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Immunology and Infection

Piattaforma di trapianto di midollo osseo per studiare il ruolo delle cellule dendritiche nella malattia di Graft-versus-Host

Published: March 17, 2020 doi: 10.3791/60083
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 4,5
1Cancer Division, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida, 2Department of Biochemistry, Hanoi University of Pharmacy, 3Center for Cardiovascular Regeneration, Department of Cardiovascular Sciences, Houston Methodist Research Institute, 4Department of Epidemiology, University of Pittsburgh Graduate School of Public Health, 5Division of Cancer Control and Population Sciences, University of Pittsburgh Medical Center, Hillman Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

La malattia da innesto contro ospite è una complicazione importante dopo il trapianto di midollo osseo allogenico. Le cellule dendritiche svolgono un ruolo critico nella patogenesi della malattia da trapianto contro ospite. L'articolo attuale descrive una nuova piattaforma di trapianto di midollo osseo per studiare il ruolo delle cellule dendritiche nello sviluppo della malattia da trapianto contro ospite e l'effetto innesto contro leucemia.

Abstract

Il trapianto di midollo osseo allogenico (BMT) è una terapia efficace per le neoplasie ematologiche dovute all'effetto innesto-contro leucemia (GVL) per sradicare i tumori. Tuttavia, la sua applicazione è limitata dallo sviluppo della malattia innesto-contro-ospite (GVHD), una complicazione importante di BMT. Il GVHD viene evocato quando le cellule T negli innesti del donatore riconosconoalloantigeno espresso dalle cellule riceventi e montano attacchi immunologici indesiderati contro i tessuti sani riceventi. Così, le terapie tradizionali sono progettate per sopprimere l'allocazione delle cellule T del donatore. Tuttavia, questi approcci compromettono sostanzialmente l'effetto GVL in modo che la sopravvivenza del destinatario non sia migliorata. Comprendere gli effetti degli approcci terapeutici su BMT, GVL e GVHD, è quindi essenziale. A causa delle capacità di presentazione dell'antigene e di citochina per stimolare le cellule T del donatore, le cellule dendritiche dei donatori (DC) svolgono un ruolo significativo nell'induzione del GVHD. Pertanto, l'indirizzamento dei controller di dominio destinatario diventa un potenziale approccio per il controllo di GVHD. Questo lavoro fornisce una descrizione di una nuova piattaforma BMT per studiare come i DC host regolano le risposte GVH e GVL dopo il trapianto. È inoltre stato presentato un modello BMT efficace per studiare la biologia del GVHD e della GVL dopo il trapianto.

Introduction

Il trapianto di cellule staminali ematopoietiche allogeneiche (BMT) è una terapia efficace per il trattamento di neoplasie ematologiche1,2 attraverso l'effetto GVL (innesto-contro-leucemia)3. Tuttavia, i linfociti del donatore montano sempre attacchi immunologici indesiderati contro i tessuti ricitati, un processo chiamato malattia innesto-contro-ospite (GVHD)4.

I modelli Murine di GVHD sono uno strumento efficace per studiare la biologia del GVHD e la risposta GVL5. I topi sono un modello animale di ricerca conveniente. Sono piccoli ed efficacemente dosati con molecole e biologici nelle prime fasi dello sviluppo6. I topi sono animali di ricerca ideali per gli studi di manipolazione genetica perché sono geneticamente ben definiti, il che è ideale per studiare percorsi e meccanismi biologici6. Diversi modelli di GVHD non corrispondenti del complesso di istocompatibilità maggiore del mouse (MHC) di GVHD sono stati ben definiti, ad esempio C57BL/6 (H2b) a BALB/c (H2d) e FVB (H2q) : C57BL/6 (H2b)5,7. Questi sono modelli particolarmente preziosi per determinare il ruolo dei singoli tipi di cellule, geni e fattori che influenzano il GVHD. Il trapianto da donatori genitori C57/BL/6 (H2b)a destinatari con mutazioni in MHC I (B6.C-H2bm1) e/o MHC II (B6.C-H2bm12) ha rivelato che un disallineamento sia nella classe MHC I che nella classe II è un requisito importante per lo sviluppo di GVHD acuto. Ciò suggerisce che sia le celluleCD4 e CD8 sono necessarie per lo sviluppo della malattia7,8. GVHD è anche coinvolto in una cascata infiammatoria conosciuta come la 'tempesta di citochine pro-infiammatorie'9. Il metodo di condizionamento più comune nei modelli murini è l'irradiazione totale del corpo (TBI) da raggi X o 137C. Questo porta all'ablazione del midollo osseo del ricevente, permettendo così l'innesto delle cellule staminali del donatore e impedendo il rigetto dell'innesto. Questo viene fatto limitando la proliferazione delle cellule T del ricevente in risposta alle cellule donatrici. Inoltre, le disparità genetiche svolgono un ruolo importante nell'induzione delle malattie, che dipende anche da una mancata corrispondenza di MHC minori10. Pertanto, la dose di irradiazione mieloablativa varia in diversi ceppi di topo (ad es., BALB/c-C57BL/6).

L'attivazione di cellule T donatori da cellule di presentazione dell'antigene host (APC) è essenziale per lo sviluppo di GVHD. Tra gli APC, le cellule dendritiche (DC) sono le più potenti. Sono ereditariamente in grado di indurre GVHD a causa del loro superiore assorbimento di antigeni, espressione di molecole co-stimolanti a cellule T e produzione di citochine pro-infiammatorie che polarizzano le cellule T in sottoinsiemi patogeni. I controller di dominio destinatari sono fondamentali per facilitare l'innesco delle cellule T e l'induzione del GVHD dopo il trapianto11,12. Di conseguenza, DC sono diventati obiettivi interessanti nel trattamento di GVHD12.

La TBI è necessaria per migliorare l'innesto delle cellule del donatore. A causa dell'effetto TBI, i controller di dominio destinatari vengono attivati e sopravvivono per un breve periodo dopo il trapianto12. Nonostante i grandi progressi nell'uso della bioluminescenza o della fluorescenza, stabilire un modello efficace per studiare il ruolo dei controller di dominio destinatari nel GVHD è ancora impegnativo.

Poiché le cellule T donatrici sono la forza motrice per l'attività GVL, strategie di trattamento che utilizzano farmaci immunosoppressivi come gli steroidi per sopprimere l'allreattività delle cellule T spesso causano ricaduta tumorale o infezione13. Pertanto, il targeting dei controller di dominio dei destinatari può fornire un approccio alternativo per trattare il GVHD preservando l'effetto GVL ed evitando l'infezione.

In breve, lo studio attuale fornisce una piattaforma per capire come i diversi tipi di segnalazione nei controller di dominio dei destinatari regolano lo sviluppo di GVHD e l'effetto GVL dopo BMT.

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Protocol

Le procedure sperimentali sono state approvate dal Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università della Florida centrale.

1. Induzione GVHD

NOTA: Il trapianto di cellule ossee allogeniche (BM) (passaggio 1.2) viene eseguito entro 24 ore dopo l'irradiazione. Tutte le procedure descritte di seguito vengono eseguite in un ambiente sterile. Eseguire la procedura in una cappa di coltura tissutale e utilizzare reagenti filtrati.

  1. Giorno 0: Preparare i mouse destinatari.
    1. Utilizzare topi di tipo selvaggio femminile (WT) su uno sfondo BALB/c (CD45.2, H2kd,) come destinatari.
    2. Ear-tag e pesare i destinatari prima di TBI. Quindi, mettere fino a 11 topi nella camera di irradiazione e tenerlo nell'irradiatore. Irradiare ad una singola dose di 700 cGy per 10,15 min.
    3. Restituire gli animali irradiati alle gabbie e ospitarli in strutture prive di agenti patogeni prima del trapianto.
      NOTA: Il peso corporeo minimo dei destinatari deve essere di circa 20 g. Utilizzare questo peso come riferimento per calcolare la perdita di peso corporeo durante il periodo sperimentale.
  2. Giorno 1: Preparare il midollo osseo impoverito a cellule T (TCD-BM) dai topi donatori.
    1. Eutanasia CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 topi da CO2 asfissia e attendere 2/3 min fino a quando non sono incoscienti. Eseguire lussazione cervicale come eutanasia secondaria, se necessario.
    2. Mettere ogni mouse su un tavolo da lavoro pulito. Sanificare la pelliccia e la pelle con il 70% di isopropanolo.
    3. Raccogliere la tibia e il femore da entrambe le gambe con pinze e forbici. Metteteli in RPMI ghiacciati contenenti 1% FCS e 100 U/mL penicillina/streptomicina e 2 mM L-glutamine (1% RPMI) in tubi conici da 50 mL. Pulire accuratamente il femore e le ossa della tibia rimuovendo tutti i tessuti muscolari utilizzando pinze e forbici. Trasferire il femore e la tibia dai tubi conici da 50 mL a un piatto Petri di 92 mm di diametro contenente 1% RPMI.
    4. Utilizzando le forbici, tagliare le estremità del femore o tibia. Riempire un tubo da 50 mL con un mezzo 1% RPMI 1640 da 25 mL. Utilizzare questo per riempire una siringa da 3 mL attaccata ad un ago da 26 G con 3 mL di 1% RPMI. Inserire questa siringa nell'osso e spingere lo stantuffo per lavare il midollo osseo (BM) dalla cavità nel tubo di raccolta con 1% RPMI (3 mL/osso).
    5. Ripetere il passaggio 1.2.4 per tutte le ossa rimanenti della tibia e del femore di altri topi donatori. Tenere tutti i tubi di raccolta sul ghiaccio.
    6. Effettuare la sospensione a singola cella sciando i pezzi del midollo osseo attraverso un colino a cellule a maglie da 75 m. Raccogliere la sospensione a cella singola in un tubo da 50 mL.
    7. Centrifuga tubi a 800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Aspirare e scartare il supernatante. Risospendere il pellet nel buffer PBS contenente lo 0,5% di albumina del siero bovino (BSA) a 20 x 106 celle/mL. Salvare un'aliquota di 2 x 106 celle per la colorazione di purezza.
    8. Aggiungere il tuo 1 anticorpo a 0,05 g/106 cellule14 e incubare per 30 min a 4 gradi centigradi. Lavare una volta con PBS ghiacciato da 25 mL. Risospendere a 20 x 106/mL in 0.5% BSA/10% complemento coniglio giovane/2% DNase (10,000 U/mL in sterile H2O). Incubare per 45 min a 37 gradi centigradi e lavare 2x come prima.
      NOTA: le cellule T si esauriscono usando un mAb specifico per Thy1, una proteina espressa da tutte le cellule T, ma non da altri leucociti.
    9. Risospendere le celle in 20 mL di buffer PBS contenente 0,5% BSA. Contare le cellule del midollo osseo in 1% acido acetico utilizzando un emocitometro. Mantenere un'aliquota di 2 x 106 cellule per un controllo di purezza per citometria di flusso dopo la purificazione cellulare.
      NOTA: Un topo donatore genera normalmente circa 25 x 106 TCD-BM.
    10. Utilizzare la citometria a flusso per confermare il successo dell'esaurimento delle cellule T. Macchie 1 x 106 cellule, conservate dai passi 1.2.7 (prima dell'esaurimento delle cellule T) e 1,2,9 (TCD-BM dopo l'esaurimento delle cellule T) con i seguenti anticorpi: s-CD3 (17A2), z-CD4 (GK1.5) e .CD8 (53-6,7).
  3. Giorno 1: Preparare le cellule T dai topi del donatore
    1. Utilizzare i topi di tipob+ selvatico (WT) CD45.2+ b c57BL/6 come donatori per le cellule T.
    2. Eutanasia C57BL/6 topi per ansiosa carbonica (CO2)asfissia come descritto nel 1.2.1.
    3. Pulire accuratamente la pelliccia e la pelle del topo con il 70% di etanolo. Accise milza e linfonodi e li separano in una sospensione a cella singola di splenociti utilizzando uno stantuffo di siringa e ceppi di maglia da 40 m. Lavare lo strainer e lo stantuffo di siringa con 1% RPMI (1% FBS contenente supporti RPMI) per raccogliere tutti gli splenociti.
    4. Centrifugare la sospensione cellulare a 800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Aggiungere 5 mL di buffer liscitale ACK (1 mM Na2EDTA, 10 mM KHCO3, 144 mM NH4Cl, pH 7.2) dopo aver scartato il supernatante. Incubare la sospensione cellulare per 5 min a temperatura ambiente.
      NOTA: ACK lysis buffer viene utilizzato per lising globuli rossi.
    5. Aggiungere 5 mL di 1% RPMI per arrestare la lisi. Centrifuga a 800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato.
    6. Preparare il buffer DI smistamento cellulare attivato a freddo ghiaccio (MACS) (0,5% BSA, 2 mM EDTA in PBS, pH 7.2). Degas il buffer prima dell'uso. Risospendere i pellet cellulari in 5 mL di buffer MACS.
    7. Contare gli splenociti e controllare le cellule vive e morte utilizzando un emocitometro e 1% trypan blu. Salvare un'aliquota di 2 x 106 cellule per valutare il rendimento della purificazione con l'analisi della citometria di flusso.
    8. Risospendere gli splenociti alla concentrazione di 200 x 106/mL nel buffer MACS. Aggiungete 0,03 l di biotina anti-mouse-Ter-119, 0,03 - L di biotina anti-topi-CD11b, 0,03 l di biotina anti-topi-CD45R e 0,03 l di biotina anti-topo-DX5 per 106 celle. Incubare per 15 min a 4 gradi centigradi.
      NOTA: Biotin anti-mouse-Ter-119, biotina anti-mouse-CD11b, biotina anti-mouse-CD45R e biotina anti-mouse-DX5 sono stati utilizzati per reagire rispettivamente con eritroidi, granulociti, cellule B e cellule NK. Pertanto, questi sottoinsiemi di celle si esauriscono nel passaggio15.
    9. Aggiungere 10 mL di buffer MACS ghiacciato alla sospensione cellulare. Centrifuga a 800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato.
    10. Risospendere i pellet cellulari nel buffer MACS a una concentrazione di 100 x 106/mL. Aggiungere microsfere antibiotine (0,22 x/106 cellule) alla sospensione splenocite. Mescolare bene e incubare per altri 15 min a 4 gradi centigradi. Lavare la sospensione cellulare una volta con 10 mL di buffer MACS ghiacciato. Centrifuga a 800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e scartare il super-natante.
    11. Mettere una colonna di separazione magnetica nel campo magnetico. Risciacquare la colonna con 3 mL di buffer MACS. Rilasciare la sospensione della cella nella colonna. Raccogliere il flusso-attraverso costituito da non legati, celle A T arricchite, in un nuovo tubo conico 15 mL. Lavare la colonna MS con 3 mL di buffer MACS ghiacciato.
      NOTA: assicurarsi che la colonna sia vuota prima di eseguire le operazioni di lavaggio.
    12. Centrifugare la sospensione cellulare a 800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di buffer MACS.
    13. Contare le celle in 1% trypan blu utilizzando un emocitometro. Salvare un'aliquota di 2 x 106 celle per un controllo di purezza per citometria di flusso.
      NOTA: La resa media delle cellule T splenose isolate da questo metodo è di 20-25 USD x10 6 celle per mouse.
    14. Confermare la resa dell'arricchimento delle cellule T per citometria di flusso. Macchie 1 x 106 cellule, conservate dai passi 1.3.7 (prima dell'esaurimento delle cellule T) e 1.3.13 (TCD-BM dopo l'esaurimento delle cellule T), con i seguenti anticorpi: s-CD3 (17A2), CD4 (GK1.5) e .
  4. Giorno 1: iniettare topi irradiati con panino t-cellule e TCD-BM.
    1. Lavare le cellule TCD-BM e T 2x con PBS (800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi). Risospendere le cellule in PBS ghiacciato per l'iniezione. Regolare la concentrazione cellulare a 20 x 106/mL per TCD BM e 4 x 106/mL per le cellule T.
    2. Riscaldare l'animale utilizzando una lampada di riscaldamento per aumentare la visibilità delle vene della coda bilaterali. Se necessario, posizionare il mouse in un restrainer.
    3. Pulire la superficie della coda utilizzando il 70% di isopropanolo. Iniettare Il TCD-BM (5 x 106 cellule/mouse) con o senza cellule T (0,75 x 106 celle/topo). Fare attenzione a non introdurre aria nella siringa.
    4. Togliere l'ago e applicare un tampone antisettico direttamente al sito di iniezione 5x10 s per fermare qualsiasi sanguinamento.
  5. Valuta GVHD nei giorni 2-80.
    1. Tieni traccia della sopravvivenza degli animali. Monitorare i segni clinici di GVHD adattati dal sistema di punteggio stabilito in precedenza da Cook et al.16 e il peso corporeo dei topi destinatari 2x a settimana. Utilizzare il peso corporeo determinato prima del TBI per calcolare la perdita di peso corporeo.
    2. Pesare ogni mouse singolarmente. Segnare la perdita di peso come segue: grado 0 - inferiore al 10%; grado 1 : 10% , 20%; superiore al 20%.
    3. Segnare il segno di postura dei destinatari: grado 0 - nessuna intuizione; grado 0,5 - lieve intuizione ma si raddrizza quando si cammina; grado 1 - animale rimane curvo quando si cammina; grado 1,5 - l'animale non si raddrizza; grado 2.0 - supporto per animali sulle alture posteriori.
    4. Punteggio il segno di mobilità dei destinatari: grado 0 - molto attivo; grado 0,5 - più lento di topi ingenui; grado 1.0 - si muove solo quando infilzolato; grado 1,5 - si muove leggermente quando infilò; grado 2.0 - non si muove quando infilpato.
    5. Segnare la pelle dei destinatari: grado 0 - nessuna abrasione, lesioni o ridimensionamento; grado 0,5 - arrossamento in un'area specifica; grado 1 - abrasione in una zona o abrasione lieve in due aree; grado 1.5 - abrasioni gravi in due o più aree; grado 2.0 - abrasioni gravi, screpolature cutanee, sangue essiccato.
    6. Segnare la pelliccia dei destinatari: grado 0 - nessun segno anormale; grado 0,5 - ridging sul lato della pancia o della nuca, grado 1.0 - ridging attraverso o il lato della pancia e del collo; - pelliccia arruffata e arruffata di grado 1,5; grado 2.0 - pelliccia mal arruffata sulla pancia e sulla schiena.
    7. Segnare la diarrea dei destinatari: grado 0 - nessuna diarrea; grado 0,5 - feci leggere e morbide; grado 1.0 - mild (sgabello giallo); grado 1,5 - moderato (sgabello giallo con un po 'di sangue); grado 2 - grave (sgabello giallo chiaro e sanguinante, "sgabelli torta essiccata" appaiono nella zona anale).

2. Modello di cotrapianto

  1. Generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo (BM-DC).
    1. Isolare il midollo osseo dai femori e dai tibi dei topi WT o del fattore B (fB)-/- sullo sfondo B6, come descritto nei passaggi 1.2.3.2.4. Girare le cellule a 800 x g per 5 min.
    2. Risospendere il pellet in 5 mL di aCK lysing buffer per lis igloma dei globuli rossi. Incubare la sospensione cellulare per 5 min sul ghiaccio. Aggiungere 10 mL di 1% RPMI alla sospensione cellulare per fermare il lisi e la centrifuga a 800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato.
    3. Risospendere i pellet cellulari in 10 mL di mezzi di coltura (RPMI 1460 contenenti 10% FBS, 100 U/mL di penicillina/streptomicina, 2 mM l-glutamina e 50 m-mercaptoethanol) e regolare il volume per soddisfare la concentrazione finale di 2 x 106 cellule/mL.
    4. Aggiungere 20 fattori di stimolazione della colonia di granulociti-mlsi (GM-CSF) di 20 ng/mL alla sospensione cellulare. Coltura le cellule del midollo osseo in piatti di Petri 100 x 15 mm a 37 gradi centigradi nel 5% di CO2 per 6 giorni.
    5. Sostituire la metà dei mezzi di coltura in corso (circa 5 mL) con supporti freschi contenenti 40 ng/mL GM-CSF il giorno 3.
    6. Preriscaldare i mezzi di coltura in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi. Raccogliere circa 5 mL dei media dai piatti di coltura del midollo osseo. Centrifuga a 800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato. Risospendere il pellet cellulare in supporti di coltura 5 mL contenenti 40 ng/mL GM-CSF.
    7. Aggiungete ai media 25 lipopolisaccaride (LPS) ai media il giorno 6 della coltura per far maturare i BM-DC.6
    8. Raccogli i BM-DC maturi: utilizza i sollevatori di celle per raschiare delicatamente i controller di dominio dai piatti Petri. Raccogliere tutte le sospensioni cellulari in tubi conici da 50 mL. Centrifuga a 800 x g, per 5 min a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato. Lavare i pellet cellulari 3x con 50 mL di PBS ghiacciato. Risparmia circa 2 x 106 BM-DC per l'analisi del fenotipo immunologico per citometria di flusso.
  2. Eseguire il cotrapianto di cellule dendritiche di BMT (DC-cotransplanting BMT).
    NOTA: Utilizzare i topi FVB (H2kq)come donatori per le cellule T e le cellule BM. Irradiare b6 Ly5.1 topi ricunati a una dose di 1.100 cGy (2 dosi, 3 h intervallo). Vedere i dettagli nel passaggio 1.1.See details in step 1.1.
    1. Isolare la BM dai femorale e dai tibi dei topi donatori FVB. Vedere i dettagli nei passaggi 1.2.3-1.2.10.
      NOTA: in questo modello, utilizzare il midollo osseo isolato totale anziché TCD-BM.
    2. Purificare le cellule T dalle milza e dai linfonodi dei topi donatori FVB. Vedere i dettagli nei passaggi 1.3.1-1.3.13.
    3. Iniettare BM (5 x 106/mouse), cellule T (0,5 x 106/mouse) con BM-DC (2 x 106/mouse) il giorno 0 del corso sperimentale.
    4. Il giorno 3 dopo il trapianto, esaminare la ricostituzione del donatore DC per citometria di flusso.
      1. Raccogliere il sangue dagli occhi dei destinatari.
      2. Anestesizzare i topi CD45.1/Ly5.1 B6 del 3% per inalazione di isoflurane. Controllare la profondità dell'anestesia per la mancanza di risposta a un pizzico di punta.
      3. Posizionare un tubo sterile di pipetta di vetro nel canto mediale dell'occhio diretto caudalmente ad un angolo di 30-45 gradi dal piano del naso. Applicare la pressione mentre si ruota delicatamente il tubo.
      4. Far cadere il sangue in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml contenente 1,5 mL. Trasferire 50 - L di sangue in tubi di flusso di vetro da 5 mL.
      5. Aggiungere 2 mL di buffer di lising ACK. Incubare a 37 gradi centigradi a bagnomaria per 45 min. Centrifuga a 800 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato.
      6. Risospendere i pellet cellulari con 200 gradi l di buffer FACS contenenti anticorpi di colorazione del flusso appropriati (live/death yellow, zo-H-2Kb, s-CD45.1, s-CD45.2, s-CD11c e . Incubare per 15 min a 4 gradi centigradi al buio. Lavare 2x con buffer FACS da 1 mL. Risospendere i pellet cellulari in 200 - L di TAC buffer ed eseguire l'analisi per citometria di flusso.

3. Modelli GVHD/GVL di BMT

  1. Eseguire l'induzione GVHD/GVL.
    1. Cultura la luciferasi ha trasposto il linfoma a cellule A20 B nei media di coltura RPMI.
    2. Irradiare BALB/c sfondo WT o Ly5.1 recipiente a 700 cGy (dose singola). Vedere i dettagli nel passaggio 1.1.See details in step 1.1.
    3. Isolare il TCD-BM dai femore e dai tibie di B6. Ly5.1 Topi donatori. Vedere i dettagli nei passaggi 1.2.1-1.2.10.
    4. Purificare le cellule T da milza e linfonodi dei topi donatori C57BL/6. Vedere i dettagli nei passaggi 1.3.1-1.3.15.
    5. Lavare il linfoma A20 2x con 25 mL di PBS. Risospendere i pellet cellulari in 10 mL di PBS ghiacciato. Prendere un'aliquota delle sospensioni cellulari (10 ) e contare le celle utilizzando 1% trypan blu e un emocitometro. Regolare la concentrazione cellulare a 20.000 cellule/mL.
    6. Iniettare il TCD-BM (5 x 106/mouse) con o senza cellule T (0,75 x 106/mouse) e il linfoma A20 (5.000 cellule/mouse).
    7. Follow-up sulla sopravvivenza del destinatario, segni clinici GVHD, e perdita di peso corporeo durante il corso sperimentale. Vedere i dettagli nel passaggio 1.5.See details in step 1.5.
  2. Eseguire l'imaging bioluminescente.
    1. Monitorare la crescita del tumore nel ricevente trapiantato iniettando i topi riceventi con 4 mg di D-lucidferina. Incubare per 5 min per garantire la luciferina reagisce con luciferasi.
    2. Anestesizzare il topo utilizzando 3% isoflurane nella camera di un imager bioluminescenza e immagine i destinatari per 5 min nel campo D e il tempo di esposizione di 1 min.
    3. Analizzare i dati utilizzando il software di analisi delle immagini. Modificare la scala delle immagini pseudo-colore per ottenere i migliori risultati.
      NOTA: tutte le immagini devono essere alla stessa scala tra gli esperimenti.
    4. Utilizzare il software di analisi delle immagini per determinare le regioni di interesse e quantificare la densità del segnale calcolando il flusso (fotoni/i) emessi da ciascuna regione di interesse.

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Representative Results

Il principale modello B6 (H2k b)-BALB/C (H2kd) corrispondeva strettamente allo sviluppo del GVHD dopo il trapianto (Figura 2).b Tutti e sei i segni clinici GVHD stabiliti in precedenza da Cooke et al.16 si sono verificati nei destinatari trapiantati con cellule T WT-B6, ma non nei destinatari trapiantati con BM da solo (passaggio 1.5), che rappresentavano il gruppo GVHD-negativo. Ci sono due fasi nello sviluppo GVHD in questo modello. In primo luogo, il picco di gravità è di circa 11 giorni dopo il trapianto, seguito da una riduzione dei punteggi clinici e recupero del peso corporeo fino a 16 giorni. In questa fase, diversi meccanismi come l'infiammazione indotta dall'irradiazione e la sindrome da innesto guidano la patogenicità della malattia e la MGHD. I destinatari soccombono uniformemente al GVHD circa 30-40 giorni dopo il trapianto.

Almeno l'85% del BM differenziato in controller di dominio(Figura 3A). È interessante notare che il trapianto con fB-/- DC ha migliorato la sopravvivenza del destinatario e il punteggio clinico GVHD (Figura 3B,C). Dato che i CONTROLLER di dominio FB-/- hanno meno capacità di presentazione dell'antigene dimostrato da una minore espressione MHCII e da una ridotta espressione del recettore co-stimolante17, il protocollo di co-trapianto può essere sufficiente per esaminare vari segnali o bersagli nei controller di dominio destinatari nello sviluppo del GVHD dopo BMT.

La purezza delle cellule T era del 90% dopo l'arricchimento (Figura 4A). Linfoma a cellule A20 B trasdotta da Luciferasi consente di monitorare la crescita del tumore negli animali vivi (Figura 4B). In questo modello, se i destinatari sono morti senza alcun segnale e un alto punteggio clinico GVHD, si è concluso che sono morti di GVHD. Tutti i destinatari WT BALB/c che hanno ricevuto BM da solo più A20 sono morti di ricaduta tumorale (Figura 3B). Al contrario, se l'animale è morto di maggiore densità del segnale, si è concluso che sono morti di ricaduta del tumore. Come dimostrato nella figura 3B, i destinatari wT BALB/c trapiantati con BM e cellule T da donatore ACC1fl/fl B6 (celluleT) sono decircolati di GVHD. Se gli animali sono morti con segnali di malattia, si è concluso che sono morti di GVHD e ricaduta tumorale. Gli animali che hanno ricevuto cellule BM e T dal donatore ACC1fl/fl x CD4 cre B6 (ACC1-/- T-cells) sono morti sia per La MG che per la ricaduta tumorale (Figura 3B). Gli animali possono essere rimessi nella gabbia per essere immagine in un momento successivo o eutanasia per l'imaging ex vivo. Utilizzando il software, la massa tumorale nell'animale può anche essere analizzata singolarmente (Figura 3B).

Figure 1
Figura 1: Rappresentazione schematica della procedura BMT. (A) Schema per il modello B6-BALB/c BMT non corrispondente all'MHC. (B) Schema per il modello di co-trapianto DC FVB-B6. (C) Schema per il modello B6-BALB/c GVHD/GVL. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Modello GVHD B6-BALB/c non corrispondente mHC principale. I topi BALB/c sono stati irradiati letali e trapiantati con 5 x 106 BM da soli o con 0,75 x 106 t-cellule. (A) Dati di sopravvivenza,(B)perdita di peso corporea e (C)dati clinici del punteggio clinico dei destinatari della sola BM o con cellule T. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: modello Di Co-trapianto DC HCT. BM è stato isolato dai topi WT e fB-/- B6 e differenziato in DC mediante coltura con GM-CSF. (A) La purezza dei controller di dominio è stata esaminata dalla citometria di flusso colorando con CD11c e MHCII. I riceventi B6 irradiati in modo lettale sono stati trapiantati con BM (3 x 106/mouse) più cellule T purificate (1 x 106/mouse) dai donatori FVB. I destinatari hanno anche ricevuto 2 x 106 cellule WT o fB--- B6 BM-DC il giorno del trapianto. Vengono mostrati la sopravvivenza (B) e il punteggio clinico (C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Modello B6-BALB/c GVHD/GVL non corrispondente di Major-MHC. I destinatari di WT BALB/c sono stati trapiantati con TCD-BM (5 x 106/mouse) da solo o con celluleT ACC1 oT-cellule (1 x 106/mouse) isolate dai topi donatori di sfondo B6. Inoltre, i destinatari hanno ricevuto 2 x 103 A20-luc al momento del trapianto. La purezza delle cellule T è stata esaminata dalla citometria di flusso attraverso la colorazione con anticorpi di flusso vivo/morto, CD3, CD4 e CD8 (A). I destinatari sono stati monitorati per la crescita del tumore determinata dalla risonanza elettronica di tutto il corpo (BLI) (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

L'uso di cellule staminali per soddisfare un particolare individuo è un approccio efficace per trattare i tumori avanzati e resistenti18. I prodotti farmaceutici a piccola molecola, tuttavia, sono rimasti a lungo al centro della terapia oncologica personalizzata. D'altra parte, nella terapia cellulare una moltitudine di interazioni tra donatore e ospite può influenzare in modo decisivo gli esiti del trattamento, come lo sviluppo di GVHD dopo BMT1.

I principali modelli murini MHC-mismatched di BMT sono uno strumento prezioso per comprendere la biologia del GVHD e testare l'efficacia dei farmaci nel suo trattamento. Tra questi, C57BL/6 (H2b) a BALB/c (H2d) e FVB (H2q) - C57BL/6 (H2b) sono modelli consolidati5,7. Questi modelli incorporano il condizionamento delle radiazioni mieloablative come una singola dose (BALB/c) o una dose frazionata (C57BL/6) in cui sono necessari intervalli di 3-8 ore per diminuire la tossicità intestinale5. Entrambi i modelli dipendono da entrambe le celleCD8 e CD4e T. In questi modelli, la gravità e la sopravvivenza del GVHD sono i principali risultati misurati e il ricevente trapiantato ha una cinetica rapida costante e una penetrazione del 100%. Al fine di monitorare la migrazione e l'espansione delle cellule T, le cellule T dei topi donatrici tradotti dalla luciferasi dovrebbero essere utilizzate per l'imaging in vivobioluminescenza19. Tuttavia, mentre il 90% della BMT eseguita è abbinata a MHC, il modello B6-BALB/c non assomiglia perfettamente alla situazione clinica. La scoperta dell'MHC e degli antigeni minori per l'istocompatibilità (miHA) ha contribuito in modo significativo a far progredire il campo di BMT10. I modelli murini MHC-mismatched GVHD minori imitano più da vicino il paziente GVHD20. L'intensità del condizionamento per indurre l'innesto cellulare del donatore provoca danni ai tessuti e può influenzare l'esito del GVHD21. Regimi di condizionamento nei modelli murini spesso coinvolge TBI in contrasto con la chemioterapia in ambienti clinici22,23. Pertanto, è stato utilizzato un modello di chemioterapia immunosoppressiva per simulare una ridotta intensità condizionale nelle cliniche. Il modello di topo era C57BL/6 (H2b) a BALB/c (H2d) e i destinatari trapiantati hanno sviluppato sintomi clinici e itologici associati al GVHD24.

Il potenziale vantaggio del protocollo co-trapiantato è quello di testare il ruolo dei controller di dominio destinatari senza dipendere specificamente dai topi impoveriti CD11c. Poiché la generazione BM-DC è stata eseguita ex vivo, questo protocollo può anche essere applicato per testare il ruolo di altri tipi di cellule come macrofagi o neutrofili nel GVHD semplicemente modificando le condizioni di coltura. L'utilizzo di mouse CD45.1e B6 come destinatari consente ai ricercatori di distinguere i BM-DC (CD45.2, CD11c+) dai controller di dominio dei destinatari (CD45.1, CD11c)mediante l'analisi del flusso. Un altro vantaggio del protocollo di cotrapianto è il numero flessibile di cellule generate ex vivo e adottate nei destinatari trapiantati. Inoltre, la cultura ex vivo ci permette di controllare i potenziali farmaci per controllare il GVHD.

La capacità di monitorare i modelli tumorali in vivo è un potente strumento che ha il potenziale per verificare se un farmaco può influenzare l'attività GVL. Utilizzando questo modello GVHD/GVL, la progressione del tumore e la metastasi possono essere monitorate in animali vivi16. Inoltre, questa impostazione può essere utilizzata per testare l'effetto GVL in più tipi di cancro.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo studio è supportato dalla sovvenzione per la start-up dell'Università della Florida College of Medicine (a HN), dalla sovvenzione start-up Hillman Cancer Center dell'Università di Pittsburgh Medical Center (a HL), dal NIH Grant #1P20CA210300-01 degli Stati Uniti e dal Ministero vietnamita di Health Grant #4694/QD-BYT (a PTH). Ringraziamo il Dr. Xue-zhong Yu presso la Medical University of South Carolina per aver fornito materiali per lo studio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA pH 8.0 100ML Fisher Scientific BP2482100 MACS buffer
10X PBS Fisher Scientific BP3994 MACS buffer
A20 B-cell lymphoma University of Central Florida In house GVL experiment
ACC1 fl/fl Jackson Lab 30954 GVL experiment
ACC1 fl/fl CD4cre University of Central Florida GVL experiment
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-485 T-cell enrichment
Anti-Human/Mouse CD45R (B220) Thermo Fisher Scientific 13-0452-85 T-cell enrichment
Anti-mouse B220 FITC Thermo Fisher Scientific 10452-85 Flow cytometry analysis
Anti-mouse CD11c- AF700 Thermo Fisher Scientific 117319 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD25 PE Thermo Fisher Scientific 12-0251-82 Flow staining
Anti-Mouse CD4 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-0041-86 T-cell enrichment
Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® replacement) Thermo Fisher Scientific 48-0042-82 Flow staining
Anti-mouse CD45.1 PE Thermo Fisher Scientific 12-0900-83 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD8a APC Thermo Fisher Scientific 17-0081-83 Flow cytometry analysis
Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710 Thermo Fisher Scientific 46-5958-82 Flow cytometry analysis
Anti-mouse MHC Class II-antibody APC Thermo Fisher Scientific 17-5320-82 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse TER-119 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-5921-85 T-cell enrichment
Anti-Thy1.2 Bio Excel BE0066 BM generation
B6 fB-/- mice University of Central Florida In house Recipients
B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice Charles River 564 Donors
BALB/c mice Charles River 028 Transplant recipients
C57BL/6 mice Charles River 027 Donors/Recipients
CD11b Thermo Fisher Scientific 13-0112-85 T-cell enrichment
CD25-biotin Thermo Fisher Scientific 13-0251-82 T-cell enrichment
CD45R Thermo Fisher Scientific 13-0452-82 T-cell enrichment
CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin Thermo Fisher Scientific 13-5971-82 T-cell enrichment
Cell strainer 40 uM Thermo Fisher Scientific 22363547 Cell preparation
Cell strainer 70 uM Thermo Fisher Scientific 22363548 Cell preparation
D-Luciferin Goldbio LUCK-1G Live animal imaging
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Bilogicals R&D system D17051 Cell Culture
Flow cytometry tubes Fisher Scientific 352008 Flow cytometry analysis
FVB/NCrl Charles River 207 Donors
Lipopolysacharide (LPS) Millipore Sigma L4391-1MG DC mature
LS column Mitenyi Biotec 130-042-401 Cell preparation
MidiMACS Miltenyi Biotec 130-042-302 T-cell enrichment
New Brunswick Galaxy 170R incubator Eppendorf Galaxy 170 R Cell Culture
Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) GIBCO 15140 Media
RPMI 1640 Thermo Fisher Scienctific 11875-093 Media
TER119 Thermo Fisher Scientific 13-5921-82 T-cell enrichment
Xenogen IVIS-200 Perkin Elmer Xenogen IVIS-200 Live animal imaging
X-RAD 320 Biological Irradiator Precision X-RAY X-RAD 320 Total Body Irradiation

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References

  1. Shlomchik, W. D. Graft-versus-host disease. Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).
  2. Appelbaum, F. R. Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy. Nature. 411, 385-389 (2001).
  3. Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. Advances in graft-versus-host disease biology and therapy. Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).
  4. Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. 2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders. Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).
  5. Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Model & Mechanism. 4, 318-333 (2011).
  6. Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation. ILAR Journal. , ily006 (2018).
  7. Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD. Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).
  8. Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease. The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).
  9. Lu, Y., Waller, E. K. Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).
  10. Abdollahi, A., et al. Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis. The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).
  11. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  12. Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia. Blood. 119, 5088-5103 (2012).
  13. Ullmann, A. J., et al. Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease. New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).
  14. Dittel, B. N. Depletion of specific cell populations by complement depletion. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  15. Nguyen, H. D., et al. Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation. Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).
  16. Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
  17. Nguyen, H., et al. Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells. Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).
  18. McNutt, M. Cancer immunotherapy. Science. 342, 1417 (2013).
  19. Negrin, R. S., Contag, C. H. In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease. Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).
  20. Roy, D. C., Perreault, C. Major vs minor histocompatibility antigens. Blood. 129, 664-666 (2017).
  21. Gendelman, M., et al. Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease. Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).
  22. Li, J., et al. HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease. Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).
  23. Zeiser, R., et al. Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease. Blood. 109, 2225-2233 (2007).
  24. Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).

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