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Bioengineering

स्क्रीनिंग और एक Phage प्रदर्शन पेप्टाइड लाइब्रेरी का उपयोग कर Fibroblast विकास कारक Receptor2 को लक्षित छोटे पेप्टाइड की पहचान

Published: September 30, 2019 doi: 10.3791/60189
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Institute of Biomedicine & Department of Cell Biology, Jinan University, National Engineering Research Center of Genetic Medicine, Guangdong Provincial Key Laboratory of Bioengineering Medicine
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ, हम छोटे पेप्टाइड्स है कि FGFR2 के लिए बाध्य एक phage प्रदर्शन पेप्टाइड पुस्तकालय का उपयोग स्क्रीनिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. हम आगे इन विट्रो में FGFR2 और सेल प्रसार को दबाने की क्षमता की ओर चयनित पेप्टाइड्स की समानता का विश्लेषण.

Abstract

मानव फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (एफजीएफआर) परिवार में चार सदस्य शामिल हैं, नामत, FGFR1, FGFR2, FGFR3, और FGFR4, जो सेल प्रसार, अस्तित्व, प्रवास और भेदभाव सहित विभिन्न जैविक गतिविधियों में शामिल हैं। उत्परिवर्तन या जीन प्रवर्धन की घटनाओं के कारण, FGFR संकेतन मार्ग में कई विपथन, कैंसर के विभिन्न प्रकार में पहचान की गई है. इसलिए, हाल ही में अनुसंधान FGFRs के चिकित्सीय लक्ष्यीकरण शामिल रणनीतियों के विकास पर ध्यान केंद्रित किया है. पूर्व नैदानिक और नैदानिक विकास के विभिन्न चरणों में वर्तमान FGFR inhibitors या तो टायरोसिन kinases के छोटे अणु inhibitors शामिल हैं या मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, पाइप लाइन में केवल कुछ पेप्टाइड-आधारित अवरोधकों के साथ। यहाँ, हम FGFR2 के विरोधी के रूप में छोटे पेप्टाइड्स स्क्रीन करने के लिए phage प्रदर्शन प्रौद्योगिकी का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. संक्षेप में, phage-प्रदर्शित पेप्टाइड्स के एक पुस्तकालय FGFR2 के साथ लेपित एक थाली में incubated था. बाद में, असीम phage TBST द्वारा धोया गया था (टीबीएस + 0.1% [v/v] ट्वीन-20), और बाध्य phage 0.2 M glycine-HCl बफर (पीएच 2.2) के साथ eluted किया गया था. eluted phage आगे परिलक्षित किया गया था और biopanning के अगले दौर के लिए इनपुट के रूप में इस्तेमाल किया. बायोपैनिंग के तीन दौर के बाद, व्यक्तिगत फेज क्लोन के पेप्टाइड दृश्यों की पहचान डीएनए अनुक्रमण द्वारा की गई थी। अंत में, स्क्रीन पेप्टाइड्स संश्लेषित और आत्मीयता और जैविक गतिविधि के लिए विश्लेषण किया गया.

Introduction

Fibroblast विकास कारक रिसेप्टर्स (FGFRs) सेल प्रसार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, घाव भरने, और विवो1में एंजियोजेनेसिस . FGFR संकेतन के Aberrant सक्रियण ट्यूमरकीएक किस्म में मनाया 2,3,4,5 जीन प्रवर्धन, जीन उत्परिवर्तन, गुणसूत्र विपथन, और अत्यधिक लिगंड स्राव6 शामिल हैं . FGFRs को लक्षित कई inhibitors नैदानिक परीक्षणों में होनहार चिकित्सीय प्रभाव दिखाया गया है और मुख्य रूप से तीन प्रकार में वर्गीकृत कर रहे हैं: (1) छोटे अणु kinase inhibitors, जो FGFR के intracellular डोमेन के लिए बाध्य, (2) विरोधी को लक्षित extracellular खंड, और (3) FGF ligand जाल6| यद्यपि अनेक छोटे अणु काइनेज अवरोधकों का विट्रो और विवो7दोनों में अच्छा चिकित्सीय प्रभाव होता है , फिर भी उनमें से अधिकांश का लक्ष्य विशिष्टता नहीं है और उच्च रक्तचाप8जैसे प्रतिकूल प्रभाव दिखाई देते हैं . अधिकांश विरोधी एक-एक एंटीबॉडी9,10 और पॉलीपेप्टाइड11हैं . पेप्टाइड्स उनकी विशिष्टता और कम साइड इफेक्ट के कारण छोटे अणुओं पर लाभ है. वे कोशिका पारगम्यता को भी बनाए रखते हैं और प्रोटीन औषधियोंकीतुलना में विशिष्ट अंगों में संचित नहीं होते . इसलिए, लक्षित छोटे पेप्टाइड्स दोनों प्रभावी और संभावित चिकित्सीय एजेंट हैं।

फाज प्रदर्शन प्रौद्योगिकी छोटे पेप्टाइडों की पहचान करने के लिए एक आसान लेकिन शक्तिशाली उपकरण है जो किसी दिए गए अणु13,14,15को बाध्य कर सकता है . हमने एक फैज डिस्प्ले पेप्टाइड लाइब्रेरी का उपयोग किया जो एक साधारण M13 फैज पर आधारित है जिसमें 109 से अधिक विभिन्न पेप्टाइड अनुक्रम ों के साथ, जो लक्ष्य अणु के लिए बाध्य करने के लिए पूंछ पर प्रदर्शित होते हैं (सामग्री की तालिकादेखें )16. दिए गए अणु के प्रति phages की उच्च आत्मीयता के कारण, असीम phages धोया जा सकता है, और केवल कसकर बंधे phages वांछित कम पेप्टाइड्स के साथ बनाए रखा है. दिए गए आणविक लक्ष्यों को स्थिर प्रोटीन17,18, कार्बोहाइड्रेट , सुसंस्कृत कोशिकाओं , या यहां तक कि अकार्बनिक पदार्थ19,20से स्थिर किया जा सकता है . एक रोमांचक मामले की सूचना मिली जहां अंग-विशिष्ट पेप्टाइड्स का चयन विवो में फैज डिस्प्ले टेक्नोलॉजी21का उपयोग करके किया गया था। phage प्रदर्शन प्रौद्योगिकी के लाभ उच्च थ्रूपुट, आपरेशन में आसानी, कम लागत और अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला22शामिल हैं.

इस अध्ययन में, हम स्क्रीनिंग छोटे पेप्टाइड्स immobilized प्रोटीन के लिए बाध्यकारी की एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान (FGFR2) एक phage प्रदर्शन पुस्तकालय का उपयोग कर. प्रौद्योगिकी की प्रभावकारिता भी Isothermal Titration कैलोरीमेट्री द्वारा FGFR2 की ओर प्राप्त पेप्टाइड की समानता को मापने के द्वारा जांच की है (आईटीसी), और एक सेल प्रसार परख द्वारा जैविक गतिविधि. विधि छोटे पेप्टाइड्स कि कार्बोहाइड्रेट के लिए बाध्य स्क्रीनिंग के लिए बढ़ाया जा सकता है, सुसंस्कृत कोशिकाओं, या यहां तक कि अकार्बनिक सामग्री.

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Protocol

1. अभिकर्मक तैयारी

  1. LB (lysogeny शोरबा) मध्यम: tryptone के 1 ग्राम भंग, खमीर निकालने के 0.5 ग्राम, और 0.5 ग्राम NaCl के 100 एमएल में एच2ओ Autoclave और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  2. टेट्रासाइक्लिन स्टॉक: 1:1 इथेनॉल में 20 मिलीग्राम/एमएल तैयार करें:एच2ओ स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर, और उपयोग करने से पहले भंवर।
  3. IPTG/X-gal solution: मिक्स 0.5 ग्राम IPTG (isopropyl जेड-डी-डी-1-thiogalactopyranoside) और 0.4 ग्राम X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl जेड-डी-गैलैक्टोसाइड) में 10 एमएल DMF (dimethyl) के रूप में। समाधान अंधेरे में एक वर्ष के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. LB + Tetracycline (Tet) प्लेटें: 1 ग्राम बैक्टो-ट्रिप्टोन, 0.5 ग्राम खमीर निकालने, 0.5 ग्राम NaCl, और 1.5 ग्राम एगर के 100 एमएल में एच2ओ ऑटोक्लेव और ठंडा करने के लिए और 70 डिग्री सेल्सियस। टेट्रासाइक्लिन स्टॉक के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और प्लेटें डालें। अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें स्टोर।
  5. LB + IPTG/X-gal प्लेट्स: 1 ग्राम बैक्टो-ट्रिप्टोन, 0.5 ग्राम खमीर निकालने, 0.5 ग्राम NaCl, और 1.5 ग्राम एगर के 100 एमएल में एच2ओ ऑटोक्लेव और ठंडा करने के लिए और 70 डिग्री सेल्सियस। IPTG/X-gal समाधान के 100 $L जोड़ें और प्लेटें डालना. अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें स्टोर।
  6. Glycine-HCI बफर (0.2 एम): भंग 1.5014 g glycine और 100 मिलीग्राम बीएसए (बोवाइन सीरम एल्बुमिन) के 100 एमएल में एच2O के 100 एमएल में और पीएच को समायोजित करने के लिए 2.2 HCl के साथ समाधान फ़िल्टर एक 0.22 डिग्री मीटर फिल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर का उपयोग कर।
  7. ट्रास-एचसीएल बफर (1 म): एच2ओ के 100 एमएल में ट्राइस (ट्रिस (हाइड्रॉक्सीमेथिल)एमिनोमेथेन) के 12.11 ग्राम को भंग करें और एचसीएल ऑटोक्लेव के साथ 9-1 में पीएच को समायोजित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  8. कोटिंग बफर (0ण्1 ड): भ्2व् के 200 एमएल में 1.68 ह नHको3 को भंग करें तथा पीएचएच को 8ण्6 में नाह के साथ समायोजित करें। 0ण्22$m फ़िल्टर का उपयोग करके समाधान फ़िल्टर करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें.
  9. बफर अवरुद्ध: तैयार 0.1 एम NaHCO3 (पीएच 8.6) के साथ 5 mg/ 0ण्22$m फ़िल्टर का उपयोग करके समाधान फ़िल्टर करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें.
  10. टीबीएस: 150 एमएम नैक्ल के साथ 50 एमएम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 7.5) तैयार करें। ऑटोक्लेव और कमरे के तापमान पर दुकान।
  11. 0.05%, 0.1%, या 0.5% TBST: 0.05%, 0.1%, या 0.5% (v/v) ट्वेन-20 के साथ टीबीएस तैयार करें। एक 0.22 डिग्री मीटर फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर और कमरे के तापमान पर दुकान.
  12. PEG/NaCl: 20% (w/v) पॉलीथीन ग्लाइकोल-8000 को 2.5 M NaCl के साथ तैयार करें। ऑटोक्लेव और कमरे के तापमान पर दुकान।
  13. ते समाधान: 1 एम ट्रास-एचसीएल (पीएच8.0) और 50 एमएल EDTA (पीएच 8.0) के 1 एमएल को मिक्स करें और वॉल्यूम को 100 एमएल में समायोजित करें जिसमें एच2ओ ऑटोक्लेव के साथ स्टोर करें और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  14. आयोडाइड बफर: 30 ग्राम नाई को 50 एमएल ते, पीएच 8.0 में घोलदें। समाधान को कमरे के तापमान पर अंधेरे में रखें।
  15. निशा: अजीम, 1 ह का 1 ह, 0.5 ग्राम यीस्ट एक्सट्रेक्ट, 0.5 ग्राम नाकल और 0.7 ग्राम एगरिन को 100 एमएल एच2ओ ऑटोक्लेव में घोलकर 15 एमएल एलिकोट्स में डिक्की करें। उपयोग के लिए कमरे के तापमान पर स्टोर करें।

2. biopanning के पहले दौर: स्क्रीनिंग phage क्लोन कि FGFR2 के extracellular डोमेन के लिए बाध्य

नोट: एयरोसोल प्रतिरोधी पिपेट युक्तियों का उपयोग करें और पर्यावरण बैक्टीरियोफेज के साथ संदूषण को कम करने के लिए सभी प्रोटोकॉल के लिए दस्ताने पहनें।

  1. कोटिंग बफर में एक 10 ग्राम/एमएल FGFR2 (शुद्धता और 97%; सामग्री की तालिकादेखें ) समाधान तैयार करें। एक 35 सेमी2 पकवान करने के लिए तैयार समाधान के 1 एमएल जोड़ें और सतह पूरी तरह से गीला है जब तक बार बार घूमता है. मिलाते हुए के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    नोट: decoy लक्ष्य बांधने की मशीन के चयन से बचने के लिए, लक्ष्य प्रोटीन अत्यधिक शुद्ध किया जाना चाहिए.
  2. एल बी + Tet मध्यम के साथ 5 एमएल inoculate Escherichia कोलाई (ई. कोलाई) ER2738 के साथ 5-10 घंटे के लिए मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर. प्रवर्धित ER2738 कोशिकाओं चरण 3.3 में अनुमापन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
  3. डिश से कोटिंग समाधान डालो (अतिरिक्त समाधान हटादिया जाना चाहिए) और अवरुद्ध समाधान जोड़ें. कम से कम 1 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  4. अवरुद्ध समाधान छोड़ें और TBST (टीबीएस + 0.05% (v/v] ट्वेन-20) के साथ 6 बार जल्दी से धो लें। पकवान बाहर सुखाने से बचें.
  5. TBST के 1 एमएल में मूल phage पुस्तकालय का पुनर्गठन [1011 पट्टिका बनाने इकाइयों (PFU) के अंतिम एकाग्रता, लेपित पकवान में जोड़ने के लिए, और कमरे के तापमान पर एक शेकर पर 2 एच के लिए धीरे रॉक.
  6. सुपरनेंट को छोड़ दें और टीबीएसटी (टीबीएस + 0.05% (v/v) ट्वेन-20) के साथ डिश 10x को धो लें, जैसा कि चरण 2.4 में किया गया है।
    नोट: असीम phages जोरदार धोने से अच्छी तरह से हटाया जाना चाहिए.
  7. 0.2 M ग्लिसिन-एचसीएल बफर (पीएच 2.2) के 1 एमएल को डिश में जोड़कर और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए धीरे-धीरे हिलाकर बाउंड फैज को मिलाकर।
  8. एल्यूएट को एक स्टरलाइज्ड माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे 1 एम ट्रास-एचसीएल, पीएच 9-1 के 100 डिग्री सेल्सियस के साथ बेअसर करें।
    नोट: चरण 2.6 में, पकवान 10x जोरदार ढंग से धोने से जितना संभव हो उतना असीम फैग को हटा दें। यह एक महत्वपूर्ण कदम है। एलिटफैड फैज को एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। हालांकि, यह जितनी जल्दी हो सके अगले कदम के लिए आगे जाने के लिए सबसे अच्छा है।

3. eluted phages के Titer दृढ़ संकल्प

  1. उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 एच के लिए प्री-वार्म एलबी + IPTG/X-gal प्लेटें।
  2. 10 गुना सीरियल कमजोर पड़ने के 100 $L तैयार करें (यानी, 101, 102, 103 और 104) LB में चरण 2.8 से eluate. संदूषण से बचने के लिए फिल्टर कारतूस के साथ सुझावों का प्रयोग करें.
  3. चरण 2.2 से संस्कृति को मध्य-लॉग चरण (OD600 $ 0.5) तक पहुँचने दें। बंध्याकरण माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में संस्कृति के 200 डिग्री सेल्सियस का वितरण, प्रत्येक eluate कमजोर पड़ने के लिए एक.
  4. संक्रमण आरंभ करने के लिए, चरण 3.2 से प्रत्येक कमजोर पड़ने के 10 डिग्री सेल्सियस को चरण 3.3 से ई. कोलाई ER2738 संस्कृति युक्त अलग-अलग माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में जोड़ें। भंवर जल्दी और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
  5. कोट 90 $L चरण 3.4 से LB +IPTG/X-gal प्लेटों में कोटिंग स्टिक्स के साथ मिश्रण की।
  6. वैकल्पिक रूप से, एक माइक्रोवेव में शीर्ष agar पिघला, बाँझ संस्कृति ट्यूबों में 3 एमएल वितरित, प्रत्येक eluate कमजोर पड़ने के लिए एक, और 45 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब ों रखने. 45 डिग्री सेल्सियस शीर्ष agar युक्त संस्कृति ट्यूबों के लिए चरण 3.4 से मिश्रण स्थानांतरण। जल्दी से मिलाएं और तुरंत एक पूर्व गर्म LB/IPTG/X-gal प्लेट पर संस्कृति डालना. प्लेट को धीरे-धीरे झुकाकर ऊपर के गार को समान रूप से फैलाने के लिए घुमाएं।
  7. 5 मिनट के बाद, 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में व्युत्क्रम और इनक्यूबेट प्लेटें।
  8. लगभग 100 प्लेक के साथ प्लेटों पर प्लेक की गणना करें। उस प्लेट के लिए कमजोर पड़ने कारक द्वारा प्रत्येक संख्या गुणा करने के लिए PFU में phage titer प्रति 10 डिग्री सेल्सियस पाने के लिए.
  9. एक और 5 एमएल एलबी + Tet माध्यम के साथ ई. कोलाई ER2738 पर 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर phage प्रवर्धन के लिए मिलाते हुए के साथ टीका.
    नोट: मध्य लॉग चरण में ER2738 की संस्कृति का उपयोग करें (OD600 $ 0.5) phage titer के लिए. यदि अधिकांश प्लेक X-gal/IPTG प्लेटों पर सफेद होते हैं, तो इसका मतलब है कि फैज का पूल जंगली बैक्टीरियोफेज से दूषित हो गया है। यदि संदूषण होता है, तो uncontaminated phage स्टॉक समाधान से पैनिंग चरणों के साथ फिर से शुरू करना आवश्यक है।

4. फैज प्रवर्धन

  1. Dilute (1:100) एक 250 एमएल Erlenmeyer फ्लास्क में LB के 20 एमएल में 3.8 कदम से रात भर संस्कृति. 37 डिग्री सेल्सियस पर 4.5 एच के लिए जोरदार मिलाते हुए के साथ unamplified eluate और इनक्यूबेट जोड़ें।
  2. संस्कृति को एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें और 10 मिनट के लिए 12,000 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रण। एक ताजा ट्यूब, अपकेंद्रण फिर से करने के लिए supernatant स्थानांतरण, और गोली त्यागें.
  3. सुपरनेंट के ऊपरी 80% को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे 20% PEG/2.5 M NaCl की 1/6 मात्रा में जोड़ें। फैग को रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर वेग करने दें।
    नोट: अच्छी तरह से खूंटी के साथ संस्कृति supernatant मिक्स /
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर वेग से होने वाली फेज को सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनेटेंट, अपकेंद्रित्र को फिर से छोड़ दें, और एक पिपेट के साथ अवशिष्ट सुपरनेट को हटा दें।
  5. टीबीएस के 1 एमएल में गोली को पुन: निलंबित करें और सुपरनेटेंट को माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
  6. सुपरनेंट को एक ताजा माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 20% PEG/2.5 M NaCl की 1/6 मात्रा जोड़कर फिर से वेग करें। बर्फ पर 15-60 मिनट के लिए इनक्यूबेट, सेंट्रीफ्यूज पर 12,000 x g के लिए 10 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस पर। सुपरनेंट को छोड़ दें, फिर से स्पिन करें, और एक पिपेट के साथ अवशिष्ट सुपरनेट को हटा दें।
  7. अशुद्धियों को दूर करने के लिए एक अतिरिक्त मिनट के लिए टीबीएस और सेंट्रीफ्यूज के 200 डिग्री एल में गोली को फिर से निलंबित करें। प्रवर्धित एल्यूएट प्राप्त करने के लिए एक ताजा माइक्रोफ्यूज ट्यूब में supernatant स्थानांतरण.
  8. खंड 3 में वर्णित के रूप में प्रवर्धित phage titer.
    नोट: प्रवर्धित एल्यूएट का कमजोर पड़ने से अनम्पल्फित एल्यूएट की तुलना में अधिक होता है; 108-1011 के धारावाहिक कमजोर पड़ने आम तौर पर सुझाव दिया जाता है.

5. बायोपैनिंग का दूसरा दौर

  1. अनुभाग 2 से 4 दोहराएँ.
  2. खंड 3 में वर्णित एलबी + IPTG/X-gal प्लेटों पर प्रवर्धित एल्यूएट के दूसरे दौर को टिटर करें।
    नोट: FGFR2 प्रोटीन की कोटिंग एकाग्रता को कम करने के लिए 5 g/ इनपुट के रूप में चरण 4.7 से प्रवर्धित phage का प्रयोग करें और पहले दौर (1011 PFU) में के रूप में titer ही रहते हैं. phage और FGFR2 लेपित पकवान के ऊष्मायन समय को 1 ज तक कम करें और धोने के चरणों में ट्वीन एकाग्रता को 0.1% (v/v) तक बढ़ाएं।

6. बायोpanning के तीसरे दौर

  1. 2-1-2-6 चरण दोहराएँ.
  2. 20 डिग्री सेल्सियस bFGF समाधान के 1 एमएल जोड़ने के द्वारा बाध्य phage (FGFR2 के लिए एक लिगन्ड) पकवान के लिए और कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए धीरे से कमाल.
  3. 3-1-3-7 चरणे।
    नोट: FGFR2 प्रोटीन की कोटिंग एकाग्रता को कम करने के लिए 2.5 g/ इनपुट के रूप में अनुभाग 5 से प्रवर्धित phage के दूसरे दौर का प्रयोग करें और पहले दौर (1011 PFU) में के रूप में ही titer रखने के लिए. phage और FGFR2 लेपित पकवान के ऊष्मायन समय को 30 मिनट तक कम करें और धोने के चरणों में ट्वीन एकाग्रता को 0.5% (v/v) तक बढ़ाएं।

7. अनुक्रमण के लिए पट्टिका डीएनए का अधिग्रहण

  1. फलक प्रवर्धन
    1. Dilute (1:100) LB. में ER2738 की एक रात की संस्कृति एक 2 एमएल ट्यूब में पतला संस्कृति के 1 एमएल, प्रत्येक क्लोन के लिए एक विशेषता के लिए वितरित.
    2. अनुभाग 6 से एक titer प्लेट से एक अच्छी तरह से अलग नीले रंग की पट्टिका लेने के लिए एक पिपेट टिप का उपयोग करें और पतला संस्कृति युक्त ट्यूब को स्थानांतरित करें। कुल 15 प्लेक चुनें।
      नोट: प्लेट्स होना चाहिए और 1-3 दिन पुराने, 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत, और है और 100 प्लेक.
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 4.5 एच के लिए जोरदार मिलाते हुए ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
    4. 30 s. के लिए 12,000 x ग्राम पर centrifuge ट्यूबऔर अपकेंद्रित्र के लिए संस्कृतियों स्थानांतरण supernatant एक ताजा ट्यूब और अपकेंद्रित्र फिर से करने के लिए स्थानांतरण।
    5. एक पिपेट का उपयोग करना, एक ताजा ट्यूब के लिए supernatant के ऊपरी 80% हस्तांतरण. इसे प्रवर्धित फैज स्टॉक के रूप में लेबल करें।
      नोट: 100% बाँझ ग्लिसरोल की एक समान मात्रा के साथ प्रवर्धित phage को पतला करें और बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. पट्टिका डीएनए का निष्कर्षण
    1. एक ताजा माइक्रोफ्यूज ट्यूब में प्रवर्धित फेज के 500 डिग्री एल को स्थानांतरित करें और 20% PEG/2.5 M NaCl की 1/6 मात्रा जोड़ें। मिश्रण और यह कमरे के तापमान पर 10-20 मिनट के लिए खड़े करने के लिए उलटा।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज और फिर सुपरनेंट बंद डालना।
      नोट: Phage गोली दिखाई नहीं हो सकता है.
    3. फिर से सेंट्रीफ्यूज। ध्यान से किसी भी शेष supernatant हटा दें.
    4. ट्यूब को जोरदार ढंग से टैप करके आयोडाइड बफर के 100 डिग्री सेल्सियस में गोली को अच्छी तरह से पुन: निलंबित करें।
    5. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 100% इथेनॉल और इनक्यूबेट के 250 $L जोड़ें।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज और supernatant हटा दें। 70% इथेनॉल के 0.5 एमएल के साथ गोली धो लें, जल्दी से फिर से अपकेंद्रित्र, supernatant निकालें, और संक्षेप में गोली सूखी.
    7. टी बफर के 30 डिग्री एल में गोली को पुन: निलंबित करें और अनुक्रमण के लिए इसका उपयोग करें।
      नोट: चरण 7.2.6 के अग्रिम में -20 डिग्री सेल्सियस पर 70% इथेनॉल पूर्व शांत। phage गोली अच्छी तरह से इथेनॉल के अलावा करने से पहले iodide बफर में resuspended किया जाना चाहिए.

8. पेप्टाइड अनुक्रम की पहचान

  1. अनुक्रमण के लिए -96 gIII अनुक्रमण प्राइमर (5 ]-CCC TCA टैग TTA GCG TAA CG -3 ]) का उपयोग करें।
  2. डीएनए अनुक्रमण परिणामों के आधार पर phage पर प्रदर्शित पेप्टाइड दृश्यों का विश्लेषण करें.
  3. छोटे पेप्टाइड्स संश्लेषित करें और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण करने के लिए उनकी शुद्धता की पुष्टि ($98%).

9. आईटीसी द्वारा प्राप्त छोटे पेप्टाइड और FGFR2 के extracellular प्रोटीन की समानता का पता लगाने

  1. एक अल्ट्रासोनिक साधन का उपयोग कर Degas बाँझ पानी। बाँझ पानी में छोटे पेप्टाइड और FGFR2 extracellular प्रोटीन भंग. अवशिष्ट वेग को दूर करने के लिए इन नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें।
  2. आईटीसी अनुमापन प्रयोगों को 25 डिग्री सेल्सियस पर निष्पादित करें। सीरिंज से FGFR2 प्रोटीन के 1.5 डिग्री सेल्सियस के साथ सेल में छोटे पेप्टाइड के 40 डिग्री सेल्सियस, 750 आरपीएम की एक सरगर्मी की गति के साथ। 5-मिनट के अंतराल पर 2 डिग्री एल एलिकोट्स (कुल 19 इंजेक्शन के लिए) में FGFR2 प्रोटीन जोड़ें।
  3. एकल-साइट बाइंडिंग मॉडल का उपयोग करके ITC डेटा का विश्लेषण करें.
    नोट: बाँझ पानी degassed किया जाना चाहिए, और सभी नमूनों हवा बुलबुले और अवशिष्ट अशुद्धियों को दूर करने के लिए centrifuged किया जाना चाहिए। प्रयोग 25 डिग्री सेल्सियस के स्थिर ताप पर किया जाना चाहिए।

10. एक सेल प्रसार परख का उपयोग कर प्राप्त छोटे पेप्टाइड की जैविक गतिविधि का सत्यापन

  1. बीज BALB/c 3T3 कोशिकाओं (3.0 ]10 3 कोशिकाओं / अच्छी तरह से, 100 $L) एक 96 अच्छी तरह से थाली में Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) रात में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2.
  2. 0.5% FBS के साथ ताजा DMEM के साथ supernatant बदलें और 12 एच के लिए कोशिकाओं को भूखा.
  3. छोटे पेप्टाइड के सीरियल कमजोर पड़ने बनाओ (0, 0.0064, 0.032, 0.16, 0.8, 4, 20, और 100 $M) के साथ पूरक ताजा DMEM 0.5% FBS (6 डुप्लिकेट कुओं / 96-वेल प्लेट से सुपरनेंट निकालें और प्रति अच्छी तरह से छोटे पेप्टाइड समाधान के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 एच के लिए इनक्यूबेट और 5% सीओ2.
  4. 10% सेल काउंटिंग किट (CCK)-8 समाधान और 2 एच के लिए इनक्यूबेट युक्त ताजा DMEM के साथ supernatant बदलें।
  5. एक microplate पाठक के साथ 450 एनएम पर प्रत्येक अच्छी तरह से अवशोषण को मापने और सेल व्यवहार्यता का विश्लेषण.

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Representative Results

एक उच्च आत्मीयता छोटे पेप्टाइड FGFR2 को लक्षित प्राप्त करने.

FGFR2 को लक्षित phages स्क्रीन करने के लिए, एक पीएच.डी.-7 पुस्तकालय इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था. कार्यप्रवाह का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्र 1में दिखाया गया है। इस प्रक्रिया में, phage इनपुट की संख्या (PFU) अपरिवर्तित रखा गया था, जबकि FGFR2 प्रोटीन की कोटिंग एकाग्रता धीरे-धीरे कम हो गया था. फेज टिटर के परिणामों से पता चलता है कि बरामद फैगों की संख्या में धीरे-धीरे वृद्धि हुई है, और 3 राउंड के बाद पहले दौर की तुलना में 65 गुना वृद्धि हुई (तालिका 1)।

अगले, हम तीसरे दौर के बाद बेतरतीब ढंग से phage क्लोन उठाया और अनुक्रमण के लिए phage डीएनए निकाला. एक प्रतिनिधि पेप्टाइड (WRARVPL) स्क्रीनिंग द्वारा प्राप्त SP1 नाम था. यह बाद में संश्लेषित किया गया था, और अपने आणविक वजन मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मापा गया था.

SP1 पेप्टाइड FGFR2 के प्रति उच्च बाध्यकारी संबंध दिखाया.

एक आईटीसी प्रयोग FGFR2 के लिए छोटे पेप्टाइड की समानता को मापने के लिए आयोजित किया गया था. परिणाम संकेत दिया है कि SP1 पेप्टाइड FGFR2 के प्रति उच्च संबंध है (केडी $ 1.4 $M; चित्र 2) इस तिथि स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल की दक्षता का प्रदर्शन किया.

SP1 पेप्टाइड फाइब्रोब्लास्ट्स के विकास को बाधित किया.

SP1 पेप्टाइड की जैविक गतिविधि की जांच करने के लिए, एक फाइब्रोब्लास्ट प्रसार परख एक CCK-8 किट का उपयोग किया गया था. BALB/c 3T3 कोशिकाओं को विभिन्न सांद्रता में SP1 पेप्टाइड के साथ इनक्यूबेट किया गया (0, 0.0064, 0.032, 0.16, 0.8, 4, 20, और 100 $M). परिणाम ने सुझाव दिया कि SP1 पेप्टाइड ने BALB/c 3T3 कोशिकाओं के विकास को दबा दिया (चित्र 3)।

Figure 1
चित्र 1. phage प्रदर्शन पुस्तकालय का उपयोग कर FGFR2 को लक्षित छोटे पेप्टाइड के लिए Biopanning.
(क)फाज डिस्प्ले लाइब्रेरी का उपयोग करके छोटे पेप्टाइड स्क्रीनिंग का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। FGFR2 के साथ लेपित एक डिश में 1011 PFU युक्त पुस्तकालय इनक्यूबेट करें। धोने से असीम phages छोड़ ें, और elute बाध्य phages. eluted phages बढ़ाना और उन्हें biopanning के अगले दौर के लिए इनपुट के रूप में उपयोग करें. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. आईटीसी द्वारा SP1 पेप्टाइड और FGFR2 के बीच बातचीत की समानता को मापने.
1.5 $M FGFR2 प्रोटीन SP1 पेप्टाइड के 40 डिग्री सेल्सियस के साथ titated किया गया था. आईटीसी डेटा आगे मूल 7.0 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. फाइब्रोब्लास्ट्स के विकास पर SP1 पेप्टाइड का प्रभाव.
BALB/c 3T3 कोशिकाओं SP1 पेप्टाइड के साथ विभिन्न सांद्रता में इलाज किया गया (0, 0.0064, 0.032, 0.16, 0.8, 4, 20 और 100 $M). परिणाम मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं - एसडी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

दौर FGFR2 (जेडजी) इनपुट फेज (PFU) आउटपुट फेज (PFU) वसूली (%) संवर्धन
1 10 2.0 x 1011 3.98 x 104 1.99 x 10-5 1
2 5 2.0 x 1011 8.1 x 105 4.05 x 10-4 20
3 2.5 2.0 x 1011 2.6 x 106 1.3 x 10-3 65

तालिका 1. दौर 1 के सापेक्ष FGFR2 को लक्षित phage का संवर्धन.

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Discussion

एक combinatorial phage पुस्तकालय उपन्यास पेप्टाइड्स है कि लक्ष्य अणुओं बाँध और उनके समारोह13को विनियमित कर सकते हैं की उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए एक शक्तिशाली और प्रभावी उपकरण है. वर्तमान में, phage प्रदर्शन पेप्टाइड पुस्तकालयों अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है. उदाहरण के लिए, वे रिसेप्टर प्रोटीन के लिए बाध्य bioactive पेप्टाइड्स के चयन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता23, गैर प्रोटीन लक्ष्य24,25, रोग-विशिष्ट प्रतिजन नकल13, सेल विशेष पेप्टाइड्स26, 27, या ऊतक /अंग-विशिष्ट पेप्टाइड्स21,28,29 और पेप्टाइड-मध्यस्थ दवा वितरण प्रणाली19,30का विकास . संक्षेप में, phage प्रदर्शन पेप्टाइड पुस्तकालयों उपयोगी और कुशल सिस्टम बुनियादी अनुसंधान और अनुवाद चिकित्सा के विकास में विशिष्ट पेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए कर रहे हैं। अध्ययन में, एक पुस्तकालय सेल विकास निषेध के लिए FGFR2 को लक्षित छोटे पेप्टाइड्स स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था.

प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों का उल्लेख नीचे किया गया है। पैनिंग चरण में, जंगली प्रकार के phages द्वारा संदूषण से बचा जाना चाहिए। असीम phages जोरदार धोने से अच्छी तरह से हटा दिया जाना चाहिए. एफ बी + IPTG/X-gal प्लेटें phage titer के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व-वॉर्म किया जाना चाहिए। फैग टिटर के लिए, ई. कोलाई ER2738 मध्य लॉग चरण तक उगाया जाना चाहिए (OD600 $ 0.5).। चरण 4-3 में, फाग को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर उकेरना चाहिए। डीएनए अनुक्रमण के लिए 100 से कम प्लेक वाले प्लेटा से अलग नीले पट्टिकाओं को उठाया जाना चाहिए। चरण 7.2.6 में, 70% इथेनॉल समाधान अग्रिम में 20 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व ठंडा किया जाना चाहिए। अंत में, आईटीसी प्रयोग के लिए, बाँझ पानी degassed किया जाना चाहिए, और सभी नमूनों हवा बुलबुले और अवशिष्ट अशुद्धियों को दूर करने के लिए centrifuged किया जाना चाहिए। प्रयोग 25 डिग्री सेल्सियस के स्थिर ताप पर किया जाना चाहिए।

कुछ कारक है कि प्राप्त हिट की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं22 इस प्रकार हैं: 1) स्क्रीनिंग के पहले दौर में, phage आदानों की संख्या 1011 PFU होने की जरूरत है. हालांकि, स्क्रीनिंग के अगले दौर में, इनपुट कम हो सकता है। 2) एक शुद्ध वातावरण जंगली प्रकार phage संदूषण से बचने के लिए बनाए रखा जाना चाहिए. 3) स्क्रीनिंग के 3 या 4 राउंड आमतौर पर पर्याप्त हैं। पेप्टाइड लाइब्रेरी को अधिक पैन करने से बचें। 4) प्रत्येक दौर में, लक्ष्य प्रोटीन की मात्रा धीरे-धीरे कम हो जाती है, जबकि ट्वीन की सामग्री धीरे-धीरे धोने के चरण में बढ़ जाती है। इसके अलावा, phage और FGFR2 लेपित पकवान के ऊष्मायन समय भी धीरे-धीरे छोटा है। यदि अधिकांश एलिट फैग प्लेक एक्स-गैल/आईपीटीजी प्लेटपर सफेद होते हैं, तो यह जंगली-प्रकार के phages द्वारा संदूषण का सुझाव देता है। पैनिंग प्रक्रिया में प्रवर्धित फैग के कम टिटर से बचने के लिए, संस्कृतियों को उनके विकास चरण (OD600 और 0.05) में जल्दी वातित और संक्रमित होना चाहिए।

इस अध्ययन में, SP1 पेप्टाइड FGFR2 के प्रति उच्च आत्मीयता से पता चला (केडी $ 1.4 $M; चित्र 2) और अच्छी जैविक क्रिया(चित्र 3) । इस प्रकार, हमारे परिणामों का सुझाव है कि प्रोटोकॉल FGFR2 प्रोटीन के extracellular डोमेन के खिलाफ पेप्टाइड्स के चयन में प्रभावी था, हालांकि ध्यान दें कि FGFR परिवार के सदस्यों के उच्च अनुक्रम समानता के कारण, SP1 पेप्टाइड FGFR के साथ कुछ बाध्यकारी संबंध हो सकता है FGFR2 के अलावा परिवार के सदस्यों, जो देखा जैविक गतिविधि के लिए जिम्मेदार हो सकता है. इसके अलावा, पैनिंग प्रक्रिया में, फैज एलिसा सकारात्मक phages गुणात्मक पहचान करने के लिए एक विकल्प है। हालांकि, हमारी प्रयोगशाला में, हम हमेशा अनुक्रमण और आईटीसी परख मात्रात्मक द्वारा उनके आत्मीयता का मूल्यांकन करके पेप्टाइड्स प्राप्त करते हैं और समस्याओं का मूल्यांकन और उम्मीदवार पेप्टाइड्स का चयन नहीं किया है।

phage प्रदर्शन पुस्तकालय कई फायदे22है. पुस्तकालयों उच्च क्षमता के हैं (अप करने के लिए 1011 PFU) और इन विट्रो में इस्तेमाल किया जा सकता है, विवो में, और पूर्व vivo. पुस्तकालयों अत्यधिक कुशल, संभाल करने के लिए आसान कर रहे हैं, सस्ती और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है. हालांकि, प्रौद्योगिकी की कुछ सीमाएं हैं। पुस्तकालयों केवल proteinogenic एमिनो एसिड होते हैं और केवल जटिल संरचनाओं के बिना रैखिक और सरल चक्रीय पेप्टाइड्स के लिए अनुकूल हैं.

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Disclosures

लेखक वित्तीय हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

यह काम ग्वांग्झू के विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम (सं. 2016201604030039) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm Filter Merck Millipore MPGP002A1
35 cm2 Small dish Thermo 150460
70% Ethanol Guangzhou chemical reagent factory 64-17-5
-96 gIII sequencing primer Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
96-well plate Nest 701001-2
Agar Beyotime ST004D
Bacto-Tryptone Oxoid L0037
BALB/c 3T3 cells ATCC CRL-­6587
BSA Biodragon BD-M10110
CCK-8 kit DOJINDO CK04
DMEM Hyclone sh30243.01
DMF Newprobe PB10247
EDTA Invitrogen 15576028
FGF2 Protein Sino Biological Inc. 10014-HNAE Purity >95%
Glycine Sigma G8898-1KG
IPTG Beyotime ST097
ITC200 system MicroCal Omega
NaCl Sigma S6191
NaHCO3 Guangzhou chemical reagent factory 144-55-8
NaI Bidepharm BD40879
NaOH Guangzhou chemical reagent factory 1310-73-2
PEG–8000 Sigma P2139-250
Ph.D.-7 phage display peptide library kit New England BioLabs E8100S Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage
Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins Sino Biological Inc. 10824-H08H Purity > 97%
Small peptide Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China)
Tetracycline Sigma S-SHS-5
Tris Sigma SLF-T1503
Tween-20 Beyotime ST825
X-gal Beyotime ST912
Yeast extract Oxoid LP0021

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Bioengineering अंक 151 छोटे पेप्टाइड phage प्रदर्शन पेप्टाइड पुस्तकालय titer दृढ़ संकल्प पट्टिका प्रवर्धन FGFR2 आत्मीयता
स्क्रीनिंग और एक Phage प्रदर्शन पेप्टाइड लाइब्रेरी का उपयोग कर Fibroblast विकास कारक Receptor2 को लक्षित छोटे पेप्टाइड की पहचान
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Zhao, Y., Wang, Q., Hong, A., Chen, X. Screening and Identification of Small Peptides Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 using a Phage Display Peptide Library. J. Vis. Exp. (151), e60189, doi:10.3791/60189 (2019).

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