Summary
Hierin präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zum Screening kleiner Peptide, die mit einer Phagenanzeige-Peptidbibliothek an FGFR2 binden. Wir analysieren weiter die Affinität der ausgewählten Peptide zu FGFR2 in vitro und seine Fähigkeit, die Zellproliferation zu unterdrücken.
Abstract
Die menschliche Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) Familie besteht aus vier Mitgliedern, nämlich FGFR1, FGFR2, FGFR3 und FGFR4, die an verschiedenen biologischen Aktivitäten wie Zellproliferation, Überleben, Migration und Differenzierung beteiligt sind. Mehrere Aberrationen im FGFR-Signalweg aufgrund von Mutationen oder Genamplifikationsereignissen wurden bei verschiedenen Krebsarten identifiziert. Daher konzentrierte sich die jüngste Forschung auf die Entwicklung von Strategien mit therapeutischer Ausrichtung von FGFRs. Aktuelle FGFR-Inhibitoren in verschiedenen Stadien der präklinischen und klinischen Entwicklung umfassen entweder kleine Molekülinhibitoren von Tyrosin-Kinasen oder monoklonale Antikörper, bei dem nur wenige Peptid-basierte Inhibitoren in der Pipeline sind. Hier stellen wir ein Protokoll mit Phagenanzeige-Technologie zur Verfügung, um kleine Peptide als Antagonisten von FGFR2 zu überprüfen. Kurz gesagt, wurde eine Bibliothek von Phagen-angezeigten Peptiden in einer Platte mit FGFR2 beschichtet inkubiert. Anschließend wurde ungebundener Phagen durch TBST abgewaschen (TBS + 0,1% [v/v] Tween-20), und gebundener Phagen wurde mit 0,2 M Glycin-HCl-Puffer (pH 2.2) eluiert. Der eluierte Phagen wurde weiter verstärkt und als Input für die nächste Runde der Biopannierung verwendet. Nach drei Runden Biopanning wurden die Peptidsequenzen einzelner Phagenklone durch DNA-Sequenzierung identifiziert. Schließlich wurden die gescreenten Peptide synthetisiert und auf Affinität und biologische Aktivität analysiert.
Introduction
Fibroblasten-Wachstumsfaktorrezeptoren (GFR) spielen eine Schlüsselrolle bei der Zellproliferation, Wundheilung und Angiogenese in vivo1. Aberrante Aktivierung der FGFR-Signalisierung, die bei einer Vielzahl von Tumoren beobachtet wurde2,3,4,5 umfasst Genverstärkung, Genmutationen, Chromosomenaberrationen und übermäßige Ligandensekretion6 . Viele Inhibitoren, die auf FGFRs abzielen, haben in klinischen Studien vielversprechende therapeutische Wirkungen gezeigt und werden hauptsächlich in drei Typen eingeteilt: (1) kleine Molekülkinase-Inhibitoren, die an die intrazelluläre Domäne von FGFR binden, (2) Antagonisten, die auf die extrazelluläres Segment und (3) FGF-Ligandenfallen6. Obwohl einige der kleinen Molekülkinase-Inhibitoren sowohl in vitro als auch in vivo7eine gute therapeutische Wirkung haben, haben die meisten von ihnen eine schlechte Zielspezifität und zeigen nebenwirkungende Wirkungen wie Bluthochdruck8. Die Mehrheit der Antagonisten sind monoklonale Antikörper9,10 und Polypeptide11. Peptide haben Vorteile gegenüber kleinen Molekülen aufgrund ihrer Spezifität und niedrigeren Nebenwirkungen. Sie behalten auch Zelldurchlässigkeit und akkumulieren nicht in bestimmten Organen im Vergleich zu Protein-Medikamente12. Daher sind gezielte kleine Peptide sowohl wirksame als auch prospektive therapeutische Wirkstoffe.
Phage Display-Technologie ist ein einfaches, aber leistungsfähiges Werkzeug zur Identifizierung von kleinen Peptiden, die an ein bestimmtes Molekül binden können13,14,15. Wir verwendeten eine Phagenanzeige Peptid-Bibliothek, die auf einem einfachen M13-Phagen mit über 109 verschiedenen Peptidsequenzen am Schwanz für die Bindung an das Zielmolekül basiert (siehe Tabelle der Materialien)16. Durch die hohe Affinität von Phagen zum gegebenen Molekül können ungebundene Phagen weggewaschen werden und nur eng gebundene Phagen mit den gewünschten kurzen Peptiden erhalten bleiben. Die gegebenen molekularen Ziele können immobilisierte Proteine17,18, Kohlenhydrate, kultivierte Zellen oder sogar anorganische Materialien19,20sein. Ein spannender Fall wurde berichtet, bei dem organspezifische Peptide in vivo mit der Phagenanzeigetechnologie21ausgewählt wurden. Zu den Vorteilen der Phagenanzeige-Technologie gehören hoher Durchsatz, einfache Bedienung, niedrige Kosten und eine breite Palette von Anwendungen22.
In dieser Studie bieten wir ein detailliertes Protokoll zum Screening kleiner Peptide, die mit hilfe einer Phagenanzeigebibliothek an das immobilisierte Protein (FGFR2) binden. Die Wirksamkeit der Technologie wird auch untersucht, indem die Affinität des erhaltenen Peptids zu FGFR2 durch Isothermale Titrationskalorimetrie (ITC) und die biologische Aktivität durch einen Zellproliferationstest gemessen wird. Die Methode kann für das Screening von kleinen Peptiden erweitert werden, die an Kohlenhydrate, kultivierte Zellen oder sogar anorganische Materialien binden.
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Protocol
1. Reagenzzubereitung
- LB (Lysogeny-Brühe) Medium: 1 g Trypton, 0,5 g Hefeextrakt und 0,5 g NaCl in 100 mlH2O. Autoklav auflösen und bei 4 °C lagern.
- Tetracyclin-Bestand: Bereiten Sie 20 mg/ml in 1:1 Ethanol:H2O. bei -20 °C auf, und Wirbel vor der Verwendung.
- IPTG/X-gal-Lösung: Mischen Sie 0,5 g IPTG (Isopropyl-D-1-Thiogalactopyranosid) und 0,4 g X-gal (5-bromo-4-chlor-3-indolyl-D-Galactosid) in 10 ml DMF (Dimethylformamid). Die Lösung kann bei -20 °C für ein Jahr im Dunkeln gelagert werden.
- LB + Tetracyclin (Tet) Platten: Dissove 1 g Bacto-Trypton, 0,5 g Hefeextrakt, 0,5 g NaCl und 1,5 g Agar in 100 mlH2O. Autoklav und abkühlen auf < 70 °C. Fügen Sie 100 l des Tetracyclin-Bestands hinzu und gießen Sie Platten. Platten bei 4 °C im Dunkeln lagern.
- LB + IPTG/X-gal Platten: 1 g Bacto-Trypton, 0,5 g Hefeextrakt, 0,5 g NaCl und 1,5 g Agar in 100 mlH2O. Autoklav auflösen und auf < 70°C abkühlen lassen. Fügen Sie 100 l der IPTG/X-gal-Lösung hinzu und gießen Sie Platten. Platten bei 4 °C im Dunkeln lagern.
- Glycin-HCI-Puffer (0,2 M): 1,5014 g Glycin und 100 mg BSA (Rinderserumalbumin) in 100 mlH2O auflösen und den pH-Wert mit HCl auf 2,2 einstellen. Die Lösung mit einem 0,22-mm-Filter filtern und bei 4 °C lagern.
- Tris-HCl-Puffer (1 M): 12,11 g Tris (Tris(Hydroxymethyl)Aminomethan) in 100 mlH2O auflösen und den pH-Wert mit HCl. Autoklav auf 9,1 einstellen und bei 4 °C lagern.
- Beschichtungspuffer (0,1 M): 1,68 g NaHCO3 in 200 mlH2O auflösen und den pH-Wert mit NaOH auf 8,6 einstellen. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,22 m-Filter und lagern Sie sie bei 4 °C.
- Sperrpuffer: Bereiten Sie 0,1 M NaHCO3 (pH 8,6) mit 5 mg/ml BSA vor. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,22 m-Filter und lagern Sie sie bei 4 °C.
- TBS: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) mit 150 mM NaCl vorbereiten. Autoklav und lagern bei Raumtemperatur.
- 0,05%, 0,1% oder 0,5% TBST: Bereiten Sie TBS mit 0,05%, 0,1% oder 0,5% (v/v) Tween-20 vor. Filtern Sie mit einem 0,22 m Filter und lagern Sie bei Raumtemperatur.
- PEG/NaCl: 20% (w/v) Polyethylenglykol–8000 mit 2,5 M NaCl vorbereiten. Autoklav und lagern bei Raumtemperatur.
- TE-Lösung: 1 ml von 1 M Tris-HCl (pH8.0) und 2 ml 50 mM EDTA (pH 8.0) mischen und das Volumen mit H2O. Autoklav auf 100 ml einstellen und bei Raumtemperatur lagern.
- Jodidpuffer: 30 g NaI in 50 ml TE auflösen, pH 8,0. Bewahren Sie die Lösung bei Raumtemperatur im Dunkeln auf.
- Top Agar: 1 g Trypton, 0,5 g Hefeextrakt, 0,5 g NaCl und 0,7 g Agarin in 100 ml H2O. Autoklav auflösen und in 15 ml Aliquoten abgeben. Bei Raumtemperatur aufbewahren.
2. Erste Runde der Biopannierung: Screening-Phagenklone, die an die extrazelluläre Domäne von FGFR2 binden
HINWEIS: Verwenden Sie aerosolbeständige Pipettenspitzen und tragen Sie Handschuhe für alle Protokolle, um die Kontamination mit Umweltbakteriophagen zu minimieren.
- Bereiten Sie eine Lösung mit 10 g/ml FGFR2 (Reinheit > 97 %; siehe Materialtabelle)im Beschichtungspuffer vor. 1 ml der vorbereiteten Lösung in eine 35 cm2 Schale geben und wiederholt wirbeln, bis die Oberfläche vollständig nass ist. Über Nacht bei 4 °C mit Schütteln inkubieren.
HINWEIS: Um die Auswahl von Köderzielbindemitteln zu vermeiden, muss das Zielprotein stark gereinigt werden. - 5 ml LB + Tet medium mit Escherichia coli (E. coli) ER2738 für 5–10 Stunden bei 37 °C mit Schütteln impfen. Die verstärkten ER2738-Zellen werden in Schritt 3.3 zur Titration verwendet.
- Gießen Sie die Beschichtungslösung aus der Schale (die überschüssige Lösung muss entfernt werden) und fügen Sie die Blockierlösung hinzu. Bei 4 °C für mindestens 1 h inkubieren.
- Entsorgen Sie die Blockierlösung und waschen Sie sie 6-mal schnell mit TBST (TBS + 0,05% (v/v] Tween-20). Vermeiden Sie das Austrocknen der Schale.
- Rekonstituieren Sie die ursprüngliche Phagenbibliothek in 1 ml TBST [Endkonzentration von 1011 Plaque forming Units (PFU)], fügen Sie die beschichtete Schale hinzu und schaukeln Sie sanft für 2 h auf einem Shaker bei Raumtemperatur.
- Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Schale 10x mit TBST (TBS + 0.05% (v/v) Tween-20), wie in Schritt 2.4 durchgeführt.
HINWEIS: Die ungebundenen Phagen müssen durch kräftiges Waschen gründlich entfernt werden. - Den gebundenen Phagen durch Zugabe von 1 ml 0,2 m Glycin-HCl-Puffer (pH 2,2) in die Schale legen und bei Raumtemperatur 10 min sanft schaukeln.
- Übertragen Sie das Eluat in ein sterilisiertes Mikrofugenrohr und neutralisieren Sie es mit 100 l von 1 M Tris-HCl, pH 9,1.
HINWEIS: Entfernen Sie in Schritt 2.6 den ungebundenen Phagen so weit wie möglich, indem Sie die Schale 10x kräftig waschen. Dies ist ein entscheidender Schritt. Der eluierte Phagen kann eine Woche lang bei 4 °C gelagert werden. Es ist jedoch am besten, so bald wie möglich zum nächsten Schritt überzugehen.
3. Titerbestimmung der eluierten Phagen
- Vorwärmige LB + IPTG/X-gal Platten für mindestens 1 h bei 37 °C vor Gebrauch.
- Bereiten Sie 100 l 10-fache serielle Verdünnungen (d. h. 101, 102, 103 und 104) des Eluats ab Schritt 2.8 in LB vor. Verwenden Sie Spitzen mit Filterpatronen, um Verunreinigungen zu vermeiden.
- Lassen Sie die Kultur von Schritt 2.2 die Mid-Log-Phase erreichen (OD600 x 0,5). Geben Sie 200 l der Kultur in sterilisierte Mikrofugenröhrchen, eine für jede Eluatverdünnung.
- Um die Infektion zu initiieren, fügen Sie 10 l jeder Verdünnung von Schritt 3.2 zu einzelnen Mikrofugenröhren hinzu, die die E. coli ER2738-Kultur ab Schritt 3.3 enthalten. Wirbel schnell und inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min.
- Beschichten Sie 90 l des Gemischs von Schritt 3.4 in die LB +IPTG/X-gal Platten mit Beschichtungsstäben.
- Optional schmelzen Top-Agar in einer Mikrowelle, geben Sie 3 ml in sterile Kulturröhren, eine für jede Eluat-Verdünnung, und pflegen Rohre bei 45 °C. Übertragen Sie die Mischung von Schritt 3.4 auf Kulturröhren mit 45 °C Top-Agar. Mischen Sie schnell und gießen Sie die Kultur sofort auf eine vorgewärmte LB/IPTG/X-gal Platte. Neigen und drehen Sie die Platte sanft, um den oberen Agar gleichmäßig zu verteilen.
- Nach 5 min Platten bei 37 °C invertieren und inkubieren.
- Graf Plaques auf Tafeln mit ca. 100 Plaques. Multiplizieren Sie jede Zahl mit dem Verdünnungsfaktor für diese Platte, um den PHAGEN-Titer in PFU pro 10 L zu erhalten.
- Ungeimpfen Sie weitere 5 ml LB + Tet Medium mit E. coli ER2738 bei 37 °C über Nacht mit Schütteln zur Phagenverstärkung.
HINWEIS: Verwenden Sie die Kultur von ER2738 in der Mittleren Log-Phase (OD600 x 0,5) für Phagen-Titer. Wenn die meisten Plaques auf X-gal/IPTG-Platten weiß sind, bedeutet dies, dass der Phagenpool mit wilden Bakteriophagen kontaminiert wurde. Wenn eine Kontamination auftritt, ist es notwendig, mit den Schwenkschritten aus der unbelasteten Phagenlagerlösung erneut zu beginnen.
4. Phage-Verstärkung
- Verdünnen (1:100) die Übernachtungskultur von Schritt 3,8 in 20 ml LB in einem 250 mL Erlenmeyer Kolben. Das ungeamplifizierte Eluat hinzufügen und mit kräftigem Schütteln für 4,5 h bei 37 °C brüten.
- Übertragen Sie die Kultur auf ein Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge für 10 min bei 12.000 x g bei 4 °C. Den Überstand in ein frisches Rohr geben, wieder zentrifugieren und das Pellet entsorgen.
- Übertragen Sie die oberen 80% des Überstandes auf ein frisches Rohr und fügen Sie 1/6 Volumen von 20% PEG/2,5 M NaCl hinzu. Lassen Sie den Phagen bei 4 °C über Nacht ausbrechen.
HINWEIS: Mischen Sie den Kulturüberstand mit PEG/2.5 M NaCl gut. - Zentrifugieren Sie den gefällten Phagen bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand, die Zentrifuge erneut, und entfernen Sie den Restüberstand mit einer Pipette.
- Das Pellet in 1 ml TBS wieder aufhängen und den Überstand in ein Mikrofugenrohr übertragen. Zentrifuge bei 12.000 x g für 5 min bei 4 °C.
- Übertragen Sie den Überstand auf ein frisches Mikrofugenrohr und fällen Sie erneut, indem Sie 1/6 Volumen von 20% PEG/2,5 M NaCl hinzufügen. 15–60 min. Zentrifuge bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C auf Eis. Zentrifuge. Entsorgen Sie den Überstand, drehen Sie ihn erneut, und entfernen Sie den Restüberstand mit einer Pipette.
- Setzen Sie das Pellet in 200 l TBS und Zentrifuge für eine zusätzliche Minute aus, um Verunreinigungen zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand in ein frisches Mikrofugenrohr, um das verstärkte Eluat zu erhalten.
- Titer den verstärkten Phagen, wie in Abschnitt 3 beschrieben.
ANMERKUNG: Die Verdünnung des verstärkten Eluats ist höher als das nicht amplifizierte Eluat; serielle Verdünnungen von 108–1011 werden in der Regel vorgeschlagen.
5. Zweite Runde der Biopannierung
- Wiederholen Sie die Abschnitte 2 bis 4.
- Titer die zweite Runde des verstärkten Eluats auf LB + IPTG/X-gal Platten, wie in Abschnitt 3 beschrieben.
ANMERKUNG: Reduzieren Sie die Beschichtungskonzentration des FGFR2-Proteins auf 5 g/ml. Verwenden Sie den verstärkten Phagen aus Schritt 4.7 als Eingang und halten Sie den Titer gleich wie in der ersten Runde (1011 PFU). Verkürzen Sie die Inkubationszeit von Phagen und FGFR2-beschichteter Schale auf 1 h und erhöhen Sie die Tween-Konzentration in den Waschschritten auf 0,1% (v/v).
6. Dritte Runde der Biopannierung
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.6.
- Den gebundenen Phagen durch Zugabe von 1 ml 20 'M bFGF-Lösung (ein Liganden für FGFR2) in die Schale geben und 60 min bei Raumtemperatur sanft schaukeln.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.7.
HINWEIS: Reduzieren Sie die Beschichtungskonzentration des FGFR2-Proteins auf 2,5 g/ml. Verwenden Sie die zweite Runde des verstärkten Phagens aus Abschnitt 5 als Eingang und halten Sie den Titer gleich wie in der ersten Runde (1011 PFU). Verkürzen Sie die Inkubationszeit von Phagen und FGFR2-beschichteter Schale auf 30 min und erhöhen Sie die Tween-Konzentration in den Waschschritten auf 0,5% (v/v).
7. Erwerb von Plaque-DNA zur Sequenzierung
- Plaque-Verstärkung
- Verdünnen Sie (1:100) eine Übernachtungskultur von ER2738 in LB. Geben Sie 1 ml verdünnte Kultur in ein 2 ml Rohr, eines für jeden zu kennzeichnenden Klon.
- Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um eine gut abgetrennte blaue Plaque aus einer Titerplatte aus Abschnitt 6 zu pflücken und in das Rohr mit der verdünnten Kultur zu übertragen. Wählen Sie insgesamt 15 Plaketten.
HINWEIS: Die Platten sollten < 1-3 Tage alt, bei 4 °C gelagert und < 100 Plaques haben. - Die Rohre mit kräftigem Schütteln für 4,5 h bei 37 °C inkubieren.
- Übertragen Sie die Kulturen bei 12.000 x g für 30 s auf Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge. Den Überstand wieder in ein frisches Rohr und eine Zentrifuge geben.
- Mit einer Pipette die oberen 80% des Überstandes auf ein frisches Rohr übertragen. Beschriften Sie dies als verstärkten Phagenbestand.
HINWEIS: Verdünnen Sie den verstärkten Phagen mit einem gleichen Volumen von 100% sterilem Glycerin und lagern Sie bei -80 °C für die spätere Anwendung.
- Extraktion von Plaque-DNA
- Übertragen Sie 500 l des verstärkten Phagens auf ein frisches Mikrofugenrohr und fügen Sie ein 1/6 Volumen von 20% PEG/2,5 M NaCl hinzu. Invertieren und 10–20 min bei Raumtemperatur stehen lassen.
- Zentrifugieren Sie bei 12.000 x g 10 min bei 4 °C und gießen Sie dann den Überstand ab.
HINWEIS: Phage Pellet ist möglicherweise nicht sichtbar. - Zentrifuge wieder. Entfernen Sie sorgfältig alle verbleibenden Überstand.
- Setzen Sie das Pellet gründlich in 100 l des Jodpuffers wieder auf, indem Sie das Rohr kräftig anzapfen.
- Fügen Sie 250 l 100% Ethanol hinzu und brüten Sie 15 min bei Raumtemperatur.
- Zentrifuge bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C und entfernen Sie den Überstand. Das Pellet mit 0,5 ml 70% Ethanol waschen, schnell wieder zentrifugieren, den Überstand entfernen und das Pellet kurz trocknen.
- Setzen Sie das Pellet in 30 L TE-Puffer wieder aus, und verwenden Sie dies für die Sequenzierung.
HINWEIS: Das 70% Ethanol bei -20°C vor Schritt 7.2.6 vorkühlen. Das Phagenpellet muss vor der Zugabe von Ethanol gründlich im Jodpuffer resuspendiert werden.
8. Identifizierung der Peptidsequenz
- Verwenden Sie die -96 gIII Sequenzierungsgrundierung (5 '-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG –3') für die Sequenzierung.
- Analysieren Sie die Peptidsequenzen, die auf dem Phagen angezeigt werden, basierend auf den DNA-Sequenzierungsergebnissen.
- Synthetisieren Sie kleine Peptide und analysieren Sie sie durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Massenspektrometrie, um ihre Reinheit zu bestätigen (98 %).
9. Erkennung der Affinität des erhaltenen kleinen Peptids und extrazellulären Proteins von FGFR2 durch ITC
- Steriles Wasser mit einem Ultraschallgerät entgasen. Lösen Sie das kleine Peptid und das extrazelluläre Protein FGFR2 in sterilem Wasser auf. Zentrifugieren Sie diese Proben, um Restausscheidung zu entfernen.
- Führen Sie die ITC-Titrationsexperimente bei 25 °C durch. Titrieren Sie 40 M kleines Peptid in der Zelle mit 1,5 M FGFR2-Protein aus der Spritze, mit einer Rührgeschwindigkeit von 750 Rprossen. Fügen Sie das FGFR2-Protein in 5-min-Intervallen in 2 L-Aliquots (für insgesamt 19 Injektionen) hinzu.
- Analysieren Sie die ITC-Daten mithilfe eines Single-Site-Bindungsmodells.
HINWEIS: Steriles Wasser muss entgast werden, und alle Proben müssen zentrifugiert werden, um Luftblasen und Restunreinheiten zu entfernen. Das Experiment muss bei einer konstanten Temperatur von 25 °C durchgeführt werden.
10. Überprüfung der biologischen Aktivität des erhaltenen kleinen Peptids mit einem Zellproliferationstest
- Samen BALB/c 3T3-Zellen (3,0 x 103 Zellen/Well, 100 l) in einer 96-Well-Platte mit Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) über Nacht bei 37 °C und 5% CO2.
- Ersetzen Sie den Überstand durch frisches DMEM mit 0,5% FBS und verhungern Sie die Zellen für 12 h.
- Machen Sie serielle Verdünnungen des kleinen Peptids (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20 und 100 M) mit frischem DMEM, ergänzt mit 0,5% FBS (6 doppelte Brunnen/Konzentration). Entfernen Sie den Überstand von der 96-Well-Platte und fügen Sie 100 l der kleinen Peptidlösung pro Brunnen hinzu. Inkubieren für 48 h bei 37 °C und 5%CO2.
- Ersetzen Sie den Überstand durch frische DMEM mit 10% Cell Counting Kit (CCK)-8 Lösung und inkubieren für 2 h.
- Messen Sie die Absorption jedes Brunnens bei 450 nm mit einem Mikroplattenleser und analysieren Sie die Zelllebensfähigkeit.
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Representative Results
Erhalten Sie eine hohe Affinität kleine Peptid Targeting FGFR2.
Um Phagen zu überprüfen, die auf FGFR2 abzielen, wurde in dieser Studie eine Ph.D.-7-Bibliothek verwendet. Eine schematische Darstellung des Workflows ist in Abbildung 1dargestellt. Dabei blieb die Anzahl der Phageneingänge (PFU) unverändert, während die Beschichtungskonzentration des FGFR2-Proteins schrittweise reduziert wurde. Die Ergebnisse des Phagen-Titers legten nahe, daß die Zahl der zurückgewonnenen Phagen allmählich zunahm, und nach 3 Runden gab es eine 65-fache Zunahme im Vergleich zur ersten Runde (Tabelle 1).
Als nächstes wählten wir Phagenklone nach der dritten Runde nach dem Zufallsprinzip und extrahierten die Phagen-DNA für die Sequenzierung. Ein repräsentatives Peptid (WRARVPL), das durch Screening erhalten wurde, hieß SP1. Es wurde anschließend synthetisiert, und sein Molekulargewicht wurde durch Massenspektrometrie gemessen.
Das SP1-Peptid zeigte eine hohe Bindungsaffinität zu FGFR2.
Ein ITC-Experiment wurde durchgeführt, um die Affinität des kleinen Peptids zu FGFR2 zu messen. Das Ergebnis zeigte, dass das SP1-Peptid eine hohe Affinität zu FGFR2 hat (Kd bei 1,4 M; Abbildung 2). Dieses Datum zeigte die Effizienz des Screening-Protokolls.
Das SP1-Peptid hemmte das Wachstum von Fibroblasten.
Um die biologische Aktivität des SP1-Peptids zu untersuchen, wurde ein Fibroblasten-Proliferationstest mit einem CCK-8-Kit durchgeführt. BALB/c 3T3-Zellen wurden mit dem SP1-Peptid in verschiedenen Konzentrationen (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20 und 100 M) inkubiert. Das Ergebnis deutete darauf hin, dass das SP1-Peptid das Wachstum von BALB/c 3T3-Zellen unterdrückte (Abbildung 3).
Abbildung 1. Biopanning für kleine Peptid-Targeting FGFR2 mit Phagen-Display-Bibliothek.
(A) Schematische Darstellung des kleinen Peptid-Screenings mit Phagenanzeigebibliothek. Inkubieren Sie die Bibliothek mit 1011 PFU in einer schale mit FGFR2 beschichtet. Entsorgen Sie ungebundene Phagen durch Waschen und elute gebundene Phagen. Verstärken Sie die eluierten Phagen und verwenden Sie sie als Input für die nächste Runde der Biopanning. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Messung der Affinität der Wechselwirkung zwischen dem SP1-Peptid und FGFR2 durch ITC.
Das 1,5-M-FGFR2-Protein wurde mit 40 M des SP1-Peptids titriert. Die ITC-Daten wurden mit der Origin 7.0-Software weiter analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Wirkung des SP1-Peptids auf das Wachstum von Fibroblasten.
BALB/c 3T3-Zellen wurden mit dem SP1-Peptid in verschiedenen Konzentrationen (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20 und 100 m) behandelt. Die Ergebnisse werden als der Mittelwert sD ausgedrückt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| rund | FGFR2 (g) | Eingangsphagen (PFU) | Ausgangsphagen (PFU) | Erholung (%) | Bereicherung |
| 1 | 10 | 2,0 x 1011 | 3,98 x 104 | 1,99 x 10-5 | 1 |
| 2 | 5 | 2,0 x 1011 | 8,1 x 105 | 4,05 x 10-4 | 20 |
| 3 | 2.5 | 2,0 x 1011 | 2,6 x 106 | 1,3 x 10-3 | 65 |
Tabelle 1. Anreicherung von Phagen, die auf FGFR2 im Vergleich zu Runde 1 abzielt.
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Discussion
Eine kombinatorische Phagenbibliothek ist ein leistungsfähiges und effektives Werkzeug für das Hochdurchsatzscreening neuartiger Peptide, die Zielmoleküle binden und ihre Funktion regulieren können13. Derzeit haben Phagenanzeige Peptidbibliotheken eine breite Palette von Anwendungen. Zum Beispiel können sie für die Auswahl von bioaktiven Peptiden verwendet werden, die an Rezeptorproteine23gebunden sind, Nicht-Protein-Targets24,25, krankheitsspezifische Antigen-Mimik13, zellspezifische Peptide26, 27, oder Gewebe/organspezifische Peptide21,28,29 und Entwicklung von Peptid-vermittelten Medikamentenabgabesystemen19,30. Kurz gesagt, Phagenanzeige Peptid Bibliotheken sind nützliche und effiziente Systeme, um spezifische Peptide in der Grundlagenforschung und Entwicklung der translationalen Medizin zu identifizieren. In der Studie wurde eine Bibliothek verwendet, um kleine Peptide zu screening, die auf FGFR2 abzielen, um die Zellwachstumshemmung zu verhindern.
Die kritischen Schritte des Protokolls werden im Folgenden erwähnt. Im Schwenkschritt muss eine Kontamination durch Wildphagen vermieden werden. Die ungebundenen Phagen müssen durch kräftiges Waschen gründlich entfernt werden. Die LB + IPTG/X-gal Platten für Phagentiter müssen auf 37 °C vorgewärmt werden. Für den Phagentiter muss E. coli ER2738 bis zur Mittleren Logphase angebaut werden (OD600 x 0,5). In Schritt 4.3 muss der Phagen über Nacht bei 4 °C gefällt werden. Gut getrennte blaue Plaques müssen aus Platea mit weniger als 100 Plaques für die DNA-Sequenzierung entnommen werden. In Schritt 7.2.6 muss die 70%ige Ethanollösung bei 20 °C im Voraus vorgekühlt werden. Schließlich muss für das ITC-Experiment steriles Wasser entgast werden, und alle Proben müssen zentrifugiert werden, um Luftblasen und Restunreinheiten zu entfernen. Das Experiment muss bei einer konstanten Temperatur von 25 °C durchgeführt werden.
Einige Faktoren, die die Qualität der erhaltenen Treffer22 beeinflussen können, sind wie folgt: 1) In der ersten Runde des Screenings muss die Anzahl der Phageneingänge 1011 PFU betragen. In der nächsten Screening-Runde kann der Eingang jedoch geringer sein. 2) Es muss eine reine Umgebung gepflegt werden, um eine Wild-Typ-Phagenkontamination zu vermeiden. 3) 3 oder 4 Screening-Runden sind in der Regel ausreichend. Vermeiden Sie eine Überpannierung der Peptidbibliothek. 4) In jeder Runde wird die Menge des Zielproteins schrittweise reduziert, während der Tweengehalt im Waschschritt schrittweise erhöht wird. Darüber hinaus wird auch die Inkubationszeit von Phagen und FGFR2-beschichteter Schale schrittweise verkürzt. Wenn die meisten der eluierten Phagen-Plaques auf X-gal/IPTG-Platten weiß sind, deutet dies auf eine Kontamination durch Wild-Typ-Phagen hin. Um einen niedrigen Titer von verstärktem Phagen im Schwenkprozess zu vermeiden, müssen Kulturen früh in ihrer Wachstumsphase gut belüftet und infiziert werden (OD600 < 0.05).
In dieser Studie zeigte das SP1-Peptid eine hohe Affinität zu FGFR2 (Kd bei 1,4 M; Abbildung 2) und gute biologische Aktivität (Abbildung 3). Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Protokoll bei der Auswahl von Peptiden gegen die extrazelluläre Domäne des FGFR2-Proteins wirksam war, obwohl beachten Sie, dass das SP1-Peptid aufgrund der hohen Sequenzähnlichkeit von FGFR-Familienmitgliedern eine gewisse Bindungsaffinität zu FGFR haben kann. Familienmitglieder neben FGFR2, die für die biologische Aktivität verantwortlich sein könnten. Auch im Schwenkprozess ist Phagen-ELISA eine Alternative, um die positiven Phagen qualitativ zu identifizieren. In unserem Labor erhalten wir jedoch immer die Peptide, indem wir ihre Affinität durch ITC-Assay quantitativ sequenzieren und bewerten und hatten keine Probleme bei der Bewertung und Auswahl der Kandidatenpeptide.
Die Phagen-Display-Bibliothek hat mehrere Vorteile22. Die Bibliotheken sind von hoher Kapazität (bis zu 1011 PFU) und können in vitro, in vivo und ex vivo verwendetwerden. Bibliotheken sind hocheffizient, einfach zu handhaben, kostengünstig und kommerziell erhältlich. Allerdings gibt es gewisse Einschränkungen der Technologie. Die Bibliotheken enthalten nur proteinogene Aminosäuren und sind nur linearen und einfachen zyklischen Peptiden ohne komplizierte Strukturen zugänglich.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Konflikt mit finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Science and Technology Program of Guangzhou (Nr. 2016201604030039) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
References
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