Summary
Die direkte Lieferung von vormontierten Cas9/Guide-RNA-Ribonukleoprotein-Komplexen ist ein schnelles und effizientes Mittel zur Genombearbeitung in hämatopoetischen Zellen. Hier nutzen wir diesen Ansatz, um einen RUNX1 intronic Schalldämpfer zu löschen und die Transkriptionsreaktionen in OCI-AML3-Leukämischen Zellen zu untersuchen.
Abstract
Der Großteil des menschlichen Genoms (98 %) besteht aus nicht-kodierenden Sequenzen. Cis-Regulierungselemente (CREs) sind nicht kodierende DNA-Sequenzen, die Bindungsstellen für Transkriptionsregulatoren enthalten, um die Genexpression zu modulieren. Veränderungen von CREs sind in verschiedene Krankheiten verwickelt, einschließlich Krebs. Während Promotoren und Enhancer die primären CREs für die Untersuchung der Genregulation waren, ist sehr wenig über die Rolle des Schalldämpfers bekannt, das eine andere Art von CRE ist, die Genrepression vermittelt. Ursprünglich als adaptives Immunitätssystem in Prokaryoten identifiziert, wurde CRISPR/Cas9 als leistungsfähiges Werkzeug für die eukaryotische Genombearbeitung ausgenutzt. Hier stellen wir den Einsatz dieser Technik vor, um einen intronnischen Schalldämpfer im menschlichen RUNX1-Gen zu löschen und die Auswirkungen auf die Genexpression in OCI-AML3-Leukämischen zu untersuchen. Unser Ansatz beruht auf der elektroporationsvermittelten Lieferung von zwei vormontierten Cas9/Guide RNA (gRNA) Ribonucleoprotein (RNP)-Komplexen, um zwei Doppelstrangbrüche (DSBs) zu erzeugen, die den Schalldämpfer flankieren. Löschungen können leicht durch Fragmentanalyse überprüft werden. Expressionsanalysen verschiedener mRNAs, die von alternativen Promotoren transkribiert wurden, helfen dabei, projektträgerabhängige Effekte zu bewerten. Diese Strategie kann verwendet werden, um andere CREs zu untersuchen und eignet sich besonders für hämatopoetische Zellen, die oft schwer mit Plasmid-basierten Methoden zu transfekt sind. Der Einsatz einer plasmid- und virenfreien Strategie ermöglicht eine einfache und schnelle Beurteilung von Genregulierungsfunktionen.
Introduction
Cis-Regulierungselemente (CREs) sind nicht kodierende DNA-Sequenzen, die Bindungsstellen für Transkriptionsregulatoren zur Kontrolle der Genexpression1,2enthalten. Diese Elemente sind in der Regel 100 bis 1.000 Basispaare (bp) lang. Promoter und Enhancer sind die beiden am stärksten charakterisierten Arten von CREs. Die Veranstalter befinden sich in unmittelbarer Nähe zu den Transkriptionsstartorten und bilden die Basiseinheit der Transkription. Viele Gene haben mehr als einen Promotor und ihre alternative Verwendung trägt zur Transkriptom-Vielfalt und Gewebespezifität3,4bei. Auf der anderen Seite aktivieren Enhancer die Transkription und können sich stromaufwärts, flussabwärts oder innerhalb von Introns der Zielgene befinden. Enhancer können aus der Ferne (über eine Megabase) und unabhängig von der Ausrichtung1,2handeln. CREs umfassen auch Schalldämpfer und Isolatoren5,6. Erstere wirkt gegensätzlich, um die Genexpression durch Bindung an Transkriptionsrepressoren zu hemmen, während letztere das Genom in diskrete topologisch-domänen unterteilt, um Gene von anderen CREs aus benachbarten Domänen zu isolieren. Diese Elemente wirken durch kurz- und/oder langstreckenlange Chromatin-Wechselwirkungen miteinander und sind in regulatorischen Hubs organisiert, um die richtige raumzeitliche Genexpression zu lenken. Jüngste Fortschritte in den Sequenzierungstechniken mit hohem Durchsatz haben die Identifizierung und funktionelle Anmerkung vieler CREs beschleunigt, die unser Verständnis der Transkriptionsnetzwerke, die linienspezifische Gene diktieren, erheblich erleichtert haben. Expression in verschiedenen Zell- und Gewebetypen7,8,9,10,11,12.
Angesichts der grundlegenden Rolle von CREs bei der Regulierung der Transkription können ihre Veränderungen zu einer abnormen Genexpression führen. Es hat sich gezeigt, dass CREs häufig durch genetische und epigenetische Veränderungen bei verschiedenen Arten von menschlichen Krebsarten gestört werden, wodurch ein Beitrag zur Tumorinitiierung, Progression und Aggressivität13,14beiträgt. Darüber hinaus werden CRE-bindende Faktoren häufig bei verschiedenen Krebsarten mutiert und/oder falsch exprimiert, was die Bedeutung der CRE-Deregulierung in der Onkogenese15weiter unterstreicht. CREs können auch durch strukturelle Aberrationen beeinflusst werden, wie häufige chromosomale Umlagerungen des Immunglobulin-schweren (IgH) Genverstärkers zeigen, die zu einer abnormalen Aktivierung der benachbarten Onkogene bei B-Zell-Lymphomen16führen. Bei akuter myeloischer Leukämie (AML) führt die Neupositionierung eines einzelnen Enhancers durch Chromosom 3q Rearrangements zu einer gleichzeitigen GATA2-Downregulation und EVI1-Aktivierung, die potenziell durch BET-Hemmung von Enhancer-Funktionen ins Visier genommen werden kann. 17. Kürzlich haben wir eine neuartige chromosomale Translokation mit Störung eines INtronnenschalldämpfers RUNX1 charakterisiert, die zur AML-Progression bei einem pädiatrischen Patienten beitragen könnte18. So bietet die Entschlüsselung des nicht-kodierenden Krebsgenoms fruchtbare Wege zur Aufklärung der Krankheitspathogenese, der Biomarker-Entdeckung und therapeutischer Interventionen, die letztlich die Patientenergebnisse verbessern.
Der CRISPR/Cas9-Nuklease-Signalweg, der ursprünglich als adaptives Immunsystem in prokaryotischen Zellen identifiziert wurde, wurde als schnelles und kostengünstiges Mittel zur ortsspezifischen genomischen Bearbeitung in lebenden Zellen und Organismen genutzt19,20 ,21,22. Das CRISPR/Cas9-System umfasst zwei Hauptkomponenten: die gRNA und Streptococcus pyogenes-abgeleitete Cas9-Nuklease. Die gRNA enthält eine spezifische Sequenz namens Protospacer, die die Zielregion erkennt und Cas9 zur Bearbeitung leitet. Die gRNA besteht aus zwei Teilen: CRISPR RNA (crRNA), typischerweise eine 20-Mer-Nukleotid-Sequenz, die die Ziel-DNA ergänzt, und eine transaktivierende crRNA (tracrRNA), die als Bindungsgerüst für die Nuklease dient. Für die Cas9-Spaltung ist ein protospacerbenachbartes Motiv (PAM) (5'-NGG) unmittelbar neben dem Zielort erforderlich und die Spaltungsstelle befindet sich 3 Nukleotide vor dem PAM. CRISPR/Cas9-vermittelte Genbearbeitung wird häufig durch Transfizieren von Zellen durchgeführt. mit einem Plasmid, das Cas9 und die geklonte gRNA23kodiert. Für hämatopoetische Zellen, die oft schwer zu transfekten und langwierige virusgestützte Transduktionsmethoden erfordern, ist dieser Ansatz jedoch eine Herausforderung. Ein alternativer Ansatz ist die direkte zelluläre Lieferung von vormontierten Cas9/gRNA RNP-Komplexen24. Ein gängiges Verfahren für die RNP-Abgabe ist die Elektroporation, die temporäre Poren in der Zellmembran erzeugt und so den Eintritt der RNP-Komplexe in die Zellen25,26ermöglicht. Zu den Vorteilen dieses Ansatzes gehören benutzerfreundliche Bedienung, reduzierte Off-Target-Effekte und Stabilität der RNP-Komplexe. Hier beschreiben wir ein Protokoll der Verwendung der RNP-Bereitstellungsmethode zur Untersuchung der Transkriptionsrolle eines RUNX1 intronic Schalldämpfers in der OCI-AML3 Leukämie-Zelllinie18, die aus dem peripheren Blut eines AML-Patienten hergestellt wurde. diagnostiziert mit dem französisch-amerikanisch-britischen M4 Subtyp27. Das Protokoll umfasst die Konstruktion von crRNA, die Vorbereitung von RNP-Komplexen, Elektroporation sowie Screening und anschließende Charakterisierung der gewünschten Klone.
Protocol
1. Design von crRNA
- Entwerfen Sie zwei crRNAs, eine 5' und die andere 3' des Ziel-CRE mit einem webbasierten CRISPR-Design-Tool28,29,30,31. Stellen Sie sicher, dass sich ein PAM von NGG unmittelbar unterhalb der Zielsequenz für die Cas9-Erkennung befindet. Das Design der beiden crRNAs (crRNA-1 und crRNA-2) zum Löschen des RUNX1 Schalldämpfers18 ist in Abbildung 1dargestellt.
HINWEIS: Eine crRNA enthält in der Regel einen 20-Mer-Protospacer, der die Zielsequenz ergänzt. - Überprüfen Sie das Vorhandensein einzelner Nukleotidpolymorphismen (SNPs)/Indels im Ziel und angrenzenden PAM-Sequenzen, indem Sie die genomischen Positionen der Sequenzen in das Suchfeld eines Online-Genombrowsers (z. B. NCBI 1000 Genomes oder UCSC Genome Browser) eingeben.
HINWEIS: Gemeinsame SNPs/Indels haben eine geringfügige Allelhäufigkeit von mindestens 1% in der Gesamtbevölkerung. - Reichen Sie die ausgewählten crRNA-Sequenzen zur Synthese bei einem kommerziellen Anbieter ein. Kaufen Sie auch die tracrRNA für die gRNA-Duplexbildung.
2. Design von Deletion Screening Primern
- Entwerfen Sie ein Paar Primer, die den beabsichtigten Löschbereich flankieren. Stellen Sie sicher, dass die Primer mindestens 50 bp von den Cas9-Spaltungsstellen entfernt sind, sodass die PCR-Verstärkung minimal von Indels beeinflusst wird, die an den Spaltstellen gebildet werden.
- Stellen Sie sicher, dass das Amplicon kleiner als 1.200 bp ist (vorzugsweise kleiner als 600 bp für eine bessere Größenauflösung). Kennzeichnen Sie auch einen der Primer mit einem Fluoreszenzfarbstoff (z. B. 6-Carboxyfluorescein (6-FAM)) am 5'-Ende für die Detektion. Die Grundierungen, die zum Screening des RUNX1 Schalldämpfers18 verwendet werden, sind in Abbildung 1dargestellt.
3. Herstellung von Cas9/gRNA RNP-Komplexen
- Setzen Sie die crRNAs und tracrRNA im 1x TE Puffer (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 7,5) auf eine Endkonzentration von 200 m aus.
- Mischen Sie für jede crRNA 2,2 l mit 200 'M crRNA, 2,2 'L von 200 'M tracrRNA und 5,6 'L von 1x TE-Puffer (insgesamt 10 'L) in einem 0,2 ml-Rohr, um eine endgültige Duplexkonzentration von 44 m zu erhalten.
- Bei 95 °C für 5 min in einem Thermocycler inkubieren. Lassen Sie die Rohre für die gRNA-Komplexbildung auf Raumtemperatur abkühlen.
- Verdünnen Sie 10,4 l von 62 m rekombinantem Cas9-Nuklease mit 7,6 l 1x phosphatgepufferter Saline (PBS), um eine endgültige Nukleasekonzentration von 36 m zu erhalten.
HINWEIS: Diese Menge reicht für die Herstellung von zwei Cas9/gRNA-Komplexen aus. - Mischen Sie gleiche Volumina (8,5 l) der verdünnten Nuklease mit jedem der gRNA-Duplexe aus Schritt 3.3.
- Inkubieren Bei Raumtemperatur für 20 min, um RNP komplexe Bildung zu ermöglichen. Halten Sie die Mischungen auf Eis bis zur Elektroporation.
4. Elektroporation der RNP-Komplexe in OCI-AML3-Zellen
- Kultur OCI-AML3-Zellen in RPMI 1640 Medium ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum (FBS), 1x GlutaMAX, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin (nachfolgend als komplettes RPMI 1640 medium bezeichnet) bei 37 °C mit 5 % CO2.
- Zählen Sie Zellen mit Trypanblaufärbung. Stellen Sie sicher, dass die Zelllebensfähigkeit zum Zeitpunkt der Elektroporation über 90 % beträgt.
- Zentrifuge 2,5 x 106 Zellen in einem 1,5 ml Rohr bei 500 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen mit 1 ml 1x PBS. Drehen Sie die Zellen erneut herunter und entfernen Sie alle Restüberstande.
- Setzen Sie die Zellen in 163 l RPMI 1640 Medium ohne Phenolrot aus. Fügen Sie den Zellen 16,7 L jedes RNP-Komplexes (ab Schritt 3,6) und 3,6 l mit 100 M Elektroporation Enhancer zu (Gesamtvolumen = 200 L) hinzu. Mischen Sie sanft durch Pipettieren.
HINWEIS: Der Electroporation Enhancer ist eine Träger-DNA zur Verbesserung der Bearbeitungseffizienz. - Übertragen Sie die Mischung auf eine 0,2 cm-Gap-Elektroporationsküvette ohne Blasen. Elektroporation mit einem Elektroporationssystem durchführen (Modus: exponentiell; Spannung =: 150 V; Kapazität = 700 F; Widerstand = 50 x).
- Übertragen Sie die Zellen in einen T-25-Gewebekulturkolben, der 6 ml vollständiges RPMI 1640Medium enthält, und inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO2 .
5. Screening und Auswahl von Zellklonen mit Biallelic Deletions
- Verdünnen Sie die Zellen auf 5 x 103/ml in vollständiger RPMI 1640 medium einen Tag nach der Elektroporation. Fügen Sie 100 l der verdünnten Zellsuspension in jeden Brunnen von 96-Well-Gewebekulturplatten hinzu und lassen Sie die Zellen für 7-14 Tage wachsen.
- Extrahieren Sie genomische DNA aus den Zellen mit einem Hochdurchsatz-Reinigungssystem.
- Fügen Sie jedem Bohrgut einer 96-Well-Extraktionsplatte 100 l Plattenbindung und Lysepuffer hinzu. Fügen Sie dem Puffer 5 x 104 Zellen hinzu, die in 10 l mit 1x PBS resuspendiert werden, und mischen Sie sie durch Pipettieren.
- Inkubieren Bei Raumtemperatur für 30 min, um die Bindung der genomischen DNA an die Brunnen zu ermöglichen.
- Die Lösung aus den Brunnen aussaugen, ohne die Brunnenoberflächen zu kratzen. Waschen Sie die Brunnen mit 120 L Waschpuffer.
- Die Brunnen, die die gebundene DNA enthalten, trocknen an der Luft.
- Bereiten Sie 20 l PCR-Mischung (2 l mit 10x High Fidelity-Puffer, 0,8 l von 50 mM MgSO4, 0,4 l von 10 mM dNTPs, 0,4 l von 10 -M FAM-markierten Vorwärtsprimer (Schritt 2,2), 0,4 l von 10 mM unbeschrifteten Reverseprimer und 0,4 U Taq DNA-Polymerase für jede Probe vor.
HINWEIS: Bereiten Sie einen Master-Mix vor, um die Zugabe standardisierter Mengen an Reagenzien in jeder Probe sicherzustellen. - Fügen Sie die PCR-Mischung in jede Bohrung der Extraktionsplatte und führen Sie die Reaktionen in einem Thermocycler (Bedingungen: anfängliche 94 °C für 2 min, gefolgt von 35 Zyklen von 94 °C für 15 s, 56 °C für 30 s und 68 °C für 1 min).
- Schätzen Sie die Menge der Produkte, indem Sie ihre Konzentrationen in einer ausgewählten Anzahl von Proben mit einem Fluorometer messen. Alle Proben mit nukleasefrei H2O bis 0,5 ng/l verdünnen.
- Mischen Sie 1 l der verdünnten PCR-Produkte mit 8,5 l entionisiertem Formamid und 0,5 l fluoreszierenden Farbstoff-markierten Größenstandard in einer 96-Well-Platte, die mit dem genetischen Analysator kompatibel ist.
HINWEIS: Bereiten Sie einen Master-Mix mit entionisiertem Formamid und dem Größenstandard vor. - Bedecken Sie die Platte mit einer Plattensepta und denaturieren Sie die Proben bei 95 °C für 3 min in einem Thermocycler. Schließen Sie den Deckel der Maschine nicht.
- Führen Sie die Kapillargelelektrophorese durch, um die beschrifteten PCR-Produkte wie zuvor beschrieben zu trennen32.
- Öffnen Sie nach der Elektrophorese die Analysesoftware, um die Ergebnisse zu analysieren.
- Klicken Sie auf Neues Projekt, und wählen Sie Microsatelliteaus. Klicken Sie dann auf OK.
- Klicken Sie auf Samples zu Project hinzufügen, und wählen Sie die Ergebnisdateien aus (enthalten die Erweiterung .fsa). Klicken Sie dann auf Zur Liste hinzufügen, um die Dateien zu importieren.
- Wählen Sie in der Tabelle mit den ausgewählten Ergebnisdateien die Option Mikrosatellitenstandard in der Spalte Analysemethode aus. Wählen Sie außerdem den Größenstandard aus, der in der Spalte Größenstandard verwendet wird. Klicken Sie dann auf das Symbol Analysieren, geben Sie den Experimentnamen ein und speichern Sie das Experiment.
- Klicken Sie auf Plots anzeigen, um die Ergebnisse anzuzeigen, und wählen Sie Fragmentanalyse in der Ploteinstellung aus.
- Wählen Sie die entsprechenden farbigen Kanäle für die Analyse aus. Überprüfen Sie das orangefarbene Symbol, um die beschrifteten Fragmente im Größenstandard anzuzeigen, um die Qualität des Aufrufs der Größe zu bewerten.
- Überprüfen Sie das blaue Symbol, um die beschrifteten PCR-Produkte anzuzeigen. Identifizieren Sie die Spitzen, die den Wildtyp- und Mutanten entsprechen (d. h. mit den erwarteten Streichungen). Schätzen Sie den Mutantengehalt in jeder Probe, indem Sie die Fläche unter dem mutierten Gipfel durch die Summe der Fläche unter den Wildtyp- und Mutantenspitzen dividieren.
- Wählen Sie mehrere Zellpools mit hohen Mengen der erwarteten Löschungen für weitere serielle Verdünnungen aus.
- Wiederholen Sie die Schritte zur DNA-Extraktion, fluoreszierenden PCR und Kapillarelektrophorese. Wählen Sie Zellklone mit Mutantenspiegeln >95 % aus, die biallelic-Deletions für nachfolgende Analysen darstellen.
- Überprüfen Sie die Identität der Löschungen in den ausgewählten Klonen durch Sanger-Sequenzierung.
6. Funktionelle Analysen der Schalldämpferlöschung durch quantitative RT-PCR-Analyse in Echtzeit
- Extrahieren Sie die gesamte RNA aus den ausgewählten Klonen und führen Sie eine komplementäre DNA-Synthese (cDNA) durch.
- Mischen Sie 1 g RNA mit 1 l von 50 'M Oligo(dT)20 Primer und 1 'L von 10 mM dNTP-Mischung in einem Gesamtvolumen von 10 l. Inkubieren bei 65 °C für 5 min und dann auf Eis für mindestens 1 min.
- Fügen Sie 10 l cDNA-Synthesemix hinzu, der 2 l 10x RT-Puffer, 4 l von 25 mM MgCl2, 2 l 0,1 M DTT, 1 l RNase-Inhibitor (40 U/L) und 1 l Reverse-Transkriptase (200 U/L) enthält. Bei 50 °C für 50 min und dann 85 °C für 5 min in einem Thermocycler inkubieren.
HINWEIS: Bereiten Sie einen Mastermix für die umgekehrte Transkription vor. - Kühlen Sie die Proben auf Eis. Fügen Sie 1 L RNase H hinzu und brüten Bei 37 °C für 20 min. Lagern Sie die cDNA bei -20 °C.
- Designprimer und TaqMan-Sonden, die speziell einzelne Transkriptvarianten erkennen, die von alternativen Promotern generiert werden.
HINWEIS: Vorgefertigte Transkript-spezifische Primer/Sonden-Sets sind im Handel erhältlich. - Klonen Sie DNA-Fragmente, die die spezifischen Transkriptsequenzen in die Plasmid-DNA enthalten. Bereiten Sie eine 10-fache Verdünnungsreihe (106 bis 10 Kopien) der rekombinanten Plasmide als Standardkurven für die Transkriptquantifizierung vor.
- Bereiten Sie für jede Probe 20 l PCR-Mix (0,5 l DNA-Vorlage, 1 L 20x vorgefertigte TaqMan-Sonde/Primer-Assay und 10 L 2x TaqMan PCR-Master-Mix) für jede Probe vor (sowohl cDNA- als auch Plasmid-Standards). Messen Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung.
HINWEIS: Bereiten Sie einen Master-Mix für die Echtzeit-PCR vor. - Führen Sie die Reaktionen in einer Echtzeit-PCR-Maschine (Bedingungen: anfängliche 50 °C für 2 min und 95 °C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen von 94 °C für 15 s und 60 °C für 1 min).
- Klicken Sie nach der Verstärkung auf das Symbol Analysieren in der Software, um die Daten zu analysieren. Überprüfen Sie die Steigung und den Korrelationskoeffizienten der Standardkurven, um die Effizienz und Linearität der Reaktionen zu bewerten. Stellen Sie sicher, dass die Steigungen zwischen -3,1 und -3,6 liegen und die Korrelationskoeffizienten größer als 0,99 sind.
- Normalisieren Sie die Kopiernummer der Zieltranskripte in jeder Probe mit einem Housekeeping-Gen (z. B. GAPDH).
Representative Results
Ziel dieses Experiments ist es, einen intronischen Schalldämpfer im RUNX1-Gen zu löschen und die Auswirkungen auf die RUNX1-Transkription in OCI-AML3-Zellen zu untersuchen. Der Schalldämpfer wurde durch einen kombinatorischen molekularen Ansatz identifiziert und enthielt ein 209 bp Kernelement18. Um eine genauere Auswertung dieses Kernelements bei der Steuerung der RUNX1-Expression zu ermöglichen, wurden die crRNAs (crRNA-1 und crRNA-2) so konzipiert, dass sie eng an diese Region ausgerichtet sind18 (Abbildung 1). Die vorhergesagten Cas9-Spaltungsstellen, die von crRNA-1 und crRNA-2 mitgebracht wurden, waren 29 bp bzw. 35 bp aus dem Kernelement (Abbildung 1). Es sollte beachtet werden, dass die PAM-Sites der beiden crRNAs zwar auf entgegengesetzten Strängen liegen, DSBs jedoch unabhängig vom Standort der PAM-Sequenz auftreten. Daher wird erwartet, dass die gleichzeitige Einführung von zwei Cas9/gRNA RNP-Komplexen, die von crRNA-1 und crRNA-2 geleitet werden, das Schalldämpferelement aus dem RUNX1-Lokus ausnimmt.
Um die gewünschten Deletionen in einer großen Anzahl von Proben zu überprüfen, wurde ein 96-Well-Format der genomischen DNA-Extraktionskit für die Hochdurchsatzreinigung verwendet. Auch dna, die an den Brunnen der Extraktionsplatten gebunden ist, kann einer direkten Verstärkung unterzogen werden, wodurch Fehler oder Verunreinigungen durch wiederholte Probenübertragung minimiert werden. Die Primer, die zum Screening der Deletionen18 verwendet werden, sind in Abbildung 1dargestellt. Die erwartete Größe des Wildtyp-PCR-Produkts beträgt etwa 500 bp. Da die beabsichtigte Löschung 273 bp umfasst, wird erwartet, dass das mutierte Produkt etwa 230 bp beträgt. Dieser Größenbereich ermöglicht eine einfache und schnelle Fragmentanalyse durch Kapillargelelektrophorese. Insgesamt wurden 160 anfängliche Zellpools gescreent und 14 wurden mit den erwarteten Deletionen mit mutierten Werten von mindestens 70% ausgestattet. Fünf Pools wurden dann für weitere serielle Verdünnungen ausgewählt, um Klone mit biallelic Deletions zu identifizieren. Repräsentative Elektropherogramme von Zellklonen mit unterschiedlichen Ebenen von mutierten Produkten sind in Abbildung 2Adargestellt. Die Identität der Löschungen wurde durch Sanger-Sequenzierung überprüft (Abbildung 2B). Wie erwartet wurden Indels, die durch nicht-homologe Endverbindungsreparatur von DSBs33 gebildet wurden, an den vorhergesagten Spaltungsstellen in den Löschklonen beobachtet. Diese führten zur Verstärkung von mutierten Produkten unterschiedlicher Größe, die auch durch Kapillarelektrophorese nachgewiesen werden konnten (Abbildung 2A).
Das RUNX1-Gen enthält zwei Promotoren, nämlich das distale P1 und das proximale P2, die durch ein großes Intron getrennt sind, das das Schalldämpferelement34enthält. Drei große mRNA-Transkripte werden von diesen Promotern erstellt: RUNX1c von P1 und RUNX1a und RUNX1b von P234. Die Nukleotidsequenz von RUNX1c und RUNX1b ist identisch, außer dass erstere einen einzigartigen N-Terminus hat, aus dem ein spezifischer TaqMan-Genexpressionstest entworfen werden kann (Abbildung 3A). Zur Messung von RUNX1bwurde ein TaqMan-Test verwendet, der sowohl RUNX1b als auch RUNX1c erkennt (Abbildung 3A). DIE RUNX1b-Ebenen wurden dann durch Subtraktion der Gesamt-RUNX1b/RUNX1c von RUNX1cermittelt. RUNX1a ist eine deutlich kürzere Isoform aufgrund alternativer Spleißen und ein spezifischer TaqMan-Assay ist für diese Variante verfügbar (Abbildung 3A). So kann die Aktivität der P1- und P2-Promoter individuell bestimmt werden. Die quantitative RT-PCR in Echtzeit zeigte, dass die Streichung des Schalldämpferelements die Expressionsniveaus sowohl von P1- als auch von P2 abgeleiteten Transkripten signifikant erhöht hat (Abbildung 3B).
Abbildung 1 : Strategie zum Löschen des INtronic-Schalldämpfers RUNX1. Der Schalldämpfer (roter Kasten) befindet sich im ersten Intron des RUNX1-Gens, das die beiden Promotoren P1 und P2 trennt (hg19 Koordinaten werden angezeigt). Zwei crRNAs (crRNA-1 und crRNA-2) wurden entwickelt, um DSBs einzuführen, die das Schalldämpferelement flankieren. Die vorhergesagten Cas9-Spaltungsstellen werden durch vertikale rote Linien angezeigt, und die PAM-Standorte (NGG) sind violett. Die beiden Primer, die zum Screening der Löschungen verwendet werden, werden durch offene Pfeile dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Identifizierung der Löschklone. (A) Repräsentative Elektropherogramme von Zellklonen mit unterschiedlichen Konzentrationen mutierter PCR-Produkte (MUTanten PCR-Produkte) (MUTanten PCR-Produkten). Die Größe der mutierten Produkte variiert zwischen den Klonen aufgrund von Indels, die an den Spaltstellen gebildet werden. WT = Wildtyp. (B) Überprüfung der Löschungen von repräsentativen Klonen durch Sanger-Sequenzierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Funktionelle Folgen der Schalldämpferlöschung. (A) Die drei hauptwichtigsten RUNX1-Isoformen (RUNX1a, RUNX1b und RUNX1c) werden angezeigt. Diese Varianten enthalten die gleiche Runt DNA-Bindungsdomäne, aber unterschiedliche N- (orange) oder C-terminus (blau). Die Position der TaqMan-Sonden-/Primerpaare wird durch rote Linien angezeigt. Zahlen geben die Aminosäurerückstände an. (B) Quantitative RT-PCR-Echtzeitanalyse von RUNX1 P1- und P2-abgeleiteten Transkripten in Zellpopulationen mit (DEL) oder ohne (WT) die biallelic Deletions18. GAPDH wurde zur Normalisierung verwendet. * und ** geben P < 0,05 und P < 0,01 bzw. durch den Mann-Whitney-Test an. Diese Zahl wurde von Cheng et al.18geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Das CRISPR/Cas9-System wurde in einer Vielzahl von Genom-Editing-Anwendungen wie Gen Knockout und Knock-in-Studien35,36, Transkriptionsverordnung37,38, Gentechnik verschiedener Modellorganismen39,40,41,42,43,44 und Gentherapie45,46. Hier zeigen wir den Einsatz von CRISPR/Cas9, um die funktionellen Folgen des Löschens eines intronischen Schalldämpfers am RUNX1-Gen zu untersuchen. Die Lieferung der CRISPR-Komponenten in unserem Ansatz stützte sich nicht auf Plasmid-DNA, Klonen von gRNA oder Virus, sondern auf Elektroporation von vormontierten Cas9/gRNA RNP-Komplexen. Es hat sich gezeigt, dass die Verwendung von exogener DNA mit einer unerwünschten Integration fremder Vektorsequenzen in das Wirtsgenom, erhöhter Toxizität und geringer EffizienzinVerbindung gebracht werden kann, während Virustransduktionsmethoden sind zeitaufwändig. Darüber hinaus kann eine verlängerte Expression von Cas9 aus Plasmid-DNA Off-Target-Effekte verstärken48. Im Gegenteil, der direkte RNP-basierte Bereitstellungsansatz wurde als bevorzugte Methode etabliert, da er schnell und unkompliziert mit verbesserter Bearbeitungseffizienz, Selektivität und Zelllebensfähigkeit ist. In der Tat, eine Vielzahl von Methoden wie Lipofection49,50, Elektroporation25,51, Nanopartikel52, zelldurchdringende Peptide53, iTOP54 und TRIAMF 55 wurden für die effiziente CRISPR/Cas9-Lieferung in verschiedene Zelltypen sowie Tier- und Pflanzenarten24,25,26,56,57 entwickelt , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63. Da nicht-kodierende DNA-Sequenzen Hotspots genetischer Variationensind 64, ist die Überprüfung des Vorhandenseins von gängigen SNPs/Indels im Ziel und benachbarten PAM-Sequenzen besonders relevant bei der Entwicklung von gRNA, die auf regulatorische Elemente.
Ein Engpass bei der CRISPR/Cas9-Genombearbeitung umfasst das Screening der gewünschten mutierten Klone in einer großen Anzahl von Proben. Wir verwendeten fluoreszierende PCR gekoppelt mit Kapillargelelektrophorese für das Screening, da die Zielmutation eine kleine genomische Deletion von etwa 300 bp ist. Diese Methode ist schnell und sensibel und kann in einer High-Throughput-Manier durchgeführt werden. Außerdem ermöglicht diese Methode eine genaue Schätzung der Mutantenpegel und Löschgrößen gleichzeitig. Darüber hinaus wird die Multiplexanalyse von PCR-Fragmenten unterstützt, die mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen gekennzeichnet sind. Wir haben routinemäßig diese Technik verwendet, um kleine Einfügungen/Deletionen in myeloischen Neoplasmen65,66zu genotypieren. Nach unserer Erfahrung können wir fragmentierte Größen, die sich durch 4 bp unterscheiden, mit hoher Präzision und mutierter Belastung bis zu 3 % konsistent erkennen. Es ist jedoch zu beachten, dass diese Methode eine Fragmentgrößenbeschränkung von 1.200 bp hat und daher nicht zum Screening großer Löschungen geeignet ist. Außerdem können Basissubstitutionen (die zu einer unveränderten Fragmentgröße führen) und potenzielle Off-Target-Ereignisse in anderen genomischen Regionen nicht erkannt werden. Für letztere ist die kostspielige gesamte Genomsequenzierung erforderlich, um globale unerwünschte Veränderungen in den Zielklonen umfassend zu profilieren. Um unseren derzeitigen Ansatz zur Untersuchung großer nicht-kodierender regulatorischer Sequenzen (>1.000 bp) zu übernehmen, können detaillierte Lösch- und Mutageneseanalysen von vermeintlichen Transkriptionsfaktorbindungsstellen mit In-vitro-Reporter-Genassays durchgeführt werden. um den minimalen Funktionsbereich für die CRISPR/Cas9-Bearbeitung18zu entlinienchen.
Da viele Gene mehr als einen Promotor3,4enthalten, ist es wichtig, sich der Existenz alternativer Promotoren im Zielgen-Lokus bewusst zu sein, da die Manipulation regulatorischer Elemente die Promotoren differenziell beeinflussen kann. Daher müssen Transkriptvarianten, die von verschiedenen Promotoren abgeleitet wurden, einzeln gemessen werden, um alle projektträgerspezifischen Reaktionen zu bewerten. Die Verwendung von TaqMan-Sonden-basierten Assays wird aufgrund einer besseren Spezifität und Reproduzierbarkeit gegenüber SYBR Green bevorzugt. Wenn das fortschrittlichere digitale PCR-System verfügbar ist, kann die Transkriptquantifizierung präziser durchgeführt werden, ohne dass eine Standard-Kurvenkonstruktion erforderlich ist.
Ein wichtiger Aspekt bei der Durchführung von CRISPR/Cas9-Experimenten in Krebszelllinien ist die Ploidy- und Ziel-Genkopienummer in den Zellen, die verwendet werden, da praktisch alle Krebszelllinien genetische Veränderungen aufweisen, einschließlich struktureller und Kopiernummernvariationen. In unserem Fall hat OCI-AML3 einen hyperdiploiden Karyotyp mit 45 bis 50 Chromosomen. Auch wurde festgestellt, dass die Zelllinie eine normale RUNX1-Kopiernummer trägt, wie aus der Krebszell-Linien-Enzyklopädie67 und fluoreszenzin situ-Hybridisierungsstudien18aufgedeckt. Wenn Sie auf ein Gen mit Kopiernummernverstärkung abzielen, muss die Bereitstellungsmethode möglicherweise optimiert werden, um ausreichende Ebenen der CRISPR-Komponenten für die Bearbeitung bereitzustellen. Außerdem müssen möglicherweise mehr Klone gescreent werden, um die vollständigen Knockouts zu identifizieren. Wichtig ist, dass die Ausrichtung auf verstärkte genomische Regionen, insbesondere solche, die durch strukturelle Umlagerungen verursacht werden, genunabhängige antiproliferative Reaktionen in Krebszellen auslösen kann, was zu falsch-positiven Ergebnissen in Genzellen führt. Funktionsstudien68,69,70. In diesem Zusammenhang sollten alternative Ansätze wie RNA-Interferenz (RNAi) Knockdown und/oder cDNA-Überexpression verwendet werden, um die CRISPR-Ergebnisse zu überprüfen. Außerdem sollten mehrere Zelllinien verwendet werden, um Fehlinterpretationen von zelllinienspezifischen, aber genunabhängigen CRISPR-Bearbeitungseffekten zu vermeiden.
Das CRISPR/Cas9-System hat die Grundlagen- und Translationsforschung revolutioniert, indem es ein einfaches und effizientes Mittel zur Genombearbeitung bereitstellt. Hier zeigen wir die Leichtigkeit der Verwendung von CRISPR/Cas9, um einen intronischen Schalldämpfer für Transkriptionsstudien in einer Krebszelllinie zu stören. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von CREs auf DNA-Ebene und bietet die Möglichkeit, CRE-Funktionen im endogenen Kontext zu untersuchen, anstatt die traditionellen heterologen Reportergene. Kürzlich wurde auch ein CRISPR-basiertes RNA-Editing-System71 identifiziert und kann als neuartiges Werkzeug zur Untersuchung von CREs dienen, indem es auf RNA abzielt, die aus den regulatorischen Elementen transkribiert wird. Durch die Kombination mit Techniken zur Erfassung der Chromosomenkonformation wird CRISPR/Cas9 sicherlich dazu beitragen, die Beteiligung von CREs an der veränderten Genomorganisation und Genexpression im Zusammenhang mit verschiedenen Gesundheitsproblemen zu entschlüsseln.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Prof. M.D. Minden (Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network, Toronto, Kanada) für die Bereitstellung der OCI-AML3-Zelllinie. Außerdem möchten die Autoren den Core Utilities of Cancer Genomics and Pathobiology (The Chinese University of Hong Kong) für die Bereitstellung der Einrichtungen und unterstützungsmitteldiese Forschung danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 cm gap electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | |
| 1×TE buffer, pH 7.5 | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
| 3500 Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405673 | |
| 6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | Thermo Fisher Scientific | None | |
| 7300 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | None | |
| 7300 System SDS Software | Thermo Fisher Scientific | None | Version 1.3.1 |
| Bio-Rad Gene Pulser Xcell system | Bio-Rad | 1652660 | |
| ChargeSwitch Direct gDNA Purification Kit, 96-well | Thermo Fisher Scientific | CS11205 | |
| crRNA-1 | Integrated DNA Technologies | Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA | Components of the Cas9/gRNA complex |
| crRNA-2 | Integrated DNA Technologies | Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA | Components of the Cas9/gRNA complex |
| Deionized formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270098 | |
| Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32857 | |
| GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| GeneScan 600 LIZ Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| PBS, 10x Solution, pH 7.4 | Affymetrix | 75889 | |
| Penicillin and streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 11304029 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Recombinant S. pyogenes Cas9 nuclease | Integrated DNA Technologies | 1081058 | Components of the Cas9/gRNA complex |
| RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 31800-022 | |
| RPMI 1640 medium without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | |
| RUNX1a TaqMan gene expression assays | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Hs04186042_m1 |
| RUNX1b/c TaqMan gene expression assays | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Hs00231079_m1 |
| RUNX1c TaqMan gene expression assays | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Hs01021966_m1 |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4304437 | |
| tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072533 | Components of the Cas9/gRNA complex |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Unlabeled PCR reverse primer | Thermo Fisher Scientific | None |
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