Summary
Los mióblastos están proliferando en células precursoras que se diferencian para formar miotubos polinucleados y, finalmente, miofibers musculares esqueléticos. Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento eficiente y el cultivo de mioblastos primarios de los músculos esqueléticos adultos jóvenes. El método permite estudios moleculares, genéticos y metabólicos de las células musculares en el cultivo.
Abstract
Los mioblastos primarios son precursores proliferantes indiferenciados del músculo esquelético. Pueden ser cultivados y estudiados como precursores musculares o inducidos para diferenciarse en etapas posteriores del desarrollo muscular. El protocolo proporcionado aquí describe un método robusto para el aislamiento y el cultivo de una población altamente proliferativa de células mioblastecas de explantes musculares esqueléticos de ratón adulto joven. Estas células son útiles para el estudio de las propiedades metabólicas del músculo esquelético de diferentes modelos de ratón, así como en otras aplicaciones aguas abajo como la transfección con ADN exógeno o la transducción con vectores de expresión viral. El nivel de diferenciación y perfil metabólico de estas células depende de la duración de la exposición y de la composición de los medios utilizados para inducir la diferenciación de mioblastos. Estos métodos proporcionan un sistema robusto para el estudio del metabolismo de las células musculares de la ratón ex vivo. Es importante destacar que, a diferencia de los modelos in vivo, los métodos descritos aquí proporcionan una población celular que se puede ampliar y estudiar con altos niveles de reproducibilidad.
Introduction
Aunque a menudo se cita como una indicación de la salud metabólica general, múltiples estudios han demostrado que el índice de masa corporal (IMC) en adultos mayores no se asocia consistentemente con un mayor riesgo de mortalidad. Hasta la fecha, el único factor que ha demostrado ser consistente con la reducción de la mortalidad en esta población es el aumento de la masa muscular1. El tejido muscular representa una de las mayores fuentes de células sensibles a la insulina en el cuerpo, y por lo tanto es crítico en el mantenimiento de la homeostasis metabólica general2. La activación del tejido muscular esquelético a través del ejercicio se asocia con aumentos tanto en la sensibilidad local a la insulina como en la salud metabólica general3. Mientras que los modelos in vivo son esenciales para estudiar la fisiología muscular y el impacto de la función muscular en el metabolismo integrado, los cultivos primarios de miotubos proporcionan un sistema manejable que reduce la complejidad de los estudios en animales.
Los mióblastos derivados de los músculos postnatales se pueden utilizar para estudiar el impacto de numerosas condiciones de tratamiento y crecimiento de una manera altamente reproducible. Esto ha sido reconocido durante mucho tiempo y se han descrito varios métodos para el aislamiento y el cultivo de mioblastos4,5,6,7,8,9. Algunos de estos métodos utilizan músculos neonatales y producen un número relativamente bajo de mioblastos5,8,que requieren varios animales para estudios a mayor escala. Además, los métodos más utilizados para el cultivo de mioblastos utilizan "pre-plating" para enriquecer los mioblastos, que son menos adherentes que otros tipos de células. Hemos encontrado que el método de enriquecimiento alternativo descrito aquí es mucho más eficiente y reproducible para enriquecer una población de mioblastos altamente proliferativos. En resumen, este protocolo permite el aislamiento de mioblastos altamente proliferativos de explantes musculares adultos jóvenes, a través del crecimiento en los medios de cultivo. Los mióblastos se pueden cosechar repetidamente, durante varios días, expandirse rápidamente e inducirse a diferenciarse en miotubos. Este protocolo genera reproduciblemente un gran número de células de mioblasto sano que se diferencian sólidamente en miotubos de espasmos espontáneamente. Nos ha permitido estudiar el metabolismo y los ritmos circadianos en miotubos primarios de ratones de una variedad de genotipos. Por último, incluimos métodos para preparar miotubos para el estudio del metabolismo oxidativo, utilizando mediciones de las tasas de consumo de oxígeno en placas de 96 pocillos.
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Protocol
Este protocolo sigue las pautas de cuidado animal de Scripps Research.
1. Recolección y procesamiento de explantes de tejido muscular
- El día anterior a la disección, esterilizar todos los equipos de disección (fórceps, cuchillas de afeitar y tijeras) y preparar todos los medios necesarios: solución salina tamponada de fosfato (PBS), MB Deplating (12,5 ml de DMEM, 12,5 ml de HAMS F12, 20 ml de bovina fetal inactivada por calor suero (FBS), 5 ml de suplemento medio de líquido amniótico) y Solución de recubrimiento (24 ml de DMEM, 24 ml de HAMS F12, 1,7 ml de colágeno, 1 ml de matrigel).
- El día de la disección, cubra un plato de 6 cm con solución de recubrimiento para cada músculo a diseccionar. Añadir 2 ml de solución de recubrimiento a la superficie de cada plato, agitar suavemente para crear una capa uniforme en la superficie, e incubar las placas con solución a 4 oC durante 1 h.
- Retire la solución de recubrimiento de las placas y vuelva a la solución de stock.
NOTA: La solución de recubrimiento se puede reutilizar durante un máximo de seis meses y debe almacenarse a 4 oC. - Enjuague las placas dos veces con 2 ml de PBS para eliminar el colágeno y el matrigel sin ataduras.
- Colocar las placas en una incubadora de cultivo de tejido de 37oC durante las disecciones.
- Preparar una cámara húmeda colocando 2-3 hojas de papel absorbente grueso en una bolsa de plástico o un plato estéril de 15 cm y utilizar una pipeta para mojar la superficie del papel con agua estéril.
- Coloque la cámara bajo luz UV durante 5 minutos para esterilizar.
- Diseccionar los músculos deseados de un ratón de 4 a 8 semanas de edad. Para esterilizar el tejido muscular, enjuague suavemente en PBS que contenga 40 g/ml de gentamicina.
NOTA: Para los músculos del cuádriceps y gastrocnemio, placa un músculo por placa. Para soleus, plantaris y EDL, combina los músculos de ambas piernas en un solo plato. - Utilice fórceps estériles para transferir el músculo a un plato estéril de 10 cm sin recubrimiento De Lica. Añadir 0,5-1,0 ml de medios de chapado sobre el músculo de tal manera que el tejido esté húmedo pero no flotante(Figura 1A).
- Utilice un bisturí estéril o una cuchilla de afeitar para cortar suavemente el músculo en pequeños fragmentos (aproximadamente 1-3 mm3).
NOTA: Es importante minimizar el manejo del tejido muscular para obtener mejores resultados. - Utilice fórceps o una pipeta para transferir los fragmentos musculares a la superficie de una placa pre-revestida de 6 cm. Superponga muy suavemente 0,8 ml de soporte de chapado sobre el tejido. Debe haber suficientes medios para mantener las piezas de tejido hidratadas pero no flotantes(Figura 1B).
- Colocar los platos de 6 cm que contienen los fragmentos musculares dentro de la cámara húmeda y volver a una incubadora (37 oC, 5% CO2) durante 48 h(Figura 1C).
NOTA: Es vital que los fragmentos musculares se adhieran a la superficie de la placa para permitir el crecimiento del mioblasto. No mueva las placas/cámara durante al menos 48 h. - Después de 48 h, compruebe cuidadosamente las placas para asegurarse de que los fragmentos musculares se han adherido. Superposición con 2 mL de Plating Media, teniendo cuidado de no desalojar los fragmentos.
NOTA: Si hay contaminación o escombros visibles en las placas, lave cuidadosamente las piezas musculares. Placa 2 ml de solución de PBS/gentamicina en el borde de la placa y punta suavemente para lavar sobre el tejido muscular. Retire el PBS y repita el paso de lavado. Después del segundo lavado, superponga 2 mL de Plating Media. - Conservar las placas en la incubadora de 37oC durante un máximo de 3 días adicionales (5 días a partir de la disección original) antes de cosechar mioblastos. Compruebe cada dos días si hay crecimiento de mioblastos.
NOTA: La aparición de células que emergen de explantas musculares será variable y heterogénea. Los mióblastos primarios aparecen como células pequeñas, redondas y brillantes. Sin embargo, no es necesario ni fiable identificarlos por su aparición en esta etapa(Figura 2).
2. Cosecha de mióblastos de cultivo
- Preparar y precalentar Myoblast Media (17,5 mL de DMEM, 17,5 mL de HAMS F12, 10 mL de FBS, 5 mL de suplemento medio de líquido amniótico), trippsina y PBS/gentamicina. Recubrir un matraz T25 por grupo muscular que se cosecha con Solución de Recubrimiento y como se describe en el paso 1.2 (ver Tabla 1).
- Retire los medios de recubrimiento y enjuague suavemente los explantes musculares con 2 ml de PBS/gentamicina. Retire rápidamente el PBS (enjuague una placa a la vez y no deje que la placa se quede en PBS en este paso).
- Agregue suavemente 1 ml de PBS/gentamicina y coloque la placa en la incubadora de 37oC durante 1 min.
- Utilice una pipeta P1000 para recoger PBS/células en un tubo centrífugo de 15 ml.
- Añadir 1 ml de trippsina a la placa y volver a la incubadora de 37 oC durante 3 minutos. Toque suavemente las placas para desalojar los mióblastos. Recoja la trippsina/células y combínelo con la colección PBS. Añadir 8 ml de Myoblast Media al tubo centrífugo e invertir suavemente para mezclar.
- Superponga suavemente 2 ml de solución de chapado en las placas musculares y vuelva a la incubadora de 37 oC.
- Gire los tubos de centrífuga que contienen células en una centrífuga durante 3 min a 200 x g.
- Aspirar el sobrenadante a 1 ml, teniendo cuidado de evitar el pellet celular. Agregue suavemente Myoblast Media (ver Tabla 1) y transfiera las células al matraz pre-recubierto y colóquelas en la incubadora de 37oC. Esta es la cosecha P0. Si se observa bajo un microscopio, puede haber muy pocas células(Figura 3).
- Repita la cosecha descrita anteriormente cada dos días hasta tres veces. Después de la tercera cosecha, deseche los explantes.
3. Expansión y enriquecimiento de los mioblastos proliferantes
NOTA: La cosecha P0 será heterogénea (60% mioblastos). Los siguientes 2 pasajes utilizan PBS para cosechar selectivamente mioblastos. Muchas de las células más adherentes se dejarán atrás y los mioblastos que proliferan rápidamente serán 95% puros dentro de 2 pasajes. Una vez establecidos los mioblastos, deben mantenerse a baja densidad para evitar la diferenciación espontánea.
- Para cada matraz T25 de células confluentes de 40-50% de la sección 2, cubra un matraz T75 con 5 ml de solución de recubrimiento y colóquelo a 4 oC durante 1-4 h.
- Retire la solución de recubrimiento de los matraces y vuelva a la solución de stock. Enjuague los matraces dos veces con 2 ml de PBS/gentamicina y colóquelos en la incubadora de 37oC.
- Aspirar los medios de los matraces P0 myoblast T25. Enjuague las células brevemente con 2 ml de PBS/gentamicina tibia. Aspirar PBS desde el matraz.
NOTA: El propósito de este paso (3.3) es reducir la posibilidad de contaminación bacteriana. Si se realiza rápida y suavemente, no debe resultar en la pérdida de mioblastos. Se puede omitir para maximizar la preservación del mioblasto si se desea. - Pipetear 2 ml de PBS caliente (no trippsina) en cada matraz que contenga mioblastos. Coloque los matraces con PBS en la incubadora de 37 oC durante 3 min.
NOTA: Los mióblastos deben desprenderse fácilmente de los matraces con PBS. El uso de PBS en lugar de la trippsina en este paso es fundamental para reducir la contaminación de la población de mióblasts con otros tipos de células. - Retire las células de la incubadora de 37 oC y toque firmemente el lado de los matraces para desalojar las células. Compruebe bajo un microscopio de luz si hay mioblastos flotantes.
- Coloque los matraces en posición vertical en una capucha de cultivo de tejido y enjuague la parte inferior de los matraces con 10 ml de Myoblast Media 2-3 veces para asegurarse de que todas las células se desalojan.
- Recoger la mezcla celular/media en un tubo centrífugo de 15 ml. Centrífuga durante 3 min a 200 x g.
- Aspirar el medio a alrededor de 1 mL, teniendo cuidado de evitar el pellet celular. Agregue suavemente un volumen adecuado de Myoblast Media al tubo centrífugo y mezcle suavemente.
- Distribuya la mezcla de células en los nuevos matraces T75. Agregue 10 ml de Myoblast Media a cada nuevo matraz T75. Agitar suavemente los matraces horizontalmente para distribuir las células y colocarlas en la incubadora de 37oC durante la noche.
- Dos días más tarde, pasa una vez más con PBS, dividiendo cada matraz T75 en tres matraces T75.
NOTA: No permita que los mióblastos se conviertan en más de 50%-60% de confluentes, ya que esto haría que comenzaran a diferenciary y perder capacidad de prolifatere. - Para pasajes adicionales, utilice trippsina. Pasar dos veces con rendimientos de PBS >95% mioblastos; los intentos de mejorar aún más la pureza tienden a dar lugar a una diferenciación más pobre.
4. Diferenciación de los mióblastos primarios a los miotubos
- Placa P2 (o pasaje posterior) mioblastos en Myoblast Media en placas recubiertas (ver Tabla 1 para los volúmenes sugeridos de recubrimiento y chapado y números de celda). Dos o tres días más tarde, cuando las células estén al 70-80% de confluencia, cambie los medios a Medios de Diferenciación (24 ml de DMEM, 24 ml de HAMS F12, 1,5 ml de suero de caballo inactivado por calor, 0,5 ml de insulina-selenio-transferrina).
- Cambiar los medios de diferenciación cada dos días durante la diferenciación de los mioblastos primarios en miotubos. La diferenciación se completa típicamente para el día 4-5 y estará marcada por células alargadas y fusionadas que se entrelacen espontáneamente. Realizar experimentos en miotubos diferenciados en un plazo de 6 días. Por lo general, las células se muestran cinco o seis días después de iniciar la diferenciación.
5. Medición de la tasa de consumo de oxígeno en mioblastos o miotubos en placas de 96 pocillos
- Cubra placas de 96 pocillos con 25 ml de solución de recubrimiento por poca. Centrifugar las placas a 58 x g durante 1 min para eliminar las burbujas.
- Incubar las placas en solución de recubrimiento durante 1-4 h a 4oC. Utilice la pipeta multicanal para retirar la solución de recubrimiento y lavar tres veces en 25 ml de PBS/gentamicina fría. Centrifugar al menos uno de estos lavados para asegurarse de que no haya burbujas atrapadas.
- Añadir 40 s de medios de diferenciación a cada poca. Centrifugar el medio en la placa recubierta sin celdas durante 1 min a 58 x g para evitar burbujas y eliminar la tensión superficial para obtener una capa uniforme de medios.
- Agregue las células suspendidas en 40 s adicionales de medios a cada poca. Girar de nuevo a 58 x g.
NOTA: La consistencia en el chapado es importante para obtener mejores resultados y el número de células chapadas por pozo debe optimizarse para cada configuración experimental, y probablemente estará en el rango de 10.000-25.000 mioblastos chapados en medios de diferenciación por pozo de una placa de 96 pocillos. - Cambie suavemente los medios diariamente durante la diferenciación. No aspirar los medios, sino retirarlo con una pipeta, dejando un pequeño volumen detrás para evitar desalojar las células o exponerlas al aire. Por ejemplo, sustituya 50 s a la vez para tres repeticiones en lugar de los 80 s a la vez.
- Utilice 8-15 pozos por condición. Puede ser necesario omitir algunos pozos si las células no forman una capa uniforme de miotubos.
NOTA: Omita los pozos en los bordes de la placa porque son altamente susceptibles a la evaporación. Varíe la configuración de la placa para réplicas experimentales para evitar errores sistemáticos. - Realizar el ensayo deseado en miotubos diferenciados dentro de 1-2 días de la diferenciación completa (Día 4-6 desde el inicio de la diferenciación). Los instrumentos y reactivos recomendados para la medición de las tasas de consumo de oxígeno se enumeran en la Tabla de Materiales.
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Representative Results
Siguiendo la Sección 1 del protocolo proporcionado debe producir células primarias que emergen de los explantes que serán visibles bajo un microscopio de luz estándar(Figura 2). Se verá una población de células heterogéneas creciendo fuera y rodeando cada explantación de tejido muscular. Los mióblastos aparecerán como esferas pequeñas, redondas y brillantes. Siguiendo la Sección 2 del protocolo producirá cosechas tempranas de mioblastos a partir de explantes tisulares, que contendrán pocas células y serán heterogéneos(Figura 3). La sección 3 del protocolo describe el paso de cosechas tempranas con PBS (en lugar de trippsina), que proporcionará una población relativamente pura de mioblastos para un cultivo posterior. Siguiendo la Sección 4 del protocolo producirá miotubos totalmente diferenciados para una mayor manipulación experimental. La diferenciación de los mioblastos suele tardar entre 4 y 6 días, durante los cuales la morfología de las células cambiará de esferas redondas simples a fibras multinucleadas alargadas, fusionadas y largas(Figura 4). A continuación de la sección 5 del protocolo se producirán miotubos diferenciados en placas de 96 pocillos para permitir una variedad de caracterizaciones metabólicas basadas en los cambios en el consumo de oxígeno y las tasas de acidificación extracelular10 (Figura 5).
Figura 1: Disección y procesamiento del músculo del cuádriceps. (A) Músculo del cuádriceps que ha sido recién diseccionado y enjuagado con PBS antes de transferirse a un plato de 10 cm. Se ha superpuesto 1 ml de soporte de chapado para su procesamiento. (B) Piezas de tejido muscular del cuádriceps después de la transferencia a placa pre-recubierta de 6 cm. (C) placas de 6 cm dentro de la cámara húmeda antes de la colocación en la incubadora de 37 oC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Crecimiento de los mióblastos. Crecimiento de mioblastos de explantes musculares de cuádriceps. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Mioblastos de paso temprano. P0 mioblastos después de la transferencia y fijación al matraz T25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Placado y diferenciación de los miotubos primarios. (A) Miólatos un día después de iniciar la exposición a los medios de diferenciación. (B,C) Miotubos diferenciados cinco (B)o seis (C) días después de iniciar la diferenciación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Miotubos listos para la medición de las tasas de consumo de oxígeno. Miotubos totalmente diferenciados cinco días después de chapar 20.000 mioblastos en medios de diferenciación en cada pocal de una microplaca de cultivo celular de 96 pocillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El músculo esquelético es vital para el establecimiento y mantenimiento de la homeostasis metabólica11. El estudio de la fisiología muscular se complica por la variabilidad interindividual, así como la dificultad para obtener muestras, especialmente en el caso de estudios en humanos. Se ha demostrado que los miotubos primarios cultivados recapitulan muchas características de la fisiología muscular, incluyendo la homeostasis de calcio12,la regeneración del tejido muscular dañado5, alteraciones metabólicas en respuesta al ejercicio13,y alteraciones del metabolismo resultantes de enfermedades como la diabetes14. El cultivo primario de mioblastos y miotubos de ratones permite la investigación de células musculares que albergan manipulaciones genéticas bien definidas, y proporciona un complemento a los estudios de miotubos derivados de biopsias musculares humanas12,15 ,16. Por lo tanto, los métodos para el aislamiento y el cultivo de mioblastos primarios de ratón y miotubos son esenciales para permitir la investigación reproducible y de alto rendimiento de la función de la célula muscular ex vivo. El protocolo descrito aquí permite el establecimiento y estudio de mioblastos primarios de ratón y miotubos bajo una variedad de manipulaciones experimentales.
Mientras que los protocolos anteriores han descrito el aislamiento de las células madre musculares de los cultivos explantadores, este protocolo proporciona un método para el aislamiento exitoso de mioblastos de múltiples tipos diferentes de tejido muscular. Además, este método produce una población significativamente mayor de células madre para una mayor manipulación experimental. Además, este método ha sido validado como el rendimiento de miotubos diferenciados que expresan marcadores de células musculares maduras17,y exhiben fisiología normal, como ritmos circadianos17 y señal de proteína quinasa mitogen activada (MAPK) transducción18.
Los pasos críticos en el protocolo son la disección y el procesamiento de los explantes de tejido muscular, así como la evitación de la contaminación entre las cosechas. Se debe tener cuidado para evitar el procesamiento excesivo de los tejidos. Mientras que las piezas más pequeñas de músculo producen un mayor número de mioblastos, el corte excesivo del músculo podría prevenir el crecimiento de las células madre. Si bien es importante no desalojar los explantes una vez chapados, el lavado cuidadoso de las placas con PBS/gentamicina es fundamental para reducir la contaminación. Los mióblastos cosechados pueden congelarse como células P2 en crioviales utilizando una mezcla de medios de mióblast de 10% DMSO/90%. Mientras que los mioblastos no necesitan mantenerse a una alta densidad para facilitar el crecimiento, se aconseja que las células se congelan en 40-50% de confluencia. Típicamente, un matraz T75 produce 4 crioviales de células.
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Disclosures
Ninguno.
Acknowledgments
Los autores están agradecidos al Dr. Matthew Watt en la Universidad de Melbourne y a la Dra. Anastasia Kralli de la Universidad Johns Hopkins por la asistencia para adoptar este protocolo basado en el trabajo de Mokbel et al.6. También damos las gracias a la Dra. Sabine Jordan por su asistencia en el desarrollo y adopción de este protocolo en nuestro laboratorio. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud R01s DK097164 y DK112927 a K.A.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating Solution: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Collagen | Life Technologies | A1064401 | 1.7 mL |
| Matrigel | Fisher | CB40234A | 1 mL |
| Plating Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Myoblast Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 min |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Differentiation Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Heat Inactivated Horse Serum | Sigma | H1138 | 1.5 mL |
| Insulin-Selenium-Transferrin | Life Technologies | 41400045 | 0.5 mL |
| Other Materials: | |||
| PBS | Gibco | 14040133 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells |
| Forceps | Any | ||
| Razor Blades | Any | ||
| Scissors | Any | ||
| Whatman paper | VWR | 21427-648 | |
| 60 mm plate | VWR | 734-2318 | |
| 10 cm plate | VWR | 25382-428 (CS) | |
| T25 Flasks | ThermoFisher | 156367 | |
| T75 Flasks | ThermoFisher | 156499 | |
| Centrifuge Tubes (15 mL) | BioPioneer | CNT-15 | |
| Oxygen Consumption Rates: | |||
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Seahorse XFe96 Analyzer | Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 96-well plates for use in XFe96 Analyzer |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate | Agilent | 102720-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Palmitic acid | Sigma | P5585-10G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Carnitine | Sigma | C0283-5G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Etomoxir | Sigma | E1905 | for measurement of fatty acid oxidation |
| BSA | Sigma | A7030 | used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation |
References
- Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults. American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).
- Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo. Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).
- Sjøberg, K. A., et al. Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling. Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).
- Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells. Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).
- Smith, J., Merrick, D. Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).
- Mokbel, N., et al. K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity. Brain. 136 (2), 494-507 (2013).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Musarò, A., Carosio, S. Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle. Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).
- Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness. Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).
- Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis. Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).
- Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy. BioMed Research International. , (2015).
- Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).
- Chen, M. B., et al. Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).
- Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. Immortalization of murine muscle cells from lysosomal α-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).
- Varga, B., et al. Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).
- Kriebs, A., et al. Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).
- Cho, Y., et al. Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle. FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).
