Summary
Myoblaste sind proliferierende Vorläuferzellen, die sich unterscheiden, um polynukleierte Myotuben und schließlich Skelettmuskelmyofien zu bilden. Hier stellen wir ein Protokoll zur effizienten Isolierung und Kultur von primären Myoblasten von jungen erwachsenen Mausskelettmuskeln vor. Die Methode ermöglicht molekulare, genetische und metabolische Studien von Muskelzellen in der Kultur.
Abstract
Primäre Myoblasten sind undifferenzierte proliferierende Vorläufer des Skelettmuskels. Sie können kultiviert und als Muskelvorläufer untersucht werden oder induziert, um in späteren Stadien der Muskelentwicklung zu unterscheiden. Das hier bereitgestellte Protokoll beschreibt eine robuste Methode zur Isolierung und Kultur einer stark proliferativen Population von Myoblastzellen aus jungen erwachsenen Mausskelettmuskelexplantationen. Diese Zellen sind nützlich für die Untersuchung der metabolischen Eigenschaften des Skelettmuskels verschiedener Mausmodelle sowie in anderen nachgelagerten Anwendungen wie Transfektion mit exogener DNA oder Transduktion mit viralen Expressionsvektoren. Der Grad der Differenzierung und des metabolischen Profils dieser Zellen hängt von der Dauer der Exposition und der Zusammensetzung der Medien ab, die zur Induzieren von Myoblastendifferenzierung verwendet werden. Diese Methoden bieten ein robustes System für die Untersuchung des Stoffwechsels von Mausmuskelzellen ex vivo. Wichtig ist, dass die hier beschriebenen Methoden im Gegensatz zu in vivo-Modellen eine Zellpopulation bieten, die mit einem hohen Maß an Reproduzierbarkeit erweitert und untersucht werden kann.
Introduction
Obwohl oft als Hinweis auf die allgemeine metabolische Gesundheit genannt, haben mehrere Studien gezeigt, dass der Body-Mass-Index (BMI) bei älteren Erwachsenen nicht konsequent mit einem höheren Sterblichkeitsrisiko verbunden ist. Bis heute ist der einzige Faktor, der mit der reduzierten Sterblichkeit in dieser Population konsistent ist, erhöhte Muskelmasse1. Muskelgewebe stellt eine der größten Quellen von Insulin-empfindlichen Zellen im Körper dar und ist daher entscheidend für die Aufrechterhaltung der gesamten metabolischen Homöostase2. Aktivierung des Skelettmuskelgewebes durch Übung ist verbunden mit Erhöhungen der lokalen Insulinempfindlichkeit und der allgemeinen metabolischen Gesundheit3. Während In-vivo-Modelle für das Studium der Muskelphysiologie und die Auswirkungen der Muskelfunktion auf den integrierten Stoffwechsel unerlässlich sind, bieten Primärkulturen von Myotuben ein beschreibbares System, das die Komplexität von Tierstudien reduziert.
Myoblaste, die aus postnatalen Muskeln gewonnen werden, können verwendet werden, um die Auswirkungen zahlreicher Behandlungs- und Wachstumsbedingungen in einer sehr reproduzierbaren Weise zu untersuchen. Dies ist seit langem anerkannt und mehrere Methoden für myoblast Isolation und Kultur wurden beschrieben4,5,6,7,8,9. Einige dieser Methoden verwenden neonatale Muskeln und ergeben relativ geringe Anzahl von Myoblasten5,8, erfordert mehrere Tiere für größere Studien. Auch die am häufigsten verwendeten Methoden zur Kultivierung von Myoblasten verwenden "Pre-Plating", um myoblasts zu bereichern, die weniger haftend sind als andere Zelltypen. Wir haben festgestellt, dass die hier beschriebene alternative Anreicherungsmethode viel effizienter und reproduzierbarer für die Anreicherung einer hochproliferativen Myoblastpopulation ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll die Isolierung von hochproliferativen Myoblasten von jungen erwachsenen Muskelexplantationen über das Auswachsen in Kulturmedien ermöglicht. Myoblaste können wiederholt geerntet werden, über mehrere Tage, schnell erweitert, und induziert, in Myotubes zu differenzieren. Dieses Protokoll erzeugt reproduzierbar eine große Anzahl gesunder Myoblastzellen, die sich robust in spontan zuckende Myotuben differenzieren. Es hat uns ermöglicht, Stoffwechsel und zirkadiane Rhythmen in primären Myotuben von Mäusen einer Vielzahl von Genotypen zu studieren. Schließlich schließen wir Methoden zur Vorbereitung von Myoröhren für die Untersuchung des oxidativen Stoffwechsels ein, indem wir Messungen der Sauerstoffverbrauchsraten in 96-Well-Platten verwenden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dieses Protokoll folgt den Tierpflegerichtlinien von Scripps Research.
1. Sammlung und Verarbeitung von Muskelgewebe-Explants
- Am Tag vor der Zerlegung alle Seziergeräte (Zangen, Rasierklingen und Scheren) sterilisieren und alle benötigten Medien vorbereiten: phosphatgepufferte Kochsaline (PBS), MB-Beschichtungsmedien (12,5 ml DMEM, 12,5 ml HAMS F12, 20 ml wärmeinaktiviertes fetales Rinderrin Serum (FBS), 5 ml Fruchtwassermedium-Ergänzung) und Beschichtungslösung (24 ml DMEM, 24 ml HAMS F12, 1,7 ml Kollagen, 1 ml Matrigel).
- Am Tag der Zerlegung, beschichten Sie eine 6-cm-Schale mit Beschichtungslösung für jeden Muskel seziert werden. Fügen Sie 2 ml Beschichtungslösung auf die Oberfläche jeder Platte, schütteln Sie sanft, um eine gleichmäßige Schicht auf der Oberfläche zu schaffen, und bebrüten die Platten mit Lösung bei 4 °C für 1 h.
- Entfernen Sie die Beschichtungslösung von den Platten und kehren Sie zur Lagerlösung zurück.
HINWEIS: Coating Solution kann bis zu sechs Monate lang wiederverwendet werden und sollte bei 4 °C gelagert werden. - Spülen Sie die Platten zweimal mit 2 ml PBS, um ungebundenes Kollagen und Matrigel zu entfernen.
- Legen Sie die Platten während der Zerlegunginten in einen 37 °C Gewebekultur-Inkubator.
- Bereiten Sie eine feuchte Kammer vor, indem Sie 2-3 Blatt dickes saugfähiges Papier in eine Plastiktüte oder eine sterile 15 cm Schale legen und eine Pipette verwenden, um die Oberfläche des Papiers mit sterilem Wasser zu befeuchten.
- Legen Sie die Kammer für 5 min unter UV-Licht, um zu sterilisieren.
- Sezieren Sie gewünschte Muskeln von einer 4 bis 8 Wochen alten Maus. Um Muskelgewebe zu sterilisieren, spülen Sie vorsichtig in PBS mit 40 g/ml Gentamicin.
HINWEIS: Für Quadrizeps und Gastrocnemius-Muskeln, Platte ein Muskel pro Platte. Für Soleus, Plantaris und EDL, kombinieren Muskeln von beiden Beinen in einer Platte. - Verwenden Sie sterile Zangen, um den Muskel auf eine sterile 10 cm unbeschichtete Petrischale zu übertragen. Fügen Sie 0,5-1,0 ml Plating-Medien über den Muskel, so dass das Gewebe feucht, aber nicht schwebend ist (Abbildung 1A).
- Verwenden Sie ein steriles Skalpell oder Rasierklinge, um den Muskel sanft in kleine Fragmente zu schneiden (ca. 1-3 mm3).
HINWEIS: Es ist wichtig, die Handhabung des Muskelgewebes für beste Ergebnisse zu minimieren. - Verwenden Sie Zangen oder eine Pipette, um die Muskelfragmente auf die Oberfläche einer vorbeschichteten 6-cm-Platte zu übertragen. Überlagern Sie sehr sanft weitere 0,8 ml Plating Media über das Gewebe. Es sollte genügend Medien vorhanden sein, um die Gewebeteile hydratisiert, aber nicht schwebend zu halten (Abbildung 1B).
- Legen Sie die 6-cm-Gerichte mit den Muskelfragmenten in die feuchte Kammer und kehren Sie für 48 h(Abbildung 1C)in einen Inkubator (37 °C, 5% CO2) zurück .
HINWEIS: Es ist wichtig, dass Muskelfragmente an der Oberfläche der Platte haften, um Myoblastenauswachsen zu ermöglichen. Bewegen Sie die Platten/Kammer nicht mindestens 48 h. - Nach 48 h, überprüfen Sie sorgfältig die Platten, um sicherzustellen, dass Muskelfragmente haften. Overlay mit 2 ml Plating Media, wobei darauf geachtet wird, die Fragmente nicht zu vertreiben.
HINWEIS: Wenn es sichtbare Verunreinigungen oder Schmutz auf den Platten gibt, waschen Sie die Muskelstücke sorgfältig. Platte 2 ml PBS/Gentamicin-Lösung am Rand der Platte und Spitze sanft über das Muskelgewebe zu waschen. Entfernen Sie die PBS und wiederholen Sie den Waschschritt. Nach der zweiten Wäsche, überlagern 2 ml Plating Media. - Bewahren Sie die Platten im 37 °C-Inkubator bis zu 3 Tage (5 Tage ab der ursprünglichen Zerlegung) auf, bevor Sie Myoblasten ernten. Überprüfen Sie jeden zweiten Tag auf Auswuchs von Myoblasten.
HINWEIS: Das Auftreten von Zellen, die aus Muskelexplantationen hervorgehen, wird variabel und heterogen sein. Primäre Myoblasten erscheinen als kleine, runde und helle Zellen. Es ist jedoch weder notwendig noch zuverlässig, sie anhand ihres Aussehens in diesem Stadium zu identifizieren (Abbildung 2).
2. Ernte outgrowing Myoblasts
- Vorbereiten und Vorwärmen Von Myoblast Media (17,5 ml DMEM, 17,5 ml HAMS F12, 10 ml FBS, 5 ml Fruchtwassermedium-Ergänzung), Trypsin und PBS/Gentamicin. Mantel Sie einen T25-Kolben pro Muskelgruppe, die mit Coating Solution geerntet wird und wie in Schritt 1.2 beschrieben (siehe Tabelle 1).
- Entfernen Sie Plating Media und spülen Sie die Muskelexplantationen vorsichtig mit 2 ml PBS/Gentamicin ab. Entfernen Sie PBS schnell (spülen Sie eine Platte nach der anderen und lassen Sie die Platte bei diesem Schritt nicht in PBS sitzen).
- 1 ml PBS/Gentamicin vorsichtig hinzufügen und 1 min in den 37 °C-Inkubator legen.
- Verwenden Sie eine P1000 Pipette, um PBS/Zellen in einem 15 ml Zentrifugenrohr zu sammeln.
- Fügen Sie 1 ml Trypsin auf die Platte und kehren Sie zum 37 °C Inkubator für 3 min. Tippen Sie vorsichtig auf die Platten, um Myoblasten zu lösen. Sammeln Sie trypsin/zellen und kombinieren Sie es mit der PBS-Auflistung. Fügen Sie 8 ml Myoblast Media in das Zentrifugenrohr und sanft invertieren, um zu mischen.
- Überlagern Sie 2 ml Plating Solution vorsichtig auf den Muskelplatten und kehren Sie zum 37 °C-Inkubator zurück.
- Drehen Sie die Zentrifugenröhren, die Zellen in einer Zentrifuge enthalten, 3 min bei 200 x g.
- Aspirieren Sie den Überstand auf 1 ml, wobei Sie darauf achten, Zellpellets zu vermeiden. Fügen Sie Myoblast Media vorsichtig hinzu (siehe Tabelle 1) und übertragen Sie die Zellen in den vorbeschichteten Kolben und legen Sie sie in den 37 °C-Inkubator. Dies ist die P0-Ernte. Wenn unter dem Mikroskop beobachtet, kann es sehr wenige Zellen geben (Abbildung 3).
- Wiederholen Sie die oben beschriebene Ernte jeden zweiten Tag bis zu dreimal. Nach der dritten Ernte die Explants entsorgen.
3. Erweiterung und Bereicherung von vermehrenden Myoblasten
HINWEIS: Die P0-Ernte wird heterogen sein (60% Myoblasten). Die nächsten 2 Passagen verwenden PBS, um selektiv Myoblasten zu ernten. Viele der anhaftenderen Zellen werden zurückgelassen und die sich schnell ausbreitenden Myoblasten werden innerhalb von 2 Passagen zu 95 % rein sein. Sobald Myoblasten eingerichtet sind, sollten sie bei geringer Dichte gehalten werden, um eine spontane Differenzierung zu vermeiden.
- Für jeden T25-Kolben mit 40-50% Konfluentzellen aus Abschnitt 2 einen T75-Kolben mit 5 ml Beschichtungslösung beschichten und bei 4 °C für 1-4 h platzieren.
- Entfernen Sie die Beschichtungslösung aus den Kolben und kehren Sie zur Lagerlösung zurück. Spülen Sie die Kolben zweimal mit 2 ml PBS/Gentamicin und legen Sie sie in den 37 °C-Inkubator.
- Aspirieren Sie die Medien von P0 myoblast T25 Kolben. Spülen Sie die Zellen kurz mit 2 ml warmem PBS/Gentamicin. PBS aus dem Kolben aspirieren.
HINWEIS: Der Zweck dieses Schritts (3.3) ist es, die Möglichkeit einer bakteriellen Kontamination zu reduzieren. Wenn schnell und schonend durchgeführt, sollte es nicht zum Verlust von Myoblasten führen. Es kann weggelassen werden, um myoblast Erhaltung zu maximieren, wenn gewünscht. - Pipette 2 ml warme PBS (nicht Trypsin) in jeden Kolben mit Myoblasten. Legen Sie die Kolben mit PBS 3 min in den 37 °C-Inkubator.
HINWEIS: Myoblasten sollten sich leicht von Kolben mit PBS lösen. Die Verwendung von PBS anstelle von Trypsin in diesem Schritt ist entscheidend für die Verringerung der Kontamination der Myoblast-Population mit anderen Zelltypen. - Entfernen Sie die Zellen aus dem 37 °C-Inkubator und tippen Sie fest auf die Seite der Kolben, um die Zellen zu lösen. Überprüfen Sie unter einem Lichtmikroskop frei schwebende Myoblasten.
- Legen Sie die Kolben aufrecht in eine Gewebekulturhaube und spülen Sie den Boden der Kolben mit 10 ml Myoblast Media 2-3 mal ab, um sicherzustellen, dass alle Zellen entfernt werden.
- Sammeln Sie die Zell-Medien-Mischung in einem 15 ml Zentrifugenrohr. Zentrifuge für 3 min bei 200 x g.
- Aspirieren Sie die Medien auf ca. 1 ml, wobei Sie darauf achten, das Zellpellet zu vermeiden. Fügen Sie dem Zentrifugenrohr vorsichtig ein entsprechendes Volumen von Myoblast Media hinzu und mischen Sie es vorsichtig.
- Verteilen Sie die Zellmischung auf neue T75-Flaschen. Fügen Sie 10 ml Myoblast Media zu jedem neuen T75-Kolben hinzu. Schütteln Sie die Kolben vorsichtig horizontal, um die Zellen zu verteilen und über Nacht in den 37 °C-Inkubator zu legen.
- Zwei Tage später, Noch einmal mit PBS, teilen sie jeden T75-Kolben in drei T75-Flaschen.
HINWEIS: Lassen Sie myoblasts nicht mehr als 50%-60% konfluent werden, da dies dazu führen würde, dass sie beginnen, sich zu differenzieren und prolifaterive Kapazität zu verlieren. - Für zusätzliche Passagen verwenden Sie Trypsin. Passieren zweimal mit PBS-Erträgen >95% Myoblasten; Versuche, die Reinheit weiter zu verbessern, führen tendenziell zu einer schlechteren Differenzierung.
4. Differenzierung von Primärmyoblasten zu Myotuben
- Platte P2 (oder späterer Durchgang) Myoblasten in Myoblast Media auf beschichteten Platten (siehe Tabelle 1 für vorgeschlagene Beschichtungs- und Beschichtungsvolumina und Zellnummern). Zwei oder drei Tage später, wenn die Zellen bei 70-80% Koninfluenza sind, ändern Sie das Medium in Differenzierungsmedien (24 ml DMEM, 24 ml HAMS F12, 1,5 ml wärmeinaktiviertes Pferdeserum, 0,5 ml Insulin-Selenium-Transferrin).
- Ändern Sie Differenzierungsmedien jeden zweiten Tag während der Differenzierung von primären Myoblasten in Myotuben. Die Differenzierung ist in der Regel bis Tag 4-5 abgeschlossen und wird durch langgestreckte, verschmolzene Zellen gekennzeichnet, die spontan zucken. Führen Sie Experimente an differenzierten Myoröhren innerhalb von 6 Tagen durch. In der Regel werden Zellen fünf oder sechs Tage nach Beginn der Differenzierung untersucht.
5. Messung der Sauerstoffverbrauchsrate in Myoblasten oder Myotuben in 96-Well-Platten
- Beschichten Sie 96-Well-Platten mit 25 l Beschichtungslösung pro Bohrung. Zentrifugieren Sie die Platten bei 58 x g für 1 min, um Blasen zu entfernen.
- Inkubieren Sie die Platten in Beschichtungslösung für 1-4 h bei 4 °C. Verwenden Sie Mehrkanalpipetten, um die Beschichtungslösung zu entfernen und dreimal in 25 l kaltem PBS/Gentamicin zu waschen. Zentrifugieren Sie mindestens eine dieser Wärerungen, um sicherzustellen, dass keine Blasen gefangen sind.
- Fügen Sie jedem Brunnen 40 L Differenzierungsmedien hinzu. Zentrifugieren Sie die Medien auf der beschichteten Platte ohne Zellen für 1 min bei 58 x g, um Blasen zu vermeiden und Oberflächenspannung zu entfernen, um eine gleichmäßige Medienschicht zu erhalten.
- Fügen Sie Zellen, die in einem zusätzlichen 40 L Medien zu jedem Brunnen suspendiert sind. Drehen Sie wieder bei 58 x g.
HINWEIS: Konsistenz in der Beschichtung ist wichtig für beste Ergebnisse und die Anzahl der Zellen pro Brunnen plattiert sollte für jeden Versuchsaufbau optimiert werden, und wird wahrscheinlich im Bereich von 10.000-25.000 Myoblasten in Differenzierungsmedien pro Brunnen einer 96-Well-Platte plattiert. - Wechseln Sie die Medien während der Differenzierung täglich sanft. Saugen Sie die Medien nicht an, sondern entfernen Sie sie mit einer Pipette, sodass ein kleines Volumen zurückbleibt, um zu vermeiden, dass die Zellen verdrängt oder der Luft aussetzt. Ersetzen Sie z. B. 50 l gleichzeitig für drei Wiederholungen anstelle aller 80 l auf einmal.
- Verwenden Sie 8-15 Brunnen pro Zustand. Es kann notwendig sein, einige Brunnen wegzulassen, wenn Zellen keine gleichmäßige Schicht von Myoröhren bilden.
HINWEIS: Auslassen von Brunnen an den Rändern der Platte, da sie sehr anfällig für Verdunstung sind. Variieren Sie den Plattenaufbau für experimentelle Replikationen, um systematische Fehler zu vermeiden. - Erwünschten Test auf differenzierten Myotuben innerhalb von 1-2 Tagen nach vollständiger Differenzierung durchführen (Tag 4-6 ab Beginn der Differenzierung). Empfohlene Instrumente und Reagenzien zur Messung der Sauerstoffverbrauchsraten sind in der Materialtabelleaufgeführt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nach Abschnitt 1 des bereitgestellten Protokolls sollten Primärzellen aus den Explanten hervorgehen, die unter einem Standardlichtmikroskop sichtbar sind (Abbildung 2). Eine heterogene Zellpopulation wird gesehen, wie sie aus jedem Muskelgewebe-Explantation herauswächst und es umgibt. Myoblasten erscheinen als kleine, runde, helle Kugeln. Nach Abschnitt 2 des Protokolls werden frühe Ernten von Myoblasten aus Gewebeexpflanzen hervorgebracht, die nur wenige Zellen enthalten und heterogen sein werden (Abbildung 3). Abschnitt 3 des Protokolls beschreibt die Vorzeitige Ernte mit PBS (anstelle von Trypsin), die eine relativ reine Population von Myoblasten für weitere Kultivierung liefern wird. Nach Abschnitt 4 des Protokolls ergeben sich vollständig differenzierte Myotubes für weitere experimentelle Manipulationen. Die Differenzierung von Myoblasten dauert in der Regel 4-6 Tage, in denen sich die Morphologie der Zellen von einzelnen, runden Kugeln zu langgestreckten, verschmolzenen, langen mehrkernigen Fasern ändert (Abbildung 4). Im folgenden Abschnitt 5 des Protokolls werden differenzierte Myotuben in 96-Well-Platten hergestellt, um eine Vielzahl von metabolischen Charakterisierungen basierend auf den Veränderungen des Sauerstoffverbrauchs und der extrazellulären Versauerungsraten10 zu ermöglichen (Abbildung 5).
Abbildung 1: Zerlegung und Verarbeitung des Quadrizepsmuskels. (A) Quadrizeps-Muskel, der vor der Übertragung auf eine 10 cm große Schale frisch seziert und mit PBS vorgespült wurde. 1 ml Beschichtungsmedium wurde für die Verarbeitung überlagert. (B) Quadriceps Muskelgewebestücke nach der Übertragung auf vorbeschichtete 6 cm Platte. (C) 6 cm Platten in der feuchten Kammer vor der Platzierung im 37 °C Inkubator. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Auswuchs von Myoblasten. Auswuchs von Myoblasten von Quadrizeps-Muskelexplantationen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Frühe Passage myoblasts. P0 myoblasts nach Demtransfer und Befestigung an T25 Kolben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Beschichtung und Differenzierung von Primärmyoröhren. (A) Myoblasten einen Tag nach Beginn der Exposition gegenüber Differenzierungsmedien. (B,C) Differenzierte Myotuben fünf (B) oder sechs (C) Tage nach Beginn der Differenzierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Myotuben zur Messung der Sauerstoffverbrauchsraten. Vollständig differenzierte Myotuben fünf Tage nach der Beschichtung von 20.000 Myoblasten in Differenzierungsmedien in jedem Brunnen einer 96-Well-Zellkultur-Mikroplatte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Skelettmuskel ist entscheidend für die Etablierung und Aufrechterhaltung der metabolischen Homöostase11. Die Untersuchung der Muskelphysiologie wird durch interindividuelle Variabilität sowie Schwierigkeiten bei der Gewinnung von Proben, insbesondere bei Studien am Menschen, erschwert. Kultivierte primäre Myotuben haben gezeigt, dass viele Merkmale der Muskelphysiologie zu rekapitulieren, einschließlich Kalziumhomöostase12, Regeneration von geschädigtem Muskelgewebe5, metabolische Veränderungen als Reaktion auf Übung13, und Veränderungen des Stoffwechsels infolge von Krankheiten wie Diabetes14. Primäre Kultur von Myoblasten und Myoröhren von Mäusen ermöglicht die Untersuchung von Muskelzellen mit gut definierten genetischen Manipulationen und ergänzt Studien von Myotuben aus menschlichen Muskelbiopsien12,15 ,16. Daher sind Methoden zur Isolierung und Kultur von Mausprimärmyoblasten und Myoröhren unerlässlich, um eine reproduzierbare Untersuchung der Muskelzellfunktion ex vivo mit hohem Durchsatz zu ermöglichen. Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Etablierung und das Studium von primären Mausmyoblasten und Myotubes unter einer Vielzahl experimenteller Manipulationen.
Während frühere Protokolle die Isolierung von Muskelstammzellen aus Explantkulturen beschrieben haben, bietet dieses Protokoll eine Methode zur erfolgreichen Isolierung von Myoblasten aus mehreren verschiedenen Arten von Muskelgewebe. Darüber hinaus ergibt diese Methode eine signifikant größere Population von Stammzellen für weitere experimentelle Manipulationen. Darüber hinaus wurde diese Methode als differenziertes Myotuben validiert, das Marker von reifen Muskelzellen17ausdrückt und eine normale Physiologie aufweist, wie z. B. zirkadiane Rhythmen17 und mitogenaktivierte Proteinkinase (MAPK) Transduktion18.
Die entscheidenden Schritte im Protokoll sind die Zerlegung und Verarbeitung der Muskelgewebeexplantationen sowie die Vermeidung von Kontaminationen zwischen den Ernten. Es sollte darauf geachtet werden, eine Überverarbeitung des Gewebes zu vermeiden. Während kleinere Muskelstücke eine größere Anzahl von Myoblasten ergeben, könnte ein übermäßiges Schneiden des Muskels ein Auswachsen von Stammzellen verhindern. Während es wichtig ist, die Expflanzen nicht zu vertreiben, sobald sie plattiert sind, ist ein sorgfältiges Waschen der Platten mit PBS/Gentamicin entscheidend für die Verringerung der Kontamination. Geerntete Myoblasten können als P2-Zellen in Kryovials mit einer 10% DMSO/90% Myoblast Media Mischung eingefroren werden. Während Myoblasten nicht bei hoher Dichte gehalten werden müssen, um das Wachstum zu erleichtern, wird empfohlen, dass Zellen bei 40-50% Zusammenfluss eingefroren werden. Typischerweise ergibt ein T75-Kolben 4 Kryovials von Zellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
nichts.
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Matthew Watt von der University of Melbourne und Dr. Anastasia Kralli von der Johns Hopkins University für die Unterstützung bei der Annahme dieses Protokolls auf der Grundlage der Arbeit von Mokbel et al.6. Wir danken auch Dr. Sabine Jordan für die Unterstützung bei der Entwicklung und Annahme dieses Protokolls in unserem Labor. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health R01s DK097164 und DK112927 an K.A.L. finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating Solution: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Collagen | Life Technologies | A1064401 | 1.7 mL |
| Matrigel | Fisher | CB40234A | 1 mL |
| Plating Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Myoblast Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 min |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Differentiation Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Heat Inactivated Horse Serum | Sigma | H1138 | 1.5 mL |
| Insulin-Selenium-Transferrin | Life Technologies | 41400045 | 0.5 mL |
| Other Materials: | |||
| PBS | Gibco | 14040133 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells |
| Forceps | Any | ||
| Razor Blades | Any | ||
| Scissors | Any | ||
| Whatman paper | VWR | 21427-648 | |
| 60 mm plate | VWR | 734-2318 | |
| 10 cm plate | VWR | 25382-428 (CS) | |
| T25 Flasks | ThermoFisher | 156367 | |
| T75 Flasks | ThermoFisher | 156499 | |
| Centrifuge Tubes (15 mL) | BioPioneer | CNT-15 | |
| Oxygen Consumption Rates: | |||
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Seahorse XFe96 Analyzer | Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 96-well plates for use in XFe96 Analyzer |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate | Agilent | 102720-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Palmitic acid | Sigma | P5585-10G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Carnitine | Sigma | C0283-5G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Etomoxir | Sigma | E1905 | for measurement of fatty acid oxidation |
| BSA | Sigma | A7030 | used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation |
References
- Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults. American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).
- Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo. Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).
- Sjøberg, K. A., et al. Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling. Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).
- Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells. Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).
- Smith, J., Merrick, D. Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).
- Mokbel, N., et al. K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity. Brain. 136 (2), 494-507 (2013).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Musarò, A., Carosio, S. Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle. Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).
- Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness. Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).
- Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis. Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).
- Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy. BioMed Research International. , (2015).
- Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).
- Chen, M. B., et al. Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).
- Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. Immortalization of murine muscle cells from lysosomal α-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).
- Varga, B., et al. Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).
- Kriebs, A., et al. Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).
- Cho, Y., et al. Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle. FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).
