Summary
우리는 골격 근의 중재 된 손상과 자가 전달 siRNA의 주입의 조합을 사용하여 위성 세포에서 특정 유전자의 기능적 손실을 조사하는 생체 내 방법을 설명합니다.
Abstract
골격 근육은 부상 후 재생할 수있는 엄청난 능력을 가지고. 이 과정은 주로 근육 줄기 세포에 의해 구동, 또한 위성 세포라고. 위성 세포는 휴식 골격 근에서 전사 인자 Pax7 및 기저 층의 밑에 그들의 위치의 발현을 특징으로 한다. 부상시, 위성 세포는 활성화 얻을, 새로운 myofibers를 형성하거나 손상된 것들과 융합하기 위해 자기 갱신 또는 분화를 받아야. 생체 내 위성 세포의 기능은 골격 근의 심독소 기반 부상 모델을 사용하여 조사 될 수있다. 골격 근의 재생 동안 하나의 유전자의 기능을 연구하기 위해, 형질전환 마우스 모델은 주로 사용된다. 여기에서, 우리는 형질전환 마우스에 대한 대체 방법을 제시하고, 재생 중에 위성 세포에서 유전자 기능을 조사하기 위해, 예를 들어, 형질전환 마우스를 사용할 수 없는 경우에 제시한다. 우리는 특정 골격 근의 심장 독소 매개 상해를 다른 세포 중 위성 세포에 의해 채택되는 재생 근육으로 자체 전달 siRNA의 주입과 결합합니다. 이에 따라, 우리는 형질전환 마우스에 대한 필요 없이 생리적 조건하에서 재생 동안 위성 세포에서 유전자 기능을 분석하는 방법을 제공한다.
Introduction
골격 근은 자발적인 운동을 가능하게 하는 총 체중의 약 40%를 나타내는 신체의 가장 큰 조직입니다. 골격근의 조직 구조는 주로 말초 신경계, 혈관 계통 및 간질 세포로부터의 다양한 다른 세포뿐만 아니라 후미, 말기 분화, 다누핵근섬유로로 구성된다 1. 중요한 것은, 골격 근은 부상 또는 손상 시 기능을 재생하고 복원 할 수있는 엄청난 능력을 가지고2. 이 과정은 또한 위성 세포라고 조직 상주 근육 줄기 세포에 따라 달라집니다3,4. 위성 세포는 근섬유와 기저 층층 사이에 위치하며 전사 인자 Pax75,6,7의발현을 특징으로 한다. 동압 조건하에서, 위성 세포는 정적이지만 외상성 부상으로 인해 활성화됩니다, 예를 들어, 편심 운동을 통해 또는 뱀 독 심장독소의주입을 통해 실험적으로6,8. 일단 활성화되면, Pax7 양성 위성 세포는 MyoD 및 Myf5를 공동 발현하여 줄기 세포를 myogenic 분화에 투입합니다. 약정 요인의 upregulation에 저항하는 위성 세포는 그들의 줄기 잠재력을 유지하고 미래 요구를 위해 줄기 세포 풀을 보충하기 위하여 정지로 돌아갑니다. 근생 전구 풀의 확장 후, 전사 네트워크는 세포 주기 출구 및 말단 분화를 개시하기 위해 Myogenin과 같은 분화 인자에 의해 활성화된다. 이들은 myoprogenitors는 그 때 myonuclear 도메인의 크기를 유지하기 위하여 myonuclei를 기여하는 기존 myofibers를 서로 융합합니다. myofibers는 Myosin 중사슬 같이 말단 근육 분화 유전자를 표현합니다. 마지막으로, 새로 형성된 근섬유는 성장하고 성숙하여골격근9,10의기능단위를 구축한다.
골격 근의 재생은 근육 질환 또는 노화 를 포함한 다양한 조건에 의해 영향을받을 수 있습니다11,12,생명을 위협하는 조건에 온화한 손상에 이르기까지, 예를 들어, Duchenne 근 이영양증13 , 14. 따라서 재생 의학은 위성 세포 기능15,16을대상으로 하여 고유의 재생 력을 사용하여 손상되거나 오작동하는 골격 근 조직을 복원하는 것을 목표로합니다. 골격 근의 재생 동안 그들의 내 인 성 틈새 시장에서 위성 세포의 포괄적인 이해의 전체 잠재력을 사용 하려면 필요. 그들의 myofibers에 인접한 위성 세포를 격리하기 위하여 실험적인 접근이 존재하더라도17,그들의 환경과 위성 세포의 세포 그리고 조직 상호 작용의 완전한 복잡성은 생체 내에서만 재충전될 수 있습니다. 그런 점에서, 골격 근 재생에 대한 큰 지식은 마우스 부상 모델2,18을사용하여 획득되었습니다.
여기서 우리는 생체 내에서 경골 전방 근육의 심독소 유도 손상의 줄기 세포 매개 재생을 연구하기 위해 특정 실험 마우스 손상 모델을 소개한다. 심폐소생술, 근섬유 탈분극 및 괴사를 일으키는 원인이 되는 뱀 유래 세포 용해 독소는, 차례차례로 재생에 선행된 조직 변성을 일으키는 원인이 되는 경골 전방 근육으로 주입됩니다. 급성 재생 동안 유전자의 기능을 분석하기 위해, 자기 전달 siRNAs는 부상 후 3 일째에 주입, 위성 세포 확장의 절정에. 실험 동물은 다양한 시점에서 희생되고 경골 전방 근육이 수집됩니다. 해부된 근육은 동결되고 추가 저온 절편을 위해 처리됩니다. 면역 형광 현미경 검사법은 재생의 마커를 분석하기 위하여 그 때 이용됩니다. 이 방법은 야생형 마우스를 사용하여 골격근의 위성 세포 구동 재생 동안 단일 유전자의 기능을 조사할 수 있게 한다.
Protocol
모든 동물 절차는 튀링거 란데삼트 퓌르 르벤스미텔시슈헤이트 und Verbraucherschutz (03-048/16)의 동물 복지부에 의해 승인되었다; TLV; 바트 랑겐살자, 독일).
1. 심장 독소 유도 근육 부상
참고: 국가 동물 복지법에 따라 적절한 무균 조건하에서 살아있는 쥐와 관련된 모든 실험을 수행하십시오. 또한 동물희생은 국가동물복지법에 따라 실시되어야 합니다.
- 흡입 마취에 사용되는 흡입 상자와 70 % 에탄올로 수술 부위를 소독하십시오. 수술이 일어날 난방 패드에 멸균 수술 천을 놓습니다.
- 37 °C에서 가열 패드를 켭니다.
- 수술 시작 15분 전에 진통제(예: 1 mg/kg 체중 멜록시캄 피하)를 투여하십시오.
참고: 일반적인 실험의 경우, 적어도 6주 령, 성냥, 그리고 좋은 일반적인 신체 상태에 있는 마우스를 사용하십시오. - 심동독소 용액(0.9% NaCl에서 20 μM)을 준비하고 용액을 -20°C에 보관합니다.
- 카디오톡신 용액이 실온(RT)에 도달할 수 있도록 하십시오.
- 흡입 상자에 마우스를 전송하고 이소플루란으로 마취를 유도 (개시 3.5 – 5% 순수 산소). 발가락 핀치에 대한 반응이 부족한 마취의 깊이를 확인하십시오.
- 깨끗한 종이 타월에 마우스를 놓고 노즈 마스크 (1.5 - 3 % 순수 산소의 이소플루란)로 마취를 유지하십시오. 두개골 하부 다리의 주사 부위를 면도하십시오 (무릎에서 발까지, 그림 1A). 과도하게 느슨한 모발을 모두 제거합니다.
참고: 실내의 쉐이드 및 사출 영역을 물리적으로 분리하면 주사에 대한 멸균 조건이 더 많이 제공됩니다. - 살균 수술 용 천으로 덮인 가열 패드의 측면 재배치 위치에 마우스를 놓고 노즈 마스크 (1.5 - 3 %의 순산소 이소플루란)로 마취를 유지하십시오.
- 70 % 에탄올로 두개골 하부 다리 (무릎에서 발까지)의 주사 부위를 소독하십시오.
- 마취의 적절한 깊이를 보장하기 위해 근육 주사를 시작하기 전에 발가락 핀치를 수행합니다.
- 29 게이지 바늘로 인슐린 주사기를 사용하여 경골 전방 근육에 50 μL 카디오톡신 (0.9 % NaCl에서 20 μM)을 주입하십시오. 첫째, 피부를 관통하는 것만으로 무릎의 말단.
- 바늘을 근육에 완전히 삽입하고 (경골에 대한 myofiber 방향 / 평행) 천천히 심장 독소 (10-20 s)를 주입하면서 바늘을 앞뒤로 움직이면서 심장 독소의 균일 한 분포를 허용합니다. 전체 경골 전방 근육을 손상(그림 1B,C).
참고: 한쪽 다리에서만 경골 전방 근육을 손상시키면 반대쪽 경골 전방 근육이 심장 독소 손상 전에 병리학적으로 영향을받지 않았다는 것을 결정하는 내부 제어 역할을 할 수 있습니다. - 가열 패드에 놓인 케이지로 마우스를 다시 옮기고 동물이 의식이 있고 외래가 될 때까지 회복 과정을 모니터링합니다.
참고: 마우스는 약간의 절뚝거리는 것만 을 보여줍니다. 쥐가 심하게 절뚝거리고 다리에 무게를 두지 않으면 마우스를 희생하십시오. - 다음 동안 진통제를 관리 2 일 (예를 들어, 1 mg / kg 체중 멜 록시캄 피하, 모든 24 시간) 매주 모니터링.
2. 재생 Tibialis 전방 근육에 자기 전달 siRNA의 주입 (3 일째에 포스트 심장 독소 부상)
- siRNA 용액을 제조업체의 지시에 따라 0.9% NaCl(최종 농도 2 μg/μL)에서 siRNA(예: siRNA 스마트 풀)를 재중단하여 준비합니다.
참고: siRNA는 세포에 의한 수동 적인 섭취를 용이하게하고 뉴클레아제 분해로부터 보호하기 위해 화학적으로 변형됩니다. 형질감염 시약이 필요하지 않으며 독성을 감소시킵니다. 동일한 유전자를 표적화하는 4개의 독립적인 siRNA 서열의 스마트 풀을 사용하여 녹다운 효율을 증가시킨다. - siRNA를 -20°C에 저장하고 얼음에 얼음으로 옮기고 수술실로 옮김을 옮김을 옮김.
- 흡입 마취에 사용되는 흡입 상자와 70 % 에탄올로 수술 부위를 소독하십시오. 수술이 일어날 난방 패드에 멸균 수술 천을 놓습니다.
- 37 °C에서 가열 패드를 켭니다.
- 흡입 상자에 마우스를 전송하고 이소플루란으로 마취를 유도 (개시 3.5 – 5% 순수 산소). 발가락 핀치에 대한 반응이 부족한 마취의 깊이를 확인하십시오.
- 살균 수술 용 천으로 덮인 가열 패드의 측면 재배치 위치에 마우스를 놓고 노즈 마스크 (1.5 - 3 %의 순산소 이소플루란)로 마취를 유지하십시오.
- 두개골 하부 다리의 주사 부위를 소독하십시오 (무릎에서 발까지).
- 마취의 적절한 깊이를 보장하기 위해 근육 주사를 시작하기 전에 발가락 핀치를 수행합니다.
- 최대 50 μL siRNA 용액(0.9% NaCl에서 최대 100 μg 총; 표적 유전자에 대한 지시; 스크램블된 siRNA를 대조군으로 사용)을 29 G 바늘로 인슐린 주사기를 사용하여 부상당한 경골 전방 근육에 주입한다. 첫째, 피부를 무릎의 말단으로 관통 한 다음 바늘을 경골 전방 근육에 삽입하십시오.
- 바늘을 근육에 완전히 삽입하고 (경골에 대한 myofiber 방향 / 평행) siRNA 용액을 천천히 주입 (10 – 20 s) 바늘을 앞뒤로 움직이면서 근육의 전체 길이를 따라 천천히 주입하여 siRNA를 따라 균일 한 분포를 허용합니다. 전체 경골 전방 근육.
- 가열 패드에 놓인 케이지로 마우스를 다시 옮기고 동물이 의식이 있고 외래가 될 때까지 회복 과정을 모니터링합니다.
참고: 진통제는 반드시 siRNA의 주입을 따르는 것은 아닙니다.
3. 티비알리스 전방 근육의 해부
- 기포를 피하기 위해 사용 전에 적어도 12 시간 전에 동결 용액 (2 부분 OCT 화합물 및 탈이온 수에서 1 부분 30 % 자당을 준비하십시오.)
- 연필 주위에 알루미늄 호일을 감싸서 냉동 금형을 준비하고 테이프로 밀봉하십시오. 금형의 바닥이 균일하고 닫힌 표면을 제공하는 것이 중요합니다.
참고: 더 작은 동결 금형은 동결 아티팩트를 피하기 위해 근육의 빠른 동결을 허용합니다. - 마우스를 희생, 예를 들어,CO2 흡입에 의해, 재생의 각각시점에서 70% 에탄올로 전체 마우스 및 해부 도구를 분무한다.
참고: 경부 탈구는 경골 전방 근육을 분리 할 때 다리에 과도한 출혈을 피하기 위해 적용 할 수 있습니다. - 매우 미세한 날카로운 가위로 발목의 피부를 절단하고 집게를 사용하여 무릎쪽으로 피부를 당겨 부상당한 뒷다리에서 털과 피부를 제거합니다.
- 발목에 경골 전방 힘줄을 노출하려면, 발쪽으로 남아있는 피부를 당기거나 날카로운 가위로 잘라.
참고: 마우스를 지원 보드에 고정하여 더 나은 고정을 허용할 수 있습니다. - 경골 전방 근육을 수확하기 전에 미세 한 집게 (Dumont 5 또는 7, 직선 또는 곡선)를 사용하여 근막을 제거하십시오. 부상당한 다리의 발목에 있는 경골 뼈 옆의 근막을 통해 닫힌 포셉을 꼬집습니다(그림2A). 포셉을 무릎 쪽으로 이동시켜 근막을 찢고 경골 전방 근육을 노출시다(그림 2B).
- 경골 전방 근육을 분리하려면 말단 힘줄을 노출하고 미세 한 집게로 잡아 (Dumont 7, 곡선). 스프링 가위를 사용하여 힘줄을 잘라 (절삭 날 : 5mm, 팁 직경 : 0.35mm) 무릎쪽으로 근육 (힘줄에 들고)를 당깁니다.
- 경골 전방 근육을 수확하려면 날카로운 가위를 사용하여 가능한 한 무릎에 가깝게 자른다.
- 동결하기 전에 직선 가위로 근육의 중간 배 영역에서 경골 전방 근육을 동일한 크기의 두 반으로 잘라 중간 배 영역의 분석을 허용합니다(그림 2C,D).
- 동결 용액으로 냉동 금형을 반쯤 채웁니다.
- 경골 전방 근육의 두 반쪽을 금형의 바닥을 향한 중간 배 영역과 함께 동결 금형에 삽입합니다(그림2E). 근육의 기울기를 피하기 위해 경골 앞쪽 절반이 동결 금형의 벽에 기대어 있는 수직 위치에 삽입되었는지 확인하십시오.
참고: 금형에 더 많은 동결 용액이 있을수록 동결 시간이 길어지므로 저온 아티팩트의 위험이 증가합니다. - 집게를 사용하여 동결 몰드를 잡고 액체 질소로 반쯤 옮긴다(그림2F). 동결 공정 중에 액체 질소가 동결 금형에 들어가지 않도록 하십시오.
- 동결 과정을 관찰하면 동결 매체가 투명에서 흰색으로 색을 변경하고 단단해집니다. 동결 금형을 액체 질소에 몇 초 간 잠기고 동결 금형을 -80 °C 냉동고로 옮기거나 향후 처리를 위해 얼음을 건조시십시오.
- 동결된 근육을 동결 형에 -80°C에서 추가 사용후 까지 보관하십시오.
참고: 냉동 금형은 24웰 플레이트 또는 1.5mL 반응 튜브에 잘 맞아 라벨링 및 정리된 보관이 허용됩니다. - 드라이 아이스에서 항상 추가 사용을 위해 냉동 금형의 근육을 처리하십시오.
4. 재생 Tibialis 전방 근육의 냉동 절제
- 단면을 시작하기 전에, 저온 극저온의 챔버 온도를 -21°C로 설정하고, 물체 온도를 -20°C로 설정하고 절단 두께를 10, 12 또는 14 μm(향후 용도에 따라 다름)(도3A).
- 동결 금형의 근육 샘플을 저온 온도로 옮기고 몇 분 동안 온도에 적응시키십시오. 이 시간 동안 현미경 슬라이드에 라벨을 붙입니다.
- 저온 유지 모원 내부의 미리 냉각 된 집게를 사용하여 내장 된 근육 주위의 호일을 제거하십시오. 냉동 중형이 쉽게 해동되기 시작하면 샘플을 만지지 마십시오.
- 경골 전방 근육의 중간 배 영역으로 샘플을 저온 매체를 사용하여 저온 살균기의 금속 샘플 홀더에 위쪽으로 향하게 합니다. 이것은 근육의 절단 부위 (곰팡이의 바닥)가 실험자 직면하고 있는지 확인합니다.
- 장착된 시료가 있는 샘플 홀더를 단면 메커니즘에 삽입합니다.
참고: 시료의 적절한 단면을 보장하려면 시작하기 전에 새 블레이드를 사용하십시오. - 먼저, 샘플 블록(30 μm)을 균일한 절편 평면을 얻고 근육의 각 영역에 도달하도록 트리밍한다(도3B).
- 트리밍 후, 각각의 두께(예를 들어, 14 μm)의 연속된 단면을 절단한다.
- 슬라이드를 섹션 위로 아래로 향하게 하여 현미경 유리 슬라이드의 섹션을 수집합니다. 섹션이 슬라이드에 연결됩니다(그림3C).
- 면역형광 또는 면역히스토화학에 직접 사용하거나 추가사용이 될 때까지 -80°C 또는 -20°C에서 섹션을 저장한다.
5. 재생의 마커에 대한 면역 염색
- 가습 챔버에서 모든 추가 단계를 수행합니다.
- 간략하게, 실온에서 섹션을 평형화.
- RT에서 슬라이드당 1mL의 2% PFA(PBS, pH 7.4)로 섹션을 수정합니다.
- 각각의 폐기물 용기에 부어 2% PFA 용액을 제거한다.
- RT에서 5분 동안 1 mL(pH 7.4)으로 3회 세척하십시오.
- 폐통에 부어 PBS를 제거합니다.
- 슬라이드당, 10분 동안 투과액(0.1% 트리톤 X-100, PBS pH 7.4에 0.1 M 글리신)을 추가합니다.
- 폐기물 용기에 부어 투과 솔루션을 제거합니다.
- 슬라이드당 차단 용액 150 μL(PBS pH 7.4에서 M.O.M. 1:40)을 추가하고 커버슬립으로 덮습니다. RT에서 1 시간 동안 배양하십시오.
- 커버슬립 및 차단 용액을 제거하고, 슬라이드당 1차 항체 용액[PAX7, DSHB, 마우스 IgG1, 원액 또는 devMHC, DSHB, 원액, 마우스 IgG1and 라미닌(토끼, 1:1,000)]을 적용한다. 커버슬립으로 덮습니다. 4 °C에서 O/N(하룻밤)을 배양합니다.
참고: 1차 항체를 생략하여 조절 염색을 수행하고, 대신 차단 용액으로 섹션을 배양한다. - RT에서 5분 동안 1 mL(pH 7.4)으로 3회 세척하십시오.
- 폐통에 부어 PBS를 제거합니다.
- 이차 항체 용액(Alexa Fluor 546 염소 항 마우스 IgG1 및 Alexa Fluor 488 당나귀 항 토끼 IgG)의 100 μL을 슬라이드당 1:000에 추가하여 커버슬립으로 커버한다. RT에서 1 시간 동안 배양하십시오.
- 어두운 장소에서 슬라이드를 인큐베이션하는 경우, 예를 들어 알루미늄 호일을 사용하여 검은 색 가습 챔버를 덮거나 사용합니다.
참고: 지금부터 는 몇몇 이차 항체가 빛과 민감하기 때문에 모든 단계는 감소된 빛 조건에서 수행되어야 합니다. - 커버슬립과 이차 항체 용액을 제거합니다.
- RT에서 5분 동안 1 mL(pH 7.4)으로 3회 세척하십시오.
- 폐통에 부어 PBS를 제거합니다.
- RT에서 5분 동안 10 μg/mL의 최종 농도에 슬라이드당 용액 의 1 mL을 추가하여 DAPI 염색을 수행합니다.
- DAPI 염색 용액을 폐기물 용기에 부어 제거합니다.
- RT에서 1 mL PBS (pH 7.4)로 3 회 씻으시고 5 분 동안 씻으하십시오.
- 세탁에 사용되는 PBS를 완전히 제거하십시오.
- 수성 마운팅 매체 를 2 - 3 방울 바르고 새 커버 슬립으로 슬라이드를 직접 덮습니다.
- 슬라이드가 어두운 RT에서 1 시간 동안 건조시키십시오.
- 염색된 부분을 형광 현미경을 이용하여 추가로 분석할 때까지 어둠 속에서 4°C에 보관한다.
6. 헤마톡실린과 에신 염색
- 가습 챔버에서 모든 추가 단계를 수행합니다.
- RT에서 슬라이드당 1mL의 2% PFA(PBS, pH 7.4)로 섹션을 수정합니다.
- 각각의 폐기물 용기에 부어 2% PFA 용액을 제거한다.
- 슬라이드를 코플린 항아리에 옮김으로 옮김.
- 수돗물로 슬라이드를 부드럽게 헹구십시오.
참고: 섹션을 손상시킬 수 있기 때문에 수도꼭지를 너무 높게 켜지 마십시오. - 슬라이드를 가습 챔버로 옮김을 옮김으로 옮김. 액체를 제거합니다.
- 헤마톡실린 염색액 1 mL(길 No 3)을 2분 동안 바르고 있습니다.
- 슬라이드를 코플린 항아리에 옮김으로 옮김.
- 핵이 파란색으로 변할 때까지 수돗물로 슬라이드를 부드럽게 헹구십시오.
참고: 섹션이 손상될 수 있으므로 수도꼭지를 너무 높게 켜지 마십시오. - 슬라이드를 가습 챔버로 옮김을 옮김으로 옮김. 액체를 제거합니다.
- 1 mL의 Eosin Y 용액을 바르고 2 분 동안 배양하십시오.
- 슬라이드를 코플린 항아리에 옮김으로 옮김.
- 슬라이드에서 나오는 수돗물이 맑아질 때까지 수돗물로 슬라이드를 부드럽게 헹구십시오.
- 모든 액체를 제거하고 슬라이드를 2 분 동안 건조시키십시오.
- 면역 히마화학에 적합한 장착 매체에 장착하십시오.
Representative Results
심장 독소 매개 부상 전후의 경골 전방 근육의 헤마톡신 및 에오신 (H&E) 염색의 전형적인 결과는 도 4A, B에제시된다. 대조군 근육에서, 근육의 구조는 근섬유의 주변에 핵의 국소화와 간질 공간에서 단핵세포의 축적의 부족에 의해 본 그대로이다(도4A). 7일 후 심독소 매개 부상 후 새로운 근섬유가 중앙에 위치한 핵에 의해 형성된다(도4B). 게다가, 단핵구 세포의 축적은 관찰될 수 있습니다, 위성 세포뿐 아니라 면역 세포 같이 또한 비 myogenic 세포로 이루어져 있습니다. 전체 근육은 모든 근핵의 중앙 위치와 전체 근육 섹션에 단핵구 세포의 축적을 특징으로 부상해야합니다.
재생 과정의 진행 및 성공을 특성화하기 위해, 재생마커를 사용하여 여러 개의 면역형 광 염색을 수행할 수 있다. 위성 셀의 수는 위성 셀에 대한 정식 마커인 Pax7에 대한 염색에 의해 평가될 수있다(도 4C,D). 부상 후 3 일 위성 세포의 수가 증가(그림 4D),위성 세포는 더 이상 기저 층층 아래에 위치하지 않습니다. 재생 과정을 더욱 분석하기 위해, 새로 형성된 묘섬유는 발달 미오신을 향한 항체로 염색될 수있다(도 4E). 새로 형성된 묘섬유는 중앙에 위치한 핵과 발달 미오신의 강한 발현을 표시한다. 근섬유가 성숙함에 따라 발달 미오신의 발현이 감소하면서 핵이 근섬유의 주변으로 이동하는 동안 근섬유의 직경이 증가합니다.
재생 과정에 대한 단일 유전자의 영향은 형질전환 마우스를 사용하거나 자가 전달 siRNA의 주입에 의해 여기에 나타난 바와 같이 조사될 수 있다. 형광표지된 자가전달 스크램블제어siRNA는 부상 후 3일째에 재생성 경골 전방 근육에 주입되었고, 위성 세포의 증식이 최고조에 이르는 시점이었다. siRNA 위성 세포를 주사한 지 이틀 후 형광표지된 siRNA의 존재를분석하였다(도 4F). 우리는 얼마나 많은 위성 세포가 재생성 근육으로 주사 한 후 형광표지 된 siRNA를 채택했는지 분석하였다(그림 5). 재생 근육에 있는 모든 위성 세포의 대략 75%는 형광성 표지된 siRNA를 위해 양성이었습니다. 게다가, 우리는 모든 재생 myofibers의 대략 74%가 재생 myofibers의 74%가 siRNA를 채택했다는 것을 건의하는 형광표지된 siRNA를 위해 양성이었다는 것을 결정했습니다 또는 siRNA 양성 위성 세포는 융합했다 서로 새로운 근섬유를 형성하거나 이미 존재하는 재생 근화과이와의 융합이 발생하였다(도5). 이것은 위성 세포가 자기 전달 siRNA를 취하고 siRNA가 적어도 2 일 동안 위성 세포에서 지속된다는 것을 건의합니다.
그림 1: 경골 전방 근육에 심장 독소 주입. (A)마우스는 이소플루란을 흡입하여 마취시키고 하반신을 면도한다. (B)29 G 바늘을 경골 전방근육(C)에주입하고 심독소 용액을 주입하는 동안 경골 뼈를 따라 이동한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 부상당한 경골 전방 근육의 해부 및 동결에 관여하는 단계. (A)뒷사지 근육이 노출되고(B)경골 전방 근육을 둘러싼 근막이 찢어져 근육을 노출시다. (C)근육을 제거 한 후, 날카로운 직선 가위를 사용하여 비슷한 크기의 두 반으로 중간 배 꼽 영역에서 절단(D). (E)해부된 근육의 반쪽은 동결용액으로 채워진 알루미늄 호일 몰드에 내장되어 액체질소(F)로동결된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 경골 전방 근육의 냉동 절제에 관여하는 장비 및 단계. (a)저온 상승의 챔버 온도는 -21°C로 설정된다. (B)동결용액의 경골 전방 근육이 샘플 홀더에 장착됩니다. (C)14 μm 두께의 섹션은 유리 현미경 슬라이드에 부착됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 경골 전방 근육을 재생하는 대표적인 이미지. 경골 전방 근육의 H&E 염색 전(A)및 7 일 후 심장 독소 부상(B). (C)부상되지 않은 근육 Pax7 양성 (적색) 위성 세포는 라미닌으로 표시된 기저 층아래에 위치한다 (녹색). 핵은 DAPI (파란색)로 반염색됩니다. Pax7 양성 세포는 화살표로 표시됩니다. (D)10일간의 재생 후, 근섬유는 중앙에 위치한 핵(파란색)을 특징으로 하며, Pax7은 녹색, 적당한 녹색으로 도시된다. Pax7 양성 세포는 화살표로 표시됩니다. (E)새로 형성된 묘섬유는 발달미오신(적색), 녹색의 라미닌, 핵은 DAPI(파란색)로 반성된다. (F)형광 표지 된 자기 전달 siRNA (siRED, 빨간색으로 묘사) 여전히 위성 세포에서 발견된다 (Pax7 양성, 녹색, 인세트에 화살표로 표시) 2 일 후 자기 전달 siRNA를 주입 후 재생 tibialis 전방으로 근육 (심장 독소 중재 부상 후 3 일째에 주입). 라미닌은 흰색으로 나타내고, 핵은 DAPI(파란색)로 반염색된다. 배율 막대 = 100 μm (A 및 B), 50 μm (C-E), 25 μm (F). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 형광표지된 siRNA의 섭취의 정량화. (A)위성 세포(Pax7+ cells)에 의한 siRNA 섭취량의 정량화 및 퇴행성 골격근에 주사 후 2일 후 근섬유를 재생시킨다. 주사는 심장 독소 가 부상 을 중재 한 후 3 일째에 수행되었다. n = 3, 오류 막대는 SEM.(B)(A)에 묘사 된 그래프의 밑에 정량화를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에서 우리는 형질전환 동물의 필요 없이 골격 근의 재생 도중 특정 유전자의 기능을 조사하는 방법을 제시합니다. 이것은 심장 독 소 유도 근육 상해의 조합에 의해 달성 되 고 자기 전달 siRNA 의 주입에 회생 골격 근육에 3 부상 후. 우리는 심동 독소에 의한 근육 손상의 절차를 자세히 설명했으며, 자가 전달 siRNA의 주입 및 수확 된 근육의 처리로 재생의 진행 상황을 분석했습니다. 우리는 뱀 독 심장 독소의 주입이 골격 근육에 효과적으로 전체 근육을 손상시키고 자기 전달 siRNAs는 다른 세포 유형 중 모든 위성 세포의 약 75 %에서 발견된다는 것을 보여줍니다 2 일 골격 근을 재생(그림 4, 그림 5).
상해의 다양한 정도가 재생 결과에 영향을 미치기 때문에 특히주의는 경골 전방 근육의 균일 한 상해에 집중되어야하고 따라서 siRNA의 효과도 영향을받을 수 있습니다. 더욱이, 전체 재생 영역이 자가 전달 siRNA로 주입되는 것이 매우 중요하다. 재생 과정의 분석을 위해, 항상 재생 골격 근육의 유사한 영역을 비교하는 것이 좋습니다, 따라서, 경골 전방 근육은 항상 항상 근육의 중간 배 꼽 영역을 비교하기 위해 반으로 절단해야합니다. 근육을 분석할 때, myofiber 조성물은 경골 전방 근육에서 다르기 때문에 전체 냉동 절을 분석할 필요가 있고 그러므로 다르게 재생될 수 있습니다.
위성 세포의 기능은 인접한 단하나 myofibers(17)에그들의 배양을 포함하여 각종 실험 절차에 의해 조사될 수 있습니다, 이식에 의하여 및 유도된 상해 후에 골격 근의 재생을 분석하 여 18,19. 생체 내 유도 된 상해 모델을 사용 하 여 위성 세포의 기능을 조사, 예를 들어, 심장 독 소의 주입, 또한 대 식 세포와 같은 다른 세포 유형과의 상호 작용 측면에서 위성 세포 기능을 분석 하는 기능을 제공 하 고 전신 요인의 영향에 대한 조사2. 골격근의 상해는 다양한 수단, 예를 들어, 편심 운동, 동결 상해, BaCl2의 주사 또는 심폐소독소 또는 노펙신(noexin)과 같은 뱀 독의 주사에 의해 달성될 수있다 18. 편심 운동은 아마 가장 생리적 인 부상 방법이지만, 하나의 특정 근육에 대한 부상은 제한20. 동결 상해는 상해의 사이트를 향해 위성 세포의 이동이 연구의 목적또는 근육의 특정 부분만 상해되어야 할 때 적용될 수 있습니다. 실험적으로 동결 부상의 단점은 미리 냉각 된 금속 프로브를 적용하기 위해 수행 할 필요가 있는 개방 수술입니다. BaCl의 주입2 또는 뱀 독 부상의 가장 극적인 방법, 따라서 가장 도전 위성 세포 기능. 더욱이, 주사는 최소침습, 수술 시간, 일반적으로 5분 미만이며 봉합 등을 수반하지 않으므로 감염의 위험을 최소화한다.
근육 손상은 주로 Pax77,21의손실과 같은 유전자 기능 상실의 기능적 결과를 조사하는 데 사용됩니다. 특히 숙성된 마우스가 과학적 질문의 초점이되는 경우, 형질전환 마우스의 생성 또는 사용은 종종 가능하지 않습니다. 특정 유전자를 표적으로 하는 자가 전달 siRNAs의 주입은 그 경우에 실행 가능한 대안이고 성공적으로22를이용되었습니다. 간단히 말해서, 마우스의 경질 전방 근육은 카디오톡신의 주입에 의해 부상을 입었으며, 섬유넥틴(FN)에 대한 지시된 siRNAs는 부상 후 3일째에 주입되었다. 근육은 부상 후 10일 및 스크램블된 siRNA 대조 군지 에서 siFN에서 현저한 감소가 관찰되었다. 녹다운 효율은 siRNA 주입 후 2일 간 정량적 실시간 PCR에 의해 전체 근육 용해로 결정되었으며, 발현 수준의 감소는 58%의 감소를 달성하여 전달 및 녹다운 효율이 기능적에 충분하다는 것을 시사하였다. 분석22. 녹다운 효율을 시험하기 위한 대안은 표적 유전자에 대하여 지시된 항체를 가진 면역 블롯 또는 면역 형광 분석입니다. 생체 내 주사에 사용되는 siRNA의 효율성 및 특이성은 마우스로 주입하기 전에 결정되어야 하며, 예를 들어, 단리된 위성 세포 또는 1차 근세포에서의 효율을 테스트하여 결정되어야 한다. 단일 siRNA대 4개의 상이한 siRNA로 구성된 스마트 풀을 사용하면 녹다운의 효율이 증가하지만 비특이적 타겟팅의 위험도 증가합니다. 사용된 모든 siRNA 서열의 특이성은 오프 표적 효력을 피하기 위하여 세포 배양에서 시험되어야 합니다. 대조군으로서, 비표적화 스크램블된 siRNA는 se당 siRNA의 주사가 주사로 인한 재생 과정에 영향을 미칠 수 있고, 따라서 근육의 추가적인 손상에 영향을 미칠 수 있기 때문에 사용되어야 한다. siRNA를 주입하는 시점은 과학적 질문과 표적 유전자의 발현 프로필에 따라 다름있다. 일반적으로, 심장 독소 부상 후 3 일째에 자가 전달 siRNA의 주사는 위성 세포 증식에 중요한 대부분의 유전자를 대상으로 부상 후 3 일 주위에 위성 세포 증식 피크. 첫 번째 siRNA 주입에 대 한 시간 보다 더 이어야 한다 48 심장 독 소 부상 후 시간 심장 독 소의 주입 볼륨은 매우 높은 액체의 재흡수 근육에 추가 솔루션을 주입 하기 전에 자리를 차지 해야. 일반에, siRNAs의 여러 주사 또는 다른 siRNAs의 조합은 가능 하지만 하나는 재생 근육에 각 주사 는 추가 손상을 일으키는 고려 해야 합니다.
기재된 방법의 한 가지 제한은 관찰된 효과가 반드시 위성 세포에서 표적 유전자의 녹다운에 만 의존하는 것이 아니라 면역 세포 또는 섬유-지방종 전구 세포와 같은 다른 세포 유형에 기인할 수 있다는 사실이다. 따라서, 위성 세포의 순수한 집단을 조사하는 실험과 그 실험을 결합할 필요가 있다. 하나는 부동 myofiber 배양을 사용하여 실험을 수행 하거나, 위성 세포는 그들의 인접 한 myofibers에 배양 또는 분리 된 위성 세포를 사용 하 여 이식 실험을 수행17.
자가 전달 siRNAs의 주입에 대 한 대안은 작은 분자 억제제 또는 재조합 단백질의 주입, 과학적 질문에 따라 수행 될 수 있는. 예를 들어, 세포외 매트릭스 단백질 fibronectin 또는 JAK/STAT 신호의 소분자 억제제의 주사는15,16세마우스에서 성공적으로 수행되었다. 골격 근의 재생 동안 하나의 특정 세포 유형에서 특정 유전자 기능의 분석, 예를 들어, 위성 세포에서, 유도성 유전 마우스 모델의 사용을 통해 가능하다. 자기 전달 siRNAs의 주사, 재조합 단백질 또는 작은 분자 억제제 는 골격 근육을 재생에 여러 세포 유형에 영향을 미칠 수 있습니다.
Disclosures
우리는 우수한 기술 지원과 siRNA 형질 전환 효율의 결정에 도움을 크리스티나 피커와 크리스틴 포세르에게 감사드립니다. 우리는 훌륭한 기술 지원을위한 핵심 서비스 역학, 특히 사빈 랜드만과 린다 로텐버거에 감사드립니다. 우리는 또한 우수한 지원을 위한 FLI에 있는 동물 시설 마우스를 감사합니다. 이 작품은 도이치 포르충스게마인샤프트(MA-3975/2-1)와 도이치 크렙실페(DKH-JvM-861005)의 보조금을 통해 J.v.M.에 지원되었다.
Acknowledgments
저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Henry Schein | Isothesia | inhalation narcotics |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Anesthesia System (Tec 7) with inhalation box + nose masks | Tem Sega | Minihub | |
| Shaver for rodents | isis | GT420 | |
| Cardiotoxin | Latoxan | L8102 | snake venom needed for muscle injury |
| Accell siRNA smart pool | Dharmacon | depending on your target gene | self delivering siRNA |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-21206 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher | A-21123 | secondary antibody |
| Coverslips | VWR | 631-1574 | |
| CV Mount | Leica | 14046430011 | mounting medium for immunohistochemistry |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | nuclear staining |
| devMHC antibody | DHSB | F.1652 | |
| Eosin Y | Thermo Fisher | 73104 | |
| Haematoxylin Gill No3 | Sigma-Aldrich | GHS316-500ML | |
| Insulin syringe (29 g) | Terumo | 3SS05M2813 | syringue used for muscle injections |
| Laminin antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
| M.O.M blocking reagent | Vector labs | MKB-2213 | blocking for immunofluorescent staining |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | Metacam | analgesics |
| OCT | Thermo Fisher | 6502 | tissue embedding |
| Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | satellite cell specific antibody |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36934 | aequos mounting medium |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | tissue embedding |
| Superfrost plus | Thermo Scientific | J1830AMNZ | microscope slides |
| TritonX-100 | Amresco | 0694-1L | permeabilization reagent |
| Dissection tools | |||
| Dumont 5, straight | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Dumont 7, curved | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Extra fine Bonn scissors (cutting edge: 13 mm) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-16 | |
| Spring scissors (cutting edge: 5 mm, tip diameter: 0.35 mm) | Fine Science Tools | 91500-09 |
References
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