Summary
Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per lo screening di piccoli peptidi che si legano a FGFR2 utilizzando una libreria di peptidi di visualizzazione del fago. Analizziamo ulteriormente l'affinità dei peptidi selezionati verso la FGFR2 in vitro e la sua capacità di sopprimere la proliferazione cellulare.
Abstract
La famiglia umana Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) comprende quattro membri, vale a dire FGFR1, FGFR2, FGFR3 e FGFR4, che sono coinvolti in varie attività biologiche tra cui la proliferazione cellulare, la sopravvivenza, la migrazione e la differenziazione. Diverse aberrazioni nella via di segnalazione FGFR, a causa di mutazioni o eventi di amplificazione genica, sono state identificate in vari tipi di cancro. Di conseguenza, una recente ricerca si è concentrata sullo sviluppo di strategie che coinvolgono il targeting terapeutico dei FGFR. Gli inibitori attuali di FGFR in varie fasi dello sviluppo pre-clinico e clinico includono inibitori di piccole molecole di chinasi di tirosina o anticorpi monoclonali, con solo pochi inibitori a base di peptidi in cantiere. Qui, forniamo un protocollo utilizzando la tecnologia di visualizzazione dei fagi per lo screening di piccoli peptidi come antagonisti della FGFR2. In breve, una biblioteca di peptidi esposti ai fagi è stata incubata in una piastra rivestita con FGFR2. Successivamente, il fago non legato è stato lavato via dalla TBST (TBS - 0,1% [v/v] Tween-20), e il fago legato è stato eluito con buffer di glicina-HCl da 0,2 M (pH 2,2). Il fago eluito è stato ulteriormente amplificato e utilizzato come input per il prossimo ciclo di biopanning. A seguito di tre cicli di biopanning, le sequenze di peptidi dei singoli cloni di fago sono state identificate dal sequenziamento del DNA. Infine, i peptidi sottoposti a screening sono stati sintetizzati e analizzati per l'affinità e l'attività biologica.
Introduction
I recettori del fattore di crescita fibroblasto (FGCR) svolgono un ruolo chiave nella proliferazione cellulare, nella guarigione delle ferite e nell'angiogenesi in vivo1. Attivazione aberrante della segnalazione FGFR osservata in una varietà di tumori2,3,4,5 include amplificazione genica, mutazioni genetiche, aberrazioni cromosomiche e secrezione di ligando eccessiva6 . Molti inibitori mirati alle FGFR hanno dimostrato promettenti effetti terapeutici negli studi clinici e sono principalmente classificati in tre tipi: (1) piccoli inibitori della chinasi molecolare, che si legano al dominio intracellulare di FGFR, (2) antagonisti segmento extracellulare e (3) ligando FGFtrappole 6. Anche se molti degli inibitori della chinasi di piccole molecole hanno buoni effetti terapeutici sia in vitro che in vivo7,la maggior parte di loro ha una scarsa specificità del bersaglio e mostra effetti negativi come l'ipertensione8. La maggior parte degli antagonisti sono anticorpi monoclonali9,10 e polipeptidi11. I peptidi hanno vantaggi rispetto alle piccole molecole a causa della loro specificità e degli effetti collaterali più bassi. Inoltre trattengono la permeabilità cellulare e non si accumulano in organi specifici rispetto ai farmaci proteici12. Quindi, i piccoli peptidi mirati sono agenti terapeutici efficaci e potenziali.
La tecnologia di visualizzazione dei fagini è uno strumento facile ma potente per identificare piccoli peptidi che possono legarsi a una data molecola13,14,15. Abbiamo usato una libreria di peptidi di visualizzazione del fago che si basa su un semplice fago M13 con oltre 109 diverse sequenze di peptidi visualizzate alla coda per il legame alla molecola bersaglio (vedi Tabella dei materiali)16. A causa dell'alta affinità dei fagi verso la molecola data, i fagi non legati possono essere lavati via, e solo i fagi strettamente legati con i peptidi corti desiderati vengono mantenuti. Gli obiettivi molecolari indicati possono essere proteine immobilizzate17,18, carboidrati, cellule coltivate, o anche materiali inorganici19,20. È stato riportato un caso interessante in cui i peptidi specifici dell'organo sono stati selezionati in vivo utilizzando la tecnologia di visualizzazione dei faghi21. I vantaggi della tecnologia di visualizzazione dei faghi includono un'elevata produttività, facilità d'uso, basso costo e una vasta gamma di applicazioni22.
In questo studio, forniamo un protocollo dettagliato di screening dei piccoli peptidi che si legano alla proteina immobilizzata (FGFR2) utilizzando una libreria di esposizione di fagi. L'efficacia della tecnologia viene esaminata anche misurando l'affinità del peptide ottenuto nei confronti della FGFR2 da Isothermal Titration Calorimetry (ITC), e l'attività biologica mediante un saggio di proliferazione cellulare. Il metodo può essere esteso per lo screening di piccoli peptidi che si legano a i carboidrati, cellule coltivate, o anche materiali inorganici.
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Protocol
1. Preparazione del reagente
- LB (brodo di lisogenia) medio: Sciogliere 1 g di tryptone, 0,5 g di estratto di lievito e 0,5 g di NaCl in 100 mL di H2O. Autoclave e conservare a 4 gradi centigradi.
- Tetracycline stock: Preparare 20 mg/mL in 1:1 etanolo:H2O. Conservare a -20 gradi centigradi e vortice prima dell'uso.
- Soluzione IPTG/X-gal: Mescolare 0,5 g di IPTG (isopropile-D-1-thiogalactopyranoside) e 0,4 g di X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl z-D-galactoside) in 10 mL di DMF (dimethyl formamide). La soluzione può essere conservata a -20 gradi centigradi per un anno al buio.
- LB - Targhe di tetraciclina (Tet): Dissove 1 g di bacto-tryptone, 0,5 g di estratto di lievito, 0,5 g di NaCl e 1,5 g di agar in 100 mL di H2O. Autoclave e fresco a < 70 . Aggiungere 100 l del brodo di tetraciclina e versare i piatti. Conservare le piastre a 4 gradi centigradi al buio.
- LB - Piastre IPTG/X-gal: Sciogliere 1 g di bacto-tryptone, 0,5 g di estratto di lievito, 0,5 g di NaCl e 1,5 g di agar in 100 mL di H2O. Autoclave e raffreddare a < 70 . Aggiungete 100 l della soluzione IPTG/X-gal e versate le piastre. Conservare le piastre a 4 gradi centigradi al buio.
- Buffer glycine-HCI (0,2 M): Dissolvere 1,5014 g di glicine e 100 mg di BSA (albumina del siero bovino) in 100 mL di H2O e regolare il pH a 2,2 con HCl. Filtrare la soluzione utilizzando un filtro 0,22 m e conservare a 4 gradi centigradi.
- Buffer Tris-HCl (1 M): Dissolvere 12,11 g di Tris (tris (idrossimethyl)aminomethane) in 100 mL di H2O e regolare il pH a 9,1 con HCl. Autoclave e conservare a 4 gradi centigradi.
- Buffer di rivestimento (0,1 M): Dissolvere 1,68 g di NaHCO3 in 200 mL di H2O e regolare il pH a 8,6 con NaOH. Filtrare la soluzione utilizzando un filtro da 0,22 m e conservarla a 4 gradi centigradi.
- Buffer di blocco: Preparare 0,1 M NaHCO3 (pH 8.6) con 5 mg/mL di BSA. Filtrare la soluzione utilizzando un filtro da 0,22 m e conservarla a 4 gradi centigradi.
- TBS: Preparare 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) con 150 mM NaCl. Autoclave e conservare a temperatura ambiente.
- 0,05%, 0,1% o 0,5% TBST: Preparare TBS con 0,05%, 0,1% o 0,5% (v/v) Tween-20. Filtrare utilizzando un filtro da 0,22 m e conservarlo a temperatura ambiente.
- PEG/NaCl: Preparare il 20% (w/v) di polietilene glicole-8000 con 2,5 M NaCl. Autoclave e conservare a temperatura ambiente.
- Soluzione TE: Mescolare 1 mL di 1 M Tris-HCl (pH8.0) e 2 mL di 50 mM EDTA (pH 8.0) e regolare il volume a 100 mL con H2O. Autoclave e conservare a temperatura ambiente.
- Buffer iodido: Dissolvere 30 g di NaI in 50 mL di TE, pH 8.0. Conservare la soluzione a temperatura ambiente al buio.
- Agar superiore: Sciogliere 1 g di tryptone, 0,5 g di estratto di lievito, 0,5 g di NaCl e 0,7 g di agarina in 100 mL di H2O. Autoclave e erogare in 15 mL. Conservare a temperatura ambiente per l'uso.
2. Primo ciclo di biopanning: screening dei cloni di fagi che si legano al dominio extracellulare della FGFR2
NOTA: Utilizzare punte pipetta resistenti all'aerosol e indossare guanti per tutti i protocolli al fine di ridurre al minimo la contaminazione con batteriofagi ambientali.
- Preparare una soluzione FGFR2 (Purity > 97%; vedere Tabella dei materiali)nel buffer di rivestimento. Aggiungere 1 mL della soluzione preparata a un piatto di 35 cm2 e girare ripetutamente fino a quando la superficie è completamente bagnata. Incubare pernottamento a 4 gradi centigradi con lo scuotimento.
NOTA: Per evitare la selezione dei leganti bersaglio, la proteina bersaglio deve essere altamente purificata. - Inoculare 5 mL di LB - Tet medium con Escherichia coli (E. coli) ER2738 per 5-10 ore a 37 gradi con agitazione. Le cellule amplificate ER2738 saranno utilizzate per la titolazione al passaggio 3.3.
- Togliere la soluzione di rivestimento dal piatto (la soluzione in eccesso deve essere rimossa) e aggiungere la soluzione di blocco. Incubare a 4 gradi centigradi per almeno 1 ora.
- Scartare la soluzione di blocco e lavare 6 volte rapidamente con TBST (TBS - 0.05% (v/v] Tween-20). Evitare di asciugare il piatto.
- Ricostituire la libreria di fagi originale in 1 mL di TBST [concentrazione finale di 1011 unità di formazione di placca (PFU)], aggiungere al piatto rivestito, e rock delicatamente per 2 h su uno shaker a temperatura ambiente.
- Scartare il supernatante e lavare il piatto 10x con TBST (TBS - 0,05% (v/v) Tween-20), come eseguito nel passaggio 2.4.
NOTA: I fagi non legati devono essere rimossi accuratamente con un lavaggio vigoroso. - Elutare il fago legato aggiungendo 1 mL di buffer di glicine-HCl da 0,2 M (pH 2.2) al piatto e dondolando delicatamente per 10 min a temperatura ambiente.
- Trasferire l'eluato in un tubo di microfuge sterilizzato e neutralizzarlo con 100 -L di 1 M Tris-HCl, pH 9.1.
NOTA: Nel passaggio 2.6, rimuovere il fago non legato il più possibile lavando il piatto 10x vigorosamente. Questo è un passo cruciale. Il fago eluito può essere conservato a 4 gradi centigradi per una settimana. Tuttavia, è meglio andare avanti al passo successivo il più presto possibile.
3. Determinazione titrata dei fagi eluiti
- Piastre preriscaldate LB - IPTG/X-gal per almeno 1 h a 37 gradi centigradi prima dell'uso.
- Preparare 100 l l di di lui a 10 volte (cioè 101,102,103 e 104)dell'eluato dal passo 2.8 in LB.
- Lasciare che le impostazioni cultura del passaggio 2.2 raggiungano la fase intermedia del log (OD600 - 0,5). Distribuiscono 200 litri della coltura in tubi di microfuge sterilizzati, uno per ogni diluizione eluata.
- Per avviare l'infezione, aggiungere 10 l di ciascuna diluizione dal punto 3.2 ai singoli tubi di microfuge contenenti la coltura E. coli ER2738 dal punto 3.3. Vortice rapidamente e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Coprire 90 ll della miscela dal passo 3.4 nelle piastre LB -IPTG/X-gal con bastoncini di rivestimento.
- Facoltativamente, sciogliere l'agar top in un forno a microonde, erogare 3 mL in tubi di coltura sterili, uno per ogni eluazione, e mantenere i tubi a 45 gradi centigradi. Trasferire la miscela dal passo 3.4 ai tubi di coltura contenenti 45 gradi centigradi. Mescolare rapidamente e immediatamente la coltura su una piastra Pre-warmed LB/IPTG/X-gal. Inclinare delicatamente e ruotare la piastra per distribuire uniformemente l'agar superiore.
- Dopo 5 min, invertire e incubare piastre durante la notte a 37 gradi centigradi.
- Contare le placche su piastre con circa 100 placche. Moltiplicare ogni numero per il fattore di diluizione per quella piastra per ottenere il titro del fago in PFU per 10 .
- Inoculare altri 5 mL di LB - Tet medio con E. coli ER2738 a 37 gradi durante la notte con agitazione per amplificazione del fago.
NOTA: Utilizzare la lingua di ER2738 in fase intermedia di registrazione (OD600 - 0,5) per il titer dei fali. Se la maggior parte delle placche sono bianche su piastre X-gal/IPTG, significa che la piscina di fagi è stata contaminata da batteriofagi selvatici. Se si verifica la contaminazione, è necessario ricominciare con i passaggi di panoramica dalla soluzione di stock di fago incontaminata.
4. Amplificazione di Fago
- Diluire (1:100) la cultura durante la notte dal passo 3.8 in 20 mL di LB in una fiaschetta Erlenmeyer 250 mL. Aggiungere l'eluato non amplificato e incubare con agitazione vigorosa per 4,5 h a 37 gradi centigradi.
- Trasferire la coltura in un tubo di centrifuga e centrifugare per 10 min a 12.000 x g a 4 gradi centigradi. Trasferire il supernatante in un tubo fresco, centrifugare di nuovo, e scartare il pellet.
- Trasferire l'80% superiore del supernatante in un tubo fresco e aggiungervi un volume di 1/6 del 20% PEG/2,5 M NaCl. Lasciare precipitare il fago a 4 gradi durante la notte.
NOTA: Mescolare bene il supernatante di coltura con PEG/2,5 M NaCl. - Centrifugare il fago precipitato a 12.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi. Scartare di nuovo il supernatante, centrifugare e rimuovere il supernatante residuo con una pipetta.
- Risospendere il pellet in 1 mL di TBS e trasferire il supernatante in un tubo di microfuge. Centrifuga a 12.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
- Trasferire il supernatante in un tubo di microfuge fresco e precipitare di nuovo con l'aggiunta di 1/6 volume del 20% PEG/2,5 M NaCl. Incubare sul ghiaccio per 15-60 min. Centrifughe a 12.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi. Scartare il supernatante, ri-girare, e rimuovere il residuo supernatante con una pipetta.
- Risospendere il pellet in 200 - L di TBS e centrifugare per un altro minuto per rimuovere le impurità. Trasferire il supernatante in un tubo di microfuge fresco per ottenere l'eluato amplificato.
- Titer il fago amplificato come descritto nella sezione 3.
NOTA: la diluizione dell'eluato amplificato è maggiore rispetto all'eluato non amplificato; diluizione seriale di 108–1011 sono in genere suggerite.
5. Secondo ciclo di biopanning
- Ripetere le sezioni da 2 a 4.
- Titer il secondo giro del eluato amplificato su Piastre LB - IPTG / X-gal come descritto nella sezione 3.
NOTA: Ridurre la concentrazione di rivestimento della proteina FGFR2 a 5 g/mL. Utilizzare il fago amplificato del punto 4.7 come input e mantenere il titro uguale al primo round (1011 PFU). Ridurre il tempo di incubazione del fago e del piatto rivestito FGFR2 a 1 h e aumentare la concentrazione di Tween allo 0,1% (v/v) nelle fasi di lavaggio.
6. Terzo ciclo di biopanning
- Ripetere i passaggi da 2.1 a 2.6.
- Elutare il fago legato aggiungendo 1 mL di soluzione di 20 m bFGF (un ligando per FGFR2) al piatto e dondolando delicatamente per 60 min a temperatura ambiente.
- Ripetere i passaggi da 3.1 a 3.7.
NOTA: Ridurre la concentrazione di rivestimento della proteina FGFR2 a 2,5 g/mL. Utilizzare il secondo giro di fago amplificato dalla sezione 5 come input e mantenere il titro uguale al primo turno (1011 PFU). Ridurre il tempo di incubazione del fago e del piatto rivestito FGFR2 a 30 min e aumentare la concentrazione di Interpolazione allo 0,5% (v/v) nei gradini di lavaggio.
7. Acquisizione del DNA della placca per il sequenziamento
- Amplificazione della placca
- Diluire (1:100) una cultura notturna di ER2738 in LB. Eroga 1 mL di coltura diluita in un tubo da 2 mL, uno per ogni clone da caratterizzare.
- Utilizzare una punta di pipetta per prelevare una placca di colore blu ben separata da una piastra titro dalla sezione 6 e trasferirla al tubo contenente la coltura diluita. Scegli un totale di 15 placche.
NOTA: Le piastre devono avere < 1-3 giorni, conservate a 4 gradi centigradi e avere < 100 placche. - Incubare i tubi con agitazione vigorosa per 4,5 h a 37 gradi centigradi.
- Trasferire le colture ai tubi di centrifuga e centrifugare a 12.000 x g per 30 s. Trasferire il supernatante in un tubo fresco e centrifugare di nuovo.
- Utilizzando una pipetta, trasferire l'80% superiore del supernatante in un tubo fresco. Etichettaquesto come lo stock di fago amplificato.
NOTA: Diluire il fago amplificato con un volume uguale di glicerolo sterile al 100% e conservarlo a -80 gradi centigradi per un uso successivo.
- Estrazione del DNA della placca
- Trasferire 500 l di fago amplificato in un tubo di microfuge fresco e aggiungere un volume di 1/6 del 20% PEG/2,5 M NaCl. Invertire per mescolare e lasciare riposare per 10-20 min a temperatura ambiente.
- Centrifuga a 12.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi e poi versare il supernatante.
NOTA: il pellet di fascio potrebbe non essere visibile. - Centrifuga di nuovo. Rimuovere con attenzione qualsiasi supernatante rimanente.
- Risospendere accuratamente il pellet in 100 o L del tampone di iodo toccando vigorosamente il tubo.
- Aggiungere 250 l di 100% etanolo e incubare per 15 min a temperatura ambiente.
- Centrifuga a 12.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi e rimuovere il supernatante. Lavare il pellet con 0,5 mL di 70% di etanolo, centrifugare rapidamente di nuovo, rimuovere il supernatante e asciugare brevemente il pellet.
- Risospendere il pellet in 30 , 3L di TE buffer e utilizzarlo per il sequenziamento.
NOTA: Pre-raffreddare l'etanolo 70% a -20oC prima del passo 7.2.6. Il pellet di fago deve essere completamente risospeso nel buffer di iodo prima dell'aggiunta di etanolo.
8. Identificazione della sequenza di peptidi
- Utilizzare il primer di sequenziamento -96 gIII (5 -CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG –3) per il sequenziamento.
- Analizzare le sequenze di peptidi visualizzate sul fago in base ai risultati del sequenziamento del DNA.
- Sintetizzare piccoli peptidi e analizzare con cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e spettrometria di massa per confermare la loro purezza (-98%).
9. Rilevare l'affinità del piccolo peptide e della proteina extracellulare ottenuta di FGFR2 da parte dell'ITC
- Degas sterile acqua utilizzando uno strumento ad ultrasuoni. Sciogliere il piccolo peptide e la proteina extracellulare FGFR2 in acqua sterile. Centrifugare questi campioni per rimuovere precipitato residuo.
- Eseguire gli esperimenti di titolazione ITC a 25 gradi centigradi. Titotra 40 M di piccolo peptide nella cellula con 1,5 M di proteina FGFR2 dalla siringa, con una velocità di agitazione di 750 rpm. Aggiungere la proteina FGFR2 in 2 gradi (per un totale di 19 iniezioni) a intervalli di 5 min.
- Analizzare i dati ITC utilizzando un modello di associazione a sito singolo.
NOTA: L'acqua sterile deve essere degastata e tutti i campioni devono essere centrifugati per rimuovere le bolle d'aria e le impurità residue. L'esperimento deve essere condotto ad una temperatura costante di 25 gradi centigradi.
10. Verifica dell'attività biologica del piccolo peptide ottenuto utilizzando un saggio di proliferazione cellulare
- Cellule di semi BALB/c 3T3 (3,0 x 103 cellule/pozzo, 100 ll) in una piastra di 96 pozzetti con DMEM (Modified Eagle Medium) di Dulbecco con 10% siero bovino fetale (FBS) durante la notte a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2.
- Sostituire il supernatante con un DMEM fresco con lo 0,5% di FBS e far morire di fame le cellule per 12 h.
- Effettuare diluizioni seriali del piccolo peptide (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20 e 100 M) con DMEM fresco integrato con 0,5% FBS (6 pozze/concentrazione). Togliere il supernatante dalla piastra del pozzo 96 e aggiungere 100 l della piccola soluzione peptide per pozzo. Incubare per 48 h a 37 e 5% DI CO2.
- Sostituire il supernatante con un DMEM fresco contenente la soluzione CCK (Cell Counting Kit)-8 al 10% e incubarla per 2 h.
- Misurare l'assorbimento di ogni pozzo a 450 nm con un lettore di micropla e analizzare la vitalità delle cellule.
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Representative Results
Ottenere un piccolo peptide ad alta affinità mirato FGFR2.
Per vagliare i fagi mirati al FGFR2, in questo studio è stata utilizzata una libreria Ph.D.-7. Nella Figura 1viene illustrata una rappresentazione schematica del flusso di lavoro. In questo processo, il numero di input di fagi (PFU) è stato mantenuto invariato, mentre la concentrazione di rivestimento della proteina FGFR2 è stata ridotta gradualmente. I risultati del tibore del fago hanno suggerito che il numero di fagi recuperati è aumentato gradualmente, e dopo 3 turni, c'è stato un aumento di 65 volte rispetto a quello del primo turno (Tabella 1).
Successivamente, abbiamo scelto i cloni di fago in modo casuale dopo il terzo round ed estratto il DNA del fagiolo per il sequenziamento. Un peptide rappresentativo (WRARVPL) ottenuto mediante screening è stato chiamato SP1. Successivamente è stato sintetizzato, e il suo peso molecolare è stato misurato dalla spettrometria di massa.
Il peptide SP1 ha mostrato un'elevata affinità vincolante verso la FGFR2.
È stato condotto un esperimento ITC per misurare l'affinità del piccolo peptide con la FGFR2. Il risultato indicava che il peptide SP1 ha un'alta affinità verso la FGFR2 (Kd : 1,4 M; figura 2). Questa data ha dimostrato l'efficienza del protocollo di screening.
Il peptide SP1 ha inibito la crescita dei fibroblasti.
Per studiare l'attività biologica del peptide SP1, è stato eseguito un saggio di proliferazione del fibroblasto utilizzando un kit CCK-8. Le cellule BALB/c 3T3 sono state incubate con il peptide SP1 a diverse concentrazioni (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20 e 100 M). Il risultato ha suggerito che il peptide SP1 ha soppresso la crescita delle cellule BALB/c 3T3 (Figura 3).
come illustrato nella Figura 1. Biopanning per il targeting di peptidi di piccole dimensioni FGFR2 utilizzando la libreria di visualizzazione dei fagi.
(A) Rappresentazione schematica dello screening dei piccoli peptidi mediante libreria di esposizione dei fagini. Incubare la biblioteca contenente 1011 PFU in un piatto rivestito con FGFR2. Eliminare i fagi non legati lavandoli, ed eluire i fagi legati. Amplifica i fagi eluiti e usali come input per il prossimo ciclo di biopanning. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella Figura 2. Misurazione dell'affinità di interazione tra il peptide SP1 e FGFR2 da parte di ITC.
È stata titolata la proteina FGFR2 con 40 m del peptide SP1. I dati ITC sono stati ulteriormente analizzati utilizzando il software Origin 7.0. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella figura 3. Effetto del peptide SP1 sulla crescita dei fibroblasti.
Le cellule BALB/c 3T3 sono state trattate con il peptide SP1 a concentrazioni diverse (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20 e 100 m). I risultati sono espressi come la media - SD. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| rotondo | FGFR2 (g) | Fago di ingresso (PFU) | Fago di uscita (PFU) | Recupero (%) | arricchimento |
| 1 | 10 | 2,0 x 1011 | 3,98 x 104 | 1,99 x 10-5 | 1 |
| 2 | 5 | 2,0 x 1011 | 8,1 x 105 | 4,05 x 10-4 | 20 |
| 3 | 2.5 | 2,0 x 1011 | 2,6 x 106 | 1,3 x 10-3 | 65 |
Tabella 1. Arricchimento del fago mirato FGFR2 rispetto al round 1.
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Discussion
Una libreria di fagi combinatori è uno strumento potente ed efficace per lo screening ad alta produttività di nuovi peptidi che possono legare le molecole bersaglio e regolare la loro funzione13. Attualmente, le librerie di peptidi di visualizzazione dei faocchi hanno una vasta gamma di applicazioni. Ad esempio, possono essere utilizzati per la selezione di peptidi bioattivi legati alle proteine recettoriali23, bersagli non proteici24,25, antigeni specifici della malattia imita13, peptidi specifici per le cellule26, 27, o peptidi tissutali/organi specifici21,28,29 e lo sviluppo di sistemi di somministrazione di peptidi19,30. In breve, le librerie di peptidi mostrabili di fago sono sistemi utili ed efficienti per identificare peptidi specifici nella ricerca di base e nello sviluppo della medicina traslazionale. Nello studio, una libreria è stata utilizzata per lo screening di piccoli peptidi mirati FGFR2 per l'inibizione della crescita cellulare.
I passaggi critici del protocollo sono menzionati di seguito. Nella fase di panning, la contaminazione da fagi di tipo selvatico deve essere evitata. I fagi non legati devono essere rimossi accuratamente con un lavaggio vigoroso. Le piastre LB - IPTG/X-gal per il titro dei fagi devono essere preriscaldate fino a 37 gradi centigradi. Per il tibo xage, E. coli ER2738 deve essere coltivato fino alla fase intermedia del log (OD600 x 0,5). Nel passaggio 4.3, il fago deve essere precipitato durante la notte a 4 gradi centigradi. Le placche blu ben separate devono essere raccolte da platea contenenti meno di 100 placche per il sequenziamento del DNA. Nel passaggio 7.2.6, la soluzione di etanolo 70% deve essere pre-raffreddata a 20 gradi centigradi in anticipo. Infine, per l'esperimento ITC, l'acqua sterile deve essere degassata e tutti i campioni devono essere centrifusi per rimuovere le bolle d'aria e le impurità residue. L'esperimento deve essere condotto ad una temperatura costante di 25 gradi centigradi.
Alcuni fattori che possono influenzare la qualità dei colpi ottenuti22 sono i seguenti: 1) Nel primo ciclo di screening, il numero di input di fago deve essere 1011 PFU. Tuttavia, nel prossimo ciclo di screening, l'input può essere inferiore. 2) Un ambiente puro deve essere mantenuto per evitare la contaminazione da fago di tipo selvatico. 3) Di solito sono sufficienti 3 o 4 cicli di screening. Evitare di eseguire un'eccessiva panoramica della libreria di peptidi. 4) In ogni round, la quantità di proteine bersaglio viene gradualmente ridotta, mentre il contenuto di Tween viene gradualmente aumentato nella fase di lavaggio. Inoltre, il tempo di incubazione del fago e del piatto rivestito FGFR2 viene gradualmente ridotto. Se la maggior parte delle placche di fago eluite sono bianche su placche X-gal/IPTG, ciò suggerisce la contaminazione da fagi di tipo selvatico. Per evitare un basso detagage amplificato nel processo di panoramica, le colture devono essere ben aerate e infettate all'inizio della loro fase di crescita (OD600 < 0.05).
In questo studio, il peptide SP1 ha mostrato un'elevata affinità verso la FGFR2 (Kd 1,4 M; Figura 2) e buona attivitàbiologica( Figura 3 ). Così, i nostri risultati suggeriscono che il protocollo è stato efficace nella selezione di peptidi contro il dominio extracellulare della proteina FGFR2, anche se si noti che a causa dell'alta somiglianza di sequenza dei membri della famiglia FGFR, il peptide SP1 può avere una certa affinità vincolante con FGFR familiari oltre al FGFR2, che potrebbe essere responsabile dell'attività biologica vista. Inoltre, nel processo di panning, il fago ELISA è un'alternativa per identificare i fagi positivi qualitativamente. Tuttavia, nel nostro laboratorio, otteniamo sempre i peptidi sequenziando e valutando la loro affinità da parte dell'ITC quantitativamente e non abbiamo avuto problemi a valutare e selezionare i peptidi candidati.
La libreria di fago-display ha diversi vantaggi22. Le biblioteche sono ad alta capacità (fino a 1011 PFU) e possono essere utilizzate in vitro, in vivo ed exvivo. Le librerie sono altamente efficienti, facili da maneggiare, poco costose e disponibili in commercio. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni della tecnologia. Le biblioteche contengono solo aminoacidi proteici e sono suscettibili solo a peptidi ciclici lineari e semplici senza strutture complicate.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal Programma Scienza e Tecnologia di Guangzhou (N. 2016201604030039).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
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