Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

تحليل استقلاب الخلايا الجذعية للدم

Published: November 9, 2019 doi: 10.3791/60234
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Nationwide Children's Hospital, 2The Ohio State University College of Medicine, 3The Ohio State University Comprehensive Cancer Center

Summary

الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSPCs) الانتقال من حاله هادئه إلى حاله التمايز بسبب اللدونة الايضيه اثناء تشكيل الدم. هنا ، نقدم طريقه الأمثل لقياس التنفس الميتوكوندريا وتحلل من HSPCs.

Abstract

الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSPCs) لديها اللدونة الايضيه المتميزة ، والتي تسمح لهم بالانتقال من حالتهم الهادئة إلى حاله التمايز للحفاظ علي متطلبات تشكيل الدم. ومع ذلك ، كان من الصعب تحليل الوضع الأيضي (التنفس الميتوكوندريا وتحلل) من HSPCs بسبب اعدادهم المحدودة وعدم وجود بروتوكولات الأمثل لغير ملتصقة ، HSPCs الهشة. هنا ، ونحن نقدم مجموعه من واضحة ، خطوه بخطوه تعليمات لقياس التنفس الأيضي (معدل استهلاك الأكسجين. OCR) وتحلل الخلايا (معدل تحمض خارج الخلية ؛ ECAR) من murine نخاع العظم سلالهnegSca1 +c-كيت + (lsk) hspcs. يوفر هذا البروتوكول كميه أكبر من HSK من نخاع العظم murine ، ويحسن من صلاحيه HSPCs اثناء الحضانة ، ويسهل تحليلات تدفق خارج الخلية من HSPCs غير ملتصقة ، ويوفر بروتوكولات الحقن الأمثل (التركيز والوقت) للادويه التي تستهدف الاكسده ومسارات غليكولتيك. هذا الأسلوب يتيح التنبؤ بالحالة الايضيه وصحة HSPCs اثناء نمو الدم والامراض.

Introduction

منذ عمر معظم خلايا الدم الناضجة قصيرة ، والتوازن من الدم يعتمد علي التجديد الذاتي والتمايز من السكان الذين عاشوا لفتره طويلة ولكنها نادره من الخلايا الجذعية للدم (HSPCs)1. HSPCs هي هادئه ، ولكنها سريعة للانتشار والخضوع التمايز علي التحفيز للحفاظ علي متطلبات نظام الدم. كما كل الدولة الخلوية HSPC يتطلب الطلب حيوية فريدة من نوعها ، والتغيرات الايضيه هي المحركات الرئيسية للقرارات مصير HSPC. ولذلك ، فان فقدان اللدونة الايضيه ، عن طريق تغيير التوازن بين السكون ، والتجديد الذاتي ، والتمايز من HSPCs ، وغالبا ما يؤدي إلى الاضطرابات التكاثرية myelo أو اللمفاوية. معا, فهم التنظيم الأيضي للتنمية hspc أمر بالغ الاهميه للكشف عن أليات الكامنة وراء الأورام الخبيثة الدموية2,3,4,5.

توليد التنفس المتقدريه وتحلل الجلوكوز تولد ATP لدفع ردود الفعل داخل الخلايا وإنتاج كتل البناء اللازمة لتوليف جزيء. منذ HSPCs لديها كتله الميتوكوندريا منخفضه مقارنه بالخلايا المتمايزة6 وانها تحافظ علي الهدوء في منافذ نخاع العظم نقص الأكسجين ، hspcs تعتمد في المقام الأول علي تحلل الجلوكوز. تنشيط HSPCs يعزز الأيض الميتوكوندريا التي تؤدي إلى فقدان الهدوء ودخولها اللاحقة في دوره الخلية. هذه اللدونة الايضيه من hspcs يسمح للحفاظ علي تجمع hspc في جميع انحاء البالغين الحياة6،7،8،9،10،11،12. ولذلك ، فمن الاهميه بمكان التحقيق في أنشطتها الايضيه ، مثل معدل استهلاك الأكسجين (OCR ؛ مؤشر فوسفولات الاكسده) ومعدل تحمض خارج الخلية (ECAR ؛ مؤشر تحلل الجلوكوز) لتحليل تنشيط HSPC والحالة الصحية. ويمكن قياس كل من OCR و ECAR في وقت واحد ، في الزمن الحقيقي ، وذلك باستخدام محلل تدفق خارج الخلية. ومع ذلك ، يتطلب الأسلوب الحالي اعداد كبيره من الخلايا وهو الأمثل للخلايا الملتصقة13. منذ HSPCs لا يمكن عزل بكميات كبيره من الفئران14، تتطلب الفرز للحصول علي السكان النقي ، هي الخلايا غير ملتصقة15، ولا يمكن ان يكون مثقفا بين عشيه وضحيها دون تجنب التمايز16، فقد كان من الصعب قياس OCR و ecar من hspcs. هنا ، ونحن نقدم مجموعه من واضحة ، خطوه بخطوه تعليمات لمرافقه الدروس المستندة إلى الفيديو علي كيفيه قياس التنفس الأيضي وتحلل من بضعة آلاف murine نخاع العظم النسبnegSca1 +c-كيت + (lsk) hspcs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة علي هذا البروتوكول من قبل اللجنة الوطنية لرعاية واستخدام الماشية في مستشفيات الأطفال (IACUC).

ملاحظه: ويرد وصف البروتوكول بالترتيب الزمني الذي يمتد لمده يومين. استخدام الكواشف الطازجة كما هو موضح في البروتوكول أدناه.

1. اعداد الكواشف في اليوم السابق لفحص

  1. هيدرات خرطوشه الاستشعار.
    1. احتضان 5 مل من معايره (جدول المواد) في غير CO2 37 درجه مئوية حاضنه بين عشيه وضحيها.
    2. فتح عده الفحص الجريان (جدول المواد) وفصل خرطوشه الاستشعار (الأخضر ؛ اعلي) من لوحه الاداه المساعدة (شفافة ؛ أسفل). بعد ذلك ، ضع خرطوشه الاستشعار راسا علي عقب والمتاخمة للوحه الاداه المساعدة.
    3. استخدام المياه المعقمة ، وملء الآبار من لوحه الاداه المساعدة (200 μL) والدوائر حول الآبار (400 μL).
    4. دمج خرطوشه الاستشعار في لوحه الاداه المساعدة مع التاكد من ان أجهزه الاستشعار مغطاه بالبالكامل بالماء. انقر فوق 3x لتجنب تشكيل فقاعات.
    5. وضع خرطوشه المغمورة في لوحه الاداه المساعدة في غير CO2 37 درجه مئوية حاضنه بين عشيه وضحيها. لمنع تبخر الماء ، تاكد من ترطيب الحاضنة بشكل صحيح. ضع الدورق المفتوح الذي يحتوي علي H2O كاحتياط إضافي بجانب لوحه الخرطوشة المساعدة ، خاصه إذا كنت تستخدم فرن عادي.
  2. جهزي لوحه الفحص
    1. تعقيم سطح مجلس الوزراء السلامة البيولوجية الفئة 2 باستخدام 70 ٪ الايثانول. افتح لوحه الفحص تحت غطاء المحرك.
    2. أضافه 40 μL من المتاحة تجاريا 0.01 ٪ (ث/ف) بولي-L-يسين (PLL) حل لكل بئر من لوحه الفحص تحت غطاء محرك السيارت.
    3. غطي لوحه الفحص بالغطاء المتوفر في الطقم. احتضان لوحه الفحص المغلقة في درجه حرارة الغرفة (RT) تحت غطاء محرك الساعة لمده 1 ساعة.
      ملاحظه: والهدف من الحضانة هو السماح PLL معطف سطح لوحه الفحص لتسهيل التصاق الخلايا المعلقة علي سطح لوحه الفحص.
    4. بعد 1 h الحضانة من لوحه الفحص ، وأزاله الحل الزائدة مع المعقم القائم علي فراغ والشفط والهواء الجاف البئر تحت غطاء محرك الطائرة.
      ملاحظه: يستغرق ~ 30 − 60 دقيقه لتجفيف الهواء الآبار من لوحه الفحص بعد أزاله PLL المفرط باستخدام الطامح.

2. يوم الفحص

  1. جهز الخرطوشة.
    1. ارفع خرطوشه المستشعر. وضعه راسا علي عقب في النسيج الثقافة هود وتجاهل المياه من لوحه الاداه المساعدة.
    2. ملء الآبار لوحه الاداه المساعدة مع 200 μL من معايره ما قبل الحرارة.
    3. ملء الغرف حول الآبار مع 400 μL من معايره.
    4. دمج خرطوشه الاستشعار في لوحه الاداه المساعدة ، والتاكد من ان أجهزه الاستشعار مغطاه تماما من قبل معايره. انقر فوق 3x لتجنب تشكيل فقاعات.
    5. تتوازن خرطوشه الاستشعار المغمورة في لوحه المرافق في غير CO2 37 درجه مئوية حاضنه لمده 45 − 60 دقيقه.
  2. حصاد النخاع العظم المشتقة من ال LSK HSPCs.
    1. لاستيعاب نسخ متماثلة البيولوجية كافيه ، خطه لاستخدام HSPCs المستمدة من ماوس واحد لكل بئر من لوحه الفحص.
      ملاحظه: يوفر هذا الأسلوب الحصاد نخاع العظم ~ 50000 − 80000 LSK HSPCs من كل ماوس. هذا البروتوكول لقياس تدفق خارج الخلية هو الأمثل ل ~ 70,000 LSK HSPCs لكل بئر من 96 جيدا لوحه.
    2. الفئران موت ببطء باستخدام CO2 جرعه زائده وخلع عنق الرحم, بعد الأساليب المعتمدة IACUC المحلية.
    3. تعقيم سطح أدوات تشريح ومقاعد البدلاء باستخدام الايثانول 70 ٪.
    4. لكل الماوس ، قبل ملء طبق بيتري واحد مع 1x الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني) التي تحتوي علي 2 ٪ الحرارة الجنين البقري المنشط المصل (ار) في RT.
      ملاحظه: لا تستخدم برامج تلفزيونيه المبردة مسبقا لأنها سوف تخلق كتل في الخطوات التالية.
    5. رذاذ 70 ٪ الايثانول (v/v) علي الماوس رحيم بأكمله. عزل جميع العظام ، بما في ذلك الأطراف العلوية والسفلية ، عظام الورك ، القص ، القفص الصدري ، والعمود الفقري ، من الماوس17،18. سحب المادة البيضاء من الحبل الشوكي للماوس لأنها يمكن ان تلوث خلايا LSK. وضع جميع العظام في 1x التلفزيونية (+ 2 ٪) ، كما يتم جمعها ، في طبق بيتري حتى مزيد من الاستخدام.
    6. عكس أنبوب مخروطي 50 mL (جديد في كل مره) واستخدامه إلى العظام تريلوريات المغمورة في 1x التلفزيونية (+ 2 ٪) في طبق بيتري.
    7. باستخدام ماصه المصلية 10 مل ، ماصه صعودا وهبوطا (~ 10x) لطرد بشكل موحد من الخلايا من العظام ، وبعد سحق العظام.
    8. وضع مصفاه الخلية 40 μm علي أنبوب مخروطي 50 mL. قبل الرطب سطح المصفاة عن طريق تمرير 1 مل من 1x تلفزيوني (+ 2 ٪ من الصواريخ).
    9. حصاد الخلية المشتقة من نخاع العظم التعليق من الخطوة 2.2.7 وتمريرها من خلال سطح ما قبل الرطب من مصفاه الخلية لأزاله الحطام العظام.
    10. كرر الخطوات 2.2.6 من خلال 2.2.9 حتى تصبح جميع مواد العظام بيضاء كعلامة ان معظم خلايا نخاع العظم يتم جمعها في أنبوب مخروطي 50 mL.
      ملاحظه: وغالبا ما يستغرق 2 50 مل أنابيب مخروطيه الشكل لكل ماوس لجمع كل الخلايا المشتقة من نخاع العظم.
    11. الطرد المركزي الأنابيب المخروطية 50 mL التي تحتوي علي خلايا نخاع العظم المشتقة لمده 5 دقائق في 500 x g و RT.
    12. أزاله الفائقة. أعاده تعليق الخلايا المشتقة من نخاع العظم (الجمع بين محتويات كل من أنابيب 50 mL) في 5 مل من 1x تلفزيوني (+ 2 ٪) كحجم النهائي والحفاظ علي الخلايا في RT.
  3. حصاد خلايا نخاع العظم الأحادي النواة.
    1. أضافه 5 مل من الكثافة المتدرج المتوسطة (اي ، Ficoll) إلى أنبوب مخروطي 15 مل. ثم أضافه ببطء 5 مل من تعليق خليه نخاع العظم. تاكد من بقاء الخلايا كطبقه فوق متوسط تدرج الكثافة.
    2. الطرد المركزي لمده 30 دقيقه في 500 x g و RT. لا تستخدم الفرامل في جهاز الطرد المركزي. تاكد من ان الطرد المركزي هو في ادني تسارع ممكن (علي سبيل المثال ، 1 تسارع و 0 التباطؤ).
    3. حصاد الواجهة الوسطي للخلايا أحاديه النوى (اللون الأبيض) بعد طرد إلى أنبوب مخروطي 15 مل جديد.
    4. اغسل الخلايا ، التي تحصد من متوسط التدرج الكثافة ، مع 5 مل من 1x تلفزيوني (+ 2 ٪). الطرد المركزي لمده 5 دقائق في 500 x g و 4 ° c. أزاله الفائقة.
    5. كرر الخطوة 2-3.
    6. أعاده تعليق محتويات الخلية من الأنبوب في 300 μL من 1x التلفزيونية (+ 2 ٪). Aliquot 10 μL من تعليق الخلية للتحكم غير ملون أو أحاديه اللون في أنبوب FACS.
  4. حصاد LSK HSPCs من خلايا نخاع العظم الأحادي النواة.
    1. جعل كوكتيل من البيوتين-الأجسام المضادة عن طريق خلط 3 μL لكل عينه من الأجسام المضادة التالية: Gr1 ، Cd8a ، Cd5 ، B220 ، Ter119. أضف 15 μL من خليط البيوتين-الأجسام المضادة إلى 300 μL من خلايا نخاع العظم أحاديه النواة.
      ملاحظه: ويستخدم كل الأجسام المضادة في 1:100 التخفيف.
    2. احتضان الخلايا مع كوكتيل البيوتين-الأجسام المضادة لمده 30 دقيقه في 4 درجه مئوية مع الانفعالات لتجنب تكتل الخلايا في الجزء السفلي من الأنبوب.
    3. أضافه 10 مل من قبل المبردة 1x تلفزيوني (+ 2 ٪) إلى خلايا مختلطة مع كوكتيل البيوتين-الأجسام المضادة.
    4. الطرد المركزي أنبوب لمده 5 دقائق في 500 x g و 4 ° c. تجاهل ماده طافي وأعاده التعليق علي بيليه الخلية في 400 μl من 1x تلفزيوني (+ 2 ٪). Aliquot 10 μL ل العقديات-التحكم في لون واحد.
    5. لفتره وجيزة دوامه الخرز المضادة البيوتين (جدول المواد) قبل الاستخدام. أضافه 80 μL من الخرز المجهري لكل عينه خليه (من 400 μL). تخلط جيدا واحتضان لمده 20 دقيقه اضافيه في 4 درجه مئوية ، مع الانفعالات.
    6. أضافه 10 مل من قبل المبردة 1x التلفزيونية (+ 2 ٪) إلى الخلايا. الطرد المركزي أنبوب لمده 5 دقائق في 500 x g و 4 ° c.
    7. تجاهل ماده طافي وأعاده التعليق علي بيليه الخلية في 1 مل من 1x تلفزيوني (+ 2 ٪). يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية اثناء اعداد وحده الفصل المغناطيسي.
    8. ضع عمود (جدول المواد) في المجال المغناطيسي لفاصل الفرز المغناطيسي للخلايا المساعدة (mac) عند درجه حرارة 4 درجات مئوية. اعداد عمود للفصل المغناطيسي عن طريق الشطف مع 3 مل من 1x التلفزيونية (+ 2 ٪) تحت تدفق الجاذبية في 4 درجه مئوية.
    9. أضافه تعليق الخلية من الخطوة 2.4.7 إلى عمود ما قبل الرطب في 4 درجه مئوية. السماح للخلايا لتمرير من خلال العمود في 4 درجه مئوية وجمع النفايات السائلة في أنبوب مخروطي 15 مل.
      ملاحظه: يمثل الجزء الذي به خلايا غير مسماه في هذه النفايات الخلايا السالبة السلالة المخصبة.
    10. غسل العمود مع 3 مل من 1x التلفزيونية (+ 2 ٪) في 4 درجه مئوية. كرر 3x. جمع التدفق من خلال والاحتفاظ بها في 4 درجه مئوية. عد الخلايا القابلة للحياة التي لا يمكن التملص منها بواسطة الاستبعاد الأزرق التريبين باستخدام مقياس الكريات الدموية.
    11. الطرد المركزي 15 مل أنبوب مخروطي الذي يحتوي علي تدفق من خلال لمده 5 دقائق في 500 x g و 4 ° c. تجاهل الخارقة. أعاده التعليق الخلايا في 0.5 mL من 1x تلفزيوني (+ 2% الإرسال) ونقل المحتويات إلى أنبوب FACS.
    12. أضف 24 μL من كوكتيل الأجسام المضادة LSK إلىكل 10 خلايا . يحتوي كوكتيل الأجسام المضادة علي تركيز متساو من الأجسام المضادة 450-العقديات ، والأجسام المضادة CY7 Sca1 ، والأجسام المضادة APC-c-Kit.
    13. احتضان ل 1 ح في 4 درجه مئوية مع الانفعالات تحت الظلام (مغطاه إحباط القصدير).
    14. أضافه 3 مل من 1x التلفزيونية (+ 2% المنفذة) إلى أنبوب FACS. الطرد المركزي لمده 5 دقائق في 500 x g و 4 ° c. تجاهل الخارقة.
    15. أعاده تعليق الخلايا الموسومة بالأجسام المضادة في 1 مل من 1x تلفزيوني (+ 2% المنفذة). أضافه 1 μL من 1 ملغ/مل بروبيديوم يوديد لتعليق الخلية فقط قبل الفرز.
    16. تصفيه محتويات أنبوب FACS باستخدام مصفاه 40 μm الحق قبل فرز الخلايا LSK.
    17. جمع خلايا LSK ، عبر FACS الفرز ، في أنبوب 1.5 mL التي تحتوي علي 0.5 mL من وسائل الاعلام كامله تستكمل مع 2 مم الجلوتامين ، 3 ملغ/مل الجلوكوز ، 1 مم pyruvate ، 1x الجلطات (TPO) ، 1x عامل الخلايا الجذعية(الصندوق الدائم) ، 0.5 x البنسلين/العقديات (P/S) ، pH 7.4

3. التنفس الميتوكوندريا واختبارات تحلل من LSK HSPCs

  1. LSK البذر في لوحه الفحص
    1. الخلايا الطاردة المركزية LSK من الخطوة 2.4.17 لمده 5 دقائق في 500 x g و RT. تجاهل supernatant.
    2. أعاده تعليق الخلايا في الوسائط الكاملة إلى التركيز النهائي ما لا يقل عن 70,000 خليه/40 μL.
    3. البذور محتويات وسائل الاعلام 40 μL (التي تحتوي علي 70,000 الخلايا) في لوحه المغلفة PLL 8-حسنا من الخطوة 2. ترك كل الآبار الزاوية فارغه.
    4. الطرد المركزي لمده 1 دقيقه في 450 x g و RT. لا تقم بتطبيق الفرامل. تاكد من ان الخلايا المرفقة إلى أسفل جيدا باستخدام المجهر المقلوب.
    5. أضافه 135 μL من وسائل الاعلام الكاملة إلى الخلايا في كل بئر لحجم النهائي من 175 μL. أضافه 175 μL من وسائل الاعلام الكاملة إلى زوايا 2 من لوحه والفراغات.
    6. احتضان الخلايا في الحاضنة غير المشتركة2 ل 2 ح في 37 درجه مئوية.
    7. اعداد برنامج لأضافه الادويه إلى كل بئر من لوحه بئر في محلل باستخدام مقياس الموصوفة في الجدول 2 (اختبار الإجهاد الميتوكوندريا) والجدول 3 (اختبار الإجهاد تحلل).
      ملاحظه: بينما يتم احتضان الخلايا ، بدوره علي الصك وتاكد من انه في 37 درجه مئوية.
  2. اختبار الإجهاد المتقدريه
    1. اعداد حلول الأسهم 45 μM من اوليغميسين ، 50 μM السيانيد كاربونريل 4-(تريفلونوميثوكسي) فينيلهيدرازون (FCCP) و 25 μM الأسهم حلول rotenone/انتيميسين ا. لاعداد 45 μM الحل الأسهم اوليغميسين ، حل محتويات الحقيبة المتاحة تجاريا في 280 μL من وسائل الاعلام الكاملة. لاعداد 50 μM FCCP حل الأسهم ، وأذابه محتويات الحقيبة المتاحة تجاريا في 288 μL من وسائل الاعلام الكاملة. لاعداد 25 μM rotenone/انتيمايسين A الحل الأسهم ، وأذابه محتويات الحقيبة المتاحة تجاريا في 216 μL من وسائل الاعلام الكاملة.
    2. خذ خرطوشه الاستشعار في لوحه الاداه المساعدة من الحاضنة وتحميل الموانئ (A ، B ، و C) بحيث يكون لكل بئر التركيز النهائي من 2 μM اوليغميسين ، 1.5 μM FCCP ، و 0.5 μM من rotenone/انتيمايسين A حسب الحاجة ، بعد مقاييس التخفيف الموصوفة في الجدول 4 (لمعدل استهلاك الأكسجين).
    3. أزاله الغطاء من خرطوشه الاستشعار تجميعها في لوحه الاداه المساعدة ووضعه علي علبه الاداات. بدء المعايرة التي سوف يستغرق 20 دقيقه.
    4. بعد المعايرة ، وأزاله لوحه الاداه المساعدة واستبدالها مع لوحه الفحص التي تحتوي علي خلايا LSK ، والتي يتم التزام بها الآن إلى أسفل البئر.
    5. اضغط علي " متابعه " لبدء تشغيل البرنامج الموضح في الجدول 2. بعد الانتهاء من البرنامج ، واسترداد البيانات وتحليلها باستخدام برنامج "سطح المكتب الموجه".
      ملاحظه: يمكن رسم البيانات التي تم إنشاؤها من اختبارات التدفق خارج الخلية باستخدام مؤامرة نقطه من برنامج "سطح المكتب الموجه" أو تصديرها إلى برنامج إحصائيات علي شبكه الإنترنت.
  3. اختبار الإجهاد جليكولسيس
    1. أعاده تشكيل الجلوكوز في 300 μL (100 mM) ، اوليغميسين في 288 μL (50 μM) ، 2-د الجلوكوز (2-DG) في 300 μL (500 mM) من وسائل الاعلام الكاملة من الحقيبة المتاحة تجاريا.
    2. ماصه بلطف صعودا وهبوطا (~ 10x) لأذابه المركبات. الدوامة 2-DG لمده 1 دقيقه تقريبا لضمان حل السليم في وسائل الاعلام.
    3. أزاله خرطوشه الاستشعار من الحاضنة. تحميل المنافذ من A إلى C التالية مقاييس التخفيف الموصوفة في الجدول 5 للحصول علي تركيز نهائي من الجلوكوز 10 ملم ، 2 μM اوليغميسين ، و 50 mm 2-DG.
    4. كرر الخطوات 3-2-3 و 3-2.
    5. اضغط علي " متابعه " لبدء تشغيل البرنامج الموضح في الجدول 3. بعد الانتهاء من البرنامج ، واسترداد البيانات وتحليلها باستخدام برنامج "سطح المكتب الموجه".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

طريقه استخراج لدينا يسمح لنا لحصاد ما يصل إلى ~ 80,000 LSK HSPCs لكل ماوس. وقد تحسنت صلاحيه واعداد خلايا LSK مع طريقتنا ، لأننا: (1) نخاع العظم مجتمعه من الأطراف العلوية والسفلية ، عظام الورك ، القص ، القفص الصدري ، والعمود الفقري ، (2) تجنب استخدام الخلية الحمراء تحلل العازلة التي من شانها زيادة الخلية الموت والتكتل ، (3 استخدام الفصل المتوسط الكثافة للخلايا أحاديه النواة ، و (4) تجنب استخدام العازلة قبل المبردة التي من شانها ان تسبب فقدان خلايا الفائدة في كتل.

علي الرغم من ان تحليل تدفق خارج الخلية قد استخدمت تقليديا للخلايا الملتصقة ، واستخدامنا للطلاء PLL من الآبار ، تليها طرد من الخلايا علي ذلك ، وسهلت الانضمام LSK HSPCs إلى سطح البئر. وهذا يسمح لنا لقياس تدفق خارج الخلية ، التالي صحة الأيض من LSK HSPCs. ونظرا للعدد المحدود من الخلايا التي يمكن حصادها من الفاره والمدة الطويلة للبروتوكول من أجل عزلتها ، فقد برز استخدامنا للمحلل بشكلهالجيد الثماني كحل أكثر فعاليه من حيث التكلفة

خلايا استخدام تحلل والتنفس الميتوكوندريا لتجديد احتياجاتها من الطاقة وإنتاج وسيطه اللازمة لانتشارها والنمو19. انزيم هيككيناز يحول الجلوكوز في الجلوكوز-6-الفوسفات والتي تحولت في وقت لاحق إلى بيروفات20. ويمكن بعد ذلك معالجه البيروفات في اللاكتات ويتم تصديرها من الخلية مع البروتونات21. يقيس ECAR تحمض وسائل الاعلام التالي مؤشرا لتحلل الجلوكوز. Pyruvate يمكن أيضا ان تنقل إلى الميتوكوندريا وتحولت في انزيم اسيتيل A (CoA). اسيتيل CoA يدخل دوره الاداره العامة للسياحة ، والتي توفر الطاقة الوسيطة لدفع حركات الكترون من سلسله النقل الكترون (ETC) ويولد الانحدار البروتون في الفضاء بين غشاء الميتوكوندريا22. الأكسجين بمثابه متقبل الكترون النهائي ، والبروتونات العودة إلى مصفوفة الميتوكوندريا من خلال مجمع synthase ATP في حين توليد ATP23. يقيس OCR استهلاك الأكسجين ولذلك فهو يستخدم لقياس التنفس المتقدريه.

من أجل تحليل OCR و ECAR في الظروف القاعدية والمجهدة ، استخدمنا حقن متسلسلة من الادويه التي تتداخل مع تحلل الجلوكوز والتنفس الميتوكوندريا. استخدمنا الجلوكوز و 2-ديوكسيكوز (2-DG) ، التناظرية الجلوكوز ، لبدء وكتله تحللعليالتوالي 24. استخدمنا rotenone (المثبط الأول الخاصة المعقدة من الخ) ، انتيميسين a (المثبط الثالث المحددة المعقدة من الخ) ، اوليغميسين (مثبط ATP synthase) ، ووكيل يفصل السيانيد-4-(تريفلوميثوكسي) فينيلهيدرازون (fccp) لمنع احداث معينه من الخ25. نحن معايره هذه الكواشف للعثور علي التركيز الأمثل ل LKS HSPCs (الشكل 2ا ، ب).

لاجراء اختبار الإجهاد تحلل ، ونحن مثقف HSPCs LSK في الجلوكوز/pyruvate وسائل الاعلام المحرومة (علي النحو الموصي به من قبل الشركة المصنعة) ، أو في الجلوكوز/pyruvate التي تحتوي علي وسائل الاعلام. كما هو متوقع ، وجدنا المستوي القاعدي لل ECAR كان اعلي ل LSK HSPCs مثقف في الجلوكوز/pyruvate + وسائل الاعلام مقارنه LSK HSPCs مثقف في الجلوكوز/pyruvate-وسائل الاعلام. الحقنه الاولي مع الجلوكوز لم تغير المستوي القاعدي من ECAR لل LSK HSPCs مثقف في الجلوكوز/pyruvate + وسائل الاعلام في حين انه عزز تحلل في LSK HSPCs مثقف في الجلوكوز/pyruvate-وسائل الاعلام. ومع ذلك ، ظل المستوي القاعدي لل ECAR ، بعد الحقن مع الجلوكوز ، اقل بالمقارنة مع الجلوكوز/pyruvate + المجموعة. الحقنه الثانية مع اوليغميسين ، والتي يمكن ان تسد إنتاج ATP من خلال فوسفولات الاكسده ، تنشيط تحلل الجلوكوز في مستواها الأقصى من HSPCs LSK في الغلوكوز/pyruvate + وسائل الاعلام ، ولكنه لم يؤثر علي الجلوكوز/pyruvate-المجموعة. الحقنه الاخيره مع التناظرية الجلوكوز 2-DG عاد ECAR إلى مستواه غير glycolytic (الشكل 2ج).

لاختبار الإجهاد الميتوكوندريا ، قمنا بقياس المستوي القاعدي من OCR من LSK HSPCs في الجلوكوز/pyruvate + وسائل الاعلام. نحن أول حقن اوليغميسين ان الاستقطاب في البداية الغشاء الميتوكوندريا ، ومنعت المزيد من البروتون ضخ من خلال المجمعات ETC ، التالي خفض معدل التنفس الميتوكوندريا. الحقن الثاني لل FCCP ionophores دفعت المستويات ETC و OCR إلى الحد الأقصى كما حاولت الخلايا لاستعاده إمكانات غشاء الميتوكوندريا. الحقن النهائي مع اثنين آخرين من مثبطات ETC (انتيمايسين A و rotenone) تسبب في وقف كامل للتنفس الميتوكوندريا التالي فان OCR عاد إلى مستواه الأدنى (الشكل 2د).

Figure 1
الشكل 1: المخطط الذي يبين عزل السلالاتnegSca1 + c-Kit + (lsk)الخلايا الجذعية للدم من نخاع العظم بالماوس. يتم استخراج نخاع العظم من العظام ويتم عزل الخلايا أحاديه النواة (MNCs) من خلال فصل التدرج الكثافة الانحدار المتوسط. بعد ذلك ، يتم احتضان الخلايا مع السلالاتالحيوية + الأجسام المضادة والخرز المغناطيسي مترافق العقديات إلى الوت سلاله السلبية (لين)الخلايابعد انفصالهم المغناطيسي. في وقت لاحق يتم احتضانالخلايا لين مع الأجسام المضادة lsk وخلايا lsk معزولة بواسطة فرز الخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحليلات التدفق خارج الخلية من السلالة murinenegSca1 +c-كيت + (lsk) الخلايا الجذعية المعدة للدم. (الف ، باء) وصف الميكانيكية للادويه المستخدمة لتحليلات تدفق خارج الخلية اثناء تحلل الجلوكوز والتنفس الميتوكوندريا. (ج) النتائج التمثيلية لاختبار الإجهاد الغليكولسيس علي MURINE Lsk HSPCs في وجود أو عدم وجود الجلوكوز/pyruvate في وسائل الاعلام. (د) النتائج التمثيلية لاختبار الإجهاد المتقدريه علي MURINE Lsk HSPCs. تمثل أشرطه الخطا الانحراف المعياري لمتوسط (ذاكره) يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الاسهم التركيز النهائي حجم ل 30 مل
الوسائط الكاملة 28.691 مل
P/S 100x 0.5 x 150 μL
L-الجلوتامين 200 مم 2 مم 300 μL
بيروفات 100 مم 1 مم 300 μL
الجلوكوز 1 M/180.2 mg/mL 3 مغ/مل 499.4 μL
TPO 100 ميكروغرام/مل 100 ng/mL 30 μL
دائم 100 ميكروغرام/مل 100 ng/mL 30 μL

الجدول 1: محتويات واعداد وسائط XF الكاملة.

القاعديه اوليموميسين (2 μM) FCCP (1.5 μM) R/A (0.5 μM)
تكرار 3 مرات 3 مرات 3 مرات 3 مرات
ميكس 3 دقائق 3 دقائق 3 دقائق 3 دقائق
انتظري 0 دقيقه 0 دقيقه 0 دقيقه 0 دقيقه
قياس 4 دقائق 4 دقائق 4 دقائق 4 دقائق

الجدول 2: بروتوكول الحقن لاختبار الإجهاد المتقدريه.

القاعديه الجلوكوز (10 ملم) اوليموميسين (2 μM) 2-DG (50 مم)
تكرار 3 مرات 3 مرات 3 مرات 3 مرات
ميكس 3 دقائق 3 دقائق 3 دقائق 3 دقائق
انتظري 0 دقيقه 0 دقيقه 0 دقيقه 0 دقيقه
قياس 7 دقائق 7 دقائق 7 دقائق 7 دقائق

الجدول 3: بروتوكول الحقن لاختبار الإجهاد الغوليكولسيس.

منفذ المخدرات تركيز البئر النهائي (μM) حجم حل المخزون (μL) حجم الوسائط (μL) ميناء الحل (μM) الحجم المضاف إلى المنفذ (μL)
المنفذ A اوليغومايسين 2 100 181.25 16 25
المنفذ B شان 1.5 100 270.4 13.5 25
المنفذ C روتنون/انتيميسين ا 0.5 60 240 5 25

الجدول 4: مقاييس التخفيف للحصول علي تركيز الدواء الأمثل لاختبار الإجهاد الميتوكوندريا في كل بئر من محلل.

منفذ المخدرات تركيز البئر النهائي حجم حل المخزون (μL) حجم الوسائط (μL) منفذ الحل الحجم المضاف إلى المنفذ (μL)
المنفذ A الجلوكوز 10 مم 300 75 80 مم 25
المنفذ B اوليغومايسين 2 μM 108 192 18 ميكرومتر 25
المنفذ C 2-المدير الخاص 50 مم 300 0 500 مم 25

الجدول 5: مقاييس التخفيف للحصول علي تركيز الدواء الأمثل لاختبار الإجهاد تحلل في كل بئر من محلل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا ، ونحن نظهر العزلة من الحد الأقصى لكميه نقيه وقابله للحياة murine LSK HSPCs السكان ، فضلا عن قياس تحللها والتنفس الميتوكوندريا مع محلل تدفق خارج الخلية. وعلي وجه التحديد ، يتغلب البروتوكول علي المسائل التقنية التالية لاستخدام النظام الخاص ب LSK HSPCs: ط) التردد المنخفض LSK HSPCs في نخاع العظم murine14، ii) انخفاض النشاط الأيضي القاعدي من Lsk hspcs26، III) هشاشة lsk hspcs27، والرابع) عدم التزام lsk hspcs إلى السفن الثقافية15. الاضافه إلى ذلك ، قمنا بتحسين تركيزات المخدرات وتكوين وسائل الاعلام للأداء الأمثل لاختبارات التدفق خارج الخلية.

Hspcs المستمدة من نخاع العظم الموجودة في مشكاة نقص الأكسجين وانها تعرض النمط الظاهري غليكوليتيك, وهو أمر حاسم للحفاظ علي ستيمنس بهم28. وعلي العكس من ذلك ، فان التنفس ضروري لتمايز HSPC6. كما الخلل الأيضي لل HSPCs يؤدي إلى امراض الدم; هنا ، وقد وصفنا البروتوكول والدروس المستندة إلى الفيديو لقياس السمات المميزة لوظائف التمثيل الأيضي ، مثل OCR و ECAR ، لنخاع العظم المشتقة لل LSK HSPCs.

خلافا لتوصيات الشركة المصنعة للخلايا الملتصقة ، وجدنا ان نتائج اختبار الإجهاد تحلل علي LSK HSPCs هي الأمثل عندما يتم استزراع الخلايا في الجلوكوز/pyruvate + وسائل الاعلام مقارنه مع الجلوكوز/pyruvate-وسائل الاعلام. أدركنا ان نقص الجلوكوز في وسائل الاعلام ل LSK HSPCs يؤدي إلى وفاه الخلية خلال ~ 2 h تاخيرمن الفترة في حاضنه غير CO2 . كما لم تغير حقن الجلوكوز المستوي القاعدي من ecar ل lsk hspcs مثقف في الجلوكوز/pyruvate + وسائل الاعلام ، لدينا تعديل البروتوكول لا يحفظ فقط جوهر اختبار الإجهاد تحلل ، ولكنه يسمح لنا أيضا للتمييز بين تحلل القاعدية (قبل اي حقن) ، والقدرة غليكوليتيك (بعد حقن اوليغميسين) وتحمض غير تحلل (بعد الحقن مع 2-DG) من lsk hspcs.

وأظهرت لدينا اختبار الإجهاد الميتوكوندريا من LSK HSPCs ان ATP التي تنتجها فوسفولات الاكسده في LSK HSPCs هو الحد الأدنى كما راينا مع انخفاض طفيف في OCR بعد حقن اوليغميسين. وعلي العكس من ذلك ، يؤكد الارتفاع في OCR علي حقن FCCP ان LSK HSPCs قادره علي الاستجابة للطلب علي الطاقة العالية.

معا ، كان الهدف من هذا البروتوكول توفير مجموعه من التعليمات الواضحة والموجزة لمرافقه الدروس المستندة إلى الفيديو حول كيفيه قياس وظائف الأيض ، مثل OCR و ECAR ، من HSPCs. مع التعديلات الرئيسية والتوصيات الاضافيه لحصاد اعداد أكبر من الصحة الانجابيه LSK HSPCs ، مما يجعلها ملتصقة علي سطح البئر ، فضلا عن الاستفادة المثلي من وقت الحضانة وتركيز المخدرات ، وهذا البروتوكول سوف تمكن المحققين لتحليل تحلل الجلوكوز وحاله التنفس الميتوكوندريا من HSPCs ، فضلا عن الخلايا غير الملتصقة التي تكون الدم اثناء النمو الدموي والامراض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

ويدعم هذا العمل جزئيا الدعم التمويلي المقدم من المعاهد الوطنية للصحة (HL131645 ، CA016058) ، ومؤسسه سانت بالدريك ، ومؤسسه بيلوفونيا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.01% (w/v) poly-L-lysine solution Sigma P8920 Used for LSK attachment
40 µm cell strainer Fisher Scientific 22-363-547 Used for cell filtration after bone crushing
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi 130-090-485 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD45R/B220 Clone RA3-6B2 BD Biosciences 553086 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD5 Clone 53-7.3 BD Biosciences 553019 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse CD8a Clone 53-6.7 BD Biosciences 553029 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C Clone RB6-8C5 BD Biosciences 553125 Used for Lin- separation
Biotin Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells Clone TER-119 BD Biosciences 553672 Used for Lin- separation
CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody (2B8), APC eBioscience 17-1171-83 Used for LSK sorting
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-959-53A Used in cell isolation
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-432-22 Used in cell isolation
Falcon Round-Bottom Polypropylene Tubes Falcon-Fischer Scientific 14-959-11A Used for LSK sorting
Fetal Bovine Serum Neuromics FBS001-HI Used in FACS buffer
Histopaque-1083 Sigma 10831 Used for ficoll gradient separation
L-glutamine 100x Fisher Scientific 25-030-081 Used for the assay media
LS Column Miltenyi 130-042-401 Used for Lin- separation
Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antibody (D7), PE-Cyanine7 eBioscience 25-5981-82 Used for LSK sorting
Murine Stem Cell Factor (SCF) PeproTech 250-03-100UG Used for the assay media
Murine Thrombopoietin (TPO) PeproTech 315-14-100UG Used for the assay media
PBS 1% Fisher Scientific SH3002802 Used for FACS buffer
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Fisher Scientific 15140122 Used for the assay media
Propidium Iodide Fisher Scientific P1304MP Used for LSK sorting
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate Agilent Technologies 103025-100 Used for LSK seeding
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher 11360070 Used for the assay media
Streptavidin eFluor 450 Conjugate eBioscience 48-4317-82 Used for LSK sorting
XF Calibrant Agilent Technologies 100840-000 Used for cartridge equilibration
XF media Agilent Technologies 103575-100 Used for the assay media
XFp Glycolysis Stress Test Kit Agilent Technologies 103017100 Drugs for glycolysis stress test
XFp Mitochondrial Stress Test Kit Agilent Technologies 103010100 Drugs for mitochondrial stress test
XFp Sensor Cartridge Agilent Technologies 103022-100 Used for glycolysis and mitochondrial stress test

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
  2. Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. International Journal of Hematology. 107, 634-641 (2018).
  3. Kohli, L., Passegue, E. Surviving change: the metabolic journey of hematopoietic stem cells. Trends in Cell Biology. 24, 479-487 (2014).
  4. Abdel-Wahab, O., Levine, R. L. Metabolism and the leukemic stem cell. The Journal of Experimental Medicine. 207, 677-680 (2010).
  5. Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells. Stem Cells International. 2019, 4067162 (2019).
  6. Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communication. 7, 13125 (2016).
  7. Anso, E., et al. The mitochondrial respiratory chain is essential for haematopoietic stem cell function. Nature Cell Biology. 19, 614-625 (2017).
  8. Wanet, A., Arnould, T., Najimi, M., Renard, P. Connecting Mitochondria, Metabolism, and Stem Cell Fate. Stem Cells and Development. 24, 1957-1971 (2015).
  9. Maryanovich, M., et al. An MTCH2 pathway repressing mitochondria metabolism regulates haematopoietic stem cell fate. Nature Communication. 6, 7901 (2015).
  10. Suda, T., Takubo, K., Semenza, G. L. Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche. Cell Stem Cell. 9, 298-310 (2011).
  11. Zhang, C. C., Sadek, H. A. Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells. Antioxidants & Redox Signaling. 20, 1891-1901 (2014).
  12. Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
  13. Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, 125-136 (2007).
  14. Chen, J., et al. Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice. Experimental Hematology. 36, 1236-1243 (2008).
  15. Jung, Y., et al. Hematopoietic stem cells regulate mesenchymal stromal cell induction into osteoblasts thereby participating in the formation of the stem cell niche. Stem Cells. 26, 2042-2051 (2008).
  16. Masuda, S., Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Niche-less maintenance of HSCs by 2i. Cell Research. 23, 458-459 (2013).
  17. Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop in the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126, 2811-2820 (2015).
  18. Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and transplantation of hematopoietic stem cells (HSCs). Journal of Visualized Experiment. (157), (2007).
  19. Van Wyngene, L., Vandewalle, J., Libert, C. Reprogramming of basic metabolic pathways in microbial sepsis: therapeutic targets at last. EMBO Molecular Medicine. 10, (2018).
  20. Olson, K. A., Schell, J. C., Rutter, J. Pyruvate and Metabolic Flexibility: Illuminating a Path Toward Selective Cancer Therapies. Trends in Biochemical Sciences. 41, 219-230 (2016).
  21. Halestrap, A. P., Wilson, M. C. The monocarboxylate transporter family--role and regulation. IUBMB Life. 64, 109-119 (2012).
  22. Kim, A. Mitochondria in Cancer Energy Metabolism: Culprits or Bystanders. Toxicological Research. 31, 323-330 (2015).
  23. Fosslien, E. Mitochondrial medicine--molecular pathology of defective oxidative phosphorylation. Annals of Clinical & Laboratory Science. 31 (1), 25-67 (2001).
  24. Wick, A. N., Nakada, H. I., Wolfe, J. B. Localization of the primary metabolic block produced by 2-deoxyglucose. The Journal of Biological Chemistry. 224 (2), 963-969 (1957).
  25. Linnett, P. E., Beechey, R. B. Inhibitors of the ATP synthetase systems. Methods in Enzymology. 55, 472-518 (1979).
  26. Rimmele, P., et al. Mitochondrial metabolism in hematopoietic stem cells requires functional FOXO3. EMBO Reports. 16, 1164-1176 (2015).
  27. Riviere, I., Dunbar, C. E., Sadelain, M. Hematopoietic stem cell engineering at a crossroads. Blood. 119, 1107-1116 (2012).
  28. Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).

Tags

البيولوجيا التنموية ، العدد 153 ، الخلايا الجذعية للدم ، الأيض ، التنفس المتقدريه ، تحلل الدم ، تحليل التدفق خارج الخلية ، الخلايا غير الملتصقة
تحليل استقلاب الخلايا الجذعية للدم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scapin, G., Goulard, M. C.,… More

Scapin, G., Goulard, M. C., Dharampuriya, P. R., Cillis, J. L., Shah, D. I. Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism. J. Vis. Exp. (153), e60234, doi:10.3791/60234 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter