Summary
В этой статье демонстрируется использование метода золотого стандарта в поведенческой генетике, методразлого разложения Холески, для оценки уникальных, перекрывающихся генетических и экологических воздействий на различные переменные, чтобы ответить на продольно мотивированные исследования Вопросы.
Abstract
Метод разложения Холеского является золотым стандартом, используемым в области поведенческой генетики. Метод популярен, потому что его легко программировать и решать. Используя этот метод, исследователи могут исследовать индивидуальные различия в продольных отношениях различных переменных в нескольких точках времени. Метод позволяет следователям разлагать дисперсию на (1) уникальные генетические, общие и необщие экологические эффекты, которые возникают в определенные моменты времени, а также (2) перекрывающихся генетических, общих и необщих экологических эффектов, которые переносятся от одного время точки к другому. Однако метод не определяет механизмы или происхождение, лежащие в основе этих эффектов. В настоящем докладе основное внимание уделяется применению метода разложения Холеского в области педагогической психологии. В частности, в нем обсуждаются индивидуальные различия в продольных отношениях между знаниями письма детского сада, детской фанологической осведомленности, первого класса слово уровня чтения навыков, а также седьмой класс чтения понимания.
Introduction
Стать опытным читателем с возможностью свободно читать и понять текст имеет важное значение для школьных результатов детей. Чтобы предотвратить развитие проблем чтения, очень важно понять, в какой степени различные навыки чтения предсказывают понимание чтения. Существующие исследования показали, что предварительное чтение и навыки чтения на уровне слов в начальной школе продольно предсказать понимание чтения в средней школе1,2. Индивидуальные различия в этих прогнозах в основном указывают на основные генетические (и в некоторой степени, экологические) факторы от детского сада до 4 класса3,4. Тем не менее, необходимо изучить ли эти же генетические и экологические факторы продолжают влиять на эти прогнозы до средней школы классов.
Один из методов, чтобы получить лучшее понимание индивидуальных различий, лежащих в основе ассоциации между начальной и средней школы навыки чтения использует поведенческую генетическую методологию, в частности, метод разложения Чолески. Метод разложения Холеского считается одним из золотого стандарта анализа поведенческой генетики. Этот метод прост в программировании и решении и позволяет разложение дисперсии и коварии в (A) генетические, (C) общие экологические, и (E) необщих экологических воздействий, как правило, в выборке близнецов. Пример неиваратного (одной переменной) разложения Холеского указывается на рисунке 1. Скрытый фактор относится к генетическим эффектам, которые являются генетическими влияниями, унаследованные от родителей. Скрытый фактор C относится к общим экологическим последствиям, которые являются аспектами окружающей среды, которые служат для того, чтобы сделать близнецов более похожими, такими как домашняя и школьная среда. Наконец, латентный фактор E относится к необщим экологическим воздействиям, которые являются экологическими влияниями, которые являются уникальными для каждого близнеца и способствуют различиям между близнецами, таким как собственный опыт каждого из них. Коэффициент E также фиксирует погрешность измерения.
Рисунок 1: Разложение на (A) генетическое, (C) совместное воздействие окружающей среды и (E) несовместное воздействие на окружающую среду. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Факторы A, C и E на рисунке 1 оценивают степень влияния генов и сред на одну (чтение) переменной. Тем не менее, для изучения индивидуальных различий, лежащих в основе продольных ассоциаций между более чем одним навыком чтения от начальной до средней школы, продольный анализ необходим. Для ответа на продольно мотивированные исследовательские вопросы здесь используется многовариантныйметод разложения Холеского. Концептуально многовариантный метод разложения Холески аналогичен иерархической множественной регрессии, так что независимый вклад генетических и экологических факторов оценивается после того, как вклад предыдущих факторов был принят в Учетной записи.
Например, в многовариантном разложении Холески с продольными данными в четырех временных точках (см. рисунок 2),первый набор факторов (A1),общие экологические (C1), и необщей экологической (E1) способствует дисперсии всех переменных, представленных в виде путей11,21,31,41, c11, c21, ..., e11, и т.д., отA 1, C1, E1 факторы для каждой переменной . Второй набор факторов (A2,C2,E2) способствует дисперсии второй и последующих переменных после контроля за первой точкой времени. Второй набор факторов представлен как пути22,32,42, c22, c32, ..., e22и т.д. Затем влияние третьего набора факторов (A3,C3,E3) оценивается для третьей и четвертой переменных после контроля за предыдущими двумя точками времени. Они представлены как пути33,43, c33, c43, e33,e43, e 43 . Наконец, влияние четвертого набора факторов (A4,C4, E4) измеряются для точки окончательного времени после контроля за всеми предыдущими точками времени. Они представлены как пути44,c44,e44.
Рисунок 2: Многовариантная модель разложения Холески в течение четырех временных точек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
В этом продольном применении многовариантного метода разложения Холески, генетические и экологические влияния в каждый момент времени оцениваются после того, как последствия предыдущих точек времени были проконтролированы. Таким образом, этот метод позволяет определить степень, в которой уникальные генетические и экологические влияния приходят онлайн в каждый конкретный момент времени, независимо от влияний из предыдущих точек времени (эти эффекты оцениваются по путям11, 22,33,44, c11, c22, ..., e11, e22и т.д.). Кроме того, метод также позволяет изучить степень, в которой те же (перекрывающиеся) генетические и экологические влияния распределяются между точками времени. Другими словами, можно определить, в какой степени генетические и экологические влияния переносятся из одной временной точки в другую (т.е. эти эффекты оцениваются по путям21, a31,a 32,a 42, a 43, c21, c31, ..., e21и т.д.). Следует отметить, что пути11,c11и e11 представляют все возможные генетические и экологические влияния до и в том числе первый момент времени, который может быть либо уникальным или перекрывающихся с предыдущими точками времени. Однако временные моменты до первой точки времени не оцениваются; следовательно, невозможно точно определить, представляют ли они уникальные или перекрывающиеся влияния. Для целей упрощения они включаются в качестве уникальных влияний в настоящем докладе.
Порядок измеренных переменных, введенных в разложение Холеского, является произвольным. Тем не менее, порядок, как правило, определяется теоретической точки зрения. Это также относится и к текущему исследованию, в котором порядок был основан на развитии навыков чтения, так что навыки чтения в начальной школе являются предсказуемыми понимания чтения в средней школе.
Есть несколько докладов в литературе исследования генетических и экологических факторов, лежащих в основе продольных ассоциаций навыков чтения с использованием метода разложения Чольский. Эти предыдущие исследования в основном сосредоточены на изучении отношений между навыками чтения среди учащихсяначальнойшколы 6,7. Существует только одно опубликованное исследование изучения индивидуальных различий, связанных с чтением из начальных классов в средней школе классов с использованием многовариантного метода разложения Холески8. Этот протокол детализирует многовариантный метод разложения Холески из этого конкретного доклада для изучения индивидуальных различий в продольных отношениях между знаниями письма детского сада, фанологической осведомленности детского сада, первого класса слово-уровня навыки чтения, и седьмой класс чтения понимания.
Результаты исследования сосредоточены на использовании многоварного метода разложения Холески для разграничения двух типов генетических и экологических воздействий. Во-первых, показано, как оценить генетические и экологические влияния, которые переносят (перекрытия) от начальной до средней школы чтения (например, оценка путей43, c43, и e43, которые являются генетические и экологические влияния на слово уровня чтения навыки с первого класса, которые влияют на понимание чтения в седьмом классе). Во-вторых, показано, как оценить уникальные генетические и экологические влияния, которые приходят онлайн в каждом конкретном классе (например, оценка путей33, c33, и e33, которые являются уникальными генетическими и экологическими влияниями на слово уровня чтения навыки, которые возникают в первом классе).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Приведенные ниже шаги описывают процесс оценки индивидуальных различий, лежащих в основе продольных связей между навыками чтения начальной и средней школы в (A) генетические, (C) общие экологические и (E) необщие экологические факторы, использующие программа статистического моделирования, текстовый процессор и программное обеспечение с графическим пользовательским интерфейсом (GUI). Это исследование было одобрено Институциональным наблюдательным советом при Университете штата Флорида.
1. Подготовка данных для программы статистического моделирования
- Подготовьте данные в формате, который может быть прочитан программой статистического моделирования по выбору. Популярные программы статистического моделирования включают Mx, OpenMx в платформе R и MPlus9. Mx может считывать файлы данных в форматах данных .vl или .dat, OpenMx в любом формате данных и Mplus в формате данных .dat. Пример, показанный здесь, выполнен в программе MPlus9.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пример файла данных в формате .dat для шести случайно выбранных участников доступен в дополнительных файлах. Переменные, используемые в файле выборочных данных, отражают переменные, используемые в файле кодирования ввода.
2. Чтение данных в программе статистического моделирования, запуск сценария и оценка эффектов
- Откройте программу статистического моделирования.
- Найдите соответствующий файл данных, который будет прочитан в программе статистического моделирования, введя ввод "Файл - это "вставить расположение файла данных на компьютере".
- Нажмите на значок RUN на ленте программы статистического моделирования, чтобы получить оценки генетических, общих экологических и необщих экологических воздействий от многовариантного метода разложения Холески. Аннотированный входной скрипт для многовариантной модели разложения Холески в течение четырех временных точек, а также его выход с помощью MPlus можно найти в дополнительных файлах кодирования.
- После того, как программа статистического моделирования генерирует оценки для генетических, общих экологических и необщих экологических воздействий, найти оценки в файле вывода под stx11 для пути11, stx21 для пути21, ..., sty11 для пути c11,sty21 для путя c21,..., stz11 для путя e11,stz21 для путя e21,etc.
3. Создание таблицы с сгенерированными оценками
- Откройте текстовый процессор.
- Копирование генерируемых оценок в таблицу в текстовом процессоре. Таблица может быть создана в формате, указанном на рисунке 3. Например, в этом случае оценки для путей11,21,31и41 имеют значения 0,60, 0,24, 0,63 и 0,18 соответственно.
Рисунок 3: Многовариантное разложение Холески моделирует стандартизированные оценки траектории генетических и экологических воздействий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
4. Распространение генетических, общих экологических и необщих экологических воздействий
- Откройте программное обеспечение с графическим интерфейсом.
- Введите оценки из созданной таблицы в ячейки F3-F16, G4-G16, H5-H16 и I6-I16. Скриншот из программного обеспечения с графическим интерфейсом изображен на рисунке 4.
Рисунок 4: Ввод оценок в программное обеспечение с графическим интерфейсом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
- Рассчитайте дисперсию генетических, общих экологических и необщих экологических воздействий, сводя оценки в клетках F3-F16, G4-G16, H5-H16 и I6-I16. Введите значения квадратного квадрата в ячейках J3-J16, K4-K16, L5-L16 и M6-M16.
- Рассчитайте процентное отклонение путем умножения значений в ячейках J3-J16, K4-K16, L5-L16 и M6-M16 на 100. Введите процентные значения в ячейках N3-N16, O4-O16, P5-P16 и No6-16. Шаги 4.3 и 4.4 изображены на рисунке 5.
Рисунок 5: Иллюстрация шагов 4.3 и 4.4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
- Рассчитайте, в какой степени генетические влияния переносят (перекрытия) из начальной в среднюю школу.
- В ячейке R3 введите "0".
- В ячейке R4 введите тип «N4». Это степень, в которой генетические влияния с первой точки времени перенести на второй момент времени. В этом случае, это указывает на генетические влияния от письма именования беглость в детском саду переносит на фонем сегментации беглости в детском саду.
- В ячейке R5 введите тип «N5»O5. Это степень, в которой генетические влияния из первых двух точек времени переносятся на третью точку времени. В этом случае, это указывает на генетические влияния от письма именования беглость в детском саду и фонем сегментации беглости в детском саду, переносит на слово уровня навыков чтения в классе 1.
- В ячейке R6 введите тип "N6-O6"P6". Это степень, в которой генетические влияния из первых трех точек времени переносятся на четвертую точку времени. В этом случае, это указывает на генетические влияния от письма именования беглость в детском саду, фонемсегментации беглости в детском саду, и слово уровня навыков чтения в классе 1 переноса на чтение понимания в классе 7.
- Рассчитайте, в какой степени общие экологические и необщие экологические влияния переносят (перекрытия) из начальной в среднюю школу так же, как и в шаге 4.5.
- Рассчитайте, в какой степени уникальные генетические, общие экологические и необщие экологические факторы выходят в систему в каждый конкретный момент времени (т.е. сорт).
- Копировать проценты от клеток N3, O4, P5 и No 6 в клетки S3, S4, S5 и S6, соответственно, чтобы получить степень, в которой уникальные генетические факторы приходят онлайн в каждом классе.
- Копируйте проценты от ячеек N8, O9, P10 и No11 в ячейки U3, U4, U5 и U6, соответственно, чтобы получить степень, в которой уникальные общие экологические факторы приходят в сети в каждом классе.
- Копируйте проценты от ячеек N13, O14, P15 и No16 в ячейки W3, W4, W5 и W6, соответственно, чтобы получить степень, в которой уникальные необщие экологические факторы выходят в интернет в каждом классе.
- Для того чтобы все расчеты были правильными, значения в ячейках R3-W3, R4-W4, R5-W5 и R6-W6 должны складываться до 100. Шаги 4.5-4.7 изображены на рисунке 6.
Рисунок 6: Иллюстрация шагов 4.5-4.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
- Участок генетического перекрытия, а также генетические уникальные влияния, нажав и перетаскивая мышь над клетками R2-R6 и S2-S6, чтобы выделить данные.
- Нажмите на меню Insert.
- Нажмите на диаграммы (gt; Stacked колонка.
- Повторите шаги 4.9-4.11 для совместного экологического и несовместного экологического перекрытия, а также уникальных воздействий. Выберите ячейки T2-T6 и U2-U6, чтобы устроить общий участок воздействия на окружающую среду, и выберите ячейки V2-V6 и W2-W6 для необщих экологических воздействий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Стандартизированные оценки генетических, общих экологических и необщих экологических воздействий многовариантной модели разложения Холески изображены на рисунке 7. В целом, результаты показали, что индивидуальные различия в детском саду предварительного чтения и первого класса слово уровня навыков чтения приходится большая доля дисперсии генетических (40%) а также общие экологические (39%) влияет на понимание чтения седьмого класса. Кроме того, результаты ссылались на степень уникальных источников, вступаюющих в игру для каждого отдельного навыка чтения в каждом классе.
Рисунок 7: Полная многовариантная модель разложения Холески со стандартизированными оценками траектории генетических и экологических воздействий. Измеренные переменные изображаются как прямоугольники, а спотыкающаяся переменная — в качестве овала. LNF - детский сад письмо именования беглость, PSF и детский сад фонеме сегментации беглости, WLRS - первый класс слово уровня чтения навыки, RC - седьмой класс чтения понимания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Как указано на рисунке 8, оказывается, была большая доля уникальных генетических влияний (темно-зеленый) на письма именования беглости в детском саду (36%), фонем сегментации беглости в детском саду (40%), и чтение понимания в седьмом классе (30%). В отличие от этого, навыки чтения на уровне слов были в меньшей степени связаны с уникальными генетическими влияниями, которые возникают в первом классе (20%). Генетическое влияние на навыки чтения на уровне слов были в основном перекрывающимися (светло-зеленый) с генетическими влияниями на беглость именования букв и беглость сегментации фонемы (40%).
Рисунок 8: Процент уникальных и перекрывающихся генетических воздействий на каждое умение чтения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Сосредоточение внимания на общих экологических влияний (см. Рисунок 9), результаты подразумевают, что перекрытия (светло-голубой) общей среды повлияли письма именования беглости и фонемы сегментации беглости в детском саду (9%). Аналогичным образом, перекрывающиеся общие экологические эффекты были отражены в навыках чтения на уровне слов в первом классе (15%) и понимание чтения в седьмом классе (39%) которые также были разделены с навыками чтения детского сада. Уникальные общие факторы окружающей среды (темно-синий) были найдены для первого класса слово уровня чтения навыков (15%). Эти влияния не зависят от общих экологических воздействий в детском саду.
Рисунок 9: Процент уникальных и перекрывающихся общих экологических воздействий на каждое умение чтения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Для необщих экологических воздействий (см. рисунок 10),результаты показали очень небольшое совпадение между факторами (светло-желтый). Большинство необщих экологических воздействий указали на уникальные влияния (темно-желтый) в каждый отдельный момент времени (т.е. сорт).
Рисунок 10: Процент уникальных и перекрывающихся необщих экологических воздействий на каждый навык чтения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Общее представление генетических и экологических факторов, лежащих в основе навыков чтения от начальной до средней школы показано на рисунке 11. В целом было показано, что навыки чтения, как представляется, зависит от генетических и экологических факторов в течение этого периода развития.
Рисунок 11: Общий процент генетических, общих экологических и необщих экологических воздействий на каждый навык чтения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Цель этого исследования состояла в том, чтобы продемонстрировать, как устоявшийся метод в поведенческой генетике, многовариантный метод разложения Холески, может эффективно использоваться для понимания отношений между переменными в временном контексте. В частности, этот метод позволяет оценить степень возникновения уникальных генетических и экологических воздействий в определенные временные моменты (например, школьный класс), а также продемонстрировать дублирование генетических и экологических воздействий во многих точки времени.
Существует один важный шаг в протоколе, который является оценка многовариантной модели разложения Холеского. Иногда сценарий программы статистического моделирования требует корректировки начальных значений на основе вводимых данных. Исследователи могут использовать различные начальные значения, предложенные в ходе программы статистического моделирования, для обеспечения более плавных процессов итерации при генерации генетических и экологических оценок.
Изменение протокола (т.е. сценарий программы статистического моделирования) может быть необходимо, если скрытые переменные заменяют измеренные переменные. В Mplus скрытая переменная определяется с помощью оператора "BY" с двумя или более измеренными переменными. Например, в этом аннотированном входном скрипте смночная переменная для каждого близнеца определена в разделе "MODEL:" как "FLU0 BY nneworf0 nnewnwf0 (3-4);" для первого близнеца в двойной паре и "FLU1 BY nneworf1" nnewnwf1 (3-4);" для второго близнеца в двух паре. Другая модификация относится к графическому представлению результатов. Результаты могут быть построены с использованием альтернативных методов, таких как круговые диаграммы. Здесь использовались сложенные столбцы, так как это типичная методика визуализации в области генетики поведения.
Есть ограничения для многовариантного метода разложения Холеского. Многовариантное разложение Холески является золотым стандартом анализа в генетике поведения, если есть заинтересованность в изучении индивидуальных различий в продольных отношениях между различными переменными в разных точках времени. Если вместо этого есть интерес к тестированию на основе разработки вопросов, направленных на изучение индивидуальных различий в развитии одной (одинаковая) переменной через несколько точек времени, то может быть использована модель простой (изображенная на рисунке 12). В модели simplex, A1, C1, и E1 факторы, присутствующие в то время 1 частично сохраняются до времени 2 (регрессии пути от1 до A2, От2 до A3, ..., C1 до C2, ..., и т.д.), в это время новые факторы могут вводить (остатки, помеченные как "Res." на рисунке 12).
Многоварная модель разложения Холески и модель простого дискса производят точно такую же матрицу дисперсии-ковариантки, если есть две временные точки, но любые дополнительные временные точки разделяют две модели. С более чем двумя точками времени метод разложения Холески производит оценки между всеми точками времени. Это может привести к оценке отношений, которые не столь значимы для развития (например, генетические и экологические влияния с 1 класса на 7 класс). С другой стороны, модель простого сточки зрения оценивает отношения, которые имеют отношение к развитию (например, генетические и экологические факторы от 1-го по класс 2, 2-го и 3-го классов и т.д.). Последняя закономерность отражает естественную траекторию обучения детей в школе, где они передвигаются из одного класса в другой. Более подробное описание модели simplex было описано10.
Рисунок 12: Модель симплекса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительным ограничением многовариантного метода разложения Холески является то, что, хотя он позволяет количественно осмотреть генетические и экологические влияния, он не идентифицирует их. Таким образом, не может быть определено конкретно, какие гены влияют на черты, измеренные переменными, используемыми в анализе. Аналогичным образом можно только доверить, какие конкретные среды способствовали совместному воздействию окружающей среды или несовместной природы. В ходе нынешнего исследования были найдены некоторые эмпирические данные о том, какие потенциальные конкретные среды могли быть в игре. Например, класс наячной среды чтения в начальной школе было показано, что продольные эффекты на понимание чтения в средней школе (результаты исследования основаны на этом докладе)11. Однако дальнейший прогресс должен опираться на дополнительные анализы для выявления других сред.
Несмотря на эти ограничения, метод разложения Холески является популярным подходом к продольным, многовариантным, поведенческим генетическим исследованиям. Техника проста в программировании и решить. Он предлагает уникальную перспективу в разложение генетических и экологических отношений между точками времени, тем самым количественно влияния, которые являются конкретными по времени, отличая их от влияний, которые пересекаются через несколько точек времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было частично поддержано грантом Национального института здоровья детей и развития человека (P50 HD052120). Мнения, высказанные в настоящем году, являются мнениями авторов и не были ни рассмотрены, ни одобрены учреждениями,предоставляющими.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Microsoft Office Powerpoint | Microsoft | ||
| Microsoft Office Visio | Microsoft | ||
| Microsoft Office Word | Microsoft | ||
| Mplus Statistical Program | Mplus |
References
- Muter, V., Hulme, C., Snowling, M. J., Stevenson, J. Phonemes, rimes, vocabulary and grammatical skills as foundations of early reading development: Evidence from a longitudinal study. Developmental Psychology. 40 (5), 665-681 (2004).
- Schatschneider, C., Fletscher, J. M., Francis, D. J., Carlson, C. D., Foorman, B. R. Kindergarten prediction of reading skills: A longitudinal comparative analysis. Journal of Educational Psychology. 96 (2), 265-282 (2004).
- Byrne, B., et al. Longitudinal twin study of early literacy development: Preschool and kindergarten phases. Scientific Studies of Reading. 9 (3), 219-235 (2005).
- Christopher, M. E., et al. Genetic and environmental etiologies of the longitudinal relations between prereading skills and. Child Development. 86 (2), 342-361 (2015).
- Neale, M. C., Cardon, L. R. Methodology for Genetic Studies of Twins and Families. , Springer Science. Kluwer Academic Publishers B.V. Dordrecht, Netherlands. (1992).
- Byrne, B., et al. Genetic and environmental influences on early literacy. Journal of Research in Reading. 29 (1), 33-49 (2006).
- Byrne, B., et al. Genetic and environmental influences on aspects of literacy and language in early childhood: Continuity and change from preschool to grade 2. Journal of Neurolinguistics. 22 (3), 219-236 (2009).
- Erbeli, F., Hart, S. A., Taylor, J. Longitudinal associations among reading related skills and reading comprehension: A twin study. Child Development. 89 (6), e480-e493 (2018).
- Muthén, L. K., Muthén, B. O. Mplus. The comprehensive modeling program for applied researchers: User’s guide. , Muthén and Muthén. Los Angeles, CA. (2012).
- Hart, S. A., et al. Exploring how nature and nurture affect the development of reading: An analysis of the Florida Twin Project on Reading. Developmental Psychology. 49 (10), 1971-1981 (2013).
- Taylor, J., Roehrig, A. D., Hensler, B. S., Connor, C. M., Schatschneider, C. Teacher quality moderates the genetic effects on early reading. Science. 328 (5977), 512-514 (2010).
