Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Knoglemarvstransplantation platform til at undersøge den rolle, dendritiske celler i Graft-versus-Host Sygdom

Published: March 17, 2020 doi: 10.3791/60083
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 4,5
1Cancer Division, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida, 2Department of Biochemistry, Hanoi University of Pharmacy, 3Center for Cardiovascular Regeneration, Department of Cardiovascular Sciences, Houston Methodist Research Institute, 4Department of Epidemiology, University of Pittsburgh Graduate School of Public Health, 5Division of Cancer Control and Population Sciences, University of Pittsburgh Medical Center, Hillman Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

Graft-versus-host sygdom er en stor komplikation efter allogen knoglemarvstransplantation. Dendritiske celler spiller en afgørende rolle i patogenesen af graft-versus-host sygdom. Den nuværende artikel beskriver en ny knoglemarvstransplantation platform til at undersøge den rolle, dendritiske celler i udviklingen af graft-versus-host sygdom og graft-versus-leukæmi effekt.

Abstract

Allogen knoglemarvstransplantation (BMT) er en effektiv behandling for hæmatologiske maligniteter på grund af graft-versus-leukæmi (GVL) effekt til at udrydde tumorer. Men, dens anvendelse er begrænset af udviklingen af graft-versus-host sygdom (GVHD), en større komplikation af BMT. GVHD fremkaldes, når T-celler i donortransplantaterne genkenderalloantigen udtrykt af recipientceller og monterer uønskede immunologiske angreb mod raske væv fra recipienten. Således traditionelle behandlingsformer er designet til at undertrykke donor T-celle alloreaktivitet. Disse tilgange forringer imidlertid i væsentlig grad GVL-effekten, således at modtagerens overlevelse ikke forbedres. Det er derfor vigtigt at forstå virkningerne af terapeutiske tilgange på BMT, GVL og GVHD. På grund af den antigen-præsenterende og cytokin-udskillende kapacitet til at stimulere donor T-celler, modtager dendritiske celler (DC' er) spiller en væsentlig rolle i induktion af GVHD. Derfor bliver målretning af modtager-DC'er en potentiel tilgang til styring af GVHD. Dette arbejde giver en beskrivelse af en ny BMT-platform til at undersøge, hvordan vært DC'er regulere GVH og GVL svar efter transplantation. Også præsenteret er en effektiv BMT model til at studere biologi GVHD og GVL efter transplantation.

Introduction

Allogen hæmatopoietisk stamcelletransplantation (BMT) er en effektiv behandling til behandling af hæmatologiske maligniteter1,2 gennem graft-versus-leukæmi (GVL) effekt3. Men, donor lymfocytter altid montere uønskede immunologiske angreb mod recipientvæv, en proces kaldet graft-versus-host sygdom (GVHD)4.

Murinemodeller af GVHD er et effektivt værktøj til at studere gvhd-populationen og GVL-responsen5. Mus er en omkostningseffektiv forskning dyr model. De er små og effektivt dosering med molekyler og biologi i de tidlige faser af udviklingen6. Mus er ideelle forskningsdyr til genetisk manipulation undersøgelser, fordi de er genetisk veldefinerede, som er ideel til at studere biologiske veje og mekanismer6. Flere mus større histocompatibility kompleks (MHC) MHC-uoverensstemmende modeller af GVHD er blevet veletableret, såsom C57BL/6 (H2b) til BALB / c (H2d) og FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b)5,7. Disse er særligt værdifulde modeller til at bestemme den rolle, som de enkelte celletyper, gener, og faktorer, der påvirker GVHD. Transplantation fra C57/BL/6 (H2b) forældredonorer til recipienter med mutationer i MHC I (B6.C-H2bm1) og/eller MHC II (B6.C-H2bm12) viste, at et misforhold i både MHC-klasse I og klasse II er et vigtigt krav for udviklingen af akut GVHD. Dette tyder på , at både CD4+ og CD8+ T-celler er nødvendige for sygdomsudvikling7,8. GVHD er også involveret i en inflammatorisk kaskade kendt som 'pro-inflammatorisk cytokin storm'9. Den mest almindelige konditioneringmetode i murinemodeller er total kropsbestråling (TBI) ved røntgen eller 137Cs. Dette fører til modtagerens knoglemarvsablation, hvilket giver donor stamcelleindpodning og forhindrer afvisning af transplantatet. Dette gøres ved at begrænse spredningen af recipient-T-celler som reaktion på donorceller. Derudover, genetiske forskelle spiller en vigtig rolle i sygdominduktion, som også afhænger af mindre MHC-mismatch10. Derfor varierer myeloablativ bestrålingsdosis i forskellige musestammer (f.eks. BALB/c→C57BL/6).

Aktivering af donor-T-celler ved værtsantigen, der præsenterer celler (APC'er), er afgørende for udviklingen af GVHD. Blandt De APC'er, dendritiske celler (DC' er) er de mest potente. De er arveligt i stand til at fremkalde GVHD på grund af deres overlegne antigen optagelse, udtryk for T-celle co-stimulerende molekyler, og produktion af pro-inflammatoriske cytokiner, der polariserer T-celler i patogene delmængder. DCs-modtagere er afgørende for at lette T-cellepriming og GVHD-induktion efter transplantation11,12. Dc er derfor blevet interessante mål i behandlingen af GVHD12.

TBI er nødvendig for at forbedre donorcelleindpodningen. På grund af TBI-effekten aktiveres recipient-DC'erne, og de overlever i kort tid efter transplantationen12. På trods af store fremskridt i brugen af bioluminescens eller fluorescens, oprettelse af en effektiv model til at studere den rolle, som modtageren DC'er i GVHD er stadig udfordrende.

Fordi donor T-celler er den drivende kraft for GVL aktivitet, behandlingsstrategier ved hjælp af immunsuppressive lægemidler såsom steroider til at undertrykke T-celle alloreaktivitet ofte forårsage tumor tilbagefald eller infektion13. Derfor kan målretning af recipient-DC'er give en alternativ tilgang til behandling af GVHD, samtidig med at GVL-effekten bevares, og infektionundgås.

Kort sagt, den nuværende undersøgelse giver en platform til at forstå, hvordan forskellige typer af signalering i modtageren DC'er regulerer GVHD udvikling og GVL effekt efter BMT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De eksperimentelle procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of University of Central Florida.

1. GVHD Induktion

BEMÆRK: Allogen knoglemarvscelletransplantation (Trin 1.2) udføres inden for 24 timer efter bestråling. Alle procedurer, der er beskrevet nedenfor, udføres i et sterilt miljø. Udfør proceduren i en vævskultur hætte og bruge filtreret reagenser.

  1. Dag 0: Forbered modtagermusene.
    1. Brug mus af vild hunn (WT) på balb/c-baggrund (CD45.2+ H2kd+), 10−12 uger gamle som modtagere.
    2. øremærke og veje modtagerne før TBI. Derefter placereop til 11 mus i bestråling kammer og holde det i irradiator. Bestråles ved en enkelt dosis på 700 cGy i 10−15 min.
    3. Vend bestrålede dyr tilbage til burene, og anbringes i patogenfrie faciliteter før transplantationen.
      BEMÆRK: Modtagernes minimale kropsvægt skal være ca. 20 g. Brug denne vægt som reference til at beregne legemstabet i forsøgsperioden.
  2. Dag 1: Klargør T-celleforarmet knoglemarv (TCD-BM) fra donormusene.
    1. Euthanize CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 mus ved CO2 kvælning og vent i 2−3 min. Udfør cervikal dislokation som en sekundær dødshjælp, hvis det er nødvendigt.
    2. Sæt hver mus på et rent arbejdskort. Desinficere pels og hud med 70% isopropanol.
    3. Saml skinnebenet og lårbenet fra begge ben ved hjælp af pincet og saks. Læg dem i iskold RPMI indeholdende 1% FCS og 100 U/ml penicillin/streptomycin og 2 mM L-glutamin (1% RPMI) i 50 ml koniske rør. Rengør lårbenet og skinnebenet knogler grundigt ved at fjerne alle de muskelvæv ved hjælp af pincet og saks. Lårbenet og skinnebenet overføres fra de koniske 50 ml rør til en petriskål med en diameter på 92 mm med 1% RPMI.
    4. Brug saks, skære enderne af lårbenet eller skinnebenet. Fyld et 50 ml rør med 25 ml 1% RPMI 1640 medium. Brug dette til at fylde en 3 ml sprøjte fastgjort til en 26 G nål med 3 ml 1% RPMI. Sæt sprøjten ind i knoglen, og skub stemplet for at skylle knoglemarven (BM) ud af hulrummet i opsamlingsrøret med 1% RPMI (~3 ml/knogle).
    5. Første trin 1.2.4 gentages for alle de resterende skinnebens- og lårbensknogler fra andre donormus. Hold alle opsamlingsrørene på is.
    6. Lav enkeltcellesuspensionen ved at skylle knoglemarvsstykkerne gennem en 75 μm meshcellesi. Opsaml enkeltcellesuspensionen i et 50 ml rør.
    7. Rør centrifugeres ved 800 x g i 5 min ved 4 °C. Aspirere og kassér supernatanten. Resuspender pellet i PBS buffer indeholdende 0,5% kvæg serum albumin (BSA) ved 20 x 106 celler / ml. Gem en prøve på 2 x 106 celler til renhed farvning.
    8. Der tilsættes Dit 1 antistof ved 0,05 μg/106 celler14 og inkuberes i 30 min ved 4 °C. Vask én gang med 25 ml iskold PBS. Resuspender ved 20 x 106/ml i 0,5% BSA/10% ung kanin komplement/2% DNase (10.000 U/ml i sterilH2O). Inkuber i 45 minutter ved 37 °C og vaskes 2x som før.
      BEMÆRK: T-celler nedbrydes med en mAb specifik for Thy1, et protein udtrykt af alle T-celler, men ikke andre leukocytter.
    9. Resuspender cellerne i 20 ml PBS buffer indeholdende 0,5% BSA. Tæl knoglemarvscellerne i 1% eddikesyre ved hjælp af et hæmocytometer. Hold en prøve på 2 x 106 celler for en renhed kontrol ved flow cytometri efter cellerensning.
      BEMÆRK: En donormus genererer normalt ca. 25 x 106 TCD-BM.
    10. Brug flowcytometri til at bekræfte en vellykket T-celleudtynding. Pletten 1 x 106 celler, bevaret fra trin 1.2.7 (før T-celleudtynding) og 1.2.9 (TCD-BM efter T-celleudtømning) med følgende antistoffer: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) og α-CD8α (53-6.7).
  3. Dag 1: Klargør T-celler fra donormusene
    1. Brug CD45.2+ H2kb+ C57BL/6 wild type (WT) mus som donorer til T-celler.
    2. Euthaniser C57BL/6-mus med kuldioxid (CO2)kvælning som beskrevet i punkt 1.2.1.
    3. Rengør pels og hud af musen grundigt med 70% ethanol. Punktafgifter milt og lymfeknuder og adskille dem i en enkelt celle suspension af miltitter ved hjælp af en sprøjte stempel og 40 μm mesh sier. Vask si- og sprøjtestemplet med 1% RPMI (1% FBS indeholdende RPMI-medier) for at indsamle alle miltytter.
    4. Cellesuspensionen centrifugeres ved 800 x g i 5 min ved 4 °C. Der tilsættes 5 ml ACK-lysningsbuffer (1 mM Na2EDTA, 10 mM KHCO3,144 mM NH4Cl, pH 7.2) efter kassering af supernatanten. Inkuber cellesuspensionen i 5 minutter ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: ACK lysis buffer bruges til lysing røde blodlegemer.
    5. Tilføj 5 ml 1% RPMI for at stoppe lysis. Der centrifugeres ved 800 x g i 5 min ved 4 °C. Kassér supernatanten.
    6. Klargør iskold, magnetisk aktiveret cellesorteringsbuffer (0,5% BSA, 2 mM EDTA i PBS, pH 7.2). Afgaser bufferen før brug. Resuspender cellepillerne i 5 ml MACS-buffer.
    7. Tæl miltitterne og tjek for de levende og døde celler ved hjælp af et hæmocytometer og 1% trypan blå. Gem en prøve på 2 x 106 celler for at evaluere rensningsudbyttet med flowcytometrianalyse.
    8. Resuspender miltitterne ved koncentrationen af 200 x 106/ml i MACS-bufferen. Der tilsættes 0,03 μL biotinantimouse-Ter-119, 0,03 μL biotin antimuse-CD11b, 0,03 μL biotin anti-mus-CD45R og 0,03 μL biotinanti-mouse-DX5 pr. 106 celler. Inkuber i 15 minutter ved 4 °C.
      BEMÆRK: Biotin anti-mouse-Ter-119, biotin anti-mouse-CD11b, biotin anti-mouse-CD45R og biotin anti-mouse-DX5 blev brugt til at reagere med henholdsvis erythroid, granulocytter, B-celler og NK-celler. Derfor er disse celleundersæt forarmet i følgende trin15.
    9. Der tilsættes 10 ml iskold MACS-buffer til cellesuspensionen. Der centrifugeres ved 800 x g i 5 min ved 4 °C. Kassér supernatanten.
    10. Resuspender cellepillerne i MACS-bufferen med en koncentration på 100 x 106/ml. Der tilsættes antibiotinmikroperler (0,22 μL/106 celler) til miltensuspensionen. Der blandes godt og inkuberes i yderligere 15 minutter ved 4 °C. Cellen affjedres én gang med 10 ml iskold MACS-buffer. Der centrifugeres ved 800 x g i 5 min ved 4 °C, og supernatanten afskafs.
    11. Sæt en magnetisk skillesøjle i magnetfeltet. Skyl kolonnen med 3 ml MACS-buffer. Smid cellesuspensionen på kolonnen. Opsaml gennemstrømningen bestående af ubundne, berigede T-celler i et nyt konisk 15 ml rør. Vask MS-kolonnen med 3 ml iskold MACS-buffer.
      BEMÆRK: Sørg for, at kolonnen er tom, før vasketrinnene udføres.
    12. Cellesuspensionen centrifugeres ved 800 x g i 5 min ved 4 °C. Resuspender cellepelletien i 5 ml MACS-buffer.
    13. Tæl cellerne i 1% trypan blå ved hjælp af et hæmocytometer. Gem en prøve på 2 x 106 celler for en renhed kontrol ved flow cytometri.
      BEMÆRK: Det gennemsnitlige udbytte af milt-T-celler, der isoleres ved denne metode, er ~20−25 x 106 celler pr. mus.
    14. Bekræft udbyttet af T-celleberigelse ved flowcytometri. Pletten 1 x 106 celler, bevaret fra trin 1.3.7 (før T-celleudtynding) og 1.3.13 (TCD-BM efter T-celleudtømning) med følgende antistoffer: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) og α-CD8α (53-6.7).
  4. Dag 1: Injicer bestrålede mus med donor-T-celler og TCD-BM.
    1. TCD-BM og T-cellerne 2x vaskes med PBS (800 x g i 5 min. ved 4 °C). Resuspender cellerne i iskold PBS til injektion. Cellekoncentrationen justeres til 20 x 106/ml for TCD BM og 4 x 106/ml for T-celler.
    2. Varm dyret ved hjælp af en varmelampe for at øge synligheden af de bilaterale halevener. Hvis det er nødvendigt, skal du placere musen i et hold.
    3. Rengør overfladen af halen ved hjælp af 70% isopropanol. Injicer TCD-BM (5 x 106 celler/mus) med eller uden T-celler (0,75 x 106 celler/mus). Pas på ikke at indføre luft i sprøjten.
    4. Fjern nålen og påfør en antiseptisk podning direkte på injektionsstedet 5−10 s for at stoppe enhver blødning.
  5. Vurder GVHD på dag 2−80.
    1. Hold styr på dyrets overlevelse. Overvåg de kliniske tegn på GVHD tilpasset fra det scoringssystem, der tidligere blev etableret af Cook et al.16, og modtagermusenes kropsvægt 2x om ugen. Brug kropsvægten, der er bestemt før TBI, til at beregne vægttabet.
    2. Vej hver mus individuelt. Score vægttabsom følger: klasse 0 = mindre end 10%; klasse 1 = 10%−20%; klasse 2 = mere end 20%.
    3. Score kropsholdning tegn på modtagerne: grade 0 = ingen fornemmelse; klasse 0,5 = let fornemmelse, men retter, når du går; klasse 1 = dyret forbliver hunched, når du går; klasse 1.5 = dyret ikke retter ud klasse 2.0 = dyrestativ på bagende.
    4. Score mobilitetstegnet for modtagerne: lønklasse 0 = meget aktiv; klasse 0,5 = langsommere end naive mus; klasse 1,0 = bevæger sig kun, når stukket; klasse 1,5 = bevæger sig lidt, når stukket; klasse 2.0 = bevæger sig ikke, når den stikkes.
    5. Score huden på modtagerne: klasse 0 = ingen hudafskrabninger, læsioner eller skalering; klasse 0,5 = rødme i et bestemt område klasse 1 = slid i et område eller mild slid i to områder; klasse 1.5 = alvorlige hudafskrabninger i to eller flere områder grad 2,0 = alvorlige hudafskrabninger, revnende hud, tørret blod.
    6. Score pelsen af modtagerne: klasse 0 = ingen unormale tegn; klasse 0,5 = ridging på siden af maven eller nakken, grad 1,0 = ridging på tværs af eller siden af mave og hals; klasse 1.5 = usoigneret og pjusket pels; klasse 2,0 = dårligt filtret pels på mave og ryg.
    7. Score diarré af modtagerne: grade 0 = ingen diarré; klasse 0,5 = let og blød afføring; klasse 1.0 = mild (gul afføring); grad 1,5 = moderat (gul afføring med lidt blod); klasse 2 = svær (lys gul og blodig afføring, "tørret kage afføring" vises på anal området).

2. Cotransplantation Model

  1. Generer knoglemarvsafledte dendritiske celler (BM-Dc'er).
    1. Lårben isoleres fra lårben og skinneben af WT eller faktor B (fB)-/- mus på B6-baggrunden som beskrevet i trin 1.2.3−1.2.4. Drej cellerne ved 800 x g i 5 min.
    2. Resuspender pellet i 5 ml ACK lysing buffer for røde blodlegemer lysis. Inkuber cellesuspensionen i 5 minutter på is. Der tilsættes 10 ml 1% RPMI til cellesuspensionen for at stoppe lysisen og centrifugere ved 800 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten.
    3. Resuspender cellepillerne i 10 ml kulturmedier (RPMI 1460 indeholdende 10% FBS, 100 U/ml penicillin/streptomycin, 2 mM l-glutamin og 50 mM β-mercaptoethanol) og justervolumenet for at opfylde den endelige koncentration på 2 x 10 celler6/ml.
    4. Der tilsættes 20 ng/ml granulocyt-makrofagkoloni-stimulerende faktor (GM-CSF) til cellesuspensionen. Kultur knoglemarvscellerne i 100 x 15 mm Petriskåle ved 37 °C i 5% CO2 i 6 dage.
    5. Udskift halvdelen af de igangværende kulturmedier (ca. 5 ml) med friske medier, der indeholder 40 NG/mL GM-CSF på dag 3.
    6. Forvarm kulturmediet i et vandbad ved 37 °C. Saml omkring 5 ml af mediet fra knoglemarvskulturretterne. Der centrifugeres ved 800 x g i 5 min ved 4 °C. Kassér supernatanten. Resuspender cellepelletien i 5 ml dyrkningsmedier indeholdende 40 ng/ml GM-CSF.
    7. Der tilsættes 25 μg/ml lipopolysaccharid (LPS) til mediet på dag 6 i kulturen for at modne6 BM-DC'erne.
    8. Saml modne BM-DCs: Brug celleløftere til blødt skrabe dcs fra petriskåle. Saml alle cellesuspensionerne i 50 ml koniske rør. Der centrifugeres ved 800 x gi 5 min. ved 4 °C. Kassér supernatanten. Cellen stilres 3x med 50 ml iskold PBS. Spar ca. 2 x 106 BM-DCs til immunologisk fænotypeanalyse efter flowcytometri.
  2. Udfør dendritisk celle co-transplantation af BMT (DC-cotransplantering BMT).
    BEMÆRK: Brug FVB (H2kq)mus som donorer for T-celler og BM-celler. Bestråle B6 Ly5.1 recipientmus med en dosis på 1.100 cGy (2 doser, 3 h interval). Se detaljerne i trin 1.1.
    1. BM isoleres fra lårben og skinneben i FVB-donormusene. Se detaljer i trin 1.2.3−1.2.10.
      BEMÆRK: Brug total isoleret knoglemarv i stedet for TCD-BM i denne model.
    2. Rense T-celler fra milt og lymfeknuder af FVB donor mus. Se detaljer i trin 1.3.1-1.3.13.
    3. Injicer BM (5 x 106/mus), T-celler (0,5 x 106/mus) med BM-DCs (2 x 106/mus) på dag 0 i forsøgsforløbet.
    4. På dag 3 efter transplantationen, undersøge donor DC rekonstitution ved flow cytometri.
      1. Indsamle blod fra øjnene af modtagerne.
      2. Bedøve CD45.1/Ly5.1 B6 mus med 3% isofluran indånding. Kontroller for dybden af anæstesi ved manglende reaktion på en tå knivspids.
      3. Placer et sterilt glaspipetterør i øjets mediale kanthus, der er anvist caudally i en vinkel på 30-45° fra næseplanet. Tryk under forsigtigt at dreje røret.
      4. Smid blodet i et 10 μL heparinholdigt sterilt 1,5 ml mikrocentrifugerør. 50 μL blod overføres til 5 ml glasflowrør.
      5. Tilføj 2 ml ACK-lysningsbuffer. Inkuber ved 37 °C i vandbad i 45 min. Tilsæt 2 ml FACS-farvningsbuffer. Der centrifugeres ved 800 x g i 5 min ved 4 °C. Kassér supernatanten.
      6. Resuspender cellepillerne med 200 μL FACS-buffer, der indeholder passende flowfarvningsantistoffer (levende/dødgul, α-H-2Kb, α-CD45.1, α-CD45.2, α-CD11c og α-MHCII). Inkuber i 15 minutter ved 4 °C i mørke. 2x med 1 ml FACS-buffer. Resuspender cellepillerne i 200 μL FACS-buffer og udfør analysen ved flowcytometri.

3. GVHD/GVL Modeller af BMT

  1. Udfør GVHD/GVL induktion.
    1. Kultur luciferase transduceret A20 B celle lymfom i RPMI kultur medier.
    2. Bestråle BALB/c baggrund WT eller Ly5.1 modtager ved 700 cGy (enkelt dosis). Se detaljerne i trin 1.1.
    3. Isoler TCD-BM fra lårbenet og tibias af B6. Ly5.1 donormus. Se detaljer i trin 1.2.1−1.2.10.
    4. T-celler renses fra milt og lymfeknuder i C57BL/6 donormusene. Se detaljer i trin 1.3.1−1.3.15.
    5. A20 lymfom 2x vaskes med 25 ml PBS. Resuspender cellepillerne i 10 ml iskold PBS. Tag en cellesuspensionsprøve (10 μL) og tæl cellerne ved hjælp af 1% trypanblå og et hæmocytometer. Cellekoncentrationen justeres til 20.000 celler/ml.
    6. Injicer TCD-BM (5 x 106/mus) med eller uden T-celler (0,75 x 106/mus) og A20 lymfom (5.000 celler/mus).
    7. Følg op på modtagerens overlevelse, kliniske GVHD-tegn og vægttab under forsøgsforløbet. Se detaljerne i trin 1.5.
  2. Udfør bioluminescerende billeddannelse.
    1. Overvåg tumorvæksten i den transplanterede modtager ved at injicere recipientmusene med 4 mg D-luciferin. Inkuber i 5 minutter for at sikre, at luciferin reagerer med luciferase.
    2. Bedøve musen ved hjælp af 3% isofluran i kammeret af en bioluminescens imager og billede modtagerne i 5 min i felt D og eksponeringstiden på 1 min.
    3. Analysér data ved hjælp af billedanalysesoftware. Rediger skalaen af pseudo farvebillederne for at opnå de bedste resultater.
      BEMÆRK: Alle billederne skal være på samme skala på tværs af eksperimenter.
    4. Brug billedanalysesoftwaren til at bestemme de områder, der er af interesse, og kvantificere signaltætheden ved at beregne den flux (fotoner),der udsendes fra hver interesseregion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den største MHC-uoverensstemmende B6 (H2kb)-BALB/C (H2kd)model svarede nøje til GVHD udvikling efter transplantationen (Figur 2). Alle seks kliniske GVHD-tegn, der tidligere blev fastslået af Cooke et al.16, forekom hos de recipienter, der blev transplanteret med WT-B6 T-celler, men ikke hos de recipienter, der blev transplanteret med BM alene (trin 1.5), som repræsenterede den GVHD-negative gruppe. Der er to faser i GVHD udvikling i denne model. For det første er sværhedsgradens højdepunkt ca. 11 dage efter transplantationen, efterfulgt af en reduktion i de kliniske scorer og nyttiggørelse n af kropsvægt en op til 16 dage. I denne fase, flere mekanismer såsom bestråling-induceret inflammation og engraftment syndrom driver sygdommen patogenicitet og GVHD. Modtagerne ensartet bukke under for GVHD omkring 30−40 dage efter transplantation.

Mindst 85 % af BM differentieret i DC 'er (figur 3A). Interessant nok forbedrede transplantation med fB-/- DC'er modtagerens overlevelse og den kliniske score for GVHD (figur 3B,C). Da fB-/- DC'er har mindre antigenpræsentationskapacitet, der påvises ved et lavere MHCII-udtryk og et reduceret cotimatorireceptorudtryk17, kan kotransplantationsprotokollen være tilstrækkelig til at undersøge forskellige signaleringer eller mål i recipient-DC'er i GVHD-udvikling efter BMT.

T-cellens renhed var 90 % efter tilsætning (figur 4A). Luciferase-transduceret A20 B celle lymfom tillader overvågning tumorvækst hos levende dyr (Figur 4B). I denne model, hvis modtagerne døde uden noget signal og en høj GVHD klinisk score, blev det konkluderet, at de døde af GVHD. Alle WT BALB / c modtagere, der modtog BM alene plus A20 døde af tumor tilbagefald (Figur 3B). Derimod, hvis dyret døde af højere signaltæthed, blev det konkluderet, at de døde af tumor tilbagefald. Som det fremgår af figur 3B, døde WT BALB/c-modtagere transplanteret med BM- og T-celler fra ACC1fl/fl B6-donor (ACC1+/+ T-celler) af GVHD. Hvis dyr døde med tegn på sygdom, blev det konkluderet, at de døde af GVHD og tumor tilbagefald. De dyr, der fik BM og T-celler fra ACC1fl/fl x CD4 cre B6 donor (ACC1-/- T-celler) døde af både GVHD og tumor tilbagefald (Figur 3B). Dyr kan placeres tilbage i buret for at blive afbildet på et senere tidspunkt eller aflives for ex vivo billeddannelse. Ved hjælp af softwaren, tumormasse i dyret kan også analyseres individuelt (Figur 3B).

Figure 1
Figur 1: Skematisk repræsentation af BMT-proceduren. (A) Ordning for MHC-uoverensstemmende B6→BALB/c BMT-model. (B) Ordning for DC co-transplantation FVB→B6 model. (C) Ordning for B6→BALB/c GVHD/GVL-model. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Major MHC-uoverensstemmende B6→BALB/c GVHD-model. BALB/c mus blev dødeligt bestrålet og transplanteret med 5 x 106 BM alene eller med 0,75 x 106 T-celler. (A) Overlevelsesdata, (B) vægttab og (C) kliniske scoredata for recipienterne af BM alene eller med T-celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: DC co-transplantering HCT model. BM blev isoleret fra WT og fB-/- B6 mus og differentieret i DC'er ved dyrkning med GM-CSF. (A) DCs renhed blev undersøgt ved flow cytometri ved farvning med CD11c og MHCII. Dødeligt bestrålede B6-modtagere blev transplanteret med BM (3 x 106/mus) plus renset T-celler (1 x 106/mus) fra FVB donorerne. Modtagerne modtog også 2 x 106 WT eller fB-/- B6 BM-DC'er celler på transplantationsdagen. Overlevelse (B) og klinisk score (C) er vist. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Major-MHC uoverensstemmende B6→BALB/c GVHD/GVL-model. WT BALB/c-modtagere blev transplanteret med TCD-BM (5 x 106/mus) alene eller med ACC1+/+ T-celler eller ACC1+/+ T-celler (1 x 106/mus) isoleret fra B6 baggrundsdonormus. Desuden modtog modtagerne 2 x 103 A20-luc på transplantationstidspunktet. T-celle renhed blev undersøgt ved flow cytometri gennem farvning med levende / død gul, CD3, CD4, og CD8 flow antistoffer (A). Modtagerne blev overvåget for tumorvækst bestemmes af hele kroppen bioluminescens imaging (BLI) (B). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Brugen af stamceller, der passer til en bestemt person, er en effektiv tilgang til behandling af fremskreden og resistentkræftform 18. Små molekyle lægemidler, dog, har længe været et primært fokus for personlig kræftbehandling. På den anden side, i cellulære terapi en lang række interaktioner mellem donor og vært kan afgørende påvirke behandlingsresultaterne, såsom udviklingen af GVHD efter BMT1.

Major MHC-uoverensstemmende musemodeller af BMT er et værdifuldt redskab til at forstå gvhd-biologien og teste effekten af lægemidler i behandlingen. Blandt dem er C57BL/6 (H2b) til BALB/c (H2d) og FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b) veletablerede modeller5,7. Disse modeller omfatter enten myeloablativ strålingskonditionering som en enkelt dosis (BALB/c) eller en fraktioneret dosis (C57BL/6), hvor der kræves 3-8 timers intervaller for at nedsætte tarmtoksiciteten5. Begge modeller er afhængige af både CD8+ og CD4+ T-celler. I disse modeller er GVHD-sværhedsgrad og overlevelse de vigtigste målte resultater, og den transplanterede modtager har konsekvent hurtig kinetik og 100% penesance. For at overvåge T-cellemigration og -ekspansion bør T-celler fra luciferase-transduceret donormus anvendes til in vivobioluminescensbilleddannelse19. Men mens 90% af den udførte BMT er MHC-matchet, ligner B6-BALB/c-modellen ikke perfekt den kliniske situation. Opdagelsen af MHC og mindre histokompatibilitet antigener (miHAs) har bidraget væsentligt til at fremme området BMT10. Mindre MHC-uoverensstemmende GVHD-musemodeller efterligner i højere grad patienten GVHD20. Konditioneringsintensitet for at fremkalde donorcelleindgraftning forårsager vævsskader og kan påvirke GVHD-resultatet21. Konditioneringsregimer i murinemodeller involverer ofte TBI i modsætning til kemoterapi i kliniske miljøer22,23. Derfor, en immunosuppressiv kemoterapi model er blevet brugt til at efterligne en reduceret betinget intensitet i klinikker. Musemodellen var C57BL/6 (H2b) til BALB/c (H2d)og transplanterede modtagere udviklede kliniske og histologiske symptomer forbundet med GVHD24.

Den potentielle fordel ved den co-transplanterede protokol er at teste den rolle, som modtageren DC'er uden specifikt afhængig af CD11c forarmet mus. Da BM-DC-generationen blev udført ex vivo, kan denne protokol også anvendes til at teste andre celletypers rolle, såsom makrofager eller neutrofiler i GVHD, blot ved at ændre dyrkningsbetingelserne. Brug CD45.1+ B6 mus som modtagere giver forskerne mulighed for at skelne BM-DC'er (CD45.2+ CD11c+) fra modtageren DC'er (CD45.1+ CD11c+) ved flow analyse. Det fleksible antal celler, der dannes ex vivo og adopteres til de transplanterede modtagere, er en anden fordel ved medtransplantationsprotokollen. Desuden ex vivo kultur giver os mulighed for at screene de potentielle lægemidler til at kontrollere GVHD.

Evnen til at spore tumormønstre in vivo er et kraftfuldt værktøj, der har potentiale til at teste, om et lægemiddel kan påvirke GVL aktivitet. Ved hjælp af denne GVHD/GVL model, tumor progression og metastase kan overvåges i levende dyr16. Desuden kan denne indstilling bruges til at teste GVL-effekten i flere kræftformer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne undersøgelse er støttet af University of Central Florida College of Medicine start-up tilskud (til HN), University of Pittsburgh Medical Center Hillman Cancer Center start-up tilskud (til HL), USA NIH Grant #1P20CA210300-01 og vietnamesiske Sundhedsministeriet Grant #4694 / QD-BYT (til PTH). Vi takker Dr. Xue-zhong Yu på Medical University of South Carolina for at levere materialer til undersøgelsen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA pH 8.0 100ML Fisher Scientific BP2482100 MACS buffer
10X PBS Fisher Scientific BP3994 MACS buffer
A20 B-cell lymphoma University of Central Florida In house GVL experiment
ACC1 fl/fl Jackson Lab 30954 GVL experiment
ACC1 fl/fl CD4cre University of Central Florida GVL experiment
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-485 T-cell enrichment
Anti-Human/Mouse CD45R (B220) Thermo Fisher Scientific 13-0452-85 T-cell enrichment
Anti-mouse B220 FITC Thermo Fisher Scientific 10452-85 Flow cytometry analysis
Anti-mouse CD11c- AF700 Thermo Fisher Scientific 117319 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD25 PE Thermo Fisher Scientific 12-0251-82 Flow staining
Anti-Mouse CD4 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-0041-86 T-cell enrichment
Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® replacement) Thermo Fisher Scientific 48-0042-82 Flow staining
Anti-mouse CD45.1 PE Thermo Fisher Scientific 12-0900-83 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD8a APC Thermo Fisher Scientific 17-0081-83 Flow cytometry analysis
Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710 Thermo Fisher Scientific 46-5958-82 Flow cytometry analysis
Anti-mouse MHC Class II-antibody APC Thermo Fisher Scientific 17-5320-82 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse TER-119 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-5921-85 T-cell enrichment
Anti-Thy1.2 Bio Excel BE0066 BM generation
B6 fB-/- mice University of Central Florida In house Recipients
B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice Charles River 564 Donors
BALB/c mice Charles River 028 Transplant recipients
C57BL/6 mice Charles River 027 Donors/Recipients
CD11b Thermo Fisher Scientific 13-0112-85 T-cell enrichment
CD25-biotin Thermo Fisher Scientific 13-0251-82 T-cell enrichment
CD45R Thermo Fisher Scientific 13-0452-82 T-cell enrichment
CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin Thermo Fisher Scientific 13-5971-82 T-cell enrichment
Cell strainer 40 uM Thermo Fisher Scientific 22363547 Cell preparation
Cell strainer 70 uM Thermo Fisher Scientific 22363548 Cell preparation
D-Luciferin Goldbio LUCK-1G Live animal imaging
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Bilogicals R&D system D17051 Cell Culture
Flow cytometry tubes Fisher Scientific 352008 Flow cytometry analysis
FVB/NCrl Charles River 207 Donors
Lipopolysacharide (LPS) Millipore Sigma L4391-1MG DC mature
LS column Mitenyi Biotec 130-042-401 Cell preparation
MidiMACS Miltenyi Biotec 130-042-302 T-cell enrichment
New Brunswick Galaxy 170R incubator Eppendorf Galaxy 170 R Cell Culture
Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) GIBCO 15140 Media
RPMI 1640 Thermo Fisher Scienctific 11875-093 Media
TER119 Thermo Fisher Scientific 13-5921-82 T-cell enrichment
Xenogen IVIS-200 Perkin Elmer Xenogen IVIS-200 Live animal imaging
X-RAD 320 Biological Irradiator Precision X-RAY X-RAD 320 Total Body Irradiation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shlomchik, W. D. Graft-versus-host disease. Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).
  2. Appelbaum, F. R. Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy. Nature. 411, 385-389 (2001).
  3. Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. Advances in graft-versus-host disease biology and therapy. Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).
  4. Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. 2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders. Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).
  5. Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Model & Mechanism. 4, 318-333 (2011).
  6. Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation. ILAR Journal. , ily006 (2018).
  7. Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD. Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).
  8. Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease. The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).
  9. Lu, Y., Waller, E. K. Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).
  10. Abdollahi, A., et al. Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis. The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).
  11. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  12. Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia. Blood. 119, 5088-5103 (2012).
  13. Ullmann, A. J., et al. Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease. New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).
  14. Dittel, B. N. Depletion of specific cell populations by complement depletion. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  15. Nguyen, H. D., et al. Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation. Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).
  16. Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
  17. Nguyen, H., et al. Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells. Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).
  18. McNutt, M. Cancer immunotherapy. Science. 342, 1417 (2013).
  19. Negrin, R. S., Contag, C. H. In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease. Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).
  20. Roy, D. C., Perreault, C. Major vs minor histocompatibility antigens. Blood. 129, 664-666 (2017).
  21. Gendelman, M., et al. Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease. Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).
  22. Li, J., et al. HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease. Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).
  23. Zeiser, R., et al. Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease. Blood. 109, 2225-2233 (2007).
  24. Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).

Tags

Immunologi og infektion Problem 157 hæmatopoietisk stamcelletransplantation knoglemarvstransplantation graft-versus-host sygdom graft-versus-leukæmi dendritiske celler dendritisk celle co-transplantation
Knoglemarvstransplantation platform til at undersøge den rolle, dendritiske celler i Graft-versus-Host Sygdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nguyen, H. D., Huong, P. T.,… More

Nguyen, H. D., Huong, P. T., Hossack, K., Gurshaney, S., Ezhakunnel, K., Huynh, T. H., Alvarez, A. M., Le, N. T., Luu, H. N. Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease. J. Vis. Exp. (157), e60083, doi:10.3791/60083 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter