Summary
Vi beskriver en in vivo metode til at undersøge den funktionelle tab af et bestemt gen i satellit celler ved hjælp af en kombination af kardiotoksiner medieret skade på skeletmuskulatur og injektion af en selv-levere siRNA.
Abstract
Skeletmuskulatur besidder en enorm kapacitet til at regenerere efter skade. Denne proces er primært drevet af muskel stamceller, også kaldet satellit celler. Satellit celler er karakteriseret ved ekspression af transkriptionsfaktoren Pax7 og deres placering under basal lamina i hvile skeletmuskulaturen. Ved skade, satellit celler bliver aktiveret, undergår selvfornyelse eller differentiering til enten danne nye myofibers eller til at smelte med beskadigede dem. Funktionaliteten af satellit celler in vivo kan undersøges ved hjælp af en kardiotoksiner baseret skade model af skeletmuskulatur. For at studere funktionen af et gen under regenerering af skeletmuskulatur, er transgene musemodeller for det meste brugt. Her præsenterer vi en alternativ metode til Transgene mus, til at undersøge genfunktionen i satellit celler under regenerering, fx i tilfælde, hvor Transgene mus ikke er tilgængelige. Vi kombinerer kardiotoksiner medieret skade af en bestemt skeletmuskulatur med injektion af en selv-levere siRNA i regenererende muskler, som derefter tages op af satellit celler blandt andre celler. Derved giver vi en metode til at analysere genfunktion i satellit celler under regenerering under fysiologiske forhold uden behov for Transgene mus.
Introduction
Skeletmuskulatur er kroppens største væv, der repræsenterer ca. 40% af den samlede legemsvægt, hvilket muliggør frivillig bevægelse. Vævs arkitekturen i skeletmuskulaturen består hovedsageligt af postmitotiske, terminalt differentierede, flerkernede myofibers samt forskellige andre celler fra det perifere nervesystem, vaskulære system og interstitielle celler1. Vigtigere, skeletmuskulatur har en enorm kapacitet til at regenerere og genoprette funktion ved skader eller skader2. Denne proces afhænger af vævs Resident muskel stamceller også kaldet satellit celler3,4. Satellit celler er placeret mellem myofiber og basal lamina og karakteriseret ved ekspression af transkriptionsfaktoren Pax75,6,7. Under homeostatiske forhold, satellit celler er latent, men bliver aktiveret på grund af traumatisk skade, fx gennem excentrisk motion eller eksperimentelt gennem injektion af slangen Venom cardiotoxin6,8. Når det er aktiveret, Pax7 positive satellit celler Co-Express MyoD og Myf5, som forpligter stamceller til myogenic differentiering. Satellit celler, der modstå docetaxels opregulering af engagement faktorer vil bevare deres stemthed potentiale og vende tilbage til inaktive at genopbygge stamcelle pulje for fremtidige krav. Efter udvidelsen af den myogene stamcelle pulje, er transkriptionelle netværk aktiveret ved differentierings faktorer som Myogenin at initiere cellen cyklus exit og terminal differentiering. Disse myoprogenitorer smelter derefter til hinanden eller til eksisterende myofibers, som bidrager med myonuclei, for at opretholde størrelsen af det myonukleare domæne. Den myofibers Express Terminal muskel differentiering gener som myosin tunge kæde. Endelig, de nyligt dannede myofibers vokse og modne til at bygge de funktionelle enheder af skeletmuskulatur9,10.
Regenerering af skeletmuskulatur kan påvirkes af forskellige tilstande, herunder muskelsygdomme eller aldring11,12, lige fra milde funktionsnedsættelser til livstruende tilstande, f. eks, i Duchenne muskuløs dystrofi13 , 14. Derfor har regenerativ medicin til formål at genoprette beskadigede eller funktionssvigt skeletmuskulatur væv ved hjælp af sin iboende regenerativ effekt ved at målrette satellit celle funktion15,16. At bruge sit fulde potentiale en omfattende forståelse af satellit celler i deres endogene niche under regenerering af skeletmuskulatur er påkrævet. Selv om der findes eksperimentelle tilgange til at isolere satellit celler ved siden af deres myofibers17, kan den fulde kompleksitet af cellulære og systemiske interaktioner af satellit celler med deres miljø kun gentages in vivo. I denne henseende, stor viden om skeletmuskulatur regenerering er erhvervet ved hjælp af muse skade modeller2,18.
Her introducerer vi en specifik eksperimentel muse skade model til at studere stamcelle medieret regenerering af kardiotoksiner-induceret skade af tibias forreste muskel in vivo. Kardiotoksiner, en slange afledt cytolytisk toksin, der forårsager myofiber depolarisering og nekrose, injiceres i tibias forreste muskel, som igen vil udløse vævs degeneration efterfulgt af regenerering. At analysere funktionen af gener under akut regenerering, selv-levere siRNAs injiceres på dag 3 efter skade, på toppen af satellit celle ekspansion. Forsøgsdyr ofres på forskellige tidspunkter og tibias forreste muskler opsamles. De dissekeret muskler er frosset og forarbejdet til yderligere kryo-skæring. Immunofluorescens mikroskopi bruges derefter til at analysere markører for regenerering. Denne metode giver mulighed for undersøgelse af funktionen af et enkelt gen under satellit celle drevet regenerering af skeletmuskulatur ved hjælp af vildtype mus.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz (03-048/16; TLV Bad Langensalza, Tyskland).
1. kardiotoksiner-induceret muskelskade
Bemærk: Udføre alle forsøg, der involverer levende mus i overensstemmelse med den nationale dyrevelfærds lov og under passende aseptiske forhold. Ofring af dyr skal også udføres i overensstemmelse med den nationale lov om dyrevelfærd.
- Desinficer inhalations kassen, der anvendes til indånding af anæstesi og operationsområdet med 70% ethanol. Anbring en steril kirurgisk klud på den varmepude, hvor operationen vil finde sted.
- Tænd for varmepuden ved 37 °C.
- Administration af analgetika (f. eks. 1 mg/kg legemsvægt meloxicam subkutant) 15 min før påbegyndelse af operationen.
Bemærk: For et typisk eksperiment, bruge mus, som er mindst 6 uger gammel, køn-matchede og i en god generel fysisk tilstand. - Forbered opløsningen af kardiotoksiner (20 μM i 0,9% NaCl), Opbevar opløsningen ved-20 °C.
- Lad kardiotoksinopløsningen nå stuetemperatur (RT).
- Overfør musen ind i inhalations boksen og fremkalde anæstesi med isofluran (initiering 3,5 – 5% i ren ilt). Kontroller dybden af anæstesi med en mangel på respons på en tå knivspids.
- Placer musen på et rent papir håndklæde og opretholde anæstesi med en næse maske (1,5 – 3% isofluran i ren ilt). Barbere Indsprøjtnings området i det kraniale nedre ben (fra knæet til pote, figur 1a). Fjern alt overdreven løst hår.
Bemærk: Fysisk adskillelse af barbering og injektion område i rummet vil give mere sterile betingelser for injektioner. - Placer musen i den laterale liggende position på varmepladen dækket med en steril kirurgisk klud og opretholde anæstesi med en næse maske (1,5-3% isofluran i ren ilt).
- Desinficer injektionsområdet i det kraniale nedre ben (fra knæ til pote) med 70% ethanol.
- Udfør en tå knivspids før du starter intramuskulær injektion for at sikre en tilstrækkelig dybde af anæstesi.
- Injicer 50 μl kardiotoksiner (20 μM i 0,9% NaCl) i den forreste tibias-muskel ved hjælp af en insulin sprøjte med en 29-gauge nål. Først gennembore huden bare distale af knæet.
- Stik kanylen helt ind i musklen (i myofiber orientering/parallel med skinneben), og Injicer cardiotoksin langsomt (10-20 s) langs musklens fulde længde, mens nålen bevægede sig frem og tilbage for at muliggøre en jævn fordeling af kardiotoksinet og dermed at skade hele tibias forreste muskel (figur 1B, C).
Bemærk: Skade tibias forreste muskel fra kun ét ben, den kontralaterale tibias forreste muskel kan tjene som en intern kontrol for at bestemme, at skeletmuskulatur ikke var patologisk påvirket før kardiotoksiner skade. - Overfør musen tilbage til sit bur placeret på en varmepude og overvåge inddrivelse proces, indtil dyret er bevidst og bliver ambulante.
Bemærk: Musene vil kun vise en svag Limp. Hvis mus halter kraftigt og ikke lægger vægt på benet på alle, ofrer musen. - Administration af analgetika i løbet af de følgende 2 dage (fx 1 mg/kg legemsvægt meloxicam subkutant, hver 24 h) og overvåge dem på en ugentlig basis.
2. injektion af selv-levere siRNA i regenererende tibialis anterior muskel (på dag 3 post Kardiotoksiner skade)
- SiRNA-opløsningen forberedes ved at resuspendere siRNA (f. eks. siRNA Smart pool) i 0,9% NaCl (slutkoncentration på 2 μg/μL) i henhold til producentens instruktion.
Bemærk: SiRNA er kemisk modificeret for at lette den passive optagelse af celler og beskytte den mod nukleasenedbrydning. Der er ikke behov for transfektering reagenser, hvorved toksiciteten mindskes. Brug af en smart pulje af fire uafhængige siRNA-sekvenser, der er målrettet mod det samme gen, øger Knockdown-effektiviteten. - Opbevar siRNA ved-20 °C og overfør det på is til operationsstuen.
- Desinficer inhalations kassen, der anvendes til indånding af anæstesi og operationsområdet med 70% ethanol. Anbring en steril kirurgisk klud på den varmepude, hvor operationen vil finde sted.
- Tænd for varmepuden ved 37 °C.
- Overfør musen ind i inhalations boksen og fremkalde anæstesi med isofluran (initiering 3,5 – 5% i ren ilt). Kontroller dybden af anæstesi med en mangel på respons på en tå knivspids.
- Placer musen i den laterale liggende position på varmepladen dækket med en steril kirurgisk klud og opretholde anæstesi med en næse maske (1,5-3% isofluran i ren ilt).
- Desinficer injektionsområdet i det kraniale nedre ben (fra knæet til pote).
- Udfør en tå knivspids før du starter intramuskulær injektion for at sikre en tilstrækkelig dybde af anæstesi.
- Injicer op til 50 μl siRNA-opløsning (op til 100 μg total i 0,9% NaCl; rettet mod målgenet; brug røræg siRNA som kontrol) i den skadede tibias forreste muskel ved hjælp af en insulin sprøjte med en 29 G nål. Først gennembore huden bare distale af knæet, derefter indsætte nålen i tibias forreste muskel.
- Stik kanylen helt ind i musklen (i myofiber orientering/parallelt med skinneben) og Injicer siRNA-opløsningen langsomt (10-20 s) langs musklens fulde længde, mens nålen bevægede sig frem og tilbage for at muliggøre en jævn fordeling af siRNA langs hele tibias forreste muskel.
- Overfør musen tilbage til sit bur placeret på en varmepude og overvåge inddrivelse proces, indtil dyret er bevidst og bliver ambulante.
Bemærk: Analgesi er ikke nødvendigvis efter injektion af siRNA.
3. dissektion af tibialis anterior muskel
- Forbered fryse opløsningen (2 dele okt sammensatte og 1 del 30% saccharose i deioniseret vand) mindst 12 h før brug for at undgå luftbobler.
- Forbered fryse forme ved at pakke en aluminiumsfolie rundt om en blyant og forsegle den med tape. Det er vigtigt, at bunden af formen giver en jævn, lukket overflade.
Bemærk: Mindre frysning forme tillade hurtigere frysning af musklen undgå frysning artefakter. - Ofrer musen, fx ved co2 indånding, på det respektive tidspunkt for regenerering og spray hele musen og dissektion værktøjer med 70% ethanol.
Bemærk: Cervikal dislokation kan anvendes, desuden for at undgå overdreven blødning på benet, når isolerer tibias forreste muskel. - Fjern pels og hud fra den skadede baglemmer ved at skære huden ved anklen med ekstra fin skarp saks (skærkant: 13 mm) og trække op huden mod knæet ved hjælp af pincet.
- For at udsætte tibias forreste senen ved anklen, trække den resterende hud mod foden eller skæres med skarp saks.
Bemærk: Musen kan fastgøres til en støtte bord for at give bedre fiksering. - Før høst tibias forreste muskel, fjerne fascia ved hjælp af fine pincet (Dumont 5 eller 7, straight eller buet). Klem de lukkede Tang gennem fascia ved siden af skinneben ved anklen af det skadede ben (figur 2a). Flyt pincet mod knæet og derved rive fascia og udsætte tibias forreste muskel (figur 2b).
- For at isolere tibias forreste muskel, udsætte den distale sene og få fat i den med fine pincet (Dumont 7, buet). Skær senen ved hjælp af fjeder saks (skærkant: 5 mm, spids diameter: 0,35 mm) og træk musklen (holder den ved senen) mod knæet.
- At høste tibias forreste muskel, klippe det så tæt på knæet som muligt ved hjælp af skarpe saks.
- Før frysning, skær tibias forreste muskel i midten af maven regionen af musklen med lige saks i to halvdele af samme størrelse for at tillade analyse af midten af maven region (figur 2C, D).
- Fyld fryse formen halvvejs med fryse opløsningen.
- Indsæt de to halvdele af tibias forreste muskel i fryse formen med midten af maveregionen mod bunden af formen (figur 2E). Sørg for, at tibias forreste halvdele er indsat i en opretstående position hælder mod væggen af fryse formen for at undgå deponering af musklen.
Bemærk: Jo mere frysning løsning er i formen, jo længere frysning vil tage, og dermed øge risikoen for Cryo-artefakter. - Hold fryse formen ved hjælp af pincet og overfør den halvvejs til flydende nitrogen (figur 2F). Sørg for, at der ikke kommer flydende nitrogen ind i fryse formen under Fryseprocessen.
- Overhold Fryseprocessen, fryser mediet skifter farve fra transparent til hvid og bliver fast. Submerse den frysende skimmel i flydende nitrogen i et par sekunder og overføre fryse formen til a-80 °C fryser eller til tøris til fremtidig behandling.
- Opbevar de frosne muskler i fryse forme ved-80 °C indtil yderligere brug.
Bemærk: De fryse forme passer godt i 24-brønds plader eller 1,5 mL reaktions slanger tillader mærkning og organiseret opbevaring. - Håndter musklen i fryse forme til yderligere brug altid på tøris.
4. kryosectioning af regenererende tibialis anterior muskel
- Før du påbegynder skæring, indstilles kammertemperaturen på kryostaten til-21 °C, objekttemperaturen til-20 °C og skære tykkelsen til 10, 12 eller 14 μm (afhængigt af de fremtidige anvendelser) (figur 3a).
- Overfør muskel prøven i fryse formen i kryostaten og lad den justeres til temperaturen i flere minutter. I dette tidsrum, etiket mikroskop slides.
- Fjern folien omkring den integrerede muskel ved hjælp af forkølede pincet inde i kryostaten. Undgå at røre ved prøven, da cryomedium begynder at tø let.
- Prøven monteres med Mid Belly-regionen af tibias-forreste musklen rettet opad på metal prøveholderen på kryostat ved hjælp af cryomedium. Dette sikrer, at skære stedet af musklen (bunden af formen) står eksperimententer.
- Sæt prøveholderen med den monterede prøve i skæremekanismen.
Bemærk: For at sikre en korrekt skæring af prøven skal du bruge en ny klinge, før du starter. - For det første trim prøve blokken (30 μm) for at få et jævnt skære plan og nå den respektive region af musklen (figur 3b).
- Efter trimning skæres de fortløbende sektioner af den respektive tykkelse (f. eks. 14 μm).
- Saml afsnittene om mikroskop glas slides ved at holde slide forsiden nedad over sektionen. Afsnittet er knyttet til diaset (figur 3c).
- Opbevar sektioner ved-80 °C eller-20 °C, indtil yderligere brug eller direkte anvendelse til immunofluorescens eller Immunhistokemi.
5. immun farvning for markører for regenerering
- Udfør alle yderligere trin i et befuret kammer.
- Kortvarigt, ækvibrere sektionerne ved stuetemperatur.
- Fastgør sektioner med 1 mL 2% PFA (i PBS, pH 7,4) pr. slide i 5 minutter ved RT.
- Fjern 2% PFA-opløsningen ved at hælde den i den respektive affaldsbeholder.
- Vask 3 gange med 1 mL PBS (pH 7,4) i 5 minutter ved RT.
- Fjern PBS ved at hælde det i en affaldsbeholder.
- Pr. slide tilsættes 1 mL permeabiliseringsvæske (0,1% Triton X-100, 0,1 M Glycin i PBS pH 7,4) i 10 min.
- Fjern permeabiliserings opløsningen ved at hælde den i en affaldsbeholder.
- Tilsæt 150 μL af blokerings opløsningen (M.O.M. 1:40 i PBS pH 7,4) pr. slide og dæk med dæksedlen. Inkuber i 1 time ved RT.
- Fjern dæksedlen og blokerings opløsningen, Anvend 100 μL primær antistof opløsning [PAX7, DSHB, muse IgG1, ufortyndet eller devMHC, DSHB, ufortyndet, mus IgG1and Laminin (kanin, 1:1000)] pr. slide. Dækslet med coverslip. Incubate O/N (overnatning) ved 4 °C.
Bemærk: Udfør en kontrol farvning ved at udelade de primære antistoffer, Inkuber afsnittet med blokerende opløsning i stedet. - Vask 3 gange med 1 mL PBS (pH 7,4) i 5 minutter ved RT.
- Fjern PBS ved at hælde det i en affaldsbeholder.
- Tilsæt 100 μL af den sekundære antistof opløsning (Alexa fluor 546 Goat anti-Mouse IgG1 og Alexa fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG i blokerende opløsning, 1:1.000) pr. slide og cover med dæksedlen. Inkuber i 1 time ved RT.
- Inkuber gliderne i mørket, fx brug en aluminiumsfolie til at dække eller bruge et sort befuret kammer.
Bemærk: Fra nu af skal alle trin udføres under reducerede lysforhold, da nogle sekundære antistoffer er lysfølsomme. - Fjern dæksedlen og den sekundære antistof opløsning.
- Vask 3 gange med 1 mL PBS (pH 7,4) i 5 minutter ved RT.
- Fjern PBS ved at hælde det i en affaldsbeholder.
- Udfør DAPI-farvning ved at tilsætte 1 mL af opløsningen pr. slide til en slutkoncentration på 10 μg/mL i 5 minutter ved RT.
- Fjern DAPI-Farvningsopløsningen ved at hælde den i en affaldsbeholder.
- Vask 3 gange med 1 mL PBS (pH 7,4) i 5 minutter ved RT.
- Helt fjerne PBS anvendes til vask.
- Påfør 2 – 3 dråber vandigt monterings medium og dæk direkte sliden med en ny dækseddel.
- Lad gliderne tørre i 1 time ved RT i mørket.
- De farvede sektioner opbevares ved 4 °C i mørke indtil yderligere analyse ved hjælp af et fluorescens mikroskop.
6. hematoxylin og eosin farvning
- Udfør alle yderligere trin i et befuret kammer.
- Fastgør sektioner med 1 mL 2% PFA (i PBS, pH 7,4) pr. slide i 5 minutter ved RT.
- Fjern 2% PFA-opløsningen ved at hælde den i den respektive affaldsbeholder.
- Overfør diasene til en Coplin-krukke.
- Skyl slides forsigtigt med vand fra hanen.
Bemærk: Tænd ikke for vandhanen for højt, da det kan beskadige sektionerne. - Overfør gliderne til det befugnede kammer. Fjern væsken.
- Påfør 1 mL Hematoxylin-farvningsopløsning (Gill No 3) i 2 min.
- Overfør diasene til en Coplin-krukke.
- Skyl forsigtigt gliderne med vand fra hanen, indtil kerderne bliver blå.
Bemærk: Tænd ikke for vandhanen for højt, da det kan beskadige dine sektioner. - Overfør gliderne til det befugnede kammer. Fjern væsken.
- Påfør 1 mL eosin Y-opløsning, og Inkuber i 2 min.
- Overfør diasene til en Coplin-krukke.
- Skyl slides forsigtigt med vand fra hanen, indtil vandhanen, der kommer ud af lysbillederne, er klar.
- Fjern al væske og lad slidene tørre i 2 min.
- Monteres i monterings medium, som egner sig til immun histokemi.
Representative Results
Et typisk resultat af en hematoxylinlegemer og eosin (H & E) farvning af en tibias forreste muskel før og efter medieret skade af kardiotoksiner er præsenteret i figur 4a, B. I kontrol musklerne, er arkitekturen af musklen intakt, som det ses af lokaliseringen af kerner i udkanten af myofibers og manglen på ophobning af mononukleerede celler i det interstitielle rum (figur 4a). 7 dage efter kardiotoksiner medieret skade nye myofibers dannes præget af centralt beliggende kerner (figur 4b). Desuden kan en ophobning af mononukleerede celler observeres, der består hovedsagelig af satellit celler, men også ikke-myogene celler som immunceller. Hele musklen skal kvæstes karakteriseret ved den centrale placering af alle myonuclei og ophobning af mononukleerede celler på hele muskel sektion.
For at karakterisere progression og succes af regenereringsprocessen, kan flere immunfluorescent farvning ved hjælp af markører for regenerering udføres. Antallet af satellit celler kan evalueres ved farvning for Pax7, den kanoniske markør for satellit celler (figur 4C, D). Tre dage efter skaden øges antallet af satellit celler (figur 4d), og satellit cellerne er ikke længere placeret under basal lamina. For yderligere at analysere regenereringsprocessen kan nyligt dannede myofibers farves med antistoffer rettet mod udviklingsmæssige myosin (figur 4E). Nyligt dannede myofibers display centralt beliggende kerner og et stærkt udtryk for udviklingsmæssige myosin. Som myofibers modne, ekspression af udviklingsmæssige myosin falder, diameteren af myofiber stiger, mens kerner migrerer til periferi af myofibers.
Påvirkning af et enkelt gen på regenereringsprocessen kan undersøges ved hjælp af Transgene mus eller som vist her ved injektion af en selv-levere siRNA. Fluorescently mærket Self-levere røræg kontrol siRNA blev injiceret i regenererende tibias forreste muskel på dag 3 efter skade, tidspunktet, hvor spredningen af satellit celler toppe. To dage efter injektion af siRNA satellit celler blev analyseret for tilstedeværelsen af fluorescently mærket siRNA (figur 4F). Vi analyserede, hvor mange satellit celler der havde taget fluorescently mærket siRNA to dage efter injektion i den regenererende muskel (figur 5). Omkring 75% af alle satellit celler i regenererende muskler var positive for fluorescently mærket siRNA. Desuden besluttede vi, at omkring 74% af alle regenererende myofibers var positive for fluorescently mærket siRNA, hvilket tyder på, at enten 74% af de regenererende myofibers havde taget op siRNA, eller at siRNA-positive satellit celler enten havde smeltet med til at danne nye myofibers, eller at fusion med allerede eksisterende regenererende myofibers forekom (figur 5). Dette tyder på, at satellit celler tage op den selv-levere siRNA og at siRNA fortsætter i satellit cellerne i mindst to dage.
Figur 1: injektion af kardiotoksiner i den forreste muskel i tibias. A) mus er bedøvet ved indånding af isofluran, og den nedre lemmer er barberet. (B) en 29 G nål injiceres i tibias forreste muskel (C) og bevægede sig langs skinnebens knoglen under injektion af kardiotoksinopløsningen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: trin involveret i dissektion og frysning af de sårede tibias forreste muskel. (A) baglemmer muskler er eksponeret (B) og fascia omkring tibias forreste muskel er rippet til at udsætte musklen. (C) efter fjernelse af musklen skæres den i midten af maveregionen i to halvdele af samme størrelse ved hjælp af skarp lige saks (D). E) halvdelen af den dissekeret muskel er indlejret i en aluminiumsfolie skimmel fyldt med fryse opløsning og frosset i flydende nitrogen (F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: udstyr og trin, der er involveret i kryosectioning af tibias-forreste muskler. A) kryostatkammerets temperatur er sat til-21 °c. B) tibias-forreste musklen i fryse opløsningen er monteret på prøveholderen. C) sektioner med en tykkelse på 14 μm er fastgjort til glasmikroskop gliderne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative billeder af regenererende tibias-forreste muskler. H & E farvning af tibias forreste muskler før (A) og 7 dage efter kardiotoksiner skade (B). (C) i uskadet muskel Pax7 er positive (i rødt) satellit celler placeret under basal lamina mærket med Laminin (med grønt). Kerner er modfarvede med DAPI (i blåt). Pax7 positive celler er markeret med en pil. (D) efter 10 dages regenerering er myofibers karakteriseret ved centralt beliggende kerner (i blåt), Pax7 er vist med rødt, Laminin i grøn. Pax7 positive celler er markeret med en pil. (E) nydannede myofibers udtrykker udviklingsmæssige myosin (i rødt), Laminin i grøn, kerner er modfarvet med dapi (i blåt). (F) fluorescently mærket Self-levere siRNA (sired, afbildet i rødt) findes stadig i satellit celler (Pax7 positiv, i grøn, markeret med en pil i inset) 2 dage efter injektion af den selv-levere siRNA til regenererende tibias forreste muskel (injektion på dag 3 efter kardiotoksiner, medieret skade). Laminin er vist i hvidt, kerner er modfarvede med DAPI (i blåt). Scale bar = 100 μm (A og B), 50 μm (C-E), 25 μm (F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: kvantificering af optagelsen af fluorescently mærket siRNA. A) kvantificering af siRNA-optagelsen ved satellit celler (Pax7 + celler) og regenererende myofibers 2 dage efter injektion i regenererende skeletmuskulatur. Injektion blev udført på dag 3 efter medieret skade på kardiotoksiner. n = 3, fejllinjer viser SEM.B) kvantificering, der ligger til grund for grafen beskrevet i litra a). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Her præsenterer vi en metode til at undersøge funktionen af et bestemt gen under regenerering af skeletmuskulatur uden behov for transgene dyr. Dette opnås ved kombinationen af kardiotoksiner induceret muskelskade med injektion af en selv-levere siRNA i regenererende skeletmuskulatur på dag 3 efter skade. Vi har beskrevet i detaljer procedurerne for muskelskade ved kardiotoksiner, injektion af den selv-levere siRNA og behandling af de høstede muskler til at analysere udviklingen af regenerering. Vi viser, at injektion af slangen Venom cardiotoxin i skeletmuskulatur effektivt skader hele musklen, og at selv-levere siRNAs findes i omkring 75% af alle satellit celler blandt andre celletyper to dage efter deres injektion i regenererende skeletmuskulatur (figur 4, figur 5).
Særlig opmærksomhed bør fokuseres på en homogen skade af tibias forreste muskel, da varierende grader af skade påvirker regenererings resultatet og dermed også virkningen af siRNA kan blive påvirket. Desuden er det afgørende vigtigt, at hele regenererende område injiceres med den selv-levere siRNA. Til analyse af regenereringsprocessen, anbefales det altid at sammenligne lignende områder af regenererende skeletmuskulatur, derfor tibias forreste muskel bør skæres i halve til altid at sammenligne midten af maven regionen af musklen. Når du analyserer musklen, hele cryosection skal analyseres, da myofiber sammensætning adskiller sig i tibias forreste muskel og kan derfor regenerere forskelligt.
Funktionen af satellit celler kan undersøges ved forskellige eksperimentelle procedurer, herunder deres kultur på de tilstødende isolerede enkelt myofibers17, ved transplantation og ved at analysere regenerering af skeletmuskulatur efter induceret skade 18,19. Undersøge funktionen af satellit celler ved hjælp af en in vivo induceret skade model, fx, injektion af kardiotoksiner, giver mulighed for at analysere satellit celle funktion også i form af deres interaktion med andre celletyper såsom makrofager og undersøgelse af indflydelsen af systemiske faktorer2. Skade på skeletmuskulatur kan opnås ved forskellige midler, fx excentrisk motion, fryse skade, injektion af BaCl2 eller injektion af slange venomer såsom kardiotoksiner eller notexin18. Mens excentrisk motion er formentlig den mest fysiologiske skade metode, er skaden på en bestemt muskel kun begrænset20. Fryse skader kan anvendes, når migrationen af satellit celler mod stedet for skade er formålet med undersøgelsen eller kun en bestemt del af musklen skal være såret. Eksperimentelt Ulempen ved fryse skader er den åbne kirurgi, som skal udføres for at anvende den forkølede metal sonde. Injektion af bacl2 eller slange hymenopteragifte er den mest dramatiske metode til skade, og dermed udfordrende satellit celle funktion mest. Desuden er injektionen minimalt invasiv, kirurgi tid, i almindelighed, er mindre end fem minutter og ikke involverer suturering, etc. derved minimerer risikoen for infektioner.
Muskelskade er for det meste bruges til at undersøge de funktionelle konsekvenser af tab af genfunktioner, f. eks, tab af Pax77,21. Især hvis ældre mus er i fokus i det videnskabelige spørgsmål, er generering eller brug af Transgene mus ofte ikke muligt. Injektion af selv-levere siRNAs rettet mod et bestemt gen er et levedygtigt alternativ i disse tilfælde og er blevet anvendt med succes22. Kort sagt, tibias forreste muskel af mus blev såret ved injektion af kardiotoksiner og selv-levere sirnas rettet mod fibronektin (FN) blev injiceret på dag 3 efter skade. Musklerne blev analyseret 10 dage efter skaden og et signifikant fald i satellit cellenumre blev observeret i sifn versus røræg siRNA kontrolbetingelser. Knockdown-effektiviteten blev fastlagt i hele muskel lysater ved kvantitativ realtids PCR 2 dage efter siRNA-injektion, blev der opnået en reduktion i ekspressions niveauerne på 58%, hvilket tyder på, at leverings-og Knockdown-effektiviteten er tilstrækkelig til funktionelle analyser22. Alternativer til afprøvning af Knockdown effektivitet er enten immun eller immunofluorescens analyser med antistoffer rettet mod målgenet. Effektiviteten og specificiteten af siRNA, der anvendes til in vivo-injektioner, bør bestemmes før injektion i mus, fx ved at afprøve effektiviteten i isolerede satellit celler eller primære myoblaster. Brugen af en smart pool bestående af 4 forskellige siRNAs versus en enkelt siRNA øger effektiviteten af Knockdown, men øger også risikoen for uspecifik målretning. Specificiteten af alle anvendte siRNA-sekvenser skal testes i cellekultur for at undgå off-Target effekter. Som en kontrol, bør en ikke-målretning røræg siRNA anvendes, da injektion af en siRNA per se kan påvirke regenerering proces på grund af injektion og dermed yderligere skader af musklen. Tidspunktet for injektion af siRNA er afhængig af det videnskabelige spørgsmål og af udtryks profilen for målgenet. Generelt, en injektion af selv-levere siRNA på dag 3 efter kardiotoksiner skade mål de fleste gener vigtige for satellit celle spredning siden satellit celle spredning toppe omkring dag 3 efter skade. Tidspunktet for den første siRNA injektion bør ikke være mindre end 48 h efter kardiotoksitis skade, da injektionsvolumenet af kardiotoksiner er ret højt, og reabsorption af væsken bør have fundet sted, før der injiceres yderligere opløsninger i musklen. Generelt er flere injektioner af siRNAs eller en kombination af forskellige siRNAs muligt, selv om man må antage, at hver injektion i den regenererende muskel forårsager yderligere skader.
En begrænsning af den beskrevne metode er den kendsgerning, at den observerede virkning ikke nødvendigvis kun afhænger af Knockdown af målgenet i satellit celler, men kan tilskrives andre celletyper såsom immunceller eller Fibro-adipogenic progenitorceller. Derfor er det nødvendigt at kombinere disse eksperimenter med eksperimenter, der undersøger en ren population af satellit celler. Man kan enten udføre eksperimenter ved hjælp af flydende myofiber kulturer, hvor satellit celler dyrkes på deres tilstødende myofibers eller udføre transplantation eksperimenter ved hjælp af isolerede satellit celler17.
Et alternativ til injektion af selv-levere siRNAs er injektion af små molekyle hæmmere eller rekombinante proteiner, som kan udføres, afhængigt af det videnskabelige spørgsmål. For eksempel, injektion af den ekstracellulære matrix protein fibronektin eller små molekyle hæmmere af Jak/stat signalering er blevet udført med succes i alderen mus15,16. Analysen af et bestemt gen funktion i en bestemt celletype under regenerering af skeletmuskulatur, f. eks, i satellit celler, er kun muligt ved hjælp af en inducerbar genetisk musemodel. Injektioner af selv-levere siRNAs, rekombinante proteiner eller små molekyle hæmmere kan påvirke flere celletyper i regenererende skeletmuskulatur.
Disclosures
Vi vil gerne takke Christina Picker og Christine poser for fremragende teknisk assistance og Saskia Steiner for hjælp med bestemmelsen af siRNA transfektering effektivitet. Vi takker kerne tjenestens histologi for stor teknisk support, især Sabine Landmann og Linda Rothenburger. Vi takker også dyret facilitet musen på FLI for fremragende støtte. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA-3975/2-1) og Deutsche Krebshilfe (DKH-JvM-861005) til J.v.M.
Acknowledgments
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Henry Schein | Isothesia | inhalation narcotics |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Anesthesia System (Tec 7) with inhalation box + nose masks | Tem Sega | Minihub | |
| Shaver for rodents | isis | GT420 | |
| Cardiotoxin | Latoxan | L8102 | snake venom needed for muscle injury |
| Accell siRNA smart pool | Dharmacon | depending on your target gene | self delivering siRNA |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-21206 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher | A-21123 | secondary antibody |
| Coverslips | VWR | 631-1574 | |
| CV Mount | Leica | 14046430011 | mounting medium for immunohistochemistry |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | nuclear staining |
| devMHC antibody | DHSB | F.1652 | |
| Eosin Y | Thermo Fisher | 73104 | |
| Haematoxylin Gill No3 | Sigma-Aldrich | GHS316-500ML | |
| Insulin syringe (29 g) | Terumo | 3SS05M2813 | syringue used for muscle injections |
| Laminin antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
| M.O.M blocking reagent | Vector labs | MKB-2213 | blocking for immunofluorescent staining |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | Metacam | analgesics |
| OCT | Thermo Fisher | 6502 | tissue embedding |
| Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | satellite cell specific antibody |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36934 | aequos mounting medium |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | tissue embedding |
| Superfrost plus | Thermo Scientific | J1830AMNZ | microscope slides |
| TritonX-100 | Amresco | 0694-1L | permeabilization reagent |
| Dissection tools | |||
| Dumont 5, straight | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Dumont 7, curved | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Extra fine Bonn scissors (cutting edge: 13 mm) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-16 | |
| Spring scissors (cutting edge: 5 mm, tip diameter: 0.35 mm) | Fine Science Tools | 91500-09 |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Schmidt, M., Schuler, S. C., Huttner, S. S., von Eyss, B., von Maltzahn, J. Adult stem cells at work: regenerating skeletal muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytolology. 9, 493-495 (1961).
- Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
- von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite cells and the muscle stem cell niche. Physiological Reviews. 93 (1), 23-67 (2013).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Building muscle: molecular regulation of myogenesis. Cold Spring Harb Perspectives in Biology. 4 (2), (2012).
- Schworer, S., et al. Epigenetic stress responses induce muscle stem-cell ageing by Hoxa9 developmental signals. Nature. 540 (7633), 428-432 (2016).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- von Maltzahn, J., Renaud, J. M., Parise, G., Rudnicki, M. A. Wnt7a treatment ameliorates muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 109 (50), 20614-20619 (2012).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Lukjanenko, L., et al. Loss of fibronectin from the aged stem cell niche affects the regenerative capacity of skeletal muscle in mice. Nature Medicine. 22 (8), 897-905 (2016).
- Huttner, S. S., et al. Isolation and Culture of Individual Myofibers and Their Adjacent Muscle Stem Cells from Aged and Adult Skeletal Muscle. Methods in Molecular Biology. , (2019).
- Hardy, D., et al. Comparative Study of Injury Models for Studying Muscle Regeneration in Mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
- Hall, M. N., et al. Transplantation of Skeletal Muscle Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1556, 237-244 (2017).
- Dueweke, J. J., Awan, T. M., Mendias, C. L. Regeneration of Skeletal Muscle After Eccentric Injury. Journal of Sport Rehabilitation. 26 (2), 171-179 (2017).
- Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).
- Bentzinger, C. F., et al. Fibronectin regulates Wnt7a signaling and satellite cell expansion. Cell Stem Cell. 12 (1), 75-87 (2013).
