Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Gransking av Transcriptional rolle en RUNX1 Intronic lyddemper av CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein i akutt myelogen leukemi celler

Published: September 1, 2019 doi: 10.3791/60130
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Blood Cancer Cytogenetics and Genomics Laboratory, Department of Anatomical and Cellular Pathology, Prince of Wales Hospital, The Chinese University of Hong Kong, 2State Key Laboratory in Oncology in South China, The Chinese University of Hong Kong

Summary

Direkte levering av forhåndsmonterte Cas9/guide RNA ribonucleoprotein komplekser er en rask og effektiv måte for Genova redigering i blodkreft celler. Her bruker vi denne tilnærmingen til å slette en RUNX1 intronic lyddemper og undersøke transcriptional svar i OCI-AML3 Leukemic celler.

Abstract

Hovedtyngden av den menneskelige Genova (~ 98%) består av ikke-koding sekvenser. CIS-regulatoriske elementer (CREs) er ikke-koding DNA-sekvenser som inneholder bindende områder for transcriptional regulatorer å modulere genuttrykk. Endringer av CREs har vært innblandet i ulike sykdommer, inkludert kreft. Mens arrangører og enhancers har vært den primære CREs for å studere gen regulering, svært lite er kjent om rollen til lyddemper, som er en annen type GROBUNN som formidler gen undertrykkelse. Opprinnelig identifisert som en adaptiv immunitet system i prokaryoter, CRISPR/Cas9 har blitt utnyttet til å være et kraftig verktøy for eukaryote Genova redigering. Her presenterer vi bruken av denne teknikken for å slette en intronic lyddemper i menneskets RUNX1 gen og undersøke virkningene på genuttrykk i OCI-AML3 Leukemic celler. Vår tilnærming er avhengig av electroporation-mediert levering av to forhåndsmonterte Cas9/guide RNA (gRNA) ribonucleoprotein (RNP) komplekser for å lage to doble strand pauser (DSBs) som flanke lyddemper. Slettinger kan lett bli vist ved fragment analyse. Uttrykks analyser av ulike mRNAs som skrives ut fra alternative arrangører, bidrar til å evaluere arrangørens avhengige effekter. Denne strategien kan brukes til å studere andre CREs og er spesielt egnet for blodkreft celler, som ofte er vanskelig å transfect med plasmider-baserte metoder. Bruken av en plasmider-og virus fri strategi gir enkle og raske vurderinger av gen regulatoriske funksjoner.

Introduction

CIS-regulatoriske elementer (CREs) er ikke-koding DNA-sekvenser som inneholder bindende områder for transcriptional regulatorer for å kontrollere genuttrykk1,2. Disse elementene er vanligvis 100 til 1 000 base parene (BP) lang. Arrangører og enhancers er de to mest preget typer CREs. Arrangører er til stede i umiddelbar nærhet til transkripsjon starte nettsteder og utgjør den grunnleggende enhet av transkripsjon. Mange gener har mer enn én promoter og deres alternative bruk bidrar til transcriptome mangfold og vev spesifisitet3,4. På den annen side, enhancers aktivere transkripsjon og kan være plassert oppstrøms, nedstrøms eller innenfor introns av målet gener. Enhancers kan handle fra langt avstand (over en megabase) og uavhengig av orientering1,2. CREs har også lyddempere og isolatorer5,6. Den tidligere handlinger oppositely til enhancers å hemme genuttrykk ved binding til transcriptional repressors, mens sistnevnte partisjonene i Genova i diskret topologisk domener å isolere gener fra andre CREs fra nabokommunene domener. Disse elementene handler i samspill med hverandre gjennom kort-og/eller langtrekkende kromatin interaksjoner og er organisert i regulatoriske huber til direkte riktig spatiotemporal genuttrykk. Nylige fremskritt i høy gjennomstrømming sekvensering teknikker har akselerert identifisering og funksjonell merknad av mange CREs som har i stor grad tilrettelagt vår forståelse av transcriptional nettverk som dikterer avstamning-spesifikke genet uttrykk i forskjellige celle-og vevstyper7,8,9, 10,11,12.

Gitt de grunnleggende rollene til CREs i regulering transkripsjon, kan deres endringer føre til avvikende genuttrykk. Det har vist seg at CREs er ofte forstyrret av genetiske og epigenetic endringer i ulike typer av menneskelig kreft, og dermed bidra til tumor innvielse, progresjon og aggressivitet13,14. I tillegg, GROBUNN-bindende faktorer er ofte mutert og/eller misexpressed i ulike krefttyper, ytterligere fremhever betydningen av GROBUNN dereguleringen i oncogenesis15. CREs kan også påvirkes av strukturelle avvik, som illustrert av hyppige kromosom rearrangements av immunglobulin tunge (IgH) gen Enhancer som resulterer i unormal aktivering av nabo oncogenes i B-celle lymfomer16. Ved akutt myelogen leukemi (AML), omplassering av en enkelt Enhancer av kromosom 3Q rearrangements forårsaker samtidig GATA2 Downregulation og EVI1 aktivering, som kan potensielt være målrettet av spill hemming av Enhancer funksjoner 17. nylig har vi karakterisert en roman kromosom translokasjon som involverer forstyrrelsene av en RUNX1 intronic lyddemper som kan bidra til AML progresjon i en pediatrisk pasient18. Således, tyde den ikke-koding kreft Genova gir fruktbare veier for Elucidating sykdom patogenesen, biomarkør oppdagelse og terapeutiske intervensjoner, som til slutt forbedre pasientens utfall.

CRISPR/Cas9 nuklease Pathway, opprinnelig identifisert som et adaptive immunsystem i prokaryote celler, har blitt utnyttet som en rask og kostnadseffektiv måte for områdespesifikk genomisk redigering i levende celler og organismer19,20 ,21,22. CRISPR/Cas9-systemet omfatter to hovedkomponenter: gRNA og Streptococcus pyogenesCas9 nuklease. GRNA inneholder en bestemt sekvens kalt protospacer som gjenkjenner målområdet og dirigerer Cas9 for redigering. GRNA består av to deler: CRISPR RNA (crRNA), vanligvis en 20-mer nukleotid sekvens komplementær til mål-DNA, og en trans-aktivere crRNA (tracrRNA), som fungerer som et bindende stillas for nuklease. En protospacer tilstøtende motiv (PAM) (5 '-NGG) umiddelbart ved siden av målet området er nødvendig for Cas9 kløft og kløften området ligger 3 nukleotider oppstrøms av PAM. CRISPR/Cas9-mediert genredigering er vanligvis utføres av transfecting celler med en plasmider det koder Cas9 og det klon gRNA23. Imidlertid er denne tilnærmingen utfordrende for blodkreft celler, som ofte er vanskelig å transfect og krever langvarige virus-baserte Transduction metoder. En alternativ tilnærming er direkte cellulær levering av forhåndsmonterte Cas9/gRNA RNP komplekser24. En vanlig metode for RNP levering er electroporation, som genererer midlertidige porer i cellemembranen, og dermed tillater oppføring av RNP komplekser i cellene25,26. Fordelene med denne tilnærmingen inkluderer brukervennlighet, redusert off-Target effekter og stabilitet av RNP komplekser. Her beskriver vi en protokoll for å bruke RNP Leveringsmetode for å undersøke transcriptional rollen til en RUNX1 intronic lyddemper i OCI-AML3 leukemi cellelinje18, som ble etablert fra PERIFERT blod av en AML pasient diagnostisert med den fransk-amerikanske-britiske M4 under type27. Protokollen inkluderer design av crRNA, utarbeidelse av RNP komplekser, electroporation samt screening og påfølgende karakterisering av de ønskede kloner.

Protocol

1. design av crRNA

  1. Design to crRNAs, en 5 ' og de andre 3 ' av målet grobunn ved hjelp av en Web-basert CRISPR design verktøyet28,29,30,31. Kontroller at en PAM av NGG ligger rett nedstrøms for mål sekvensen for Cas9-gjenkjenning. Utformingen av de to crRNAs (crRNA-1 og crRNA-2) for sletting av RUNX1 lyddemper18 er vist i figur 1.
    Merk: En crRNA inneholder vanligvis en 20-mer protospacer som er komplementær til mål sekvensen.
  2. Sjekk tilstedeværelsen av enkle nukleotid polymorfismer (SNPs)/indels i målet og tilstøtende PAM sekvenser ved å skrive inn genomisk plasseringene av sekvensene i søkeboksen av en online Genova nettleser (f. eks, NCBI 1000 genomer eller UCSC Genova Browser).
    Merk: Vanlige SNPs/indeler har en mindre allel frekvens på minst 1% i befolkningen generelt.
  3. Send inn de valgte crRNA-sekvensene for syntese med en kommersiell leverandør. Også kjøpe tracrRNA for gRNA duplex formasjon.

2. design av sletting screening primere

  1. Design et par primere som flanken den tiltenkte sletting regionen. Sørg for at primere er minst 50 BP fra Cas9 kløft steder slik at PCR forsterkning er minimalt påvirket av indeler dannet på kløften steder.
  2. Sørg for at amplicon er mindre enn 1 200 BP (fortrinnsvis mindre enn 600 BP for bedre størrelses oppløsning). Også merke en av primere med et fluorescerende fargestoff (f. eks 6-carboxyfluorescein (6-FAM)) på 5 '-end for påvisning. Den primere som brukes for screening av RUNX1 lyddemper sletting18 er vist i figur 1.

3. utarbeidelse av Cas9/gRNA RNP komplekser

  1. Resuspend crRNAs og tracrRNA i 1x TE-buffer (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 7,5) til en endelig konsentrasjon på 200 μM.
  2. For hver crRNA, bland 2,2 μL av 200 μM crRNA, 2,2 μL av 200 μM tracrRNA og 5,6 μL av 1x TE buffer (totalt 10 μL) i et 0,2 mL rør for å oppnå en endelig dupleks konsentrasjon på 44 μM.
  3. Ruge ved 95 ° c for 5 min i en thermocycler. La rørene avkjøles til romtemperatur for gRNA kompleks dannelse.
  4. Fortynne 10,4 μL av 62 μM rekombinant Cas9-nuklease med 7,6 μL av 1x fosfat-bufret saltvann (PBS) for å oppnå en endelig nuklease konsentrasjon på 36 μM.
    Merk: Dette beløpet er tilstrekkelig for utarbeidelse av to Cas9/gRNA komplekser.
  5. Bland like volumer (8,5 μL) av den fortynnede nuklease med hver av gRNA-duplexes Hentet fra trinn 3,3.
  6. Ruge ved romtemperatur i 20 min for å tillate RNP kompleks formasjon. Hold blandinger på isen til electroporation.

4. electroporation av RNP komplekser i OCI-AML3 celler

  1. Kultur OCI-AML3 celler i RPMI 1640 medium supplert med 10% varme-deaktivert fosterets storfe serum (FBS), 1x GlutaMAX, 100 enheter/mL av penicillin og 100 μg/mL av Streptomycin (heretter referert til som komplett RPMI 1640 medium) ved 37 ° c med 5% CO2.
  2. Telle celler ved hjelp trypan blå farging. Sørg for at celle levedyktigheten på tidspunktet for electroporation er over 90%.
  3. Sentrifuger 2,5 x 106 celler i et 1,5 ml rør ved 500 x g i 5 min ved romtemperatur. Fjern supernatanten og vask cellene med 1 mL 1x PBS. Snurr ned cellene igjen og Fjern alle rester av supernatanten.
  4. Resuspend cellene i 163 μL av RPMI 1640 medium uten fenol rød.  Tilsett 16,7 μL av hvert RNP-kompleks (fra trinn 3,6) og 3,6 μL av 100 μM electroporation Enhancer til cellene (totalt volum = 200 μL). Bland forsiktig ved pipettering.
    Merk: Electroporation Enhancer er et bære-DNA for å forbedre redigerings effektiviteten.
  5. Overfør blandingen til en 0,2 cm-gap electroporation Cuvette uten bobler. Utfør electroporation med et electroporation system (modus: eksponentiell; Spenning =: 150 V; Kapasitans = 700 μF; Motstand = 50 Ω).
  6. Overfør cellene til en T-25 vevs kultur kolbe som inneholder 6 mL komplett RPMI 1640 medium og ruge ved 37 ° c med 5% CO2.

5. screening og valg av Cell kloner med Biallelic slettinger

  1. Fortynne cellene til 5 x 103/ml i komplett RPMI 1640 medium en dag etter electroporation. Tilsett 100 μL av den fortynnede celle fjæringen i hver brønn av 96-brønn vevs kultur plater og la cellene vokse i 7-14 dager.
  2. Pakk genomisk DNA fra cellene ved hjelp av en høy-gjennomstrømming rensing system.
  3. Tilsett 100 μL av plate binding og lyseringsbuffer til hver brønn på en 96-brønn avsugs plate. Tilsett 5 x 104 celler resuspendert i 10 μL av 1x PBS til buffer og bland dem ved pipettering.
  4. Ruge i romtemperatur i 30 minutter for å tillate binding av genomisk DNA til brønnene.
  5. Aspirer løsningen fra brønnene uten å skrape brønnen overflater. Vask brønnene med 120 μL av vaskebuffer.
  6. Luft tørker brønnene som inneholder det bundne DNA.
  7. Forbered 20 μL av PCR-blanding (2 μL av 10x høy Fidelity-buffer, 0,8 μL av 50 mM MgSO4, 0,4 μL av 10 mm dNTPs, 0,4 μL av 10 μM fam-merket Forward primer (trinn 2,2), 0,4 μL av 10 μm umerkede omvendt primer og 0,4 U av Taq DNA polymerase for hver prøve).
    Merk: Forbered en Master mix for å sikre at det legges til standardiserte mengder reagenser i hvert utvalg.
  8. Tilsett PCR-blandingen i hver brønn av avsugs platen og Kjør reaksjonene i en thermocycler (betingelser: Initial 94 ° c i 2 min, etterfulgt av 35 sykluser på 94 ° c i 15 s, 56 ° c for 30 s og 68 ° c i 1 min).
  9. Anslå mengden av produktene ved å måle konsentrasjonen i et valgt antall prøver ved hjelp av en fluorometer. Fortynne alle prøvene med nuklease-fri H2O til 0,5 ng/μL.
  10. Bland 1 μL av de fortynnede PCR-produktene med 8,5 μL av deionisert formamid og 0,5 μL av fluorescerende fargestoff merket størrelses standard i en 96-brønn plate som er kompatibel med den genetiske analysator.
    Merk: Forbered en Master Mix som inneholder deionisert formamid og størrelses standarden.
  11. Dekkplaten med en plate septa og denaturere prøvene ved 95 ° c i 3 minutter i en thermocycler. Ikke Lukk dekslet på maskinen.
  12. Utfør kapillær gel elektroforese for å skille de merkede PCR-produktene som tidligere beskrevet32.
  13. Etter elektroforese, åpne analyseprogramvaren for å analysere resultatene.
  14. Klikk nytt prosjekt , og velg mikrosatellittmarkør. Deretter klikker du OK.
  15. Klikk Legg til eksempler i Project , og velg resultat filene (inneholder FSA-filtypen). Klikk deretter Legg til i listen for å importere filene.
  16. I tabellen som viser de valgte resultat filene, velger du mikrosatellittmarkør standard i kolonnen analysemetode . Du kan også velge størrelse standarden som brukes i kolonnen størrelse standard . Klikk deretter på analyser -ikonet, Skriv inn eksperiment navnet og lagre eksperimentet.
  17. Klikk Vis plott for å vise resultatene og velge fragment analyse i plott-innstillingen.
  18. Velg de aktuelle fargede kanalene for analyse. Kontroller det oransje ikonet for å vise de merkede fragmentene i størrelses standarden for å vurdere kvaliteten på anrops størrelsen.
  19. Kontroller det blå ikonet for å vise de merkede PCR-produktene. Identifiser toppene som samsvarer med vill-type og mutant (dvs. bærer forventet slettinger) produkter. Beregn det muterte nivået i hver prøve ved å dele området under mutant toppen med summen av arealet under vill-type og mutant topper.
  20. Velg flere celleutvalg med høye nivåer av forventede slettinger for videre serielle fortynninger.
  21. Gjenta DNA-ekstraksjon, fluorescerende PCR og kapillær elektroforese trinn. Velg celle kloner med mutant nivåer > 95% som representerer biallelic slettinger for senere analyser.
  22. Kontroller identiteten til slettinger i de valgte kloner av sanger sekvensering.

6. funksjonell analyser av lyddemper sletting av sann tids kvantitativ RT-PCR-analyse

  1. Pakk total RNA fra utvalgte kloner og utfør komplementær DNA (cDNA)-syntese.
  2. Bland 1 mikrogram RNA med 1 μL 50 μM oligo (dT)20 primer og 1 ΜL 10 mm dNTP mix i et samlet volum på 10 ΜL. ruge ved 65 ° c i 5 min og plasser på isen i minst 1 min.
  3. Tilsett 10 μL av cDNA-syntese som inneholder 2 μL av 10x RT buffer, 4 μL av 25 mM MgCl2, 2 μl av 0,1 M DTT, 1 μL av RNase-hemmere (40 u/μL) og 1 μL av revers transkriptase (200 u/μL). Ruge ved 50 ° c for 50 min og deretter 85 ° c i 5 min i en thermocycler.
    Merk: Forbered en Master mix for omvendt transkripsjon.
  4. Chill prøvene på isen. Tilsett 1 μL av RNase H og ruge ved 37 ° c i 20 min. Oppbevar cDNA ved-20 ° c.
  5. Design primere og TaqMan sonder som spesifikt anerkjenner individuelle transkripsjon varianter generert fra alternative arrangører.
    Merk: Pre-designede transkripsjon-spesifikke primer/sonde sett er kommersielt tilgjengelig.
  6. Klon DNA-fragmenter som inneholder de spesifikke transkripsjon sekvenser til plasmider DNA. Forbered en 10-fold fortynning serien (106 til 10 eksemplarer) av rekombinant plasmider som standard kurver for transkripsjon kvantifisering.
  7. Forbered 20 μL av PCR-mix (0,5 μL av DNA-mal, 1 μL av 20x pre-designet TaqMan sonde/primer-analyse og 10 μL av 2x TaqMan PCR Master Mix) for hver prøve (både cDNA og plasmider standarder). Mål hver prøve i tre eksemplarer.
    Merk: Forbered en Master mix for sann tids PCR.
  8. Kjør reaksjonene i en PCR-maskin i sanntid (betingelser: innledende 50 ° c i 2 min og 95 ° c i 10 min, etterfulgt av 40 sykluser med 94 ° c i 15 s og 60 ° c i 1 min).
  9. Etter forsterkningen klikker du på analyser -ikonet i programvaren for å analysere dataene. Sjekk skråningen og korrelasjonskoeffisienten til standard kurvene for å evaluere effektiviteten og linearitet av reaksjonene. Kontroller at bakkene er mellom-3,1 og-3,6 og korrelasjonskoeffisienter er større enn 0,99.
  10. Normalisere kopi nummeret til mål transkripsjoner i hver prøve med et rengjørings gen (f.eks. GAPDH).

Representative Results

Målet med dette eksperimentet er å slette en intronic lyddemper i RUNX1 genet og undersøke virkningene på RUNX1 TRANSKRIPSJON i OCI-AML3 celler. Lyddemperen ble identifisert av en Kombinatorisk molekylær tilnærming og funnet å inneholde en 209 BP kjerneelement18. For å muliggjøre mer nøyaktig evaluering av dette kjerneelementet i kontroll av RUNX1 uttrykk, ble CrRNAs (crRNA-1 og crRNA-2) utformet for å målrette tett mot denne regionen18 (figur 1). Den spådde Cas9 kløft områder brakt av crRNA-1 og crRNA-2 var 29 BP og 35 BP fra kjernen element, henholdsvis (figur 1). Det bør bemerkes at mens PAM områder av de to crRNAs bor på motsatte tråder, vil DSBs skje uavhengig av PAM sekvens plassering. Dermed er samtidig innføring av to Cas9/gRNA RNP komplekser guidet av crRNA-1 og crRNA-2 forventes å avgiftsdirektoratet lyddemper element fra RUNX1 geometrisk.

Til skjermen for ønsket sletting i et stort antall prøver, en 96-brønn format av genomisk DNA-ekstraksjon Kit ble brukt for høy gjennomstrømming rensing. Også, DNA bundet på brønnene av utvinnings platene kan utsettes for direkte forsterkning, og dermed minimere feil eller forurensning på grunn av gjentatte sample overføring. Den primere som brukes for screening av slettinger18 er vist i figur 1. Forventet størrelse av det ville-type PCR produktet er ca 500 BP. Siden den tiltenkte slettingen spenner 273 BP, er det muterte produktet forventes å være ca 230 BP. Dette størrelsesområdet muliggjør enkel og rask fragment analyse av kapillær gel-elektroforese. Totalt 160 første celle bassenger ble vist og 14 ble funnet å bære den forventede slettinger med mutant nivåer på minst 70%. Fem bassenger ble deretter valgt for ytterligere serie fortynninger å identifisere kloner bærende biallelic slettinger. Representative electropherograms fra celle kloner med ulike nivåer av muterte produkter er vist i figur 2A. Identiteten til slettinger ble verifisert av sanger sekvensering (figur 2B). Som forventet, indeler dannet av ikke-homologe ende bli reparasjon av DSBs33 ble observert ved spådde kløft steder i slettingen kloner. Disse resulterte i forsterkning av muterte produkter av varierende størrelse, som også kan oppdages av kapillær elektroforese (figur 2A).

RUNX1 -genet inneholder to arrangører, nemlig den som er den som er den proksimale P2, som er adskilt av en stor Intronets opprinnelse harboring lyddemper elementet34. Tre store mRNA transkripsjoner er produsert av disse arrangørene: RUNX1c av P1 og RUNX1a og RUNX1b av P234. Den nukleotid sekvensen av RUNX1c og RUNX1b er identiske bortsett fra det tidligere har en unik N-Terminus, som en bestemt TaqMan genuttrykket analysen kan utformes (Figur 3a). For å måle RUNX1b, en TaqMan analysen erkjenner både RUNX1b og RUNX1c ble brukt (Figur 3a). RUNX1b nivåer ble deretter bestemt ved å trekke totalt RUNX1b/RUNX1c fra RUNX1c. RUNX1a er en utpreget kortere isoformen på grunn av alternative skjøting og en bestemt TaqMan analysen er tilgjengelig for denne varianten (Figur 3a). Dermed aktiviteten av P1 og P2 arrangører kan bestemmes individuelt. Sann tids kvantitativ RT-PCR viste at sletting av lyddemper elementet betydelig upregulated uttrykks nivåene for både P1-og P2-avledede transkripsjoner (Figur 3B).

Figure 1
Figur 1 : Strategi for å slette RUNX1 intronic lyddemper. Lyddemperen (rød eske) ligger i første Intronets opprinnelse av RUNX1 -genet som skiller de to arrangørene P1 og P2 (hg19-koordinatene vises). To crRNAs (crRNA-1 og crRNA-2) ble utformet for å innføre DSBs flankerer lyddemper elementet. Den spådde Cas9 kløft steder er indikert av vertikale røde linjer og PAM nettsteder (NGG) er i lilla. De to primere som brukes for screening av slettinger er representert med åpne piler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Identifikasjon av slettingen kloner. (A) representative electropherograms av celle kloner som viser ulike nivåer av muterte PCR-produkter (MUT). Størrelsen på de muterte produkter varierer blant de kloner på grunn av indeler dannet på kløften steder. WT = vill-type. (B) verifisering av slettinger fra representative kloner av sanger sekvensering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Funksjonelle konsekvenser av lyddemper sletting. (A) de tre store RUNX1 isoformene (RUNX1a, RUNX1b og RUNX1c) vises. Disse variantene inneholder samme runt DNA bindende domene, men forskjellige N-(oransje) eller C-Terminus (blå). Plasseringen av TaqMan sonde/primer parene indikeres av røde linjer. Tall indikerer aminosyren rester. (B) sann tids kvantitativ RT-PCR-analyse av RUNX1 P1-og P2-avledede transkripsjoner i celle populasjoner med (del) eller uten (WT) biallelic slettinger18. GAPDH ble brukt til normalisering. * og * * indikerer p < 0,05 og p < 0,01, henholdsvis av mann-Whitney test. Dette tallet er endret fra Cheng et al.18. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Den CRISPR/Cas9 systemet har vært brukt i en rekke Genova redigering programmer som Gen knockout og knock-in studier35,36, transcriptional regulering37,38, genetisk engineering av ulike modell organismer39,40,41,42,43,44 og genterapi45,46. Her demonstrerer vi bruken av CRISPR/Cas9 for å undersøke de funksjonelle konsekvensene av å slette en intronic lyddemper på RUNX1 -genet. Leveransen av CRISPR komponenter i tilnærmingen vår var ikke avhengig av plasmider DNA, kloning av gRNA eller virus, men electroporation av forhåndsmonterte Cas9/gRNA RNP komplekser. Det har vist seg at bruk av eksogene DNA kan knyttes til uønsket integrering av utenlandske vektor sekvenser inn i verten Genova, økt toksisitet og lav effektivitet25,47,48, mens virus Transduction metoder er tidkrevende. I tillegg kan langvarig uttrykk for Cas9 fra plasmider DNA forsterke off-Target effekter48. Tvert imot, det direkte RNP-basert leveranse adgang er blitt etablerte idet det foretrakk metoden for den er rask og direkte med forbedret redigere bort effektiv, selektivitet og cellen levedyktighet. Faktisk, en rekke metoder som lipofection49,50, electroporation25,51, nanopartikler52, celle-gjennomtrengende peptider53, iTOP54 og TRIAMF 55 har blitt utviklet for effektiv CRISPR/Cas9 levering til ulike celletyper, samt dyre-og plantearter24,25,26,56,57 , 58 for alle , 59 for alle , 60 for alle , 61 for alle , 62 for alle , 63. siden ikke-koding DNA-sekvenser er hotspots av genetiske variasjoner64, sjekke tilstedeværelsen av vanlige SNPs/indeler i målet og nabolandet Pam sekvenser er spesielt relevant når du utformer gRNA som mål regulatoriske Elementer.

En flaskehals i CRISPR/Cas9 Genova redigering innebærer screening av ønsket mutant kloner i et stort antall prøver. Vi brukte fluorescerende PCR kombinert med kapillær gel elektroforese for screening som mål mutasjon er en liten genomisk sletting av ca 300 BP. Denne metoden er rask og følsom og kan utføres i en høy-gjennomstrømming mote. Denne metoden gir også nøyaktig estimering av mutant nivåer og slette størrelser samtidig. I tillegg støttes multiplex analyse av PCR-fragmenter merket med ulike fluorescerende fargestoffer. Vi har vært rutinemessig bruker denne teknikken til genotype små innsettinger/slettinger i myelogen svulster65,66. I vår erfaring, kan vi konsekvent oppdage fragment størrelser som er forskjellig fra 4 BP med høy presisjon og mutant byrde ned til ~ 3%. Imidlertid bør det bemerkes at denne metoden har et fragment størrelsesgrensen på 1 200 BP, og dermed er det ikke egnet for screening av store slettinger. Også basis erstatninger (som resulterer i uendret fragment størrelse) og potensielle hendelser utenfor mål i andre genomisk områder, kan ikke oppdages. For det latter, det kostbar hele Genova sekvensering er krevde å allsidig profil fleste uønsket endre inne målet klon. Å vedta vår nåværende tilnærming for etterforskning av store ikke-koding regulatoriske sekvenser (> 1000 BP), en detaljert sletting og mutagenese analyser av antatte transkripsjon faktor bindende nettsteder bruker in vitro reporter genanalyser kan utføres på forhånd for å avgrense den minimale funksjonelle regionen for CRISPR/Cas9 redigering18.

Som mange gener inneholder mer enn én arrangører3,4, er det viktig å være klar over eksistensen av alternative arrangører i målet genet geometriske som manipulerer regulatoriske elementer kan påvirke arrangørene differensielt. Dermed, transkripsjon varianter avledet fra ulike arrangører må måles individuelt for å evaluere eventuelle promoter-spesifikke tiltak. Bruk av TaqMan-sonde er foretrukket over SYBR Green på grunn av bedre spesifisitet og reproduserbarhet. Hvis den mer avanserte digitale PCR-systemet er tilgjengelig, transkripsjon kvantifisering kan utføres mer presist uten behov for standard kurve konstruksjon.

En viktig faktor i å utføre CRISPR/Cas9 eksperimenter i kreftcelle linjer er ploidy og målet genet kopi nummer i cellene brukes som nesten alle kreftcelle linjer havn genetiske endringer inkludert strukturelle og kopiere antall variasjoner. I vårt tilfelle har OCI-AML3 en hyperdiploid Karyotype med 45 til 50 kromosomer. I tillegg ble cellelinjen funnet å bære en normal RUNX1 kopi nummer som avslørt fra kreft Cell line Encyclopedia67 og fluorescens in situ hybridisering studier18. Når du målretter et gen med kopi nummer forsterkning, kan det hende leveringsmetoden må optimaliseres for å gi tilstrekkelige nivåer av CRISPR-komponentene for redigeringen. Dessuten kan flere kloner må bli vist for å identifisere den komplette Knockouts. Viktigere er det vist at målretting på forsterket genomisk regioner, spesielt de som skyldes strukturelle rearrangements, kan utløse gen-uavhengige antiproliferative responser i kreftceller, noe som fører til falske positive resultater i genet funksjonelle studier68,69,70. I denne forbindelse bør alternative tilnærminger som RNA-interferens (RNAi) knockdown og/eller cDNA-overuttrykte benyttes for å verifisere CRISPR-funnene. I tillegg bør flere cellelinjer brukes for å unngå feil tolkning av cellelinje spesifikke, men gen-uavhengige CRISPR redigerings effekter.

Den CRISPR/Cas9 systemet har revolusjonert grunnleggende og translational forskning ved å tilby en enkel og effektiv måte å Genova redigering. Her viser vi hvor enkelt det er å bruke CRISPR/Cas9 for å forstyrre en intronic lyddemper for transcriptional studier i en kreftcelle linje. Denne teknikken gjør det mulig for studiet av CREs på DNA-nivå og gir muligheter til å undersøke GROBUNN funksjoner i endogene sammenheng i stedet for den tradisjonelle heterologous reporter gener. Nylig har et CRISPR-basert RNA redigeringssystem også blitt identifisert71 og kan tjene som et nytt verktøy for å studere CREs ved å målrette RNA-er fra regulatoriske elementer. Ved å kombinere med kromosom konformasjon fangst teknikker, CRISPR/Cas9 vil sikkert hjelpe dechiffrere den engasjement av CREs i endrede Genova organisasjon og genuttrykk knyttet til ulike helseproblemer.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke Prof. MD Minden (prinsesse Margaret Cancer Centre, University Health Network, Toronto, Canada) for å gi OCI-AML3 cellelinje. Også forfatterne vil gjerne takke Core Utilities av Cancer Genomics og Pathobiology (The Chinese University of Hong Kong) for å gi fasiliteter og bistand til støtte for denne forskningen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 cm gap electroporation cuvette Bio-Rad 1652086
1×TE buffer, pH 7.5 Integrated DNA Technologies 11-01-02-02
10 mM dNTP mix Thermo Fisher Scientific 18427013
3500 Genetic Analyzer Thermo Fisher Scientific 4405673
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer Thermo Fisher Scientific None
7300 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific None
7300 System SDS Software Thermo Fisher Scientific None Version 1.3.1
Bio-Rad Gene Pulser Xcell system Bio-Rad 1652660
ChargeSwitch Direct gDNA Purification Kit, 96-well Thermo Fisher Scientific CS11205
crRNA-1 Integrated DNA Technologies Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA Components of the Cas9/gRNA complex
crRNA-2 Integrated DNA Technologies Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA Components of the Cas9/gRNA complex
Deionized formamide Thermo Fisher Scientific 4311320
Electroporation Enhancer Integrated DNA Technologies 1075915
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10270098
Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q32857
GeneMapper Software 5 Thermo Fisher Scientific 4475073
GeneScan 600 LIZ Size Standard Thermo Fisher Scientific 4408399
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
PBS, 10x Solution, pH 7.4 Affymetrix 75889
Penicillin and streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Thermo Fisher Scientific 11304029
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Recombinant S. pyogenes Cas9 nuclease Integrated DNA Technologies 1081058 Components of the Cas9/gRNA complex
RPMI 1640 medium Thermo Fisher Scientific 31800-022
RPMI 1640 medium without phenol red Thermo Fisher Scientific 11835030
RUNX1a TaqMan gene expression assays Thermo Fisher Scientific 4331182 Hs04186042_m1
RUNX1b/c TaqMan gene expression assays Thermo Fisher Scientific 4331182 Hs00231079_m1
RUNX1c TaqMan gene expression assays Thermo Fisher Scientific 4331182 Hs01021966_m1
SuperScript III First-Strand Synthesis System Thermo Fisher Scientific 18080051
TaqMan Universal PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4304437
tracrRNA Integrated DNA Technologies 1072533 Components of the Cas9/gRNA complex
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596018
Unlabeled PCR reverse primer Thermo Fisher Scientific None

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maston, G. A., Evans, S. K., Green, M. R. Transcriptional regulatory elements in the human genome. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 29-59 (2006).
  2. Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nature Reviews Genetics. 15 (4), 272-286 (2014).
  3. Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Research. 16 (1), 55-65 (2006).
  4. Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends in Genetics. 19 (11), 640-648 (2003).
  5. West, A. G., Gaszner, M., Felsenfeld, G. Insulators: many functions, many mechanisms. Genes & Development. 16 (3), 271-288 (2002).
  6. Riethoven, J. J. Regulatory regions in DNA: promoters, enhancers, silencers, and insulators. Methods in Molecular Biology. 674, 33-42 (2010).
  7. Thurman, R. E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
  8. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  9. Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  10. Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  11. Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
  12. Bernstein, B. E., et al. The NIH roadmap epigenomics mapping consortium. Nature Biotechnology. 28 (10), 1045-1048 (2010).
  13. Zhou, S., Treloar, A. E., Lupien, M. Emergence of the Noncoding Cancer Genome: A Target of Genetic and Epigenetic Alterations. Cancer Discovery. 6 (11), 1215-1229 (2016).
  14. Khurana, E., et al. Role of non-coding sequence variants in cancer. Nature Reviews Genetics. 17 (2), 93-108 (2016).
  15. Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. Enhancer malfunction in cancer. Molecular Cell. 53 (6), 859-866 (2014).
  16. Willis, T. G., Dyer, M. J. The role of immunoglobulin translocations in the pathogenesis of B-cell malignancies. Blood. 96 (3), 808-822 (2000).
  17. Gröschel, S., et al. A single oncogenic enhancer rearrangement causes concomitant EVI1 and GATA2 deregulation in leukemia. Cell. 157 (2), 369-381 (2014).
  18. Cheng, C. K., et al. RUNX1 upregulation via disruption of long-range transcriptional control by a novel t(5;21)(q13;q22) translocation in acute myeloid leukemia. Molecular Cancer. 17 (1), 133 (2018).
  19. Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
  20. Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual Review of Genetics. 45, 273-297 (2011).
  21. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  22. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  23. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  24. Cho, S. W., Lee, J., Carroll, D., Kim, J. S., Lee, J. Heritable gene knockout in Caenorhabditis elegans by direct injection of Cas9-sgRNA ribonucleoproteins. Genetics. 195 (3), 1177-1180 (2013).
  25. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  26. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, 04766 (2014).
  27. Quentmeier, H., et al. Cell line OCI/AML3 bears exon-12 NPM gene mutation-A and cytoplasmic expression of nucleophosmin. Leukemia. 19 (10), 1760-1767 (2005).
  28. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
  29. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).
  30. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  31. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  32. Ramlee, M. K., Wang, J., Cheung, A. M., Li, S. Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format. Journal of Visualized Experiments. (122), e55586 (2017).
  33. Canver, M. C., et al. Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 289 (31), 21312-21324 (2014).
  34. Sood, R., Kamikubo, Y., Liu, P. Role of RUNX1 in hematological malignancies. Blood. 129 (15), 2070-2082 (2017).
  35. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  36. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  37. Wright, J. B., Sanjana, N. E. CRISPR Screens to Discover Functional Noncoding Elements. Trends in Genetics. 32 (9), 526-529 (2016).
  38. Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).
  39. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  40. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
  41. Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
  42. Chen, C., Fenk, L. A., de Bono, M. Efficient genome editing in Caenorhabditis elegans by CRISPR-targeted homologous recombination. Nucleic Acids Research. 41 (20), 193 (2013).
  43. Jacobs, T. B., LaFayette, P. R., Schmitz, R. J., Parrott, W. A. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9. BMC Biotechnology. 15, 16 (2015).
  44. Svitashev, S., et al. Targeted Mutagenesis, Precise Gene Editing, and Site-Specific Gene Insertion in Maize Using Cas9 and Guide RNA. Plant Physiology. 169 (2), 931-945 (2015).
  45. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  46. Ye, L., et al. Genome editing using CRISPR-Cas9 to create the HPFH genotype in HSPCs: An approach for treating sickle cell disease and β-thalassemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10661-10665 (2016).
  47. Gabriel, R. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nature Biotechnology. 29 (9), 816-823 (2011).
  48. Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins. Nature Methods. 9 (8), 805-807 (2012).
  49. Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
  50. Wang, M., et al. Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (11), 2868-2873 (2016).
  51. Gundry, M. C., et al. Highly Efficient Genome Editing of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9. Cell Reports. 17 (5), 1453-1461 (2016).
  52. Mout, R., et al. Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing. ACS Nano. 11 (3), 2452-2458 (2017).
  53. Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).
  54. D'Astolfo, D. S., et al. Efficient intracellular delivery of native proteins. Cell. 161 (3), 674-690 (2015).
  55. Yen, J., et al. TRIAMF: A New Method for Delivery of Cas9 Ribonucleoprotein Complex to Human Hematopoietic Stem Cells. Scientific Reports. 8 (1), 16304 (2018).
  56. Sung, Y. H., et al. Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).
  57. Martin, A., et al. CRISPR/Cas9 mutagenesis reveals versatile roles of Hox genes in crustacean limb specification and evolution. Current Biology. 26 (1), 14-26 (2016).
  58. Menoret, S., et al. Homology-directed repair in rodent zygotes using Cas9 and TALEN engineered proteins. Scientific Reports. 5, 14410 (2015).
  59. Woo, J. W., et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).
  60. Malnoy, M., et al. DNA-free genetically edited grapevine and apple protoplast using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins. Frontiers in Plant Science. 7, 1904 (2016).
  61. Liang, Z., et al. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 8, 14261 (2017).
  62. Svitashev, S., Schwartz, C., Lenderts, B., Young, J. K., Mark Cigan, A. Genome editing in maize directed by CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 7, 13274 (2016).
  63. Shin, S. E., et al. CRISPR/Cas9-induced knockout and knock-in mutations in Chlamydomonas reinhardtii. Scientific Reports. 6, 27810 (2016).
  64. 1000 Genomes Project Consortium et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
  65. Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. The New England Journal of Medicine. 369 (25), 2379-2390 (2013).
  66. Döhner, H., et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations fro an international expert panel. Blood. 129 (4), 424-447 (2017).
  67. Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
  68. Aguirre, A. J., et al. Genomic Copy Number Dictates a Gene-Independent Cell Response to CRISPR/Cas9 Targeting. Cancer Discovery. 6 (8), 914-929 (2016).
  69. Munoz, D. M., et al. CRISPR Screens Provide a Comprehensive Assessment of Cancer Vulnerabilities but Generate False-Positive Hits for Highly Amplified Genomic Regions. Cancer Discovery. 6 (8), 900-913 (2016).
  70. Gonçalves, E., et al. Structural rearrangements generate cell-specific, gene-independent CRISPR-Cas9 loss of fitness effects. Genome Biology. 20 (1), 27 (2019).
  71. Abudayyeh, O. O., et al. RNA targeting with CRISPR-Cas13. Nature. 550 (7675), 280-284 (2017).

Tags

Genetikk CRISPR/CAS9 ribonucleoprotein electroporation CIS-regulatoriske element lyddemper Transcriptional kontroll leukemi
Gransking av Transcriptional rolle en <em>RUNX1</em> Intronic lyddemper av CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein i akutt myelogen leukemi celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, C. K., Wong, T. H. Y., Yung,… More

Cheng, C. K., Wong, T. H. Y., Yung, Y. L., Chan, N. C. N., Ng, M. H. L. Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (151), e60130, doi:10.3791/60130 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter