: lokalisera varje mus i poolen på en ny startposition för att observera den rumsliga utforskning förmåga av musen.- Ta bort plattformen.
- Leta upp varje mus som vetter mot tankväggen i poolen en gång för 60 s. se till att startplatsen är NW kvadrant, som är den kvadrant längst bort från SE kvadrant.
- Spela in simning avstånd, simning hastighet, och plattformen crossover nummer i labyrinten.
- Torka varje mus med handdukar och ge värme efter rättegången.
- Utför återförings försöket.
Anmärkning: utför återförings prov från dagar 8 − 11.- Placera plattformen i mitten av NW-kvadranten (i stället för SE-kvadranten).
- Följ steg 5.3.2 − 5.3.5 som beskrivs i den dolda plattformen Trial avsnitt.
6. statistisk analys
- Använd statistik programvara (t. ex. SPSS 20,0) för att utföra den statistiska analysen.
Representative Results
Tids axelns diagram över detta protokoll visas i figur 1.
Figur 1: tids axelns diagram över studieprotokollet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tidsaxeln visar att experimentet varade i totalt 21 dagar. Behandlingen applicerades på musen under hela experimentet och MWM-testerna började efter 15 dagars behandling. Den synliga plattformen, dolda plattform, sond och återföring prövningar genomfördes i ordning.
Tidigare publicerade resultat från Ding et al.5 presenteras som typiska resultat av MWM figur 2.
Figur 2: typiska resultat av Morris vatten labyrint test (n = 10). (A) förändringar i flykt latens och simning hastighet av råttor bland de olika grupperna i den synliga plattformen rättegång. (B) förändringar i flykt latens av råttor bland de olika grupperna i den dolda plattformen och återföring prövningar. P-värdena är * p < 0,05 och * * p < 0,01 jämfört med kontrollgruppen. Symbolen # # indikerar p < 0,01 jämfört med annonsgruppen. (C) förändringar i plattforms delnings nummer och den procentuella andelen av den tid som råttor i den nordvästra kvadranten bland de olika experimentella grupperna i sond prövningen. Resultaten av den synliga plattformen, dolda plattformen och återförings prov i varje grupp visas (n = 10, medelvärde ± SD). Denna siffra har modifierats från Ding et al5. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2A visar resultatet av den synliga plattforms prövningen. Inga statistiska skillnader observerades i flykt latens eller simning hastighet bland grupperna på den första dagen av MWM. Figur 2b visar resultatet av den dolda plattformen och återförings rättegången från dagar 2 − 6 och dagar 8 − 11. Escape-fördröjningen i annonsgruppen förblev på en hög nivå på varje dag i testet. Flykt latensen av de andra tre grupperna minskade gradvist. Flykt fördröjningen från dagar 3 − 6 och dagar 8 − 11 var längre i annonsgruppen än i kontrollgruppen (p < 0,01). Escape latenser av möss i MA och läkemedelsgrupper var kortare än för möss i annonsgruppen på dagar 2 − 6 och dagar 8 − 11, respektive (p < 0,01). I figur 2C visas resultaten av sond prövningen. Plattforms korsnings antalet möss i annonsgruppen var statistiskt lägre än i kontrollgruppen (p < 0,01). Plattforms delnings numret i MA-gruppen var högre än i annonsgruppen (p < 0,05). Den andel av tiden som tillbringades i SW-kvadranten av möss i annonsgruppen var signifikant lägre än i kontrollgruppen (p < 0,01). Andelen av den tid som tillbringades på SW-kvadranten i MA-gruppen var högre än i annonsgruppen (p < 0,01).
Discussion
Även om många vatten labyrinter, inklusive Biel vatten labyrint och Cincinnati vatten labyrint, har funnits i minst ett sekel, bara MWM har i stor utsträckning används för att effektivt och objektivt utvärdera spatial inlärning och minne förmåga eftersom det har många fördelar9. Trots omfattande användning av MWM har förfarandet inte alltid använts optimalt. MWM-experiment tar i allmänhet lång tid och påverkas av många variabla faktorer. Det finns några effektiva och pålitliga aspekter som hjälper till att upptäcka förändringar i rumslig inlärning och minnesförmåga som bör beaktas.
Fyra olika MWM-prövningar utfördes. Det synliga plattforms försöket användes på dag 1 av MWM. Om djuren kunde simma direkt till plattformen, indikerade det att simnings förmågan och synen av djuren var normala10. Otnass föreslog att den synliga plattformen rättegång bör genomföras första11. Resultatet av den synliga plattforms prövningen i denna studie innebar att de fyra grupperna började på samma inlärnings nivå. Därifrån kan de efterföljande experimenten startas. Den dolda plattformen rättegången användes för att bedöma förmågan hos möss att förvärva inlärning och minne förmåga. Sonden rättegången genomfördes på dag 7, 24 h efter utgången av den dolda plattformen rättegång, att bedöma arbetsminnet. Slutligen användes återförings försöket för att bedöma arbetsminne2. Förändringarna i de fyra olika studierna av MWM tillsammans indikerade att AD-modellmöss hade låg inlärning och minnesförmåga och att MA hade en positiv effekt på AD5.
Det finns inga specifika standarder för dimensionerna av poolen och plattform1. En pool med 214 cm diameter används i de flesta MWM-studier. Vorhees och Williams visade att med identiska protokoll, råttor lära sig snabbare i en 122-cm pool än i en 210-cm pool; den branta sluttningen av inlärningskurvan indikerar att 122-cm diameter pool är extremt lätt för råttor att navigera12. I det nuvarande protokollet, med tanke på ålderdom och svaga resning av annonsen möss, en 90-cm diameter pool och 9,5-cm diameter plattform användes. Resultaten av preliminära experiment indikerade att möss hade svårare att hitta plattformen i en pool med större diameter. Därför representerar tester i större pooler inte den verkliga skillnaden mellan grupperna. Försöksdjuren hade en svårare tid att hitta plattformen i en större pool med en mindre plattform4. Därför måste storleken på poolen och plattformen optimeras i preliminära experiment i enlighet med försöksdjurens experimentella krav och skick.
Vatten vid temperatur mellan 20 och 24 ° c rekommenderas för att utföra MWM-provet4. Åldern försöksdjur utförs dåligt i kallt vatten13, vilket indikerar en tydlig åldersrelaterad förlust av termoreglering14. I denna studie, en termostat placerades i botten av poolen för att bibehålla temperaturen på vattnet vid 20 – 24 ° c. Studieresultaten visade ingen signifikant skillnad i SIM hastigheter bland de fyra grupperna5.
MWM är en kraftfull teknik för att bedöma kognitiv funktion och används ofta i studier för närvarande. Det finns dock ingen definierad, standard, konsekvent utrustning för att utföra MWM-testet, inklusive storleken på poolen och plattformen15,16. Olika laboratorier har olika specifikationer för MWM. Därför väljer forskarna lämplig försöksenhet enligt deras individuella experimentella krav, vilket kan orsaka förvirring bland forskarna. Preliminära experiment är också nödvändiga. Fler studier måste utföras på grundläggande experiment som MWM. För närvarande ligger flexibiliteten i MWM som ett experimentellt verktyg bara i möjligheten att välja de grundläggande protokollen enligt den studie som har föresatt sig. Därför, detta test kan tillämpas för att bedöma kognitiv funktion i större djup.
Disclosures
Författarna förklarar ingen potentiell intressekonflikt.
Acknowledgments
Huiling Tian och ning Ding är co-första författare. Zhigang Li och Jing Jiang är co-korresponderande författare. Denna forskning stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation i Kina (Grant nos. 81804178, 81473774 och 81503654). Protokollet och resultaten som beskrivs häri härstammar från artikeln, "medverkan av manuell akupunktur reglerar beteende och cerebralt blodflöde i SAMP8 Mouse modell av Alzheimers sjukdom" av Dr. ning Ding et al.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acupuncture needles | Beijing Zhongyan Taihe Medical Instrument Limited Company | 511526 | |
| desktop computer | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | Lenovo T4700D | |
| Donepezil Hydrochloride Tablet | Eisai China | H20050978 | Aricept |
| mice | Zhi Shan (Beijing) Academy of Medical Science | SCXK2014-0003 | |
| Mirros water maze device | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | WMT-100S | |
| mouse bags | home-made | ||
| Signal acquisition and processing system | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | BL-420N |
References
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Value of water mazes for assessing spatial and egocentric learning and memory in rodent basic research and regulatory studies. Neurotoxicology Teratology. 45, 75-90 (2014).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocol. 1 (2), 848-858 (2006).
- The state of the art of dementia research: New frontiers; World Alzheimer Report 2018. Alzheimer's Disease International. 9, 1-46 (2018).
- Vorhees, C. V., et al. Effects of neonatal (+)-methamphetamine on path integration and spatial learning in rats: effects of dose and rearing conditions. International Journal of Developmental Neuroscience. 26 (6), 599-610 (2008).
- Ding, N., Jiang, J., Xu, A., Tang, Y., Li, Z. Manual acupuncture regulates behavior and cerebral blood flow in the SAMP8 mouse model of Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 13, 37 (2019).
- Ding, N., et al. Manual acupuncture suppresses the expression of proinflammatory proteins associated with the NLRP3 inflammasome in the hippocampus of SAMP8 mice. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2017, 1-8 (2017).
- Cao, J., et al. Behavioral changes and hippocampus glucose metabolism in APP/PS1 transgenic mice via electro-acupuncture at governor vessel acupoints. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 5 (2017).
- Amy, E., et al. Effects of sub-chronic donepezil on brain Abeta and cognition in a mouse model of Alzheimer's disease. Psychopharmacology. 230, 279-289 (2013).
- Garthe, A., Kempermann, G. An old test for new neurons: refining the Morris water maze to study the functional relevance of adult hippocampal neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 7, 63 (2013).
- Schoenfeld, R., Schiffelholz, T., Beyer, C., Leplow, B., Foreman, N. Variants of the Morris water maze task to comparatively assess human and rodent place navigation. Neurobiology of Learning and Memory. 139, 117-127 (2017).
- Otnass, M. K., Brun, V. H., Moser, M., Moser, E. I. Pretraining prevents spatial learning impairment after saturation of hippocampal long-term potentiation. Journal of Neuroscience. 19 (24), 49 (1999).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Assessing spatial learning and memory in rodents. Ilar Journal. 55 (2), 310-332 (2014).
- Vorhees, C. V., Skelton, M. R., Williams, M. T. Age-dependent effects of neonatal methamphetamine exposure on spatial learning. Behavioural Pharmacology. 18 (5-6), 549-562 (2007).
- Iivonen, H., Nurminen, L., Harri, M., Tanila, H., Puoliväli, J. Hypothermia in mice tested in Morris water maze. Behaviour Brain Research. 141 (2), 207-213 (2003).
- Lin, S. Y., et al. Ozone inhibits APP/Aβ production and improves cognition in an APP/PS1 transgenic mouse model. Neuroscience. , (2019).
- Zuo, Y., et al. Preoperative vitamin-rich carbohydrate loading alleviates postoperative cognitive dysfunction in aged rats. Behavioural Brain Research. 373, 112107 (2019).
