Summary
I denna studie beskriver vi ett detaljerat förfarande av TNBS-medierad intestinal fibros, som uppvisar jämförbar patofysiologi till Crohns fibros. Vi diskuterar också denna strategi mot bakgrund av rapamycin underlättade hämmande effekter på intestinal fibros.
Abstract
Signifikanta studier har utförts för att förstå effektiv hantering av intestinal fibros. Bristen på bättre kunskap om fibros har dock hindrat utvecklingen av en förebyggande drog. I första hand, att hitta en lämplig djurmodell är utmanande i förståelsen av mekanismen för Crohns-associerad intestinal fibros patologi. Här, vi antog en effektiv metod där TNBS kemisk exponering för möss rectumsen producerar betydligt djupa sår och kronisk inflammation, och möss sedan kroniskt utveckla intestinal fibros. Vi beskriver också en teknik där en rapamycin injektion visar hämmande effekter på TNBS-medierad fibros i musmodellen. För att bedöma den bakomliggande mekanismen för fibros, diskuterar vi metodiskt ett förfarande för rening av Cx3Cr1 + celler från lamina propria av TNBS-behandlade och kontroll möss. Detta detaljerade protokoll kommer att vara till hjälp för forskare som undersöker mekanismen för fibros och bana väg för att hitta en bättre terapeutisk uppfinning för Crohns-associerad intestinal fibros.
Introduction
Dysreglering av immun homeostas i tarmen leder till patogena inflammation och har varit vida känt att orsaka inflammatorisk tarmsjukdom (IBD)1,2. Intestinal fibros är en kronisk följd av inflammatoriska tarmsjukdomar (IBDs), såsom Crohns sjukdom (CD)3. Den oåterkalleliga patofysiologin av CD inkluderar intestinal striktur eller stenos av fibros, som begränsar behandlingsalternativ, och utan mediciner för närvarande finns, den enda behandlingen är kirurgi. I slutändan, utvecklingen av effektiva terapier för att motverka olämplig inflammation är mycket som behövs för att studera mekanismen för CD, och detta kommer att leda oss ett steg närmare det.
En mängd olika genetiska musmodeller finns att studera IBD inklusive IL10 ko, SAMP/YIT och adoptiv CD45+RB High cell transfer till scid möss4,5,6. Här visar vi proceduren för TNBS-medierad fibros i musmodellen av CD, som är jämförbar med patologi av mänsklig Crohns fibros. Den TNBS-inducerad modellen har vissa fördelar. Denna modell är tekniskt enkel; sjukdomsdebut är snabb, billig, och kan i stor utsträckning användas i olika djur (t. ex., mus, råtta och marsvin7). Samtidig administrering av etanol och TNBS (2, 4, 6-Trinitrobensen sulfonsyra) abrupt skadar tarmbarriären och exponerar kolon vävnad protein till TNBS och framkalla betydande immunologiska svar8,9. Upprepad exponering av TNBS leder till en overreactive reparationsprocessen reagera på inflammation och skada, och utvecklar en fibrotisk reaktion i tarmen. Således, TNBS-inducerad fibros modell tjänar till att vara en mycket övertygande modell för att studera Crohns-associerade intestinal fibros.
Dessutom, mononukleära fagocyter är de primära celler som medla den medfödda immunsvaret till patogenes och skada i tarmen10,11,12,13. För att belysa den cellulära mekanismen och för att fastställa den roll som Cx3Cr1+ mononukleära fagocyter i TNBS fibros modell, visar vi förfarandet för rening av mononukleära fagocyter. Analys av Cx3Cr1+ celler är ett viktigt steg för att bedöma de inflammatoriska markörer och bestämma samtidig mekanism för intestinal fibros. Kollektivt, detta detaljerade förfarande för TNBS fibros kommer att vara till hjälp för att förklara cellulära mekanismer av intestinal fibros.
Protocol
För detta manuskript upphandlades alla mänskliga prover enligt det godkända protokollet av Institute Review Board (IRB) och av utskottet för humanforskning vid Albany Medical College. All forskning som involverar djur följdes strikt enligt det godkända protokollet av den institutionella djuromsorg och användning kommittén vid Albany Medical College samt National Institutes of Health Guide för vård och användning av försöksdjur .
1. insamling av mänskliga tarm preparat
- Samla in mänskliga vävnadsprover enligt institutionens forskningskommitté protokoll.
- Anskaffa tarm vävnad (ileocolonic) av en CD-Patient diagnostiserad med fibros och kontrollprover från patienter utan anamnes på IBDs.
- Använd en del av Tarmvävnaden för immunohistokologi, en annan del av vävnaden för att analysera mRNA, och en sista del för proteinuttryck av fibrotiska och cytokiner gener/markörer.
- För immunohistokologi analys, först fastställa den mänskliga vävnaden provet i 4% PARAFORMALDEHYD för minst 48 h och sedan överföra den till ett rör som innehåller 70% etanol för minst 16 h. Använd denna fasta vävnad för att göra en paraffin-inbäddade block och skär 5 μm tjock vävnad avsnitt med hjälp av en vävnads mikrotom.
- Använd en borste och fördela försiktigt varje snitt sektion på en glas bild för färgning.
- Fläcken vävnad avsnitt glida med trikrom fläck att upptäcka kollagen deposition, och med αSMA fläck att upptäcka myofibroblaster (se avsnitt 3 för detaljerad information om trikrom och αSMA färgning). Undersök de färgade sektionerna under ett ljusmikroskop.
- Bearbeta en annan del av det erhållna Human vävnadsprovet för att göra proteinlysat för att detektera αSMA via Western blot (se avsnitt 7 för detaljerad information om Western blot-analys).
- Skaffa RNA från den sista delen av Human vävnadsprovet med hjälp av en extraktionsmedel (tabell över material) och omvandla mRNA till cDNA via RT-PCR.
- Analysera fibrotiska och cytokin gener genom qPCR (se avsnitt 6 för detaljerad information om mRNA beredning).
2. induktion av TNBS fibros och rapamycin behandling hos möss
- Bedriva djur forskning i enlighet med de protokoll för djurstudier som godkänts av institutionen.
- Raka vuxna möss runt halsen området för att pre-sensibilisera till TNBS via dermal exponering. Blötlägg TNBS i en bomullstuss och sedan tillämpa TNBS till rakade området av mus halsen.
Anmärkning: pre-sensibilisering är ett mycket viktigt steg eftersom det förbättrar fördröjd överkänslighetsreaktion att initiera TNBS-medierad inflammation. - Åtta dagar efter pre-sensibilisering, inducera kolit av intrarektal administrering en gång i veckan i sex veckor. Applicera fyra mg TNBS (i 25% etanol) med en 100 μL lavemang via en 1 mL spruta ansluten till en 3,5 franska polyuretankateter och ge kontroll möss 100 μL av 25% etanol endast.
- Anesthetize möss med pentobarbital (25 mg/kg intraperitoneal) eller utsätta dem för 2,5% isofluran tillsammans med 1 L/min av syre under TNBS administrering. Bekräfta bedövningsmedel genom att försiktigt klämmande tår och letar efter en frånvaro av reflex.
- Använd veterinär salva på ögonen för att förhindra torrhet medan möss är under anestesi.
- Injicera rapamycin vid 2 mg/kg/dag eller vehikel (5% Tween-20 och 4% etanol) varje vardag under 3-6 veckor, intraperitoneal, till både kontroll och TNBS-behandlade möss.
- Använd 6-veckors TNBS post-behandlade möss tarmen för att analysera extracellulära analyser inklusive histologi, flödescytometri, Western blotting och RNA utvinning. Att skörda organ, euthanize möss med CO2 inandning och bekräfta eutanasi med cervikal dislokation.
- Att skörda organ, euthanize möss med CO2 inandning och bekräfta eutanasi med cervikal dislokation. Efter dödshjälp, longitudinellt öppna musen på sin ventrala sida med kirurgisk kvalitet sax och pinps. Ta bort hela tjocktarmen från ändtarmen till terminalen Ilium området. Snabbt överföra tjocktarmen till iskallt 1x HBSS och tvätta tjocktarmen med samma buffert.
- Mät och jämför kolon längder av kontroll och TNBS-behandlade möss. Gör detta steg så snabbt som möjligt för att undvika uttorkning av kolon för att undvika cell dödsfall.
- Skär tjocktarmen i små bitar och håll vid-80 ° c för lagring för framtida ändamål (RNA/Western blot-analys). Använd en annan bit av tjocktarmen för FACS analys.
- Var noga med att klippa och samla kolon vävnadsprover från liknande regioner i tjocktarmen för både kontroll och TNBS-behandlade djur.
Anmärkning: en 10%-20% dödlighet förväntas med TNBS inympning men med erfarenhet, dödligheten kan minskas avsevärt.
3. Immuno-histopatologisk bedömning av Gut fibros
- Fix människa och/eller möss vävnader i 4% PARAFORMALDEHYD för 48 h, och sedan överföra till 70% etanol för 16 h.
Anmärkning: PARAFORMALDEHYD är en neurotoxisk kemikalie så Undvik inandning; Använd en ansiktsmask när du använder den. - Paraffin bädda fast kolon vävnader, skiva till en 5 μm tjocklek, och direkt sätta vävnaderna på glas diabilder för histologi.
- Utför H & E och trikrom Blåfärgning enligt tillverkarens anvisningar för att upptäcka kollagen.
- Kortfattat, första deparaffinize sektioner genom att dränka den bild som innehåller sektioner i två kammare av xylen för 5 min i varje kammare.
- Skölj diabilder med 100% alkohol i 1 min; Upprepa det här steget tre gånger. Skölj igen med kranvatten i 1 min.
- Efter det, doppa diabilder i förvärmd Bouin lösning vid 56 ° c för 60 min. Bouin lösning är gul i utseende; Tvätta efter att ha tagit ut bilderna från Bouin lösning i kranvatten i 3 min eller tills bilderna blev färglös.
- Doppa diabilder i modifierad Mayer ' s hematoxylin lösning för 7 min vid rumstemperatur.
- Fläcken glider genom att doppa i trikrom fläck för 5-8 min. omedelbart, skölj diabilder i rinnande vatten för 5-10 s för att ta bort överflödig trikrom fläck.
- Dehydrera diabilder med 100% alkohol i 1 min. Upprepa proceduren tre gånger.
- Rensa diabilder med xylen i 1 min och upprepa steg 3x.
- Montera diabilder med monteringsmaterial (tabell över material).
- Håll försiktigt täckslip i ena änden med tång och låt den täcka hela sektionen utan att ha några bubblor. Om det finns några bubblor, snabbt ta bort bubblor genom att knacka på täckslip.
- Använd immunofärgning för att detektera αSMA.
- Block kolon sektioner i blockerande buffert (0,2% Triton X-100 och 5% normalt get serum i 1x PBS) för 1 h vid rumstemperatur.
- Inkubera med 100 μL utspädd primär antikropp för αSMA (tabell över material) på glid lösningen (0,2% Triton X-100 och 3% normalt get serum i 1x PBS; anti-αsma 1:200) vid 4 ° c över natten.
- Tvätta avsnitten tre gånger med 1x PBS.
- Använd Get anti-Mouse IgG (H + L) konjugerat med Alexa fluor 488 (tabell över material) som sekundär antikropp för 2 H vid rumstemperatur.
- Tvätta avsnitten tre gånger med 1x PBS.
- Använd DAPI för att motfärga kärnan i 5 minuter.
- Tvätta avsnitten tre gånger med 1x PBS.
- Montera diabilder med fluorescerande monteringsmaterial (tabell över material) och försegla med ett täckglas med nagellack.
- Hämta bilder med hjälp av lsm 880 konfokalmikroskopi Mikroskop och processbilder med hjälp av Mikroskop programvara.
- Kvantifiera bilder genom att ta ett genomsnitt av flera valda områden i samma sektion med ImageJ.
4. isolering av intestinal lamina propria och rening av Cx3Cr1+ mononukleära fagocyter
- Longitudinellt öppna tjocktarmen i iskalla Hank ' s balanserade saltlösning (HBSS; Tabell över material) och tvätta tjocktarmen med samma buffert.
- Skär ca 5 cm små bitar av kolon vävnader med hjälp av steril sax i HBSS.
- Överför små tjocktarms bitar i ett 50 mL koniskt rör innehållande 10 mL pre-digestionsbuffert (1x HBSS med 5% FBS, 5 mM EDTA och 1 mM DTT) och skaka i 20 min vid 100 rpm i 37 ° c inkubator11.
Anmärkning: inkubation av kolon vävnad i 37 ° c vid 100 rpm skakning tillstånd möjliggör effektiv kollagenase vävnad matsmältningen och hög avkastning av livskraftiga celler. - Kassera lossat kolon epitel genom att passera genom en cellsil på 40 μm.
- Samla resterande vävnad från sil och ytterligare smälta dem i rötnings buffert som innehåller kollagenas typ IV och DNase I (tabell över material) i 1x Hbss med 5% FBS för 20 min vid 37 ° c vid 100 rpm.
- Vortex den smälta vävnader för cirka 20 s och passera genom en 40 μm cell sil för att få lamina propria fraktioner.
- Centrifugera lamina propria fraktioner till pellet ner cellerna vid 700 x g i 4 ° c
- För att utesluta döda celler från lamina propria Använd en täthetlutning (bordlägga av material).
Obs: densitetsgradienten media som används här (tabell över material) kan orsaka förlust av mononukleära celler; emellertid, det tar mycket bort döda celler från preparatet, som totalt ökar renheten.- Gör 100 mL vardera av 30% och 70% densitet gradient medialösningar. Omsuspendera de erhållna cellerna i 10 mL av 30%-lösningen och överlagra ovanpå 5 mL av 70%-lösningen i en 15 mL tub.
- Centrifugera lutningen i ett broms fritt tillstånd vid 1 000 x g och rumstemperatur. Samla in den vita ringen fas som innehåller lamina propria lymfocyter, som kommer att vara mellan 30% och 70% gradient lager.
- Tvätta de erhållna cellerna genom att Återsuspendera i iskalla HBSS och centrifugera vid 500 x g, 20 ° c, under 10 min. re-Suspend celler i FACS (fluorescens-aktiverad cell sortering) buffert (PBS, pH 7,4, med 1% BSA och 2 mm EDTA).
- Rena mononukleära fagocyter från de insamlade cellerna rening med hjälp av magnetiska pärlor och/eller FACS sortering.
- Magnetisk rening
- Före färgning med antikroppar, första blocket cellyta lamina propria celler genom inkuberande med anti-Mouse CD16/CD32 FC blockerare för 15 min på is.
- Inkubera celler med anti-Cx3Cr1-PE (phycoerythrin) antikroppar tillsammans med anti-PE mikropärlor (tabell över material) för 30 min på is, att fånga de bundna cellerna. Tvätta celler med FACS buffert.
- Passera antikropp/pärla bundna celler genom en magnetisk aktiverad cell-sortering kolumn i ett magnetfält för att ta bort obundna celler. Tvätta tre gånger med FACS buffert. Ta bort kolonnen från magnetfältet och tryck kolven i kolonnen för att ge pärlbundna celler.
- FACS sortering
Obs: FACS sortering kan användas i stället för magnetisk rening. Även om magnetisk rening är en enkel och kostnadseffektiv metod, är det begränsat till endast rena enstaka celler, inte för subpopulationer av celler. Därför, för att isolera subpopulationer av celler, är FACS sorteringsmetod en effektiv metod för att sortera enstaka celler och subpopulationer av celler.- Blockera lamina propria celler med anti-Mouse CD16/CD32 FC blockerare (tabell över material).
- Fläcken celler genom inkuberande med anti-CD64, CD11c, CD11b, Cx3Cr1, Ly6C, och MHCII antikroppar.
- Sortera med en FACS Flow cytometer, gating för CD11c-CD64+ CD11b+ Cx3Cr1+ Ly6C- celler för att rena Cx3Cr1 (P3 + P4) population.
- Magnetisk rening
- Lyse sorterade celler för total RNA-beredning och detekterar cytokin-och fibrotikamarkörer (se avsnitt 6 för RNA och cDNA-beredning).
- Analysera mRNA uttryck för fibrotiska markörer och inflammatorisk cytokin analys från isolerade Single-cellsuspensioner från magnetisk rening.
- För FACS analys, blockera celler med anti-Mouse CD16/CD32 FC blockerare (tabell över material) före färgning med antikroppar mot yt-eller intracellulära markörer.
5. Flödesanalys av flödescytometrianalys
- Cellyta färgning och analys
- Omsuspendera 5-10 × 105 isolerade lamina propria-celler i 50 ml FACS-buffert (1% BSA, 2 mm EDTA i PBS, pH 7,4).
- Inkubera celler med anti-Mouse CD16/CD32 (tabell över material) vid en 1:50 utspädning för att blockera FC-receptorer på is i 10 min.
- Tvätta celler med 500 μL av Ice-Cold FACS buffert för att avlägsna obunden anti-CD16/CD32 före cellytan färgning.
- Yta fläcken kolon encellig suspensioner (106 celler/50 ml) med fluorescerande-märkt antikropp vid 1:100 utspädning på is i 30 min för att utvärdera kolon lamina propria.
- Tvätta märkta celler med 500 μL av Ice-Cold FACS buffert två gånger för att ta bort obundna antikroppar.
- Analysera märkta mononukleära celler med flödescytometri. Gate för Live, sedan för FSC+SSC+ följt av CD11b+ Cx3Cr1+, och sedan analysera andra MAKROFAGAKTIVERING MARKÖRER inklusive MHCII, CD80, CD86 och CD40.
- Intracellulär cytokin färgning och analys
- För intracellulär cytokin färgning, Fix och permeabilize ytan-färgade celler med hjälp av en fixering/permeabilization lösning Kit (tabell över material); Följ tillverkarens anvisningar för detaljerade anvisningar.
- Gate lamina propria celler för levande, sedan för FSC+SSC+ följt av CD11b+ Cx3Cr1+IL23+ för att upptäcka intracellulär nivå av IL23 cytokin och CD11b+ Cx3Cr1+IL1β+ till detektera intracellulär nivå av IL1β cytokin.
- αSMA färgning och analys
- Tvätta celler med FACS buffert två gånger genom centrifugering vid 200 x g och 4 ° c i 5 min för att ta bort överflödig fixativ buffert.
- För att bestämma αSMA nivå, permeabilize celler med en fixering/permeabilization lösning Kit (tabell över material).
- Inkubera celler med anti-αSMA-AF488 antikropp (tabell över material) med 1:1000 utspädning på is i 30 min.
- Tvätta celler två gånger och sedan göra FACS analys. Grind för Live, FSC+SSC+ följt av detektion av αsma+ celler i kolon celler.
6. RNA-isolering, RT-PCR, realtids PCR
- Isolera RNA från Mac eller FACS renade celler eller kolon vävnad genom att homogenisera dem i extraktionsmedel (tabell över material).
Obs: Använd skyddsglasögon och andra labb skyddsutrustning när du arbetar med denna reagens eftersom det är en lung-och hudirriterande. Arbeta säkert i en huva. - Tillsätt 0,5 μL av RNase-fri glykogen från 20 μg/mL glykogen stamlösning (tabell över material) för att förbättra återvinningen av totalt RNA före fällningen av RNA med isopropanol.
- Omsuspendera RNA-pelleten i 50 μL av RNase fritt vatten (tabell över material) och inkubera vid 55 ° c i 5 min för att lösa upp RNA-gommen helt.
- Läs RNA-koncentrationer med en spektrofotometer vid 260 Nm.
- Syntetisera cDNA med 1 μg totalt RNA och en syntes sats för omvänd Transkription (tabell över material).
- Analysera genuttryck med hjälp av 2 μL cDNA som mallar via realtids PCR. Använd en 96-well PCR-platta qPCR Master Mix Kit (tabell över material). Använd CT-värden för att beräkna veck förändringen av RNA-överflöd efter normalisering av GAPDH/HPRT-värdena.
7. Western blotting
- Lyse kolon vävnad med hjälp av RIPA lysis buffert (1% NP40).
- Lös proteinlysat i en 8% BIS-Tris gel med en konstant spänning på 80 V.
- Överför gel-protein till nitrocellulosa membran (s) i kall överföringbuffert som löper vid en konstant ström på 50 mA för 2 h vid 4 ° c.
- Blockera icke-specifika regioner på det proteinöverförda membranet med 5% fettfri mjölk i TBST (25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1,5 M NaCl, 0,05% Tween-20) i minst 1 h vid rumstemperatur.
- För att detektera αSMA-nivåer, inkubera membran (s) med αSMA primär detektionsantikropp vid 4 ° c över natten.
- Tvätta membran 3-4 gånger med TBST i 15 min intervaller.
- Inkubera med HRP-konjugerad sekundär antikropp (1:10000) i 5% fettfri mjölk i TBST.
- Utveckla membran med hjälp av en ECL utveckla kit.
- Normalisera proteinsignalintensiteter med GAPDH som lastnings kontroll för densitometri analys.
8. statistisk analys
- Analysera data med hjälp av dataanalysprogram vara val genom att jämföra mellan vild typ och KO djur.
- Överväg att P-värdet på < 0,05 är betydande (* P < 0,05; * * P < 0,01; * * * P < 0,001).
- Använd Students t-test för att testa skillnaderna mellan två grupper och ANOVA test för analys mellan mer än två grupper.
Representative Results
Vi antog TNBS kolit musmodell för att studera och belysa de bakomliggande mekanismerna av intestinal fibros8. Här utförde vi en detaljerad tid kurs studie av TNBS-medierad kolit, där TNBS rektalt administreras veckovis till vild typ möss i upp till sex veckor som representeras schematiskt (figur 1a). Efter sex veckors behandling med TNBS märkte vi att kolon längder förkortar progressivt under TNBS-behandlingen, från i genomsnitt 5 ± 0,5 cm i kontrollgruppen till 3 ± 0,5 cm i TNBS-gruppen. sådan kvantitativ analys av tjocktarms längd utgör en mycket uppenbar minskning av kolon längd (figur 1B). För att säkerställa att TNBS Crohns sjukdoms modell är jämförbar med den humana Crohns fibros-modellen och inte var en artefakt relaterad till metodiken, analyserade vi fibrotiska markörer på flera nivåer i en detaljerad tidsstudie för TNBS-injektionen till den vilda typen . Ackumulering av alfa-glatt muskel aktin (αsma) positiva celler och kollagen deposition inom submukosala skikt har rapporterats i de flesta av fibros incidenser och betraktas som ett kännetecken för fibrotiska händelser14. Vi fann att kolon avsnitten av TNBS-behandlade möss som färgas med αSMA visade en 4-6-faldig ökning i kolon submucosa skikt positivt färgade med αSMA (figur 1C). Dessutom visade trikrom Blåfärgning för dessa avsnitt också en 2-4-faldig ökning, vilket tyder på betydande kollagen deposition, som validerar svår intestinal fibros (figur 1D). Vi bedömde ytterligare aktiveringen av myofibroblaster genom att detektera αSMA-positiva celler genom FACS-analys i TNBS-behandlade möss kolon och fann en signifikant ackumulering av αSMA-positiv färgning (figur 1E). Dessutom fann vi betydande induktion i uttrycket av αSMA, Col-I, och Col-III mätt med qPCR analys i TNBS-behandlade möss (figur 1F). Ökat uttryck av αSMA-protein i västerländsk blot-analys avslöjade ökad fibros (figur 1G). Övergripande, TNBS kinetik behandling ger en möjlighet att få tillgång till förruttativ immunsvar i kroniska sjukdomar, som nära härmar CD kronisk fas tillstånd och är viktigt att fibros utveckling.
För att jämföra TNBS fibros med Crohns associerad fibros, analyserade vi uttrycket av fibros markörer och cytokiner i färsk vävnad biopsi från ileum av patienter med aktiv CD eller under remission. Anmärkningsvärt, fann vi märkt induktion av förtjockning av αSMA-positiva skikt och ökad kollagen avsättning som upptäcks av trikrom färgning i Active CD-sektioner (figur 2a). Vi utförde också Western blot-analys och bekräftade induktionen av αSMA-uttryck i aktiva CD-prover (figur 2B). Dessutom observerade vi signifikant induktion av fibros markörer inklusive αSMA, Kol1, som upptäcks av qPCR analys (figur 2C).
Nästa, för att fastställa en mekanism för att begränsa TNBS fibros vi utvärderade effekterna av rapamycin, en farmakologisk hämmare av mTOR aktivitet15,16. Därför behandlade vi möss med både TNBS och rapamycin och analyserade αSMA-och kollagen nivån i kolonhistologi och har visat kvantitativ mätning av αSMA och kollagen i densitometri Plot (figur 3A). Våra data tyder på att rapamycin minskar αSMA-positiv färgning i submukosala skikt och minskar kollagen deposition. För att ytterligare validera och kvantifiera fibrotiska svar, bestämde vi αSMA, kollagen och TGFβ uttryck genom qPCR, och αSMA uttryck genom flödescytometri i TNBS-behandlade tjocktarmen (figur 3B, 3c). Vi har också visat Cx3Cr1+ mononukleära fagocyter inducera en inflammatorisk immunsvar på skada9. Således, vi ville se om administrering av rapamycin i TNBS-behandlade möss kunde vända de inflammatoriska och fibrotiska effekter. Därför har vi renat Cx3Cr1+ Resident mononukleära fagocyter från kolon Single cellsuspensioner med hjälp av magnetiska mikropärlor (figur 3D). Vi hittade en ökad nivå av p-P70 och p-S6 i Cx3Cr1+ Resident mononukleära fagocyter av Western blot analys från TNBS-behandlade möss, och denna nivå blockerades av rapamycin (figur 3E). Dessutom fann vi att rapamycin behandling dämpar IL-23 och IL-1 β i den TNBS-behandlade gruppen (figur 3F). Dessutom belyser dessa fynd den effektiva mekanismen som är involverad i induktion av TNBS-fibros och har visat att rapamycin dämpar induktionen av fibros.
Figur 1: lyckad TNBS-administrering leder till utveckling av intestinal fibros hos möss. A. Schematiskt diagram representation av veckovis TNBS-behandling som ges till vildtyp-möss. B. kolon bilder och mätning av kolon längder från TNBS-behandlade möss, skördas på veckor 0, 2, 4, och 6 post-tnsb behandling. C-D. Kolon avsnitten ' histologisk analys färgas med anti-αSMA antikropp för aktivering av myofibroblaster och trikrom Blåfärgning för kollagen; skalbar 100 μm. E. FACS-analys för att identifiera αSMA-positiva celler i tjocktarmen och kvantifiering av αSMA-positiva celler. F. fibrotiska markörer och cytokiner som upptäckts av qPCR. G. Western blot-analys av αsma från kolon lysat av TNBS-behandlade och kontroll möss. Denna modifierade siffra återanvänds med tillstånd av tidigare publikation9 i mucosal immunologi, 2019 av Mathur et al. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: TNBS fibros är jämförbart med Crohns-associerad intestinal fibros. A. representativa bilder av kolon biopsier av kontroll, aktiv CD visar en signifikant ökning av trikrom Blåfärgning och αsma-positiv färgning i submukosala lager, skala bar 50 μm. B. Western blot-analys av αSMA-uttryck och kvantifiering. C. qPCR-analys av fibrotiska markörer och cytokiner. Denna modifierade siffra återanvänds med tillstånd av tidigare publikation9 i mucosal immunologi, 2019 av Mathur et al. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: behandling med rapamycin Ameliorates effektivt TNBS-inducerad fibros. A. kolon histologisk analys-representativa bilder av myofibroblast färgning med anti-αsma antikropp och kollagen färgning med trikrom blå, scale bar 100 μm. B. qPCR analys av αsma, kollagen och tgfβ uttryck i kontroll/ TNBS-behandlade mus kolon. C. FACS analys av αsma i Single cellsuspension från Mouse Colon behandlas med kontroll/TNBS. D. Schematisk för rening av Cx3Cr1+ celler från kolon lamina propria fraktion och FACS analys av renade celler. E. Western blot analys av p-P70 och p-S6 nivåer i renas Cx3Cr1 + mononukleära fagocyter från möss som behandlats med TNBS och/eller rapamycin. F. qPCR analys av uttrycket i renade Cx3Cr1 + mononukleära fagocyter, som producerar Il-23 och Il-1 β. Denna modifierade siffra återanvänds med tillstånd av tidigare publikation9 i mucosal immunologi, 2019 av Mathur et al. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Sårläkning eller vävnads reparation är en tätt reglerad biologisk process17. Under vävnadsskada med en kemisk, mekanisk och infektion tillstånd, en inflammatorisk reaktion utlöser vävnads reparationsprocessen. Emellertid, en dysreglerad och patologiska inflammatoriska svar leder till att utveckla ärrbildning eller en fibrotisk reaktion, som kan försämra vävnads reparationsfunktionen9,18,19. Här visar vi proceduren för TNBS-inducerad fibros djurmodell, som signifikant delar patofysiologi med mänsklig Crohns sjukdom. Successiva inympning av TNBS kemisk exponering för skador på mus epitel orsakar djupa sår och inducerar fibros utveckling. Med en pålitlig, låg kostnad, och snabb induktion av sjukdomsdebut, denna metod är allmänt accepterat av flera forskargrupper inblandade i studier för vävnadsskada, transmural inflammation och Gut-hjärn-axeln.
För att framgångsrikt implementera TNBS fibros-modellen finns det flera viktiga steg. Till exempel, adekvat dosering och timing av TNBS administration är mycket viktiga. En 6-8-veckors TNBS inympning tillåter djup vävnad sår och rekommenderas starkt för kroniska fibrotiska studier. Utkommande avföring från möss och retrograd reflex av inokulerade TNBS är två stora problem, vilket kan resultera i leverans av variabla doser till möss. Milt tryck nära möss ändtarmen kan hjälpa frisättning avföring innan TNBS administration. Håller huvudet av djuret ner i några sekunder dramatiskt hjälper till att stoppa omvänd reflux av TNBS. Att hålla möss i en bur, placera buren på en värme pad, och ge möss med Napa nektar kan också vara användbara strategier för att förhindra hög dödlighet.
Här, vi diskuterar också tarmen inflammation under TNBS fibros och deras inverkan på fibrotiska svar. mTOR/autofagi roll är i stort sett inblandad i intestinal homeostas och i IBD patogenes20,21. Vi identifierade att mTOR/autofagi signalering är avgörande för att modulera pro-inflammatoriska reaktioner från IL-23 och IL1β cytokiner från Cx3Cr1+ mononukleära fagocyter som påverkar Pro-FIBROTISK Il-23/Il-22-axeln (figur 3A)9 . Därmed är renande Single Cx3Cr1+ mononukleära celler för immunoprofilering och genuttryck ett kritiskt steg i modellen. Vi diskuterar i detalj protokollet för att isolera lamina propria och ge Reningsproceduren för Cx3Cr1+ mononukleära celler med hjälp av magnetiska pärlor.
Kollektivt, trots närvaron av genetiska och spontana modeller för Crohns sjukdom, TNBS-kolit är fortfarande ett potent verktyg för att studera Immuno-patogenesen av CD och har potential att utvärdera Crohns fibros behandlingar. Den största begränsningen av användning av kemiskt inducerad fibros modeller såsom TNBS är risken för hög variation från användare till användare och möjligheten att extremvärden i data. En urvalsstorlek på 5-8 djur per grupp tillsammans med större användarupplevelse kan öka konsekvensen i modellen. Emellertid, att hitta en lämplig genetisk modell som orsakar spontan Crohns fibros är och kommer alltid att vara motiverad.
Disclosures
Konkurrerande intressen: författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH Grant R01NS093045 (Y.H.), NIH Grant K08DK088950 (X.Z.), R03DK099566 (X.Z.), och Crohns & kolit Foundation of America Research Fellowship (CCFA) 481637 (R.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse aSMA, AF488 conjugated, Clone#1A4 | e-bioscience | 53-9760-82 | |
| Anti-mouse aSMA, purified Clone#M1/77 | e-bioscience | 149760-80 | |
| Anti-mouse CD11b, APCCy7 conjugated, Clone#M1/70 | Biolegend Inc | 101226 | |
| Anti-mouse CX3cr1 PE conjugated, Clone#SA011F11 | Biolegend | 149006 | |
| Anti-mouse purified CD16/32 Fc block | Biolegend Inc | 14-9760-80 | |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi | 130-105-639 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | e-bioscience | 7074 | |
| Bovine Serum Albumin | InvivoGen | tlrl-isdn | |
| Collagenase type IV | Roche | 1088866001 | |
| DAPI | SIGMA | D9542 | |
| DMEM | Corning | 10013-CV | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | D263-5vl | |
| Falcon® 40µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug kit | BD Bioscience | 555028 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | www.flowjo.com | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | e-bioscience | 5018 | |
| Graphpad Prism 7 | GraphPad Software Inc | www.graphpad.com | |
| H&E kit | American Mastertech Kit | HXMMHPT | |
| Image J | NIH | www.imagej.nih.gov/ij/ | |
| Mouse: C57BL/6J | Jackson Laboratories | 664 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Percol | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| PMA/Ionomycin salt | Sigma | P8139 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermofisher | A25777 | |
| Rabbit Anti mouse GAPDH, Clone# D16H11 | Cell signaling | 5174 | |
| Rabbit Anti mouse p70 S6 Kinase, Clone#49D7 | Cell signaling | 2708 | |
| Rabbit Anti mouse Phospho-p70 S6 Kinase, Clone#S371 | Cell signaling | 9208 | |
| Rabbit Anti mouse Phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236), Clone# D57.2.2E | Cell signaling | 4858 | |
| Rabbit Anti mouse S6 Ribosomal Protein | Cell signaling | 2217 | |
| Rapamycin | LC LABORATORIES | 1003799 | |
| TNBS | Sigma | 92823 | |
| Trichorme staining kit | American Mastertech Kit | STOSTBPT | |
| TRIzol | Life technologies | 15596018 | |
| Verso cDNA Synthesis Kit | Thermofisher | AB1453B | |
| Zen black 2.1 | Carl Zeiss | www.zeis.com | |
| Zen blue lite 2.3 | Carl Zeiss | www.zeis.com |
References
- Garrett, W. S., Gordon, J. I., Glimcher, L. H.
- Park, S. G., et al. T regulatory cells maintain intestinal homeostasis by suppressing gammadelta T cells. Immunity. 33, 791-803 (2010).
- Speca, S., Giusti, I., Rieder, F., Latella, G. Cellular and molecular mechanisms of intestinal fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18, 3635-3661 (2012).
- Keubler, L. M., Buettner, M., Hager, C., Bleich, A. A Multihit Model: Colitis Lessons from the Interleukin-10-deficient Mouse. Inflammatory Bowel Disease. 21, 1967-1975 (2015).
- Strober, W., Nakamura, K., Kitani, A. The SAMP1/Yit mouse: another step closer to modeling human inflammatory bowel disease. Journal of Clinical Investigation. 107, 667-670 (2001).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. American Journal of Physiology-Gastroenterology and Liver Physiology. 296, G135-G146 (2009).
- Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery. 11, 9-15 (2016).
- Loeuillard, E., et al. 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid-induced chronic colitis with fibrosis and modulation of TGF-beta1 signaling. World Journal of Gastroenterology. 20, 18207-18215 (2014).
- Mathur, R., et al. Induction of autophagy in Cx3cr1(+) mononuclear cells limits IL-23/IL-22 axis-mediated intestinal fibrosis. Mucosal Immunology. 12, 612-623 (2019).
- Joeris, T., Muller-Luda, K., Agace, W. W., Mowat, A. M. Diversity and functions of intestinal mononuclear phagocytes. Mucosal Immunology. 10, 845-864 (2017).
- Mathur, R., et al. A mouse model of Salmonella typhi infection. Cell. 151, 590-602 (2012).
- Zhao, X., et al. Noninflammatory Changes of Microglia Are Sufficient to Cause Epilepsy. Cell Reports. 22, 2080-2093 (2018).
- Murugaiyan, G., et al. MicroRNA-21 promotes Th17 differentiation and mediates experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Clinical Investigation. 125, 1069-1080 (2015).
- Hinz, B., Celetta, G., Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Chaponnier, C. Alpha-smooth muscle actin expression upregulates fibroblast contractile activity. Molecular Biology of the Cell. 12, 2730-2741 (2001).
- Yang, J., et al. Rapamycin Inhibition of mTOR Reduces Levels of the Na+/H+ Exchanger 3 in Intestines of Mice and Humans, Leading to Diarrhea. Gastroenterology. 149, 151-162 (2015).
- Mutalib, M., et al. The use of sirolimus (rapamycin) in the management of refractory inflammatory bowel disease in children. Journal of Crohns and Colitis. 8, 1730-1734 (2014).
- Shaw, T. J., Martin, P. Wound repair at a glance. Journal of Cell Science. 122, 3209-3213 (2009).
- Paul, J., et al. IL-17-driven intestinal fibrosis is inhibited by Itch-mediated ubiquitination of HIC-5. Mucosal Immunology. 11, 427-436 (2018).
- Sohail, I., Ghosh, S., Mukundan, S., Zelewski, S., Khan, M. N. Role of Inflammatory Risk Factors in the Pathogenesis of Streptococcus pneumoniae. Frontiers of Immunology. 9, 2275 (2018).
- Laplante, M., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth control and disease. Cell. 149, 274-293 (2012).
- Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448, 427-434 (2007).
