Summary
Nós descrevemos um método in vivo para investigar a perda funcional de um gene específico em pilhas satélites usando uma combinação de ferimento mediado letal do músculo esqueletal e da injeção de um siRNA Self-entregando.
Abstract
O músculo esquelético possui uma enorme capacidade de regeneração após lesão. Este processo é impulsionado principalmente por células-tronco musculares, também denominado células satélites. As células satélites são caracterizadas pela expressão do fator de transcrição Pax7 e sua localização embaixo da lâmina basal no músculo esquelético em repouso. Após a lesão, as células de satélite são ativadas, passam por autorenovação ou diferenciação para formar novas miofibras ou para fundir-se com os danificados. A funcionalidade das células de satélite in vivo pode ser investigada usando um modelo de lesão baseado em cardiotoxina do músculo esquelético. Para estudar a função de um gene durante a regeneração do músculo esquelético, modelos de camundongo transgênicos são usados principalmente. Aqui, nós apresentamos um método alternativo aos ratos transgênicas, para investigar a função do gene em pilhas satélites durante a regeneração, por exemplo, nos casos onde os ratos transgênicas não estão disponíveis. Nós combinamos o ferimento mediado letal de um músculo esqueletal específico com a injeção de um siRNA Self-entregando no músculo regenerando que é tomado então acima por pilhas satélites entre outras pilhas. Desse modo, nós fornecemos um método para analisar a função do gene em pilhas satélites durante a regeneração circunstâncias physiological sem a necessidade para ratos transgênicas.
Introduction
O músculo esqueletal é o tecido o maior do corpo que representa aproximadamente 40% do peso de corpo total permitindo a locomoção voluntária. A arquitetura tecidual do músculo esquelético é composta principalmente por miofibras pós-mitóticas, terminalmente diferenciadas, multinucleadas, bem como várias outras células do sistema nervoso periférico, sistema vascular e células intersticiais1. Importante, o músculo esqueletal tem uma capacidade tremenda de regenerar e restaurar a função em cima da lesão ou do dano2. Esse processo depende das células-tronco musculares residentes no tecido também denominadas células satélites3,4. As células satélites estão localizadas entre o miofiber e a lâmina basal e caracterizadas pela expressão do fator de transcrição Pax7,5,6,7. Em condições homeostáticas, as células satélites são quiescentes, mas são ativadas devido a lesões traumáticas, por exemplo, através de exercícios excêntricos ou experimentalmente através da injeção do veneno de cobra cardiotoxina6,8. Uma vez ativadas, Pax7 células satélites positivas expressam MyoD e Myf5, que compromete as células-tronco à diferenciação miogênica. As células satélites que resistem ao upregulation de fatores do compromisso conservarão seu potencial do células e retornarão ao quiescência para reabastecer a associação da pilha de haste para demandas futuras. Após a expansão da Associação de progenitoras miogênicas, as redes transcricional são ativadas por fatores de diferenciação como Myogenin para iniciar a saída do ciclo celular e a diferenciação terminal. Estes myoprogenitors fundem-se então a se ou às miofibras existentes que contribuem internos para manter o tamanho do domínio myonuclear. Os myofibers expressam genes terminais da diferenciação do músculo como a corrente pesada de myosin. Finalmente, as miofibras recém-formadas crescem e amadurecem para construir as unidades funcionais do músculo esquelético9,10.
A regeneração do músculo esquelético pode ser afetada por váriascondições, incluindodoenças musculares ou envelhecimento11,12, variandode deficiências leves a condições de risco de vida, por exemplo, em distrofia muscular de Duchenne13 , 14. portanto, a medicina regenerativa tem como objetivo restaurar o tecido muscular esquelético danificado ou defeituoso usando seu poder regenerativo inerente, visando afunção de céluladesatélite15,16. Para usar seu pleno potencial uma compreensão detalhada de pilhas satélites em seu Niche endógeno durante a regeneração do músculo esqueletal é exigida. Embora existam abordagens experimentais para isolar as células satélites adjacentes às suas miofibras17, a complexidade total das interações celulares e sistêmicas das células satélites com seu ambiente só pode ser recapitulada in vivo. Nesse sentido, grandes conhecimentos sobre a regeneração muscular esquelética foram adquiridos por meiode modelosdelesão do camundongo,18.
Aqui nós introduzimos um modelo experimental específico do ferimento do rato para estudar a regeneração negociada da pilha de haste de dano cardiotoxin-induzido do músculo anterior dos tibial in vivo. A cardiotoxina, uma toxina citolítica derivada da serpente que causa a despolarização e a necrose do interiorizados, é injetada no músculo anterior dos tibial, que por sua vez provocará a degeneração do tecido seguida pela regeneração. Para analisar a função dos genes durante a regeneração aguda, os siRNAs Self-entregando são injetados no dia 3 após ferimento, no pico da expansão da pilha Satellite. Os animais experimentais são sacrificados em vários pontos temporais e os músculos tibial anterior são coletados. Os músculos dissecados são congelados e processados para posterior crioseccionamento. A microscopia da imunofluorescência é usada então para analisar marcadores da regeneração. Este método permite a investigação da função de um único gene durante a regeneração conduzida da pilha satélite do músculo esqueletal usando ratos do tipo selvagem.
Protocol
Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo departamento de bem-estar dos animais da Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz (03-048/16; TLV Bad Langensalza, Alemanha).
1. lesão muscular induzida por cardiotoxina
Nota: Realize todos os experimentos envolvendo camundongos vivos de acordo com a lei nacional de bem-estar animal e condições assépticas apropriadas. Além disso, o sacrifício de animais deve ser realizado de acordo com a lei nacional de bem-estar animal.
- Desinfecte a caixa inalatória utilizada para anestesia inalatória e a área cirúrgica com 70% de etanol. Coloc um pano cirúrgico estéril na almofada de aquecimento onde a cirurgia ocorrerá.
- Ligue a almofada de aquecimento a 37 ° c.
- Administrar analgésicos (por exemplo, 1 mg/kg de peso corporal Meloxicam subcutaneously) 15 min antes do início da cirurgia.
Nota: Para um experimento típico, use camundongos com pelo menos 6 semanas de idade, com correspondência sexual e em uma boa condição física geral. - Prepare a solução de cardiotoxina (20 μM em 0,9% de NaCl), armazene a solução a-20 ° c.
- Permitir que a solução de cardiotoxina atinja a temperatura ambiente (RT).
- Transfira o rato para a caixa de inalação e induza a anestesia com isoflurano (iniciação 3,5 – 5% em oxigénio puro). Verifique a profundidade da anestesia com a falta de resposta a uma pitada de dedo do pé.
- Coloque o mouse sobre uma toalha de papel limpo e manter a anestesia com uma máscara de nariz (1,5-3% isoflurano em oxigênio puro). Depilar a área de injeção da perna inferior do crânio (do joelho à pata, Figura 1a). Retire todo o cabelo solto excessivo.
Nota: A separação física da área de corte e injeção na sala fornecerá condições mais estéreis para as injeções. - Coloque o mouse na posição lateral reclinada na almofada de aquecimento coberta com um pano cirúrgico estéril e manter a anestesia com uma máscara de nariz (1,5 – 3% isoflurano em oxigênio puro).
- Desinfete a área de injeção da perna inferior do crânio (do joelho à pata) com 70% de etanol.
- Realize uma pitada de dedo do pé antes de iniciar a injeção intramuscular para garantir uma profundidade adequada de anestesia.
- Injete 50 μL de cardiotoxina (20 μM em 0,9% de NaCl) no músculo tibial anterior usando uma seringa de insulina com uma agulha de calibre 29. Primeiro, perfure a pele apenas distal do joelho.
- Insira a agulha totalmente no músculo (na orientação de miofibras/paralela ao osso da tíbia) e injete a cardiotoxina lentamente (10-20 s) ao longo do comprimento total do músculo enquanto move a agulha para trás e para frente para permitir uma distribuição uniforme da cardiotoxina assim ferindo todo o músculo tibial anterior (Figura 1B, C).
Nota: Ferir o músculo tibial anterior de apenas uma perna, o músculo tibial anterior tibial pode servir como um controle interno para determinar que os músculos esqueléticos não foram patologicamente afetados antes da lesão de cardiotoxina. - Transfira o mouse de volta para a gaiola colocada em uma almofada de aquecimento e monitore o processo de recuperação até que o animal esteja consciente e se torne ambulatório.
Nota: Os ratos só vão mostrar um ligeiro coxear. Se os ratos estão mancando pesadamente e não colocar o peso sobre a perna em tudo, sacrificar o mouse. - Administrar analgésicos durante os 2 dias seguintes (por exemplo, 1 mg/kg de peso corporal Meloxicam subcutaneamente, a cada 24 h) e monitorá-los semanalmente.
2. injeção de self-entregando o siRNA no músculo anterior de regeneração do tibialis (no dia 3 ferimento do Cardiotoxin do borne)
- Prepare a solução de siRNA ressuscita o siRNA (por exemplo, a associação esperta de siRNA) em 0,9% NaCl (concentração final de 2 μg/μL) de acordo com a instrução do fabricante.
Nota: O siRNA é quimicamente modificado para facilitar a captação passiva pelas células e protegê-la da degradação da nuclease. Não são necessários reagentes de transfecção, reduzindo assim a toxicidade. Usando um pool inteligente de quatro sequências independentes de siRNA visando o mesmo gene aumenta a eficiência de knockdown. - Guarde o siRNA a-20 ° c e transfira-o no gelo para a sala de cirurgia.
- Desinfecte a caixa inalatória utilizada para anestesia inalatória e a área cirúrgica com 70% de etanol. Coloc um pano cirúrgico estéril na almofada de aquecimento onde a cirurgia ocorrerá.
- Ligue a almofada de aquecimento a 37 ° c.
- Transfira o rato para a caixa de inalação e induza a anestesia com isoflurano (iniciação 3,5 – 5% em oxigénio puro). Verifique a profundidade da anestesia com a falta de resposta a uma pitada de dedo do pé.
- Coloque o mouse na posição lateral reclinada na almofada de aquecimento coberta com um pano cirúrgico estéril e manter a anestesia com uma máscara de nariz (1,5 – 3% isoflurano em oxigênio puro).
- Desinfete a área de injeção da perna inferior do crânio (do joelho à pata).
- Realize uma pitada de dedo do pé antes de iniciar a injeção intramuscular para garantir uma profundidade adequada de anestesia.
- Injete até 50 μL de solução de siRNA (até 100 μg no total em 0,9% de NaCl; dirigida contra o gene alvo; use o siRNA codificado como controle) para o músculo tibial anterior lesionado usando uma seringa de insulina com uma agulha de 29 G. Primeiro, perfure a pele apenas distal do joelho, em seguida, insira a agulha no músculo tibial anterior.
- Insira a agulha totalmente no músculo (na orientação miofiber/paralela ao osso da tíbia) e injete a solução de siRNA lentamente (10 – 20 s) ao longo do comprimento total do músculo ao mover a agulha para trás e para frente para permitir uma distribuição uniforme do siRNA ao longo do músculo anterior do tibial inteiro.
- Transfira o mouse de volta para a gaiola colocada em uma almofada de aquecimento e monitore o processo de recuperação até que o animal esteja consciente e se torne ambulatório.
Nota: A analgesia não está necessariamente seguindo a injeção de siRNA.
3. dissecção do músculo tibialis anterior
- Prepare a solução de congelamento (2 partes de composto de OCT e 1 parte de sacarose a 30% em água desionizada) pelo menos 12 h antes do uso para evitar bolhas de ar.
- Prepare moldes de congelação envolvendo uma folha de alumínio em torno de um lápis e sele-a com fita adesiva. É importante que a parte inferior do molde forneça uma superfície mesmo, fechada.
Nota: Os moldes de congelação menores permitem o congelamento mais rápido do músculo evitando artefatos congelantes. - Sacrifique o rato, por exemplo, por inalação de CO2 , no ponto de tempo respectivo da regeneração e pulverize as ferramentas inteiras do rato e da dissecção com o etanol 70%.
Nota: A deslocação cervical pode ser aplicada, além, para evitar o sangramento excessivo na perna ao isolar o músculo tibial anterior. - Retire o pêlo e a pele do membro posterior lesionado cortando a pele no tornozelo com uma tesoura afiada extra fina (aresta de corte: 13 mm) e puxando a pele para o joelho utilizando fórceps.
- Para expor o tendão anterior do tibial no tornozelo, puxe a pele restante para o pé ou corte com tesouras afiadas.
Nota: O mouse pode ser fixado a uma placa de suporte para permitir uma melhor fixação. - Antes de colher o músculo tibial anterior, retire a fáscia usando fórceps fino (Dumont 5 ou 7, reto ou curvo). Aperte o fórceps fechado através da fáscia ao lado do osso da tíbia no tornozelo da perna ferida (Figura 2a). Mova o fórceps para o joelho, assim, rasgando a fáscia e expondo o músculo tibial anterior (Figura 2b).
- Para isolar o músculo tibial anterior, expor o tendão distal e agarrá-lo com pinça fina (Dumont 7, curvo). Corte o tendão usando tesouras de mola (aresta de corte: 5 mm, diâmetro da ponta: 0,35 mm) e puxe o músculo (segurando-o no tendão) em direção ao joelho.
- Para colher o músculo tibial anterior, cortá-lo tão perto do joelho quanto possível usando tesouras afiadas.
- Antes do congelamento, corte o músculo tibial anterior na região da barriga média do músculo com tesoura reta em duas metades de tamanho igual para permitir a análise da região do ventre médio (Figura 2C, D).
- Encha o molde de congelação no meio da solução de congelação.
- Insira as duas metades do músculo tibial anterior no molde de congelação com a região da barriga do meio virada para o fundo do molde (Figura 2e). Certifique-se que as metades anteriores do tibial estão inseridas em uma posição ereta que inclina-se de encontro à parede do molde de congelação para evitar a derrubada do músculo.
Nota: A solução mais congelante está no molde, quanto mais tempo o congelamento tomará, aumentando assim o risco de crio-artefatos. - Segure o molde de congelação usando fórceps e transfira-o no meio do nitrogênio líquido (Figura 2F). Certifique-se de que nenhum nitrogênio líquido está entrando no molde de congelação durante o processo de congelação.
- Observe o processo de congelamento, o meio de congelamento muda de cor de transparente para branco e torna-se sólido. Submersa o molde de congelação no nitrogênio líquido por alguns segundos e transfere o molde de congelação a um congelador de-80 ° c ou a gelo seco para o processamento futuro.
- Armazene os músculos congelados nos moldes de congelação em-80 ° c até o uso mais adicional.
Nota: Os moldes de congelamento se encaixam bem em 24-bem placas ou 1,5 mL tubos de reação permitindo a rotulagem e armazenamento organizado. - Manuseie o músculo nos moldes de congelação para um uso mais adicional sempre no gelo seco.
4. cryosectioning do músculo anterior de regeneração de tibialis
- Antes de iniciar o corte, defina a temperatura da câmara do criostat para-21 ° c, a temperatura do objeto para-20 ° c e a espessura de corte para 10, 12 ou 14 μm (dependendo das aplicações futuras) (Figura 3a).
- Transfira a amostra do músculo no molde de congelação no criostato e deixe-a ajustar à temperatura por diversos minutos. Durante este tempo, rotule as lâminas do microscópio.
- Retire a folha em torno do músculo incorporado usando fórceps pré-arrefecido dentro do criostat. Evite tocar da amostra como o cryomedium começa a descongelar facilmente.
- Monte a amostra com a região da barriga média do músculo tibial anterior dirigida para cima para o suporte de amostra de metal do criostat usando cryomedium. Isto assegura-se de que o local do corte do músculo (parte inferior do molde) esteja enfrentando o experimentador.
- Insira o suporte da amostra com a amostra montada no mecanismo de corte.
Nota: Para garantir o corte adequado da amostra, use uma nova lâmina antes de iniciar. - Primeiro, aparar o bloco de amostra (30 μm) para obter um plano de corte mesmo e para alcançar a respectiva região do músculo (Figura 3B).
- Após aparar, corte seções consecutivas da respectiva espessura (por exemplo, 14 μm).
- Colete as seções em lâminas de vidro do microscópio segurando a corrediça virada para baixo sobre a seção. A seção está anexando ao slide (Figura 3C).
- Armazene seções em-80 ° c ou-20 ° c até o uso mais adicional ou o uso diretamente para a imunofluorescência ou immunohistochemistry.
5. imunocoloração para marcadores de regeneração
- Realize todas as etapas adicionais em uma câmara humidificada.
- Brevemente, equilibram as secções à temperatura ambiente.
- Fixar secções com 1 mL de 2% de PFA (em PBS, pH 7,4) por diapositivo durante 5 min em RT.
- Retire a solução 2% PFA derramando-a no respectivo contentor de resíduos.
- Lave 3 vezes com 1 mL de PBS (pH 7,4) durante 5 min em RT.
- Remova o PBS derramando-o em um recipiente waste.
- Por slide, adicione 1 mL da solução de permeabilização (0,1% Triton X-100, 0,1 M Glycine em PBS pH 7,4) por 10 min.
- Retire a solução de permeabilização derramando-a num contentor de resíduos.
- Adicione 150 μL da solução de bloqueio (M.O.M. 1:40 em PBS pH 7,4) por slide e cubra com a lamínula. Incubar por 1 h em RT.
- Retire a lamínula e a solução de bloqueio, aplique 100 μL de solução de anticorpo primário [PAX7, DSHB, mouse IgG1, não diluído ou devMHC, DSHB, não diluído, mouse IgG1and laminina (Rabbit,1:1000)] por slide. Cubra com lamínula. Incubar O/N (durante a noite) a 4 ° c.
Nota: Realize uma coloração de controle omitindo os anticorpos primários, incubar a seção com solução de bloqueio em vez disso. - Lave 3 vezes com 1 mL de PBS (pH 7,4) durante 5 min em RT.
- Remova o PBS derramando-o em um recipiente waste.
- Adicionar 100 μL da solução de anticorpo secundário (Alexa fluor 546 cabra anti-mouse IgG1 e Alexa fluor 488 burro anti-coelho IgG na solução de bloqueio, 1:1.000) por slide e tampa com a lamínula. Incubar por 1 h em RT.
- Incubar as lâminas no escuro, por exemplo, use uma folha de alumínio para cobrir ou usar uma câmara umidificada preta.
Nota: A partir de agora, todos os passos devem ser realizados em condições de luz reduzidas, uma vez que alguns anticorpos secundários são sensíveis à luz. - Retire a lamínula e a solução de anticorpos secundários.
- Lave 3 vezes com 1 mL de PBS (pH 7,4) durante 5 min em RT.
- Remova o PBS derramando-o em um recipiente waste.
- Realize a coloração DAPI adicionando 1 mL da solução por slide a uma concentração final de 10 μg/mL por 5 min em RT.
- Remova a solução de coloração DAPI derramando-a em um recipiente waste.
- Lave 3 vezes com 1 mL de PBS (pH 7,4) durante 5 min em RT.
- Remova completamente o PBS usado para lavar.
- Aplique 2 – 3 gotas de meio de montagem aquosa e cubra diretamente o slide com uma nova lamínula.
- Deixe as lâminas secar por 1 h na RT no escuro.
- Guarde as secções manchadas a 4 ° c no escuro até uma análise mais aprofundada utilizando um microscópio de fluorescência.
6. coloração de hematoxilina e eosina
- Realize todas as etapas adicionais em uma câmara humidificada.
- Fixar secções com 1 mL de 2% de PFA (em PBS, pH 7,4) por diapositivo durante 5 min em RT.
- Retire a solução 2% PFA derramando-a no respectivo contentor de resíduos.
- Transfira os slides para um frasco de Coplin.
- Lave suavemente as lâminas com água da torneira.
Nota: Não ligue a torneira muito alta, uma vez que pode danificar as seções. - Transfira os slides para a câmara humidificada. Retire o líquido.
- Aplique 1 mL de solução de coloração de hematoxilina (Gill n º 3) durante 2 min.
- Transfira os slides para um frasco de Coplin.
- Enxague suavemente as lâminas com a água da torneira até que os núcleos se transformam em azul.
Nota: Não ligue a torneira muito alta, uma vez que pode danificar suas seções. - Transfira os slides para a câmara humidificada. Retire o líquido.
- Aplique 1 mL de solução de eosina Y e incubar durante 2 min.
- Transfira os slides para um frasco de Coplin.
- Lave suavemente as lâminas com água da torneira até que a água da torneira que sai das lâminas esteja clara.
- Retire todo o líquido e deixe secar as lâminas durante 2 min.
- Monte no meio de montagem apropriado para immunohistochemistry.
Representative Results
Um resultado típico de uma coloração do hematoxilina e do eosina (H & e) de um músculo anterior dos tibial antes e depois que ferimento mediado letal é apresentado em Figura 4a, B. Nos músculos controle, a arquitetura do músculo está intacta como visto pela localização dos núcleos na periferia das miofibras e a falta de acúmulo de células mononucleadas no espaço intersticial (figura 4a). 7 dias após a lesão mediada por cardiotoxina, novas miofibras são formadas marcadas por núcleos localizados centralmente (Figura 4B). Além disso, uma acumulação de pilhas células pode ser observada, consistindo na maior parte de pilhas satélites mas também de pilhas não-myogenic como pilhas imunes. O músculo inteiro deve ser ferido caracterizado pela posição central de todo o internos e pela acumulação de pilhas células na seção inteira do músculo.
Para caracterizar a progressão e o sucesso do processo da regeneração, diversas coloração Immunofluorescent usando marcadores da regeneração podem ser executadas. O número de células de satélite pode ser avaliado por coloração para Pax7, o marcador canônico para células de satélite (Figura 4C, D). Três dias após a lesão, o número de células satélites aumenta (Figura 4D), as células satélites não estão mais localizadas a lâmina basal. Para analisar ainda mais o processo de regeneração, as miofibras recém-formadas podem ser coradas com anticorpos direcionados à miosina desenvolvimental (Figura 4E). Os myofibers recentemente formados exibem núcleos centralmente localizados e uma forte expressão de miosina desenvolvimental. Como as miofibras amadurecem, a expressão de miosina de desenvolvimento diminui, o diâmetro do miofiber aumenta enquanto os núcleos estão migrando para a periferia das miofibras.
A influência de um único gene no processo de regeneração pode ser investigada usando camundongos transgênicos ou como mostrado aqui pela injeção de um siRNA Self-entregando. Fluorescently rotulado auto-entregando controle codificado siRNA foi injetado no músculo anterior de regeneração tibial no dia 3 após a lesão, o ponto de tempo quando a proliferação de células de satélite picos. Dois dias após a injeção das células satélites de siRNA foram analisados para a presença do siRNA rotulado fluorescentamente (Figura 4F). Analisamos quantas células satélites haviam tomado o siRNA rotulado fluorescentemente dois dias após a injeção no músculo regenerador (Figura 5). Cerca de 75% de todas as células satélites no músculo regenerador foram positivas para o siRNA rotulado fluorescentamente. Além disso, nós determinamos que aproximadamente 74% de todos os myofibers de regeneração eram positivos para o siRNA cDNAs etiquetado sugerindo que 74% dos myofibers de regeneração tivessem tomado acima do siRNA ou que as pilhas de satélite siRNA-positivas ou tinham fundido com um ao outro para formar novas miofibras ou que a fusão com miofibras regeneradoras já existentes ocorreu (Figura 5). Isto sugere que as pilhas satélites tomam acima o siRNA Self-entregando e que o siRNA persiste nas pilhas satélites por pelo menos dois dias.
Figura 1: injeção de cardiotoxina no músculo tibial anterior. (A) os camundongos são anestesiados por inalação de isoflurano e o membro inferior é raspado. (B) uma agulha de 29 G é injetada no músculo tibial anterior (C) e movida ao longo do osso da tíbia durante a injeção da solução de cardiotoxina. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: etapas envolvidas na dissecção e congelamento do músculo tibial anterior lesionado. (A) osmúsculos do membro traseiro são expostos (B) e a fáscia em torno do músculo tibial anterior é rasgada para expor o músculo. (C) após a remoção do músculo, ele é cortado na região do ventre mid em duas metades de tamanho similar usando tesouras retas afiadas (D). (E) as metades do músculo dissecado são encaixadas em um molde da folha de alumínio enchido com a solução de congelação e congelado no nitrogênio líquido (F). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: equipamentos e etapas envolvidas na criticidade dos músculos tibial anterior. (A) a temperatura da câmara do criostat é ajustada a-21 ° c. (B) o músculo tibial anterior na solução de congelação é montado no suporte da amostra. (C) secções de 14 μm de espessura estão ligadas a lâminas de microscópio de vidro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: imagens representativas dos músculos anteriores dos tibial regenerantes. Coloração de H & E de músculos tibial anterior antes (A) e 7 dias após lesão de cardiotoxina (B). (C) em células satélites Pax7 positivas (em vermelho) do músculo não lesionado estão localizadas embaixo da lâmina basal marcada por laminina (em verde). Os núcleos são contracorados com DAPI (em azul). Pax7 células positivas são marcadas por uma seta. (D) após 10 dias da regeneração, os myofibers são caracterizados por núcleos centralmente situados (no azul), Pax7 são mostrados no vermelho, laminina no verde. Pax7 células positivas são marcadas por uma seta. (E) miofibras recém-formadas expressam miosina de desenvolvimento (em vermelho), laminina em verde, núcleos são contracorados com DAPI (em azul). (F) o siRNA Self-entregando fluorescently etiquetado (sired, representado no vermelho) é encontrado ainda nas pilhas satélites (Pax7 positivo, no verde, marcado por uma seta no Inset) 2 dias após a injeção do siRNA Self-entregando em tibial de regeneração anterior muscular (injeção no dia 3 após lesão mediada por cardiotoxina). A laminina é mostrada em branco, os núcleos são contracorados com DAPI (em azul). Barra de escala = 100 μm (A e B), 50 μm (C-E), 25 μm (F). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: quantificação da captação de siRNA rotulado fluorescentemente. (A) quantificação da captação de siRNA por células satélites (células Pax7 +) e miofibras regeneradoras 2 dias após a injeção no músculo esquelético regenerador. A injeção foi realizada no dia 3 após lesão mediada por cardiotoxina. n = 3, as barras de erro mostram SEM. (B) quantificação subjacente ao gráfico representado em (a). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Aqui nós apresentamos um método para investigar a função de um gene específico durante a regeneração do músculo esqueletal sem a necessidade de animais transgênicas. Isto é conseguido pela combinação de cardiotoxina induzida ferimento de músculo com a injeção de um siRNA Self-entregando no músculo esqueletal de regeneração no dia 3 após ferimento. Nós descrevemos em detalhe os procedimentos da lesão de músculo por cardiotoxin, a injeção do self-entregando o siRNA e o processamento dos músculos colhidos para analisar o progresso da regeneração. Nós demonstramos que a injeção da cardiotoxina do veneno da serpente no músculo esqueletal fere eficazmente o músculo inteiro e que os siRNAs Self-entregando são encontrados em aproximadamente 75% de todas as pilhas satélites entre outros tipos da pilha dois dias após sua injeção no regeneração do músculo esquelético (Figura 4, Figura 5).
A atenção particular deve ser focalizada em um ferimento homogêneo do músculo anterior dos tibial desde que os graus de variação de ferimento influenciam o resultado da regeneração e desse modo também o efeito do siRNA pôde ser afetado. Além disso, é extremamente importante que toda a área regeneradora seja injetada com o siRNA Self-entregando. Para a análise do processo de regeneração, recomenda-se sempre comparar áreas semelhantes do músculo esquelético regenerador, portanto, o músculo tibial anterior deve ser cortado ao meio para sempre comparar a região do meio-ventre do músculo. Ao analisar o músculo, o criossecção inteiro precisa de ser analisado desde que a composição do interiorizados difere no músculo anterior dos tibial e pôde conseqüentemente regenerar diferentemente.
A função das células satélites pode ser investigada por vários procedimentos experimentais, incluindo sua cultura nas miofibras isoladas adjacentes17, por transplante e analisando a regeneração do músculo esquelético após lesão induzida 18,19. Investigar a função de células de satélite usando um modelo de lesão induzida in vivo, por exemplo, injeção de cardiotoxina, fornece a capacidade de analisar a função de células de satélite também em termos de sua interação com outros tipos de células, como macrófagos e investigação da influência de fatores sistêmicos2. O ferimento do músculo esqueletal pode ser conseguido por vários meios, por exemplo, exercício excêntrico, ferimento do gelo, injeção de BaCl2 ou injeção de venenos da serpente tais como o letal ou o notexin18. Quando o exercício excêntrico for provavelmente o método o mais fisiológico da lesão, a lesão a um músculo particular é limitada somente20. Os ferimentos do gelo podem ser aplicados quando a migração de pilhas satélites para o local da lesão for o alvo do estudo ou somente uma parte específica do músculo deve ser ferida. Experimentalmente, a desvantagem das lesões por congelamento é a cirurgia aberta que precisa ser realizada para aplicar a sonda metálica pré-resfriada. A injeção de BaCl2 ou de venenos da serpente é o método o mais dramático de ferimento, desafiando desse modo a função da pilha satélite mais. Além disso, a injeção é minimamente invasiva, o tempo de cirurgia, em geral, é inferior a cinco minutos e não envolve a sutura, etc, minimizando assim o risco de infecções.
A lesão muscular é usada principalmente para investigar as conseqüências funcionais da perda de funções genéticas, por exemplo, perda de Pax7,7,21. Especialmente se os camundongos envelhecidos são o foco da questão científica, a geração ou uso de camundongos transgênicos muitas vezes não é viável. A injeção de siRNAs Self-entregando que alvejam um gene específico é uma alternativa viável naqueles casos e foi usada com sucesso22. Em suma, o músculo tibial anterior dos camundongos foi ferido por injeção de cardiotoxina e os siRNAs de autoentrega dirigidos contra fibronectina (FN) foram injetados no dia 3 após a lesão. Os músculos foram analisados 10 dias após a lesão e uma diminuição significativa nos números de células satélites foi observada em siFN versus condições de controle de siRNA mexidos. A eficiência do knockdown foi determinada em lysates inteiros do músculo pelo PCR quantitativo do tempo real 2 dias após a injeção de siRNA, uma redução em níveis da expressão de 58% foi conseguida sugerindo que a eficiência da entrega e do knockdown seja suficiente para funcional análises de22. As alternativas para testar a eficiência do knockdown são análises do immunoblot ou da imunofluorescência com os anticorpos dirigidos de encontro ao gene do alvo. A eficiência e a especificidade do siRNA usados para injeções in vivo devem ser determinadas antes da injeção em camundongos, por exemplo, testando a eficiência em células satélites isoladas ou mioblasts primários. O uso de um pool inteligente que consiste em 4 siRNAs diferentes versus um único siRNA aumenta a eficiência do knockdown, mas também aumenta o risco de segmentação inespecífica. A especificidade de todas as sequências de siRNA utilizadas deve ser testada na cultura celular para evitar efeitos fora do alvo. Como um controle, um siRNA não-alvo mexidos deve ser usado desde a injeção de um siRNA per se pode influenciar o processo de regeneração devido à injeção e, assim, danos adicionais do músculo. O ponto do tempo de injetar o siRNA é dependendo da pergunta científica e no perfil da expressão do gene do alvo. Geralmente, uma injeção de siRNA Self-entregando no dia 3 após ferimento do letal alvos a maioria de genes importantes para a proliferação da pilha satélite desde picos da proliferação da pilha satélite em torno do dia 3 após ferimento. O ponto de tempo para a primeira injeção de siRNA não deve ser inferior a 48 h após a lesão de cardiotoxina, uma vez que o volume de injeção de cardiotoxina é bastante elevado e a reabsorção do líquido deve ter ocorrido antes de injetar soluções adicionais no músculo. Em geral, múltiplas injeções de siRNAs ou uma combinação de diferentes siRNAs é possível, embora se deva considerar que cada injeção no músculo regenerador está causando danos adicionais.
Uma limitação do método descrito é o fato, que o efeito observado não é necessariamente somente dependendo do knockdown do gene do alvo em pilhas satélites mas pôde ser atribuído a outros tipos da pilha tais como pilhas imunes ou células fibro-adipogenic do progenitor. Portanto, é necessário combinar esses experimentos com experimentos investigando uma população pura de células satélites. Pode-se realizar experimentos usando culturas de miofibras flutuantes, onde as células satélites são cultivadas em suas miofibras adjacentes ou realizar experimentos de transplante usando células satélites isoladas17.
Uma alternativa à injeção de siRNAs Self-entregando é a injeção de nervos inibidores pequenos da molécula ou de proteínas de recombinação que podem ser executadas, dependendo da pergunta científica. Por exemplo, a injeção da proteína da matriz extracelular fibronectina ou inibidores da molécula pequena da sinalização de Jak/stat foram executadas com sucesso em camundongos envelhecidos15,16. A análise de uma função específica do gene em um tipo específico da pilha durante a regeneração do músculo esqueletal, por exemplo, em pilhas satélites, é somente possível com o uso de um modelo genético induzível do rato. As injeções de siRNAs Self-entregando, de proteínas de recombinação ou de nervos inibidores pequenos da molécula puderam afetar tipos múltiplos da pilha no músculo esqueletal de regeneração.
Disclosures
Gostaríamos de agradecer Christina Picker e Christine Poser para excelente assistência técnica e Saskia Steiner para ajudar com a determinação da eficiência de transfection siRNA. Agradecemos ao núcleo de serviço histologia para grande suporte técnico, especialmente Sabine Landmann e linda Rothenburger. Agradecemos também o rato de instalação animal na FLI para um excelente apoio. Este trabalho foi apoiado por subvenções da Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA-3975/2-1) e da Deutsche Krebshilfe (DKH-JvM-861005) para J.v.M.
Acknowledgments
Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Henry Schein | Isothesia | inhalation narcotics |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Anesthesia System (Tec 7) with inhalation box + nose masks | Tem Sega | Minihub | |
| Shaver for rodents | isis | GT420 | |
| Cardiotoxin | Latoxan | L8102 | snake venom needed for muscle injury |
| Accell siRNA smart pool | Dharmacon | depending on your target gene | self delivering siRNA |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-21206 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher | A-21123 | secondary antibody |
| Coverslips | VWR | 631-1574 | |
| CV Mount | Leica | 14046430011 | mounting medium for immunohistochemistry |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | nuclear staining |
| devMHC antibody | DHSB | F.1652 | |
| Eosin Y | Thermo Fisher | 73104 | |
| Haematoxylin Gill No3 | Sigma-Aldrich | GHS316-500ML | |
| Insulin syringe (29 g) | Terumo | 3SS05M2813 | syringue used for muscle injections |
| Laminin antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
| M.O.M blocking reagent | Vector labs | MKB-2213 | blocking for immunofluorescent staining |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | Metacam | analgesics |
| OCT | Thermo Fisher | 6502 | tissue embedding |
| Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | satellite cell specific antibody |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36934 | aequos mounting medium |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | tissue embedding |
| Superfrost plus | Thermo Scientific | J1830AMNZ | microscope slides |
| TritonX-100 | Amresco | 0694-1L | permeabilization reagent |
| Dissection tools | |||
| Dumont 5, straight | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Dumont 7, curved | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Extra fine Bonn scissors (cutting edge: 13 mm) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-16 | |
| Spring scissors (cutting edge: 5 mm, tip diameter: 0.35 mm) | Fine Science Tools | 91500-09 |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Schmidt, M., Schuler, S. C., Huttner, S. S., von Eyss, B., von Maltzahn, J. Adult stem cells at work: regenerating skeletal muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytolology. 9, 493-495 (1961).
- Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
- von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite cells and the muscle stem cell niche. Physiological Reviews. 93 (1), 23-67 (2013).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Building muscle: molecular regulation of myogenesis. Cold Spring Harb Perspectives in Biology. 4 (2), (2012).
- Schworer, S., et al. Epigenetic stress responses induce muscle stem-cell ageing by Hoxa9 developmental signals. Nature. 540 (7633), 428-432 (2016).
- Sousa-Victor, P., et al. Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence. Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).
- Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
- von Maltzahn, J., Renaud, J. M., Parise, G., Rudnicki, M. A. Wnt7a treatment ameliorates muscular dystrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 109 (50), 20614-20619 (2012).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- Lukjanenko, L., et al. Loss of fibronectin from the aged stem cell niche affects the regenerative capacity of skeletal muscle in mice. Nature Medicine. 22 (8), 897-905 (2016).
- Huttner, S. S., et al. Isolation and Culture of Individual Myofibers and Their Adjacent Muscle Stem Cells from Aged and Adult Skeletal Muscle. Methods in Molecular Biology. , (2019).
- Hardy, D., et al. Comparative Study of Injury Models for Studying Muscle Regeneration in Mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
- Hall, M. N., et al. Transplantation of Skeletal Muscle Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1556, 237-244 (2017).
- Dueweke, J. J., Awan, T. M., Mendias, C. L. Regeneration of Skeletal Muscle After Eccentric Injury. Journal of Sport Rehabilitation. 26 (2), 171-179 (2017).
- Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements. Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).
- Bentzinger, C. F., et al. Fibronectin regulates Wnt7a signaling and satellite cell expansion. Cell Stem Cell. 12 (1), 75-87 (2013).
