Summary
Häri presenterar vi ett detaljerat protokoll för screening av små peptider som binder till FGFR2 med hjälp av en fagdisplay peptid bibliotek. Vi analyserar vidare Affiniteten hos de utvalda peptiderna mot FGFR2 in vitro och dess förmåga att undertrycka cellproliferation.
Abstract
Den mänskliga fibroblast tillväxtfaktor receptor (FGFR) familjen består av fyra medlemmar, nämligen, FGFR1, FGFR2, FGFR3, och FGFR4, som är involverade i olika biologiska aktiviteter inklusive cellproliferation, överlevnad, migration och differentiering. Flera avvikelser i FGFR signalvägen, på grund av mutationer eller genamplifiering händelser, har identifierats i olika typer av cancer. Den senaste forskningen har därför fokuserat på att utveckla strategier som involverar terapeutisk inriktning av FGFRs. aktuella FGFR-hämmare i olika stadier av preklinisk och klinisk utveckling omfattar antingen småmolekylära hämmare av tyrosinkinaser eller monoklonala antikroppar, med endast ett fåtal peptid-baserade hämmare i rörledningen. Här tillhandahåller vi ett protokoll som använder phage displayteknik för att avskärma små peptider som antagonister till FGFR2. Kortfattat, ett bibliotek med fagvisade peptider inkuberades i en tallrik belagd med FGFR2. Därefter spolades obunden phage av av TBST (TBS + 0,1% [v/v] Tween-20), och destinerad phage eluerades med 0,2 M Glycine-HCl buffert (pH 2,2). Den eluerade Fagen förstärkallades ytterligare och användes som indata för nästa omgång biopanning. Efter tre omgångar av biopanning identifierades peptidsekvenserna av enskilda fagkloner med DNA-sekvensering. Slutligen, de screening peptider syntetiseras och analyseras för affinitet och biologisk aktivitet.
Introduction
Fibroblast tillväxtfaktor receptorer (FGFRs) spela viktiga roller i cellproliferation, sårläkning, och angiogenes in vivo1. Avvikande aktivering av FGFR-signalering observerades i en mängd olika tumörer2,3,4,5 inkluderar genamplifiering, genmutationer, kromosomala avvikelser, och överdriven ligand sekretion6 . Många hämmare som riktar sig mot FGFRs har visat lovande terapeutiska effekter i kliniska prövningar och är huvudsakligen indelade i tre typer: (1) små molekyl kinashämmare, som binder till den intracellulära domänen av FGFR, (2) antagonister riktade mot extracellulära segmentet och (3) FGF ligand-fällor6. Även om flera av de små molekylen kinashämmare har goda terapeutiska effekter både in vitro-och in vivo7, de flesta av dem har dålig mål specificitet och visar negativa effekter såsom hypertoni8. Majoriteten av antagonister är monoklonala antikroppar9,10 och polypeptider11. Peptider har fördelar jämfört med små molekyler på grund av deras specificitet och lägre biverkningar. De behåller också cellernas permeabilitet och ackumuleras inte i specifika organ jämfört med protein droger12. Därför riktade små peptider är både effektiva och prospektiva terapeutiska medel.
Phage displayteknik är ett enkelt men kraftfullt verktyg för att identifiera små peptider som kan binda till en given molekyl13,14,15. Vi använde en phage display peptid bibliotek som är baserad på en enkel M13 phage med över 109 olika peptid sekvenser visas på svansen för bindning till målmolekylen (se tabell över material)16. På grund av den höga affinitet av Fager mot den givna molekylen kan obundna Fager tvättas bort, och endast tätt bundna Fager med de önskade korta peptiderna behålls. De givna molekylära målen kan immobiliseras proteiner17,18, kolhydrater, odlade celler, eller till och med oorganiska material19,20. Ett spännande fall rapporterades där organspecifika peptider valdes in vivo med hjälp av phage displayteknik21. Fördelarna med phage displayteknik inkluderar hög genomströmning, enkel drift, låg kostnad och ett brett spektrum av applikationer22.
I denna studie ger vi ett detaljerat protokoll för screening små peptider bindning till immobiliserat protein (FGFR2) med hjälp av en fagdisplay bibliotek. Effekten av tekniken undersöks också genom att mäta Affiniteten hos den erhållna peptiden mot FGFR2 genom isotermisk titrering Calorimetri (ITC), och den biologiska aktiviteten genom en cell proliferation assay. Metoden kan förlängas för screening av små peptider som binder till kolhydrater, odlade celler, eller till och med oorganiska material.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av reagens
- LB (lysogeny buljong) medel: Lös upp 1 g Tryptone, 0,5 g jästextrakt, och 0,5 g NaCl i 100 mL av H2O. autoklav och förvara vid 4 ° c.
- Tetracyklin lager: Förbered 20 mg/mL i 1:1 etanol: H2O. Förvara vid-20 ° c, och Vortex före användning.
- IPTG/X-gal lösning: Blanda 0,5 g IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) och 0,4 g X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactosid) i 10 mL DMF (dimetylformamid). Lösningen kan förvaras vid-20 ° c i ett år i mörker.
- LB + tetracyklin (tet) plattor: Dissove 1 g Bacto-Tryptone, 0,5 g jästextrakt, 0,5 g NaCl, och 1,5 g agar i 100 mL av H2O. autoklav och svalna till ≪ 70 ° c. Tillsätt 100 μL av tetracyklinbeståndet och häll plattorna. Förvara plattorna vid 4 ° c i mörker.
- LB + IPTG/X-gal plattor: Lös upp 1 g Bacto-Tryptone, 0,5 g jästextrakt, 0,5 g NaCl och 1,5 g agar i 100 mL H2O. autoklav och kyl till ≪ 70 ° c. Tillsätt 100 μL av IPTG/X-gal-lösningen och häll plattorna. Förvara plattorna vid 4 ° c i mörker.
- Glycin-HCI buffert (0,2 M): Lös upp 1,5014 g glycin och 100 mg BSA (bovint serumalbumin) i 100 mL av H2O och justera pH till 2,2 med HCl. filtrera lösningen med ett filter på 0,22 μm och förvara vid 4 ° c.
- Tris-HCl buffert (1 M): lös 12,11 g av tris (tris (hydroxymetyl) aminometan) i 100 mL av H2O och justera pH till 9,1 med HCl. autoklav och förvara vid 4 ° c.
- Beläggningsbuffert (0,1 M): Lös upp 1,68 g NaHCO3 i 200 ml H2O och justera pH till 8,6 med NaOH. Filtrera lösningen med ett 0,22 μm filter och förvara vid 4 ° c.
- Blockeringsbuffert: Förbered 0,1 M NaHCO3 (pH 8,6) med 5 mg/ml BSA. Filtrera lösningen med ett 0,22 μm filter och förvara vid 4 ° c.
- TBS: Förbered 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) med 150 mM NaCl. Autoklav och förvara i rumstemperatur.
- 0,05%, 0,1% eller 0,5% TBST: Förbered TBS med 0,05%, 0,1% eller 0,5% (v/v) Tween-20. Filtrera med ett 0,22 μm filter och förvara i rumstemperatur.
- PEG/NaCl: Förbered 20% (w/v) polyetylenglykol – 8000 med 2,5 M NaCl. Autoklav och förvara i rumstemperatur.
- TE lösning: Blanda 1 mL 1 M Tris-HCl (pH 8.0) och 2 mL 50 mM EDTA (pH 8,0) och justera volymen till 100 mL med H2O. autoklav och förvara i rumstemperatur.
- Iodidbuffert: lös 30 g NaI i 50 mL TE, pH 8,0. Förvara lösningen i rumstemperatur i mörker.
- Toppagar: Lös upp 1 g Tryptone, 0,5 g jästextrakt, 0,5 g NaCl och 0,7 g agarin i 100 mL H2O. autoklav och fördela i 15 ml-portioner. Förvara i rumstemperatur för användning.
2. första omgången av biopanning: screening phage kloner som binder till den extracellulära domänen av FGFR2
Anmärkning: Använd aerosol resistenta pipettspetsar och Använd handskar för alla protokoll för att minimera kontaminering med miljö bakteriophages.
- Bered en 10 μg/mL FGFR2 (renhet > 97%; se tabell över material) lösning i beläggningsbuffert. Tillsätt 1 mL av den beredda lösningen till en 35 cm2 skålen och snurra upprepade gånger tills ytan är helt våt. Inkubera över natten vid 4 ° c med skakning.
Anmärkning: för att undvika val av lockbete mål bindemedel, målproteinet måste vara mycket renad. - Inokulera 5 mL LB + tet-medium med Escherichia coli (E. coli) ER2738 i 5 – 10 timmar vid 37 ° c med skakning. De amplifierade ER2738 cellerna kommer att användas för titrering i steg 3,3.
- Häll av beläggnings lösningen från skålen (den överskjutande lösningen måste avlägsnas) och tillsätt den blockerande lösningen. Inkubera vid 4 ° c i minst 1 h.
- Kassera den blockerande lösningen och tvätta 6 gånger snabbt med TBST (TBS + 0,05% (v/v) Tween-20). Undvik att torka ut skålen.
- Rekonstituera det ursprungliga fagbiblioteket i 1 mL TBST [slutlig koncentration av 1011 plackbildande enheter (PFU)], tillsätt till den belagda skålen, och vagga försiktigt för 2 h på en shaker vid rumstemperatur.
- Kassera supernatanten och tvätta skålen 10X med TBST (TBS + 0,05% (v/v) Tween-20), som utförs i steg 2,4.
Obs: den obundna Fager måste avlägsnas grundligt genom kraftig tvättning. - Eluera den bundna Fagen genom att tillsätta 1 mL 0,2 M Glycine-HCl buffert (pH 2,2) till skålen och gunga försiktigt i 10 min vid rumstemperatur.
- Överför eluatet till ett steriliserat microfugerör och neutralisera det med 100 μL av 1 M Tris-HCl, pH 9,1.
ANMÄRKNINGAR: i steg 2,6, ta bort den obundna phage så mycket som möjligt genom att tvätta skålen 10X kraftigt. Detta är ett avgörande steg. Den eluerade Fagen kan förvaras vid 4 ° c i en vecka. Det är dock bäst att gå vidare till nästa steg så snart som möjligt.
3. titer bestämning av eluerade Fagor
- Pre-Warm LB + IPTG/X-gal plattor för minst 1 h vid 37 ° c före användning.
- Förbered 100 μL 10-faldig seriell utspädning (d.v.s. 101, 102, 103 och 104) av eluatet från steg 2,8 i lb. Använd tips med filterpatroner för att undvika kontaminering.
- Låt kulturen från steg 2,2 nå Mid-log fas (OD600 ≈ 0,5). Fördela 200 μL av kulturen i steriliserade mikrofuge rör, en för varje eluat utspädning.
- För att initiera infektionen, tillsätt 10 μl av varje utspädning från steg 3,2 till enskilda mikrofugrör rör som innehåller E. coli ER2738 kulturen från steg 3,3. Vortex snabbt och inkubera i rumstemperatur i 5 min.
- Täck 90 μL av blandningen från steg 3,4 till LB + IPTG/X-gal plattorna med beläggnings pinnar.
- Du kan också smälta toppagar i en mikrovågsugn, fördela 3 mL i sterila odlings rör, en för varje eluatutspädning, och underhålla rören vid 45 ° c. Överför blandningen från steg 3,4 till odlings rör som innehåller 45 ° c toppagar. Blanda snabbt och omedelbart Häll kulturen på en pre-warmed LB/IPTG/X-gal plattan. Luta försiktigt och rotera plattan för att fördela de översta agar jämnt.
- Efter 5 min, Invertera och inkubera plattorna över natten vid 37 ° c.
- Räkna plack på tallrikar med ca 100 plack. Multiplicera varje siffra med utspädningsfaktorn för den plattan för att få fagtitern i PFU per 10 μL.
- Inokulera ytterligare 5 mL LB + tet medium med E. coli ER2738 vid 37 ° c över natten med skakning för fagamplifiering.
Obs: Använd kulturen i ER2738 i mitten av log fas (OD600 ≈ 0,5) för fagtiter. Om de flesta plaketter är vita på X-gal/IPTG-plattor, betyder det att poolen av Faget har kontaminerats med vilda bakteriofages. Om kontaminering sker, är det nödvändigt att börja om med panorering steg från oförorenat phage stamlösning.
4. phage amplifiering
- Späd (1:100) den nattliga kulturen från steg 3,8 i 20 mL LB i en 250 mL Erlenmeyerkolv. Tillsätt det oförstärkta eluatet och inkubera med kraftig skakning för 4,5 h vid 37 ° c.
- Överför kulturen till ett centrifugrör och Centrifugera i 10 min vid 12 000 x g vid 4 ° c. Överför supernatanten till ett nytt rör, Centrifugera igen och kassera pelleten.
- Överför den övre 80% av supernatanten till en ny slang och tillsätt 1/6 volym 20% PEG/2.5 M NaCl. Låt Fagen fällning vid 4 ° c över natten.
Obs: blanda kulturen supernatanten med PEG/2.5 M NaCl väl. - Centrifugera den utfälld Fagen vid 12 000 x g i 15 min vid 4 ° c. Kassera supernatanten, Centrifugera igen och avlägsna den resterande supernatanten med en pipett.
- Omsuspendera pelleten i 1 ml TBS och överför supernatanten till ett mikrofugrör-rör. Centrifugera vid 12 000 x g i 5 min vid 4 ° c.
- Överför supernatanten till ett nytt microfugerör och fäller igen genom att tillsätta 1/6 volym 20% PEG/2.5 M NaCl. Inkubera på is under 15 – 60 min. Centrifugera vid 12 000 x g i 10 min vid 4 ° c. Kassera supernatanten, re-spin, och ta bort resterande supernatanten med en pipett.
- Omsuspendera pelleten i 200 μL av TBS och Centrifugera i ytterligare en minut för att avlägsna orenheter. Överför supernatanten till ett nytt microfugerör för att få det förstärkta eluatet.
- Den amplifierade Fagen enligt beskrivningen i avsnitt 3.
Anmärkning: spädning av det förstärkta eluatet är högre än det oförstärkta eluatet. seriella utspädningar på 108– 1011 föreslås vanligtvis.
5. andra omgången av biopanning
- Upprepa avsnitten 2 till 4.
- Den andra omgången av det förstärkta eluatet på LB + IPTG/X-gal-plattorna enligt beskrivningen i avsnitt 3.
Anmärkning: minska beläggnings koncentrationen av FGFR2 protein till 5 μg/mL. Använd förstärks phage från steg 4,7 som indata och hålla titern samma som i den första omgången (1011 PFU). Förkorta inkubationstiden för fagets och FGFR2-belagda skålen till 1 h och öka Interpoleringskoncentrationen till 0,1% (v/v) i tvätt stegen.
6. tredje omgången av biopanning
- Upprepa steg 2.1-2.6.
- Eluera den bundna Fagen genom att tillsätta 1 mL 20 μM bFGF-lösning (en ligand för FGFR2) till skålen och gunga försiktigt för 60 min vid rumstemperatur.
- Upprepa steg 3.1-3.7.
Anmärkning: minska beläggnings koncentrationen av FGFR2 proteinet till 2,5 μg/mL. Använd den andra omgången av förstärks phage från avsnitt 5 som indata och behåll titern samma som i den första omgången (1011 PFU). Förkorta inkubationstiden för fagets och FGFR2-belagda skålen till 30 min och öka Interpoleringskoncentrationen till 0,5% (v/v) i tvätt stegen.
7. förvärv av plack-DNA för sekvensering
- Plack amplifiering
- Späd ut (1:100) en natt kultur av ER2738 i LB. fördela 1 mL utspädd kultur i en 2 mL tub, en för varje klon som ska karakteriseras.
- Använd en pipettspets för att välja en väl separerad blåfärgad plakett från en titerplatta från avsnitt 6 och överför till röret som innehåller den utspädda kulturen. Välj totalt 15 plaketter.
Obs: plattorna ska vara < 1 – 3 dagar gamla, förvaras vid 4 ° c, och har < 100 plack. - Inkubera rören med kraftig skakning för 4,5 h vid 37 ° c.
- Överför kulturerna till Centrifugera rören och centrifugera vid 12 000 x g i 30 s. överför supernatanten till ett nytt rör och centrifugera igen.
- Överför den övre 80% av supernatanten till ett nytt rör med hjälp av en pipett. Märk detta som det förstärkta fagbeståndet.
Anmärkning: Späd den amplifierade Fagen med en lika volym på 100% steril glycerol och förvara vid-80 ° c för senare användning.
- Extraktion av plack-DNA
- Överför 500 μL av den förstärkta Fagen till ett nytt microfugerör och tillsätt en 1/6 volym på 20% PEG/2.5 M NaCl. Invertera för att blanda och låt den stå i 10 – 20 minuter vid rumstemperatur.
- Centrifugera vid 12 000 x g i 10 min vid 4 ° c och häll sedan av supernatanten.
Observera: Fagpelleten kanske inte syns. - Centrifugera igen. Ta försiktigt bort eventuella kvarvarande supernatanten.
- Omsuspendera pelleten grundligt i 100 μl av jodid-bufferten genom att kraftigt knacka på röret.
- Tillsätt 250 μL 100% etanol och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Centrifugera vid 12 000 x g i 10 min vid 4 ° c och avlägsna supernatanten. Tvätta pellets med 0,5 mL av 70% etanol, snabbt Centrifugera igen, ta bort supernatanten, och kort torka pelleten.
- Omsuspendera pelleten i 30 μL TE-buffert och Använd detta för sekvensering.
Anmärkning: pre-kyla 70% etanol vid-20 ° c i förväg steg 7.2.6. Fagpelleten måste noggrant återsuspenderas i iodidbufferten före tillsats av etanol.
8. identifiering av peptidsekvensen
- Använd-96 gIII sekvensering primer (5 ́-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3 ́) för sekvensering.
- Analysera de peptidsekvenser som visas på phage baserat på DNA sekvenserings resultat.
- Syntetisera små peptider och analysera genom högeffektiv vätskekromatografi (HPLC) och masspektrometri för att bekräfta deras renhet (≥ 98%).
9. detektering av Affiniteten hos den erhållna lilla peptiden och det extracellulära proteinet FGFR2 av ITC
- Degas sterilt vatten med hjälp av ett ultraljud instrument. Lös den lilla peptiden och det FGFR2 extracellulära proteinet i sterilt vatten. Centrifugera dessa prover för att avlägsna kvarvarande fällat.
- Utför ITC-titreringsexperiment vid 25 ° c. Titrera 40 μM av liten peptid i cellen med 1,5 μM FGFR2 protein från sprutan, med en omrörnings hastighet på 750 rpm. Tillsätt FGFR2-proteinet i 2 μL alikvoter (totalt 19 injektioner) med 5 minuters mellanrum.
- Analysera ITC-data med hjälp av en enda plats bindnings modell.
Anmärkning: sterilt vatten måste avgasas och alla prover måste centrifugeras för att avlägsna luftbubblor och kvarvarande orenheter. Försöket skall utföras vid en konstant temperatur på 25 ° c.
10. kontroll av den biologiska aktiviteten hos den erhållna små peptiden med hjälp av en cell spridnings analys
- Seed BALB/c 3T3 celler (3,0 × 103 celler/brunn, 100 μl) i en 96-väl tallrik med Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM) med 10% foster bovin serum (FBS) över natten vid 37 ° c och 5% Co2.
- Ersätt supernatanten med färska DMEM med 0,5% FBS och svälta cellerna i 12 h.
- Gör seriella utspädningar av den lilla peptiden (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20 och 100 μM) med färskt DMEM kompletterat med 0,5% FBS (6 dubbla brunnar/koncentration). Ta bort supernatanten från 96-brunnen plattan och tillsätt 100 μL av den lilla peptid lösningen per brunn. Inkubera i 48 h vid 37 ° c och 5% CO2.
- Ersätt supernatanten med färska DMEM innehållande 10% cell Counting Kit (CCK)-8 lösning och inkubera för 2 h.
- Mät absorbansen för varje brunn vid 450 nm med en mikroplattläsare och analysera cellernas lönsamhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Erhålla en hög affinitet liten peptid inriktning FGFR2.
För att avskärma Fager som riktar FGFR2, användes ett Ph.D.-7 Arkiv i denna studie. En schematisk representation av arbetsflödet visas i figur 1. I denna process, antalet fagindata (PFU) hölls oförändrad, medan beläggningen koncentrationen av FGFR2 protein reducerades gradvis. Resultaten av fagtiter föreslog att antalet återvunna Fager ökade gradvis, och efter 3 omgångar, det var en 65-faldig ökning jämfört med den första omgången (tabell 1).
Därefter plockade vi fagklon slumpmässigt efter den tredje omgången och extraherade phage DNA för sekvensering. En representativ peptid (WRARVPL) som erhållits genom screening hette SP1. Det var därefter syntetiseras, och dess molekylvikt mättes med masspektrometri.
Den SP1 peptid visade hög bindning affinitet mot FGFR2.
Ett ITC-experiment utfördes för att mäta Affiniteten hos den lilla peptiden till FGFR2. Resultatet indikerade att SP1-peptiden har hög affinitet mot FGFR2 (KD ≈ 1,4 μM; Figur 2). Detta datum visade hur effektivt screening protokollet är.
Den SP1 peptid hämmade tillväxten av fibroblaster.
För att undersöka den biologiska aktiviteten av SP1 peptid, en fibroblast proliferation assay utfördes med hjälp av en CCK-8 kit. BALB/c 3T3 celler inkuberades med SP1-peptiden vid olika koncentrationer (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20 och 100 μM). Resultatet föreslog att SP1-peptiden undertryckte tillväxten av BALB/c 3T3-celler (figur 3).
Figur 1. Biopanning för små peptid inriktning FGFR2 använda phage display bibliotek.
(A) schematisk representation av små peptid screening med hjälp av phage display bibliotek. Inkubera biblioteket som innehåller 1011 PFU i en skål belagd med FGFR2. Kassera obundna Fager genom att tvätta och eluera bundna Fager. Förstärka den eluerade Fager och använda dem som indata för nästa omgång av biopanning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Mäta affinitet av interaktion mellan SP1 peptid och FGFR2 av ITC.
1,5 μM FGFR2-protein titrerades med 40 μM av SP1-peptiden. ITC-data analyserades ytterligare med Origin 7,0-programvaran. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Effekt av SP1 peptid på tillväxten av fibroblaster.
BALB/c 3T3-celler behandlades med SP1-peptiden vid olika koncentrationer (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20 och 100 μM). Resultaten uttrycks som medelvärdet ± SD. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Runda | FGFR2 (μg) | Ingång phage (PFU) | Utgång FAGE (PFU) | Återhämtning (%) | Anrikning |
| 1 | 10 | 2,0 x 1011 | 3,98 x 104 | 1,99 x 10-5 | 1 |
| 2 | 5 | 2,0 x 1011 | 8,1 x 105 | 4,05 x 10-4 | 20 |
| 3 | 2,5 | 2,0 x 1011 | 2,6 x 106 | 1,3 x 10-3 | 65 |
Tabell 1. Anrikning av phage inriktning FGFR2 i förhållande till rond 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett kombinatoriskt phage-bibliotek är ett kraftfullt och effektivt verktyg för hög genomflöde av nya peptider som kan binda målmolekyler och reglera deras funktion13. För närvarande, phage display peptid bibliotek har ett brett spektrum av applikationer. Till exempel, de kan användas för att välja bioaktiva peptider bundna till receptor proteiner23, icke-proteinmål24,25, sjukdomsspecifika antigen härmar13, cellspecifika peptider26, 27, eller vävnad/organ-specifika peptider21,28,29 och utveckling av peptid-medierade läkemedel leveranssystem19,30. I korthet, phage display peptid bibliotek är användbara och effektiva system för att identifiera specifika peptider i grundläggande forskning och utveckling av translationell medicin. I studien användes ett bibliotek för screening av små peptider riktade mot FGFR2 för cell tillväxthämning.
Protokollets kritiska steg nämns nedan. I panoreringssteget måste kontaminering av vildtyps-Fager undvikas. Den obundna Fagen måste avlägsnas grundligt genom kraftig tvättning. De LB + IPTG/X-gal plattorna för fagtiter måste förvärmas till 37 ° c. För fagtitern, E. coli ER2738 måste odlas till mitten av log fas (OD600 ≈ 0,5). I steg 4,3 måste Fagen fällas över natten vid 4 ° c. Väl separerade blå plack måste plockas från platea som innehåller mindre än 100 plack för DNA-sekvensering. I steg 7.2.6 måste etanollösningen på 70% förkylas vid 20 ° c i förväg. Slutligen, för ITC-experimentet, måste sterilt vatten avgasas, och alla prover måste centrifugeras för att avlägsna luftbubblor och kvarvarande orenheter. Försöket skall utföras vid en konstant temperatur på 25 ° c.
Vissa faktorer som kan påverka kvaliteten på träffar som erhålls22 är följande: 1) i den första omgången av screening, antalet faginspänningar måste vara 1011 PFU. Men i nästa omgång av screening, kan ingången vara lägre. 2) en ren miljö måste upprätthållas för att undvika vildtyp fagkontaminering. 3) 3 eller 4 omgångar av screening är vanligtvis tillräckliga. Undvik överpanorering av peptid biblioteket. 4) i varje omgång minskar mängden målprotein gradvis, medan interpoleringens innehåll gradvis ökas i tvättsteget. Dessutom är inkubationstiden för Fagen och FGFR2-belagda skålen också gradvis förkortas. Om de flesta av de eluerade fagplaketter är vita på X-gal/IPTG plattor, detta tyder på förorening av vildtyp Fager. För att undvika en låg titer av förstärks phage i panorering processen, kulturer måste vara väl kolsyrade och infekterade tidigt i sin tillväxtfas (OD600 < 0,05).
I denna studie visade SP1-peptiden hög affinitet mot FGFR2 (KD ≈ 1,4 μM; Figur 2) och god biologisk aktivitet (figur 3). Således, våra resultat tyder på att protokollet var effektivt att välja peptider mot den extracellulära domänen av FGFR2 protein, även om Observera att på grund av den höga sekvensen likhet FGFR familjemedlemmar, SP1 peptid kan ha viss bindning affinitet med FGFR familjemedlemmar förutom FGFR2, som kunde vara ansvariga för den biologiska aktiviteten som ses. Dessutom, i panoreringsprocessen, är phage ELISA ett alternativ för att identifiera de positiva Fagin kvalitativt. Men i vårt labb får vi alltid peptiderna genom att sekvensera och utvärdera deras affinitet med ITC-analysen kvantitativt och har inte haft problem med att utvärdera och välja kandidat peptiderna.
Den phage-display biblioteket har flera fördelar22. Biblioteken är av hög kapacitet (upp till 1011 PFU) och kan användas in vitro, in vivo, och ex vivo. Biblioteken är mycket effektiva, lätta att hantera, Billiga och kommersiellt tillgängliga. Det finns dock vissa begränsningar i tekniken. Biblioteken innehåller endast proteinogena aminosyror och är endast mottagliga för linjära och enkla cykliska peptider utan komplicerade strukturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen konflikt mellan ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av det vetenskapliga och tekniska programmet i Guangzhou (nr 2016201604030039).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
References
- Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine & Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).
- Turner, N., Grose, R. Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).
- Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Matsumoto, K., et al. FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer. British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).
- Weiss, J., et al. Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer. Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).
- Babina, I. S., Turner, N. C. Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).
- Katoh, M. Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).
- Soria, J. C., et al. Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors. Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).
- French, D. M., et al. Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models. PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).
- Martinez-Torrecuadrada, J., et al. Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation. Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).
- Palamakumbura, A. H., et al. Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling. Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).
- Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).
- Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science. Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).
- Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries. Methods. 24 (3), 240-246 (2001).
- Rodi, D. J., Makowski, L. Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack. Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).
- Sidhu, S. S. Engineering M13 for phage display. Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).
- Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding. Chemical Biology & Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).
- Askoxylakis, V., et al. Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta. Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).
- Chen, Y., et al. Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display. Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).
- Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. Jr Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
- Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
- Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries. Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).
- Binetruy-Tournaire, R., et al. Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis. The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).
- Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever. Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).
- Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries. Molecules. 16, 1211-1239 (2011).
- Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific. Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).
- Kelly, K. A., et al. Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma. PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).
- Sugihara, K., et al. Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis. Nature Communications. 5, 4478 (2014).
- Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display. Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).
- Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model. Science. 279, 377-390 (1997).
