Summary
此方法的目的是获得成纤维细胞衍生的 3D 基质作为后续细胞测定的天然支架。纤维细胞在预处理培养板中播种,并用抗坏血酸刺激,用于基质生成。基质被去细胞化并阻断以培养相关细胞(例如,内皮细胞)。
Abstract
细胞外基质(ECM)是一种三维支架,作为组织细胞的主要支撑。除了其结构功能外,ECM 还参与细胞迁移、增殖和分化。成纤维细胞是改变ECM光纤排列和生产的主要细胞类型。在癌症中,CAFs(癌症相关成纤维细胞)处于永久活化状态,参与ECM重塑,促进肿瘤细胞迁移,刺激肿瘤相关血管生成,以及其他亲肿瘤作用。此方法的目标是使用永垂成纤维细胞或人类原发性CAF创建一个具有纤维成分类似于体内基质的三维矩阵。纤维细胞在预处理的细胞培养板中培养,并在抗坏血酸刺激下生长。然后,去掉成纤维细胞,并阻止基质进行进一步的细胞播种。在此ECM模型中,可以激活或修改成纤维细胞以生成不同类型的基质,其效应可以在细胞培养中研究。3D矩阵也由细胞信号塑造,如降解或可能改变纤维分布的交联酶。在这种情况下,血管生成可以与其他细胞类型,如上皮肿瘤细胞一起研究。
Introduction
细胞外基质(ECM)是存在于所有类型的组织的动态结构。它由蛋白质和多糖组成,形成对细胞粘附、迁移和通信至关重要的纤维网1。ECM 成分因组织而异。虽然I型胶原蛋白是最常见的结构蛋白,但胶原蛋白类型II、III、V和XI也可在各种组织中发现2。纤维素产生成纤维细胞是细胞粘附2所必需的。此外,还有其他结构分子,如艾氏素,层宁和表面受体称为整体,以调解纤维组装,并特定于不同的ECM组织2。ECM作为细胞支架起着重要的作用,也可以参与生理和病理过程1。在癌症等病理中观察到 ECM 中的异常,从而改变 ECM 组成和/或其组织。在肿瘤中,ECM代表肿瘤微环境(TME)的非细胞成分,这是细胞成分的复杂环境,如成纤维细胞、免疫细胞、内皮细胞、围细胞和各种可溶性因子。众所周知,TME促进癌症进展和转移;癌症相关成纤维细胞,作为肿瘤频段的主要细胞类型,参与这一过程3。与正常的成纤维细胞不同,CAF处于永久活化状态,显示ECM蛋白和生长因子(例如,转化生长因子-β,TGF-β)的分泌增加,以及一些标记物的较高表达,如β-平滑肌活动(β-SMA)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)4。然而,CAF是一个异构细胞群,显示不同级别的激活或标记表达式5。可以假定,成纤维细胞衍生基质的组成和结构将取决于成纤维细胞的状态和特性。
在这方面,该方法的目标是通过相当于体内ECM设置的成纤维细胞为ECM生成建立适当的体外模型。我们建议这种方法作为一种体外转化方法,以进一步研究肿瘤细胞功能,如化学抗性或迁移,由ECM调解。正如我们小组在其他地方发表的,CAF可以从新鲜的组织样本中获得,但必须指出,CAF在培养中的生存是有限的,它们的细胞通道数量减少了6。此外,从患者样本建立的CAF主要培养物可用于基质生成。在成纤维细胞中操作基因表达也是产生各种体外基质的有趣方法,以评估对基质组成、纤维方向等的可能影响。沿着这些思路,我们小组最近报告了蜗牛表达成纤维细胞在各种衍生基质7的组成和纤维方向中的作用。
此外,CAFs和ECM也参与血管系统,包括血管生成和花瓶外层8的一部分。ECM重塑诱发血管生成;基质金属蛋白酶(MmPs)似乎是最重要的酶型,有助于这个过程9,10。产生ECM的原细胞的组织血管化、ECM大分子、ECM中残留生长因子、基质弹性和基质厚度被描述为内皮细胞活化11中涉及的因素。在肿瘤中,缺氧增加ECM刚度和内皮芽第12代。此外,CAFs分泌血管内皮生长因子(VEGF)和血小板衍生生长因子(PDGF),刺激肿瘤频闪13的血管生成。在这一领域,体外基质生成可用于研究不同实验条件下的血管生成过程或MMP作用。因此,最相似的体内基质的体外生殖可能是研究ECM在血管生成或微环境细胞相互作用中的作用的宝贵工具。
用抗坏血酸刺激培养成纤维细胞以增强基质沉积并产生ECM是生成类似体基质的公认方法。不朽的成纤维细胞系易于培养,并被不同的生长因子激活,如PDGF-BB、肿瘤坏死因子-β(TNF-α)或TGF-β14。在TME中,CAF合成I型胶原蛋白和纤维蛋白作为ECM4的主要成分。同样,这些成分也被认为是体外产生的成纤维细胞衍生基质的主要成分(图1)。
有不同的体外方法来模拟体内ECM。在过去几年中,使用含有ECM纤维混合物的涂层培养皿得到了扩展,但这种2D方法需要改进3D结构,如交联凝胶(例如,Matrigel)1 。类似母体的设置已成为模拟 3D 矩阵的标准方法。菲布林也是一个替代时,生成矩阵,但失败的强度和耐久性在ECM1。胶原蛋白与其他ECM组件结合使用,弥补了上述一些问题。然而,这些胶原蛋白凝胶形成了一个强大的网络,纤维可以定向,但高度异质性,这可能是一个问题,在实验重复1。然而,必须假定,根据实验的目标,使用Matrigel或其他水凝胶更合适(例如,在易于检测凝胶收缩的基体收缩研究中)。
在一些细胞类型的实验中,生成基质的潜在免疫原性可能是一个问题。因此,为了减少使用我们的方法时ECM生成细胞引起的免疫反应的可能性,对基质进行去细胞化并洗涤,尽管细胞片段去除不能总共15个。理想的ECM需要与细胞培养兼容,能够对细胞信号进行通信和反应。我们的程序允许在ECM生产过程中毫无困难地引入变化(例如,添加成纤维细胞刺激生长因子)。
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Protocol
人体组织样本是经马德里拉蒙和卡哈尔医院研究伦理委员会批准获得的。
1. 准备解决方案
- 准备 0.2% 明胶溶液:将 1 克明胶加入 500 mL 的 PBS。高压灭菌溶液,并保持在4°C。使用前使用 0.22 μm 过滤器进行过滤。
- 制备1%谷醛:在24 mL的PBS中加入1 mL的25%谷醛库存溶液。使用前使用 0.22 μm 过滤器进行过滤。
- 准备1M乙醇胺:在使用前用无菌H2O.过滤器制备乙醇胺溶液。
注:由于乙醇胺带有安全帽,因此需要针头和注射器。 - 制备抗坏血酸:将0.1 mL的50mg/mL库存溶液抗坏血酸(光敏)加入100 mL的介质中。
- 准备莱沙缓冲:准备PBS 0.5% Triton 100X与20 nM NH4OH。使用前直接添加 NH4OH。
- 准备 PBS 笔/链球菌:将笔/链球菌溶液稀释到 100 U/mL 笔和 100 μg/mL 链球菌。
- 使用 10% FBS 准备 DMEM:将 10% FBS 添加到 500 mL 的 DMEM 中。补充100 U/mL青霉素,100微克/mL链霉素,0.1毫克/mL诺莫辛和0.25微克/mL五聚氰酸B。
- 准备 2% BSA 热变性:将 2 克 BSA 添加到 100 mL 无菌水中。在沸水中加热7分钟。
- 用抗生素制备FBS:用200U/mL青霉素补充FBS,200微克/mL链霉素,100微克/mL甘霉素和2.5克/mL五甲素B。
2. 细胞培养准备
- 不朽的成纤维细胞细胞系
- 培养重组端粒酶转染不朽的人类前皮成纤维细胞(BJ-hTERT,ATCC CRL-4001)在DMEM与10%FBS,并保持在37°C和5%CO2。
- 内皮细胞
- 培养人脐带内皮细胞(HUVECs,ATCC PCS-100-013)在EBM-2培养基中含有2%FBS,并维持在37°C和5%CO2。
- 成纤维细胞原文化
注:对于CAF的建立和文化,我们小组先前公布的协议遵循了6。- 简单地说,将组织样本切成约2-3 mm3的小块,并在FBS中切成高浓度抗生素的种子。
- 当出现第一个成纤维细胞时,用FBM介质替换培养基,用于细胞维护。
注:根据组织来源,细胞培养物很容易被污染。在PBS中用抗生素补充洗涤样品,用高度污染的组织(例如结肠6)洗涤,摇动30-45分钟。
3. 纤维细胞衍生的3D矩阵(改编自卡斯特莱-克罗斯和库基曼16)
- 在6孔板的每口孔中加入2 mL 0.2%明胶溶液,在37°C下孵育1小时,或在4°C下孵育1小时。
- 吸气明胶,在2 mL的PBS中洗涤。
- 加入2 mL 1%谷醛,在RT.谷氨酸孵育30分钟,将交叉链接明胶。
- 在2mL的PBS中吸气谷醛和洗井5分钟重复3次。
- 加入2 mL的1M乙醇胺,在RT孵育30分钟。 乙醇胺将起到阻断剩余的谷醛的作用。
- 在PBS的2mL中吸气乙醇胺和洗井5分钟重复3次。
- 添加 1 mL 的 DMEM,带 10% FBS。如果介质立即变成粉红色,取出介质,用 2 mL 的 PBS 清洗,再添加 1 mL 的 DMEM,并加 10% FBS。
- 种子 1 mL 的成纤维细胞悬浮液,每个井中 5 x 105个细胞。每口井的总体积为 2 mL。
- 培养细胞,直到达到100%汇合。然后取出介质,用 10% FBS 与 50 μg/mL 抗坏血酸一起更换 DMEM,如果使用,则进行额外处理。
- 每 2 天用 10% FBS 和 50 μg/mL 抗坏血酸将培养基替换为新鲜 DMEM,每次 6 天。
注:如果使用额外的处理(例如,PDGF-BB、TGF-+和/或其他生长因子),则将它们与添加抗坏血酸处理的同一天添加。 - 最后一次抗坏血酸处理两天后,去除培养基,在2mL的PBS中洗涤。
- 缓慢地将1 mL的液化缓冲液,在37°C下预热,加入每个井。在RT孵育5-10分钟,直到成纤维细胞被解伤(在显微镜下观察)。
- 小心,不删除莱沙缓冲液,添加2 mL的PBS。然后吸出大约 2.5 mL 的 PBS。重复两次,共三次。
- 最终,取出 2.5 mL 的 PBS,并添加 2 mL 的 PBS,分别使用笔/链条(分别为 100 U/mL 和 100 μg/mL)。用薄膜密封,并保持在4°C长达3个月。
注:根据实验的不同,生成矩阵的长期存储可能会影响结果。我们建议尽快使用基质,如果实验涉及细胞播种,由于可能的蛋白质降解,则更是如此。如果矩阵用于结构测定,如胶原蛋白观察,则基质可以固定并储存更长时间。此协议为 6 孔培养板指示。可以使用其他板,但反应体积和细胞悬浮液浓度需要根据井面积重新计算。
4. 管形测定
- 在 EBM-2 2% FBS 中生长 HUVEC 细胞,直到最大汇合。
- 在无 FBS 的情况下用 EBM-2 更换介质 8 小时。
- 在播种单元格之前准备矩阵。
- 从冰箱中取出基质,在 RT 处放置 1 小时。
- 通过添加 2 mL 的热变性 2% BSA 来阻滞矩阵。在37°C下孵育1小时。
- 吸气BSA,在2mL的PBS中洗涤。
- 种子 2 x 105 HUVEC 细胞在 FBS 耗尽介质中,每个孔的 6 孔板以前涂有 3D 成纤维细胞衍生基质。
- 在37°C孵育内皮细胞16小时。
- 以20-40倍的放大倍率在标准明亮的场显微镜下检查类似管的结构形成。
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Representative Results
PDGF-BB 刺激成纤维细胞产生更厚的 ECM。Herrera等人展示了PDGF刺激的成纤维细胞如何产生更厚的基质以及更高的纤维方向7。BJ-hTERT成纤维细胞在有PDGF或没有PDGF的情况下孵育,观察的代表性区域显示PDGF刺激成纤维细胞产生的基质中的细胞分布更加一致(图1a)。胶原蛋白I和纤维素蛋白表达在PDGF刺激成纤维细胞(图1b)衍生的基质中增加,因此,基质厚度增加(图1c)。此外,胶原蛋白I和纤维蛋白显示平行模式,如方向性直方图所示(图1d)。
来自PDGF-BB刺激的成纤维细胞的3D基质诱导内皮细胞的输卵管发生。HUVEC细胞被播种到从PDGF刺激或非刺激的BJ-hTERT成纤维细胞衍生的去细胞化基质。在PDGF刺激的成纤维细胞产生的基质上播种的内皮细胞比在非刺激条件下表现出更多的毛细管状结构(图2)。
图1:PDGF刺激成纤维细胞增强较厚和各向异性ECM。(A) 二进制图像代表使用 PDGF-BB(上图)和方向性直方图(下图)处理或不处理的 BJ-hTERT 成纤维细胞方向的二进制图像,表示细胞角度的分布频率(以 0° 角为中心)。(B) 在从ECM衍生的PDGF刺激成纤维细胞中,细胞外蛋白纤维蛋白和胶原蛋白I的蛋白质表达增加。(C) 从PDGF刺激的成纤维细胞衍生的ECM中ECM厚度增加。(D) 在PDGF刺激的成纤维细胞中增加蛋白质,组织细胞外蛋白质,如纤维蛋白和胶原蛋白I。下面是方向性直方图。*p < 0.05;p < 0.001.改编自埃雷拉等人7请点击这里查看这个数字的较大版本。
图2:PDGF刺激的成纤维细胞促进内皮细胞活化,通过PDGF刺激成纤维细胞基质基质基质基质形成毛细管状结构来观察。ImageJ 的"粒子分析"工具显示,在 PDGF 刺激的成纤维细胞基质上播种的 HUVECs 中,非刺激成纤维细胞在基质上播种的细胞的增长率为 1.81。改编自埃雷拉等人7请点击这里查看这个数字的较大版本。
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Discussion
基质可以产生不朽的成纤维细胞或初级成纤维细胞培养物。纤维细胞易于在体外培养中保持高生长率和抗应力性。它们甚至可以从死后组织3中分离出来,尽管污染可能是一种限制,这取决于组织的来源。
此处的 3D 矩阵模型为成功研究 ECM 组成和光纤方向提供了一种新颖有效的系统。也可用于分析成纤维细胞活化状态、基因/蛋白质表达、与其他细胞类型的相互作用等。需要强调的是,用患者的成纤维细胞生成的矩阵使得对肿瘤中与频闪相关的机制进行个性化研究成为可能。例如,这种方法可以应用于化学阻力的研究,其中ECM具有重要作用。这种类型的研究的翻译有助于在临床实践中对患者进行治疗,实现个性化医学。
尽管 3D 矩阵协议可能很繁琐,但可以通过遵循说明来实现有趣的结果。必须注意,需要多个洗涤步骤,因此避免基质损坏至关重要。此外,我们建议,当使用该协议测试不同的细胞培养条件时,由于实验期间可能发生的最小差异(例如,在播种时使用相同的成纤维细胞悬浮液),应同时生成基质预处理板)。
其他组织工程方法正在开发中,但还需要采取其他步骤,如灭菌,以创建供人类使用的兼容的ECM和组织。虽然新技术正在出现,但它们可能成本高昂,而且可能难以适应标准实验室设施。使用从患者获得的主要CAF,可以生成"个性化矩阵"来测试不同的治疗方法。沿着这条线,我们小组一直在使用这种方法来证明由CAF生成的矩阵与由NF生成的矩阵不同,显示更厚、更有条理的矩阵7。我们报告说,从内皮细胞衍生的毛细管状结构依赖于成纤维细胞Snail1表达,并且有未来的研究来观察这种对CAF源基质的影响。
ECM需要进一步研究,我们才能了解导致化疗耐药性或肿瘤复发的基本机制。因此,我们建议使用来自癌症患者组织的CAF衍生基质作为研究癌症和ECM与癌细胞或其他基质细胞通信中的微环境行为的程序。
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Disclosures
提交人声明没有利益冲突。
Acknowledgments
该协议的开发得到了萨卢德·卡洛斯三世研究所的PI12/02037、PI15/02101、PI17/01847、PI18/01034和RD12/0036/0041的支持;由欧洲德萨罗罗地区(FEDER);由"CIBER de Cáncer",CB16/12/00273和CB16/12/00446,来自萨卢德·卡洛斯三世-FEDER研究所;由科学基金会AECC(针对胰腺癌的多方面方法)。克里斯蒂娜·佩尼亚是萨卢德·卡洛斯三世研究所米格尔·塞尔维特合同的获得者。欧德先生帮助处理英文课文。我们感谢实验室成员在整个研究中提供帮助和建议。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
Triton X100 | Roth | 3051 | |
Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
References
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