Summary
Heri presenterer vi en detaljert protokoll for screening av små peptider som binder til FGFR2 ved hjelp av et phage display peptid-bibliotek. Vi analyserer affinitet for de valgte peptider mot FGFR2 in vitro og dens evne til å undertrykke celle spredning.
Abstract
Den menneskelige Fibroblast Vekstfaktorreseptor (FGFR) familien består av fire medlemmer, nemlig FGFR1, FGFR2, FGFR3, og FGFR4, som er involvert i ulike biologiske aktiviteter inkludert celle spredning, overlevelse, migrasjon og differensiering. Flere avvik i FGFR signalering veien, på grunn av mutasjoner eller genet forsterkning hendelser, har blitt identifisert i ulike typer kreft. Derfor har nyere forskning fokusert på å utvikle strategier som involverer terapeutisk målretting av FGFRs. nåværende FGFR-hemmere på ulike stadier av pre-klinisk og klinisk utvikling inkluderer enten små molekyl hemmere av tyrosin kinaser eller monoklonale antistoffer, med bare noen få peptid-baserte hemmere i rørledningen. Her gir vi en protokoll som bruker phage skjermteknologi til skjerm små peptider som motstandere av FGFR2. Et kort, et bibliotek med phage-viste peptider ble inkubert i en plate belagt med FGFR2. Deretter ble ubundet phage vasket av av TBST (TBS + 0,1% [v/v] mellom-20), og bundet phage ble eluert med 0,2 M Glycine-HCl buffer (pH 2,2). Den eluert phage ble ytterligere forsterket og brukt som input for neste runde av biopanning. Etter tre runder med biopanning ble peptid sekvenser av individuelle phage kloner identifisert av DNA-sekvensering. Til slutt ble de skjermede peptider syntetisert og analysert for affinitet og biologisk aktivitet.
Introduction
Fibroblast vekstfaktor reseptorer (FGFRs) spiller nøkkelroller i celle spredning, sår helbredelse, og angiogenese in vivo1. Avvikende aktivering av FGFR signalering observert i en rekke svulster2,3,4,5 inkluderer gen forsterkning, genmutasjoner, kromosomavvik, og overdreven ligand sekresjon6 . Mange hemmere målretting FGFRs har vist lovende terapeutiske effekter i kliniske studier og er i hovedsak klassifisert i tre typer: (1) små molekyl kinase hemmere, som binder seg til intracellulære domenet til FGFR, (2) motstandere rettet mot ekstracellulære segmentet, og (3) FGF ligand feller6. Selv om flere av de små molekylet kinase hemmere har gode terapeutiske effekter både in vitro og in vivo7, de fleste av dem har dårlig Target spesifisitet og vise bivirkninger som hypertensjon8. Flertallet av motstanderne er monoklonale antistoffer9,10 og polypeptider11. Peptider har fordeler fremfor små molekyler på grunn av spesifisitet og lavere bivirkninger. De har også beholde celle permeabilitet og akkumuleres ikke i bestemte organer i forhold til protein narkotika12. Derfor målrettede små peptider er både effektive og potensielle terapeutiske midler.
Phage display-teknologi er et enkelt, men kraftig verktøy for identifisering av små peptider som kan bindes til et gitt molekyl13,14,15. Vi brukte en phage display peptid bibliotek som er basert på en enkel M13 phage med over 109 forskjellige peptid sekvenser vises på halen for binding til målet molekylet (se tabell over materialer)16. På grunn av phages høye affinitet mot det gitte molekylet, kan ubundet phages vaskes bort, og bare tett bundet phages med de ønskede korte peptider beholdes. De gitte molekylære målene kan være immobilisert proteiner17,18, karbohydrater, kultivert celler, eller til og med uorganiske materialer19,20. En spennende sak ble rapportert der organ-spesifikke peptider ble valgt in vivo ved hjelp av phage display teknologi21. Fordelene med phage skjermteknologi inkluderer høy gjennomstrømning, enkel drift, lave kostnader og et bredt spekter av applikasjoner22.
I denne studien, gir vi en detaljert protokoll for screening små peptider binding til immobilisert protein (FGFR2) ved hjelp av en phage display biblioteket. Effekten av teknologien er også undersøkt ved å måle affinitet av den oppnådde peptid mot FGFR2 av isotermiske titrering Reaksjonskalorimetri (ITC), og den biologiske aktiviteten ved en celle spredning analysen. Metoden kan utvides for screening av små peptider som binder til karbohydrater, kultivert celler, eller til og med uorganiske materialer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av reagens
- LB (lysogeny buljong) medium: oppløse 1 g av tryptone, 0,5 g av gjærekstrakt, og 0,5 g NaCl i 100 mL av H2O. autoklav og oppbevares ved 4 ° c.
- Tetracycline lager: Forbered 20 mg/mL i 1:1 etanol: H2O. lagre ved-20 ° c, og Vortex før bruk.
- IPTH/X-gal løsning: Mix 0,5 g av IPTH (isopropylalkohol β-D-1-thiogalactopyranoside) og 0,4 g av X-gal (5-bromo-4-klor-3-indolyl β-D-galactoside) i 10 mL DMF (dimethyl formamid). Oppløsningen kan oppbevares ved-20 ° c i ett år i mørket.
- LB + Tetracycline (tet) plater: Dissove 1 g bacto-tryptone, 0,5 g av gjærekstrakt, 0,5 g av NaCl, og 1,5 g av agar i 100 mL H2O. autoklav og kult å ≪ 70 ° c. Tilsett 100 μL av Tetracycline og hell platene. Lagre plater ved 4 ° c i mørket.
- LB + IPTH/X-gal plater: oppløse 1 g av bacto-tryptone, 0,5 g av gjærekstrakt, 0,5 g av NaCl, og 1,5 g av agar i 100 mL H2O. autoklav og kjølig til ≪ 70 ° c. Tilsett 100 μL av IPTH/X-gal-løsningen og hell platene. Lagre plater ved 4 ° c i mørket.
- Glycine-HCI-buffer (0,2 M): løs opp 1,5014 g av Glycine og 100 mg BSA (blod serum albumin) i 100 mL H2O og Juster pH-verdien til 2,2 med HCL. Filtrer løsningen med et 0,22 μm-filter og oppbevar ved 4 ° c.
- Tris-HCl buffer (1 M): oppløse 12,11 g av Tris (Tris (hydroksymetyl) aminometan) i 100 mL av H2O og justere pH til 9,1 med HCL. autoklav og oppbevares ved 4 ° c.
- Belegg buffer (0,1 M): løs opp 1,68 g NaHCO3 i 200 ml av H2O og Juster pH til 8,6 med NaOH. Filtrer løsningen ved å bruke et 0,22 μm-filter og oppbevares ved 4 ° c.
- Blokkerings buffer: klargjør 0,1 M NaHCO3 (pH 8,6) med 5 mg/ml BSA. Filtrer løsningen ved å bruke et 0,22 μm-filter og oppbevares ved 4 ° c.
- TBS: Forbered 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) med 150 mM NaCl. Autoklav og oppbevares ved romtemperatur.
- 0,05%, 0,1% eller 0,5% TBST: klargjør TBS med 0,05%, 0,1% eller 0,5% (v/v) mellom-20. Filtrer med et 0,22 μm filter og oppbevar ved romtemperatur.
- PEG/NaCl: Forbered 20% (w/v) polyetylen glykol – 8000 med 2,5 M NaCl. Autoklav og oppbevares ved romtemperatur.
- TE-løsning: Bland 1 mL av 1 M Tris-HCl (pH 8.0) og 2 mL 50 mM EDTA (pH 8,0) og juster volumet til 100 mL med H2O. autoklav og oppbevar ved romtemperatur.
- Iodide buffer: løs opp 30 g av NaI i 50 mL TE, pH 8,0. Oppbevar løsningen ved romtemperatur i mørket.
- Topp agar: oppløse 1 g av tryptone, 0,5 g av gjærekstrakt, 0,5 g av NaCl, og 0,7 g agarin i 100 mL av H2O. autoklav og dispensere i 15 ml alikvoter. Oppbevares ved romtemperatur for bruk.
2. første runde av biopanning: screening phage kloner som binder til ekstracellulære domenet til FGFR2
Merk: Bruk aerosol bestandige pipette-spisser og hansker for alle protokoller for å minimere forurensning med miljø bacteriophages.
- Forbered en 10 μg/mL FGFR2 (renhet > 97%; se tabell materiale) løsning i belegg buffer. Tilsett 1 mL av den tilberedte oppløsningen til en 35 cm2 rett og snurr gjentatte ganger til overflaten er helt våt. Ruge over natten ved 4 ° c med risting.
Merk: for å unngå valg av lokkemiddel mål bindemidler må mål proteinet være svært renset. - Vaksinere 5 mL LB + tet medium med Escherichia coli (E. coli) ER2738 i 5 – 10 timer ved 37 ° c med risting. De forsterkede ER2738-cellene vil bli brukt til titrering i trinn 3,3.
- Hell av belegget løsningen fra parabolen (overflødig løsning må fjernes) og legge til blokkering løsning. Ruge ved 4 ° c i minst 1 time.
- Kast blokkerings løsningen og vask 6 ganger raskt med TBST (TBS + 0,05% (v/v] mellom-20). Unngå å tørke ut parabolen.
- Rekonstituer det opprinnelige phage biblioteket i 1 mL av TBST [siste konsentrasjon av 1011 plakk forming UNITS (PFU)], Legg til belagt parabolen, og rock forsiktig for 2 t på en shaker ved romtemperatur.
- Kast supernatanten og vask parabolen 10x med TBST (TBS + 0,05% (v/v) mellom-20), som utført i trinn 2,4.
Merk: de ubundne phages må fjernes grundig ved kraftig vasking. - Eluere den bundne phage ved å tilsette 1 mL 0,2 M Glycine-HCl buffer (pH 2,2) til fatet og rocking forsiktig i 10 min ved romtemperatur.
- Overfør eluatet til en sterilisert microfuge tube og nøytralisere den med 100 μL av 1 M Tris-HCl, pH 9,1.
Merk: i trinn 2,6, Fjern de ubundne phage så mye som mulig ved å vaske parabolen 10x kraftig. Dette er et viktig skritt. Eluert phage kan oppbevares ved 4 ° c i en uke. Det er imidlertid best å gå videre til neste trinn så snart som mulig.
3. titer bestemmelse av eluert phages
- Pre-Warm LB + IPTH/X-gal plater i minst 1 time ved 37 ° c før bruk.
- Forbered 100 μL av 10-fold seriell fortynninger (dvs. 101, 102, 103 og 104) av eluatet fra trinn 2,8 i lb. Bruk tips med filterpatroner for å unngå forurensning.
- La kulturen fra trinn 2,2 nå midt-log fase (OD600 ≈ 0,5). Dispensere 200 μL av kulturen i sterilisert microfuge rør, en for hver eluatet fortynning.
- For å starte infeksjonen, tilsett 10 μL av hver fortynning fra trinn 3,2 til individuelle microfuge tuber som inneholder E. coli ER2738 kulturen fra trinn 3,3. Vortex raskt og ruge ved romtemperatur i 5 min.
- Coat 90 μL av blandingen fra trinn 3,4 i LB + IPTH/X-gal plater med belegg pinner.
- Alternativt, smelte topp agar i en mikrobølgeovn, dispensere 3 mL i sterile kultur rør, en for hver eluatet fortynning, og vedlikeholde rør ved 45 ° c. Overfør blandingen fra trinn 3,4 til kultur rør som inneholder 45 ° c topp agar. Bland raskt og umiddelbart helle kulturen på en pre-varmet LB/IPTH/X-gal plate. Forsiktig vippe og rotere platen for å spre toppen agar jevnt.
- Etter 5 min, inverter og ruge plater over natten ved 37 ° c.
- Telle plaketter på tallerkener med ca. 100 plaketter. Multipliser hvert tall med fortynning faktor for at platen for å få phage titer i PFU per 10 μL.
- Vaksinere ytterligere 5 mL LB + tet medium med E. coli ER2738 ved 37 ° c over natten med risting for phage forsterkning.
Merk: Bruk kulturen i ER2738 i midten av Logg fasen (OD600 ≈ 0,5) for phage titer. Hvis de fleste av plaketter er hvite på X-gal/IPTH plater, betyr det at bassenget av phage har blitt forurenset med vill bacteriophages. Hvis forurensning oppstår, er det nødvendig å starte på nytt med panorering trinnene fra uforurenset phage lagerløsning.
4. Phage forsterkning
- Fortynne (1:100) det overnight kulturen fra steg 3,8 inne 20 mL av LB inne en 250 mL Erlenmeyer kolbe. Tilsett unamplified eluatet og ruge med kraftig risting for 4,5 h ved 37 ° c.
- Overfør kulturen til et sentrifugerør og sentrifuger i 10 min ved 12 000 x g ved 4 ° c. Overfør supernatanten til et nytt rør, sentrifuger igjen og kast pellet.
- Overfør de øvre 80% av supernatanten til et friskt rør og Legg til det 1/6 volum på 20% PEG/2.5 M NaCl. La phage til å utløse 4 ° c over natten.
Merk: Bland kulturen supernatanten med PEG/2.5 M NaCl godt. - Sentrifuger den igangsatte phage ved 12 000 x g i 15 min ved 4 ° c. Kast supernatanten, sentrifuger igjen, og fjern rest supernatanten med en pipette.
- Resuspend pellet i 1 mL av TBS og overføre supernatanten til en microfuge tube. Sentrifuger ved 12 000 x g i 5 min ved 4 ° c.
- Overfør supernatanten til et friskt microfuge rør og utløse igjen ved å legge til 1/6 volum på 20% PEG/2.5 M NaCl. Ruge på isen i 15 – 60 min. sentrifuger ved 12 000 x g i 10 min ved 4 ° c. Kast supernatanten, re-spin, og fjern den gjenværende supernatanten med en pipette.
- Resuspend pellet i 200 og sentrifuge i en ekstra minutt for å fjerne urenheter. Overfør supernatanten til et friskt microfuge rør for å få den forsterkede eluatet.
- Titer den forsterkede phage som beskrevet i avsnitt 3.
Merk: fortynning av den forsterkede eluatet er høyere sammenlignet med unamplified eluatet; seriell fortynninger på 108– 1011 er vanligvis foreslått.
5. andre runde med biopanning
- Gjenta avsnittene 2 til 4.
- Titer den andre runden av forsterket eluatet på LB + IPTH/X-gal plater som beskrevet i avsnitt 3.
Merk: Reduser malings konsentrasjonen på FGFR2 protein til 5 μg/mL. Bruk den forsterkede phage fra trinn 4,7 som inn data og behold titer samme som i første runde (1011 PFU). Reduser inkubasjonstiden for phage og FGFR2-belagt tallerken til 1 h og Øk mellom konsentrasjonen til 0,1% (v/v) i vaske trinnene.
6. tredje runde med biopanning
- Gjenta trinn 2.1-2.6.
- Eluere den bundne phage ved å tilsette 1 mL 20 μM bFGF-oppløsning (en ligand for FGFR2) til fatet og rocking forsiktig i 60 min. ved romtemperatur.
- Gjenta trinn 3.1-3.7.
Merk: Reduser malings konsentrasjonen til FGFR2-proteinet til 2,5 μg/mL. Bruk den andre runden med forsterkede phage fra del 5 som input og behold titer som i første runde (1011 PFU). Reduser inkubasjonstiden for phage og FGFR2-belagt fat til 30 min og Øk mellom konsentrasjonen til 0,5% (v/v) i vaske trinnene.
7. oppkjøp av plakk DNA for sekvensering
- Plakk forsterkning
- Fortynne (1:100) en overnatting kultur ER2738 i LB. dispensere 1 mL fortynnet kultur i en 2 mL tube, en for hver klone som skal karakteriseres.
- Bruk en pipette tips for å velge en godt separert blå farget plakk fra en titer plate fra § 6 og overføre til røret som inneholder fortynnet kultur. Plukk totalt 15 plaketter.
Merk: platene skal være < 1 – 3 dager gamle, oppbevares ved 4 ° c og ha < 100 plaketter. - Ruge rørene med kraftig risting for 4,5 h ved 37 ° c.
- Overfør kulturene til sentrifugerør og sentrifuger ved 12 000 x g for 30 s. overføre supernatanten til et friskt rør og sentrifuger igjen.
- Bruk en pipette og Overfør de øvre 80% av supernatanten til et friskt rør. Merk dette som forsterket phage lager.
Merk: fortynne den forsterkede phage med et likt volum på 100% steril glyserol og oppbevares ved-80 ° c for senere bruk.
- Ekstraksjon av plakk DNA
- Overfør 500 til den forsterkede phage til et friskt microfuge rør og tilsett et 1/6 volum på 20% PEG/2.5 M NaCl. Inverter å mikse og la den stå i 10-20 min ved romtemperatur.
- Sentrifuger ved 12 000 x g i 10 min ved 4 ° c og hell av supernatanten.
Merk: Phage pellet er kanskje ikke synlig. - Sentrifuger igjen. Fjern eventuelle gjenværende supernatanten forsiktig.
- Resuspend pellet grundig i 100 μL av iodide buffer ved kraftig tappe røret.
- Tilsett 250 μL av 100% etanol og ruge i 15 min ved romtemperatur.
- Sentrifuger ved 12 000 x g i 10 min ved 4 ° c og fjern supernatanten. Vask pellet med 0,5 mL 70% etanol, raskt sentrifuger igjen, fjerne supernatanten, og kort tørke pellet.
- Resuspend pellet i 30 μL av TE buffer og bruke dette for sekvensering.
Merk: pre-Cool den 70% etanol ved-20 ° c i forkant av Step 7.2.6. Phage pellet må være grundig resuspendert i iodide buffer før tilsetning av etanol.
8. identifisering av peptid sekvensen
- Bruk-96 gIII sekvensering primer (5 ́-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG – 3 ́) for sekvensering.
- Analysere peptid sekvensene som vises på phage basert på resultatene av DNA-sekvensering.
- Syntetisere små peptider og analyser av høyytelses flytende kromatografi (HPLC) og masse massespektrometri for å bekrefte renheten (≥ 98%).
9. oppdage affinitet av de oppnådde små peptid og ekstracellulære protein av FGFR2 av ITC
- Degas sterilt vann ved hjelp av et ultralyd instrument. Oppløse den lille peptid og FGFR2 ekstracellulære protein i sterilt vann. Sentrifuger disse prøvene for å fjerne rester av utfelling.
- Utfør ITC titrering eksperimenter ved 25 ° c. Titrere 40 μM av et lite peptid i cellen med 1,5 μM av FGFR2 protein fra sprøyten, med en gripende hastighet på 750 RPM. Tilsett FGFR2-proteinet i 2 μL alikvoter (for totalt 19 injeksjoner) ved 5-min intervaller.
- Analysere ITC-data ved hjelp av en enkelt-område bindende modell.
Merk: sterilt vann må være degassed, og alle prøvene må være sentrifugert for å fjerne luftbobler og rester av urenheter. Eksperimentet må gjennomføres ved en konstant temperatur på 25 ° c.
10. verifisere biologisk aktivitet av innhentet liten peptid ved hjelp av en celle spredning analysen
- Seed BALB/c 3T3 celler (3,0 × 103 celler/brønn, 100 μL) i en 96-brønn plate med Dulbecco ' s modifisert Eagle medium (DMEM) med 10% fosterets storfe serum (FBS) over natten ved 37 ° c og 5% co2.
- Skift ut supernatanten med friskt DMEM med 0,5% FBS og sulte cellene i 12 timer.
- Gjør seriell fortynninger av det lille peptid (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20 og 100 μM) med fersk DMEM supplert med 0,5% FBS (6 dupliserte brønner/Concentration). Fjern supernatanten fra 96-brønn platen og tilsett 100 μL av den lille peptid løsningen per brønn. Ruge for 48 h ved 37 ° c og 5% CO2.
- Erstatt supernatanten med frisk DMEM som inneholder 10% Cell Counting Kit (CCK)-8 løsning og ruge for 2 t.
- Mål absorbansen av hver brønn på 450 nm med en mikroplate leser og analysere celle levedyktighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Få en høy affinitet liten peptid målretting FGFR2.
Til skjermen phages målretting FGFR2, en Ph.D.-7 biblioteket ble brukt i denne studien. En skjematisk fremstilling av arbeidsflyten vises i figur 1. I denne prosessen ble antall phage input (PFU) holdt uendret, mens belegget konsentrasjonen av FGFR2 protein ble redusert gradvis. Resultatene av phage titer antydet at antall gjenopprettede phages økte gradvis, og etter 3 runder, var det en 65-fold økning i forhold til den første runden (tabell 1).
Deretter plukket vi phage kloner tilfeldig etter den tredje runden og pakket ut phage DNA for sekvensering. En representant peptid (WRARVPL) innhentet av screening ble kalt SP1. Det ble deretter syntetisert, og Molekylvekten ble målt ved masse massespektrometri.
Den SP1 peptid viste høy bindende affinitet mot FGFR2.
En ITC eksperimentet ble gjennomført for å måle affinitet av den lille peptid til FGFR2. Resultatet indikerte at SP1 peptid har høy affinitet mot FGFR2 (KD ≈ 1,4 μM; Figur 2). Denne datoen viste effektiviteten av screening-protokollen.
Det SP1 peptid hemmet veksten av fibroblaster.
Å etterforske det biological aktivitet av det SP1 peptid, en Fibroblast spredningen analysen var utført benytter en CCK-8 utstyr. BALB/c 3T3 celler var inkubert med SP1 peptid på ulike konsentrasjoner (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20, og 100 μM). Resultatet foreslo at SP1 peptid undertrykt veksten av BALB/c 3T3 celler (Figur 3).
Figur 1. Biopanning for små peptid målretting FGFR2 bruker phage display biblioteket.
(A) skjematisk fremstilling av små peptid-screening ved bruk av phage visnings bibliotek. Ruge biblioteket inneholder 1011 PFU i en tallerken BELAGT med FGFR2. Kast ubundne phages ved å vaske, og eluere bundne phages. Forsterk eluert phages og bruk dem som inn data for neste runde med biopanning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Måle affinitet av samspillet mellom SP1 peptid og FGFR2 av ITC.
1,5 μM FGFR2 protein ble titrert med 40 μM av SP1 peptid. ITC-dataene ble videre analysert ved hjelp av Origin 7,0-programvaren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Effekten av SP1 peptid på veksten av fibroblaster.
BALB/c 3T3 celler ble behandlet med SP1 peptid på ulike konsentrasjoner (0, 0,0064, 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20 og 100 μM). Resultatene uttrykkes som gjennomsnittet ± SD. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Runde | FGFR2 (μg) | Input-phage (PFU) | Utdata-phage (PFU) | Gjenoppretting (%) | Berikelse |
| 1 | 10 | 2,0 x 1011 | 3,98 x 104 | 1,99 x 10-5 | 1 |
| 2 | 5 | 2,0 x 1011 | 8,1 x 105 | 4,05 x 10-4 | 20 |
| 3 | 2,5 | 2,0 x 1011 | 2,6 x 106 | 1,3 x 10-3 | 65 |
Tabell 1. Berikelse av phage målretting FGFR2 forhold til runde 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En Kombinatorisk phage biblioteket er et kraftig og effektivt verktøy for høy gjennomstrømming screening av romanen peptider som kan binde målmolekyler og regulere deres funksjon13. Foreløpig phage display peptid bibliotekene har et bredt spekter av applikasjoner. For eksempel kan de brukes til å velge bioaktive peptider bundet til reseptor proteiner23, ikke-protein mål24,25, sykdom-spesifikke antigen etterligner13, celle-spesifikke peptider26, 27, eller vev/organ-spesifikke peptider21,28,29 og utvikling av peptid-mediert legemiddel leveranse systemer19,30. Kort sagt, phage display peptid bibliotekene er nyttige og effektive systemer for å identifisere spesifikke peptider i grunnleggende forskning og utvikling av translational medisin. I studien ble et bibliotek brukes for screening små peptider målretting FGFR2 for cellevekst hemming.
De kritiske trinnene i protokollen er nevnt nedenfor. I panorering må forurensning av vill-type phages unngås. Den ubundne phages må fjernes grundig ved kraftig vasking. LB + IPTH/X-gal platene for phage titer må være forvarmet til 37 ° c. For phage titer, E. coli ER2738 må dyrkes til midten av loggen fase (OD600 ≈ 0,5). I trinn 4,3 må phage igangsettes over natten ved 4 ° c. Vel separerte blå plaketter må plukkes fra platea som inneholder mindre enn 100 plaketter for DNA-sekvenser. I trinn 7.2.6 må 70% etanol oppløsningen kjøles ned ved 20 ° c på forhånd. Til slutt, for ITC eksperimentet, sterilt vann må være degassed, og alle prøvene må være sentrifugert for å fjerne luftbobler og rester av urenheter. Eksperimentet må gjennomføres ved en konstant temperatur på 25 ° c.
Noen faktorer som kan påvirke kvaliteten på treff oppnådd22 er som følger: 1) i den første runden av screening, antall phage innganger må være 1011 PFU. Men i neste runde av screening, input kan være lavere. 2) et rent miljø må opprettholdes for å unngå vill-type phage forurensning. 3) 3 eller 4 runder med screening er vanligvis tilstrekkelig. Unngå over-panorering av peptid biblioteket. 4) i hver runde reduseres mengden mål protein gradvis, mens innholdet i mellom økes gradvis i vaske trinnet. I tillegg er inkubasjonstid av phage og FGFR2-belagt parabol også gradvis forkortet. Hvis de fleste av eluert phage plaketter er hvite på X-gal/IPTH plater, dette tyder på forurensning av vill-type phages. For å unngå en lav titer av forsterket phage i panorering prosessen, kulturer må være godt luftet og smittet tidlig i sin vekstfase (OD600 < 0,05).
I denne studien, den SP1 peptid viste høy affinitet mot FGFR2 (KD ≈ 1,4 μM; Figur 2) og god biologisk aktivitet (Figur 3). Således, våre resultater foreslå det protokollen var effektiv inne velger peptider imot det ekstracellulære domenen av FGFR2 protein, til tross for note det på grunn av det høy orden likheten av FGFR slekt medlemmer, det SP1 peptid kanskje ha noe innbindingen slektskap med FGFR familiemedlemmer foruten FGFR2, som kan være ansvarlig for den biologiske aktiviteten sett. Også i panorering prosessen, er phage ELISA et alternativ til å identifisere de positive phages kvalitativt. Men i laboratoriet vårt, vi alltid få peptider ved sekvensering og evaluere deres affinitet ved ITC analysen kvantitativt og har ikke hatt problemer med å evaluere og velge kandidat peptider.
Phage-biblioteket har flere fordeler22. Bibliotekene er av høy kapasitet (opp til 1011 PFU) og kan brukes in vitro, in vivo, og ex vivo. Bibliotekene er svært effektiv, lett å håndtere, billig og kommersielt tilgjengelig. Det er imidlertid visse begrensninger av teknologien. Bibliotekene bare inneholde proteinogenic aminosyrer og er bare mottagelig for lineære og enkle sykliske peptider uten kompliserte strukturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konflikt med økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Science and Technology program of Guangzhou (nr. 2016201604030039).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
References
- Eswarakumar, V. P., Lax, I., Schlessinger, J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine & Growth Factor Reviews. 16 (2), 139-149 (2005).
- Turner, N., Grose, R. Fibroblast growth factor signaling: from development to cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (2), 116-129 (2010).
- Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Matsumoto, K., et al. FGFR2 gene amplification and clinicopathological features in gastric cancer. British Journal of Cancer. 106 (4), 727-732 (2012).
- Weiss, J., et al. Frequent and focal FGFR1 amplification associates with therapeutically tractable FGFR1 dependency in squamous cell lung cancer. Science Translational Medicine. 2 (62), 62ra93 (2010).
- Babina, I. S., Turner, N. C. Advances and challenges in targeting FGFR signaling in cancer. Nature Reviews Cancer. 17 (5), 318-322 (2017).
- Katoh, M. Fibroblast growth factor receptors as treatment targets in clinical oncology. Nature Reviews Clinical Oncology. 16 (2), 105-122 (2019).
- Soria, J. C., et al. Phase I/IIa study evaluating the safety, efficacy, pharmacokinetics, and pharmacodynamics of lucitanib in advanced solid tumors. Annals of Oncology. 25 (11), 2244-2251 (2014).
- French, D. M., et al. Targeting FGFR4 inhibits hepatocellular carcinoma in preclinical mouse models. PLoS ONE. 7 (5), e36713 (2012).
- Martinez-Torrecuadrada, J., et al. Targeting the extracellular domain of fibroblast growth factor receptor 3 with human single-chain Fv antibodies inhibits bladder carcinoma cell line proliferation. Clinical Cancer Research. 11 (17), 6280-6290 (2005).
- Palamakumbura, A. H., et al. Lysyl oxidase propeptide inhibits prostate cancer cell growth by mechanisms that target FGF-2-cell binding and signaling. Oncogene. 28 (38), 3390-3400 (2009).
- Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discovery Today. 9 (12), 525-529 (2004).
- Wu, C. H., Liu, I. J., Lu, R. M., Wu, H. C. Advancement and applications of peptide phage display technology in biomedical science. Journal of Biomedical Science. 23, 8 (2016).
- Kay, B. K., Kasanov, J., Yamabhai, M. Screening phage-displayed combinatorial peptide libraries. Methods. 24 (3), 240-246 (2001).
- Rodi, D. J., Makowski, L. Phage-display technology - Finding a needle in a vast molecular haystack. Current Opinion in Biotechnology. 10, 87-93 (1999).
- Sidhu, S. S. Engineering M13 for phage display. Biomolecular Engineering. 18, 57-63 (2002).
- Hamzeh-Mivehroud, M., Mahmoudpour, A., Dastmalchi, S. Identification of new peptide ligands for epidermal growth factor receptor using phage display and computationally modeling their mode of binding. Chemical Biology & Drug Design. 79 (3), 246-259 (2012).
- Askoxylakis, V., et al. Peptide-based targeting of the platelet-derived growth factor receptor beta. Molecular Imaging and Biology. 15 (2), 212-221 (2013).
- Chen, Y., et al. Transdermal protein delivery by a coadministered peptide identified via phage display. Nature Biotechnology. 24 (4), 455-460 (2006).
- Azzazy, H. M., Highsmith, W. E. Jr Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
- Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Organ targeting In vivo using phage display peptide libraries. Nature. 380 (6572), 364-366 (1996).
- Liu, R., Li, X., Xiao, W., Lam, K. S. Tumor-targeting peptides from combinatorial libraries. Advanced Drug Delivery Reviews. 110-111, 13-37 (2017).
- Binetruy-Tournaire, R., et al. Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis. The EMBO Journal. 19, 1525-1533 (2000).
- Peng, Y., Zhang, Y., Mitchell, W. J., Zhang, G. Development of a Lipopolysaccharide-Targeted Peptide Mimic Vaccine against Q Fever. Journal of Immunology. 189, 4909-4920 (2012).
- Lamichhane, T. N., Abeydeera, N. D., Duc, A. C., Cunningham, P. R., Chow, C. S. Selection of Peptides Targeting Helix 31 of Bacterial 16S Ribosomal RNA by Screening M13 Phage-Display Libraries. Molecules. 16, 1211-1239 (2011).
- Sahin, D., Taflan, S. O., Yartas, G., Ashktorab, H., Smoot, D. T. Screening and Identification of Peptides Specifically Targeted to Gastric Cancer Cells from a Phage Display Peptide Library. Asian Pacific. Journal of Cancer Prevention. 19 (4), 927-932 (2018).
- Kelly, K. A., et al. Targeted nanoparticles for imaging incipient pancreatic ductal adenocarcinoma. PLOS Medicine. 5 (4), e85 (2008).
- Sugihara, K., et al. Development of pro-apoptotic peptides as potential therapy for peritoneal endometriosis. Nature Communications. 5, 4478 (2014).
- Rafii, S., Avecilla, S. T., Jin, D. K. Tumor vasculature address book: Identification of stage-specific tumor vessel zip codes by phage display. Cancer Cell. 4, 331-333 (2003).
- Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Cancer Treatment by Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model. Science. 279, 377-390 (1997).
