Summary
Myoblaster är prolifererande föregångare celler som differentierar för att bilda polynukleerade myotubes och så småningom skelettmuskel myofibers. Här presenterar vi ett protokoll för effektiv isolering och kultur av primära myoblasts från unga vuxna mus skelett muskler. Metoden möjliggör molekylära, genetiska och metaboliska studier av muskelceller i kulturen.
Abstract
Primära myoblasts är odifferentierade prolifererande prekursorer av skelettmuskulaturen. De kan odlas och studeras som muskelprekursorer eller induceras för att differentiera i senare stadier av muskelutveckling. Det protokoll som anges här beskriver en robust metod för isolering och kultur av en mycket proliferativ population av myoblast celler från unga vuxna mus skelettmuskel explants. Dessa celler är användbara för studiet av de metabola egenskaperna hos skelettmuskulaturen i olika möss modeller, liksom i andra nedströms applikationer såsom transfektion med exogent DNA eller transduktion med viral Expression vektorer. Graden av differentiering och metabolisk profil av dessa celler beror på längden av exponeringen, och sammansättningen av de medier som används för att inducera myoblast differentiering. Dessa metoder ger ett robust system för studiet av mus muskel cell metabolism ex vivo. Viktigare, till skillnad från in vivo modeller, de metoder som beskrivs här ger en cellpopulation som kan utökas och studeras med höga nivåer av reproducerbarhet.
Introduction
Medan ofta nämns som en indikation på övergripande metabolisk hälsa, flera studier har visat att body mass index (BMI) hos äldre vuxna är inte konsekvent förknippad med högre risk för dödlighet. Hittills, den enda faktor som visat sig vara förenligt med minskad dödlighet i denna population är ökad muskelmassa1. Muskelvävnad representerar en av de största källorna till insulin känsliga celler i kroppen, och är därför avgörande för upprätthållandet av övergripande metabolisk homeostas2. Aktivering av skelettmuskulaturen vävnad via motion är förknippad med ökningar i både lokal insulinkänslighet och övergripande metabolisk hälsa3. Medan in vivo modeller är viktiga för att studera muskelfysiologi och effekterna av muskelfunktion på integrerad metabolism, primära kulturer av myotubes ger ett tractable system som minskar komplexiteten i djurstudier.
Myoblaster som härrör från postnatal muskler kan användas för att studera effekten av många behandlings-och tillväxtförhållanden på ett mycket reproducerbart sätt. Detta har länge erkänts och flera metoder för myoblast isolering och kultur har beskrivits4,5,6,7,8,9. Några av dessa metoder använder neonatal muskler och avkastning relativt lågt antal myoblasts5,8, kräver flera djur för större skala studier. Också, mest använda metoder för odling myoblaster använder "förplätering" att berika för myoblasts, som är mindre anhängare än andra celltyper. Vi har funnit den alternativa anriknings metoden som beskrivs här för att vara mycket mer effektiv och reproducerbar för berikande en mycket proliferativ myoblast population. Sammanfattnings, detta protokoll möjliggör isolering av mycket proliferativa myoblasts från unga vuxna muskel explants, via utväxt till kultur media. Myoblasts kan skördas upprepade gånger, under flera dagar, snabbt expanderat, och induceras för att differentiera till myotubes. Detta protokoll reproducerbart genererar ett stort antal friska myoblast celler som robust differentiera till spontant ryckningar myotubes. Det har gjort det möjligt för oss att studera metabolism och dygnsrytm i primära myotubes av möss i en mängd olika genotyper. Slutligen, vi inkluderar metoder för att förbereda myotubes för studiet av oxidativ metabolism, med mätningar av syreförbrukning i 96-bra tallrikar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer djurskötsel riktlinjerna för Scripps Research.
1. insamling och bearbetning av muskelvävnad Explants
- Dagen före dissektion, sterilisera alla dissektion utrustning (pincett, rakblad, och sax) och förbereda alla nödvändiga medier: fosfatbuffrad saltlösning (PBS), MB Pläteringsmaterial (12,5 mL av DMEM, 12,5 mL skinka F12, 20 mL Värmeinaktiverade fetalt nötkreatur serum (FBS), 5 mL av fostervatten medel tillägg), och beläggnings lösning (24 mL DMEM, 24 mL skinka F12, 1,7 mL kollagen, 1 mL matrigel).
- Dagen för dissektion, Coat en 6-cm skålen med beläggning lösning för varje muskel som skall dissekeras. Tillsätt 2 mL beläggnings lösning till ytan på varje platta, skaka försiktigt för att skapa en jämn kappa på ytan, och inkubera plattorna med lösning vid 4 ° c i 1 h.
- Ta bort beläggnings lösningen från plattorna och återgå till stamlösningen.
Anmärkning: Beläggnings lösningen kan återanvändas i upp till sex månader och förvaras vid 4 ° c. - Skölj plattorna två gånger med 2 mL PBS för att avlägsna obunden kollagen och matrigel.
- Placera plattorna i en vävnads Kulturinkubator på 37 ° c under dissektioner.
- Förbered en fuktig kammare genom att placera 2-3 ark tjockt absorberande papper i en plastpåse eller en steril 15 cm skål och Använd en pipett för att blöta papperets yta med sterilt vatten.
- Placera kammaren under UV-ljus i 5 min för att sterilisera.
- Dissekera önskade muskler från en 4 till 8-veckors gammal mus. För att sterilisera muskelvävnad, skölj försiktigt i PBS som innehåller 40 μg/mL gentamicin.
Anmärkning: För quadriceps och gastrocnemius muskler, plattan en muskel per tallrik. För soleus, och och EDL, kombinera muskler från båda benen i en tallrik. - Använd sterila tång för att överföra muskeln till en steril 10 cm icke-belagd petriskål. Tillsätt 0,5-1,0 mL Bordsmedia över muskeln så att vävnaden är fuktig men inte flytande (figur 1a).
- Använd en steril skalpell eller rakblad för att försiktigt skära muskeln i små fragment (ca 1-3 mm3).
Anmärkning: Det är viktigt att minimera hanteringen av muskelvävnad för bästa resultat. - Använd pinpett eller en pipett för att överföra muskel fragmenten till ytan på en 6-cm belagd platta. Mycket försiktigt överlagra ytterligare 0,8 mL bordläggningen media över vävnaden. Det bör finnas tillräckligt med media för att hålla vävnads delarna hydrerade men inte flytande (figur 1B).
- Placera 6-cm rätter som innehåller muskel fragment inuti fuktig kammare och återgå till en inkubator (37 ° c, 5% CO2) för 48 h (figur 1C).
Anmärkning: Det är viktigt att muskel fragment följa ytan av plattan för att möjliggöra myoblast utväxt. Flytta inte plattorna/kammaren i minst 48 h. - Efter 48 h, noggrant kontrollera plattorna för att säkerställa att muskel fragment har anslutit sig. Overlay med 2 mL Pläteringsmedia, noga med att inte ta bort fragmenten.
Anmärkning: Om det finns synliga föroreningar eller skräp på plattorna, tvätta försiktigt muskel bitarna. Platta 2 mL PBS/gentamicin lösning vid kanten av plattan och spetsen försiktigt för att tvätta över muskelvävnad. Ta bort PBS och upprepa tvättsteget. Efter den andra tvätten, överlägg 2 mL Bordningsmedia. - Förvara plattorna i 37 ° c inkubator i upp till ytterligare 3 dagar (5 dagar från original dissektion) innan du skördar myoblasts. Kontrollera varannan dag för utväxt av myoblasts.
Anmärkning: Utseendet på celler som växer fram från muskel djur kommer att vara varierande och heterogena. Primära myoblasts visas som små, runda, och ljusa celler. Det är dock varken nödvändigt eller tillförlitligt att identifiera dem genom deras utseende i detta skede (figur 2).
2. skörd outgrowing myoblaster
- Förbered och förvarma myoblast media (17,5 mL DMEM, 17,5 mL skinka F12, 10 mL FBS, 5 mL fostervatten medium tillägg), trypsin, och PBS/gentamicin. Coat en T25 kolv per muskelgrupp som skördas med beläggnings lösning och som beskrivs i steg 1,2 (se tabell 1).
- Ta bort bordläggningen media och skölj försiktigt muskeln djur med 2 ml PBS/gentamicin. Ta snabbt bort PBS (skölj en tallrik i taget och låt inte plattan sitta i PBS i detta steg).
- Tillsätt försiktigt 1 mL PBS/gentamicin och placera plattan i inkubatorn 37 ° c i 1 min.
- Använd en P1000 pipett för att samla PBS/celler i ett 15 mL centrifugerör.
- Tillsätt 1 mL trypsin till plattan och återgå till 37 ° c inkubator i 3 min. Knacka försiktigt plattorna för att avlägsna myoblaster. Samla trypsin/celler och kombinera med PBS-samlingen. Tillsätt 8 mL myoblast-media till centrifugerröret och vänd försiktigt för att blanda.
- Överlägg försiktigt 2 mL Pläteringslösning på muskel plattorna och återvänd till inkubatorn 37 ° c.
- Snurra centrifugrör som innehåller celler i en centrifug i 3 min vid 200 x gram.
- Aspirera supernatanten till ~ 1 mL, är noga med att undvika cellpellet. Tillsätt försiktigt myoblast-media (se tabell 1) och överför cellerna till den förbelagda kolven och placera den i inkubatorn 37 ° c. Detta är P0 skörden. Om det observeras under ett mikroskop, kan det finnas mycket få celler (figur 3).
- Upprepa skörden som beskrivs ovan varannan dag upp till tre gånger. Efter den tredje skörden, kassera explants.
3. expansion och anrikning av prolifererande myoblasts
Anmärkning: P0 skörden kommer att vara heterogena (~ 60% myoblasts). De kommande 2 passager använder PBS för att selektivt skörda myoblasts. Många av de mer anhängare celler kommer att lämnas kvar och snabbt prolifererande myoblasts kommer att vara ≥ 95% ren inom 2 passager. När myoblasts är etablerade, de bör bibehållas vid en låg densitet för att undvika spontan differentiering.
- För varje T25 kolv med ~ 40-50% konfluenta-celler från avsnitt 2, Täck en T75 kolv med 5 ml beläggnings lösning och placera vid 4 ° c i 1-4 h.
- Ta bort beläggnings lösningen från flaskor och återgå till lagerlösning. Skölj kolvar två gånger med 2 mL PBS/gentamicin och placera den i inkubatorn 37 ° c.
- Aspirera media från P0 myoblast T25 kolvar. Skölj cellerna en kort stund med 2 mL varm PBS/gentamicin. Sug upp PBS från kolven.
Anmärkning: Syftet med detta steg (3,3) är att minska risken för bakteriell kontaminering. Om det utförs snabbt och försiktigt, det bör inte resultera i förlust av myoblasts. Det kan utelämnas för att maximera myoblast bevarande om så önskas. - Pipettera över 2 mL varm PBS (inte trypsin) i varje kolv som innehåller myoblaster. Placera kolvar med PBS i 37 ° c inkubator i 3 min.
Anmärkning: Myoblasts bör lätt lossna från flaskor med PBS. Använda PBS snarare än trypsin i detta steg är avgörande för att minska kontaminering av myoblast populationen med andra celltyper. - Ta bort cellerna från inkubatorn 37 ° c och knacka hårt på sidan av kolvar för att lossa cellerna. Kontrollera under ett ljusmikroskop för fritt flytande myoblasts.
- Placera flaskor upprätt i en vävnad kultur huva och skölj botten av kolvar med 10 mL myoblast Media 2-3 gånger för att säkerställa att alla celler är disinges.
- Samla in cell/Media blandningen i en 15 mL Centrifugera röret. Centrifugera i 3 min vid 200 x g.
- Aspirera media till cirka 1 mL, är noga med att undvika cellpelleten. Tillsätt försiktigt en lämplig volym myoblast media för att Centrifugera röret och blanda försiktigt.
- Fördela cell blandningen till nya T75 kolvar. Tillsätt 10 mL myoblast-media till varje ny T75 kolv. Skaka försiktigt flaskorna horisontellt för att fördela cellerna och placera dem i inkubatorn 37 ° c över natten.
- Två dagar senare, passage igen med PBS, dela varje T75 kolv i tre T75 flaskor.
Anmärkning: Låt inte myoblasts att bli mer än 50%-60% confluent, eftersom detta skulle orsaka dem att börja differentiera och förlora prolifaterive kapacitet. - För ytterligare passager, Använd trypsin. Passaging två gånger med PBS ger > 95% myoblasts; försök att ytterligare förbättra renheten tenderar att resultera i sämre differentiering.
4. differentiering av primära myoblasts till Myotubes
- Tallrik P2 (eller senare passage) myoblasts i myoblast media på belagda plattor (se tabell 1 för föreslagna beläggning och plätering volymer och cell nummer). Två eller tre dagar senare, när cellerna är på 70-80% confluency, ändra media till differentiering media (24 mL av DMEM, 24 mL skinka F12, 1,5 mL värme inaktiverat Horse serum, 0,5 mL av insulin-selen-transferrin).
- Ändra differentiering Media varannan dag under differentiering av primära myoblasts i myotubes. Differentiering är typiskt klar för dag 4-5 och kommer att präglas av långsträckt, smält celler som spontant rycka. Utföra experiment på differentierade myotubes inom 6 dagar. Normalt analyseras celler fem eller sex dagar efter initiering av differentiering.
5. mätning av syreförbrukning i myoblasts eller Myotubes i 96-well tallrikar
- Coat 96-bra tallrikar med 25 μL beläggnings lösning per brunn. Centrifugera plattorna vid 58 x g i 1 min för att avlägsna eventuella bubblor.
- Inkubera plattorna i beläggnings lösningen för 1-4 h vid 4 ° c. Använd flerkanalspipett för att ta bort beläggnings lösningen och tvätta tre gånger i 25 μL kallt PBS/gentamicin. Centrifugera minst en av dessa tvättar för att säkerställa att inga bubblor fastnar.
- Tillsätt 40 μL differentierings material till varje brunn. Centrifugera mediet på den belagda plattan utan celler i 1 min vid 58 x g för att undvika bubblor och ta bort ytspänningen för att få ett enhetligt lager av media.
- Lägg till celler suspenderade i ytterligare 40 μL media i varje brunn. Snurra igen på 58 x g.
Anmärkning: Konsistens i plätering är viktigt för bästa resultat och antalet celler pläterade per brunn bör optimeras för varje experimentell installation, och kommer sannolikt att vara i intervallet ~ 10000-25000 myoblaster pläterade i differentiering Media per brunn av en 96-bra tallrik. - Ändra försiktigt mediet dagligen under differentieringen. Inte aspirera medierna utan snarare ta bort den med en pipett, lämnar en liten volym bakom för att undvika att lossa cellerna eller utsätta dem för luften. Ersätt till exempel 50 μL i taget för tre upprepningar i stället för alla 80 μL på en gång.
- Använd 8-15 brunnar per skick. Det kan vara nödvändigt att utelämna vissa brunnar om celler inte utgör ett enhetligt skikt av myotubes.
Anmärkning: Utelämna brunnar på kanterna av plattan eftersom de är mycket mottagliga för avdunstning. Variera plattans inställning för experimentella replikat för att undvika systematiska fel. - Utför önskad analys på differentierade myotubes inom 1-2 dagar efter fullständig differentiering (dag 4-6 från början av differentiering). Rekommenderade instrument och reagenser för mätning av syre förbruknings satser listas i material tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I enlighet med avsnitt 1 i det tillhandahållna protokollet bör primärceller från de växter som kommer att synas under ett vanligt ljusmikroskop (figur 2) ges. En heterogen cellpopulation kommer att ses växa ut ur och runt varje muskelvävnad explant. Myoblasts kommer att visas som små, runda, ljusa sfärer. Efter avsnitt 2 i protokollet kommer att ge tidiga skördar av myoblaster från vävnad explants, som kommer att innehålla några celler och kommer att vara heterogena (figur 3). Avsnitt 3 i protokollet beskriver passaging tidiga skördar med PBS (snarare än trypsin), som kommer att ge en relativt ren population av myoblasts för ytterligare odling. Efter avsnitt 4 i protokollet kommer att ge helt differentierade myotubes för ytterligare experimentell manipulation. Differentiering av myoblaster tar vanligtvis 4-6 dagar, under vilken morfologin av cellerna kommer att förändras från enstaka, runda sfärer till långsträckta, smält, långa flerkärniga fibrer (figur 4). Efter avsnitt 5 i protokollet kommer att producera differentierade myotubes i 96-väl plattor för att möjliggöra en mängd olika metaboliska karakteriseringar baserat på förändringar i syreförbrukning och extracellulär syrning priser10 (figur 5).
Figur 1: dissektion och bearbetning av quadriceps muskler. (A) quadriceps muskel som har nyligen dissekeras och sköljs med PBS före överföring till en 10 cm skålen. 1 mL bordningsmedia har överlagts för bearbetning. (B) quadriceps muskelvävnad bitar efter överföring till pre-belagda 6 cm plattan. C) 6 cm plattor inuti fuktig kammare före placeringen i inkubatorn 37 ° c. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: utväxt av myoblasts. Utväxt av myoblasts från quadriceps muskel explants. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: tidiga passage myoblasts. P0 myoblaster efter överföring och fastsättning på T25 kolv. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: plätering och differentiering av primära myotubes. A) myoblaster en dag efter påbörjad exponering för Differentieringsmedia. (B, C) Differentierade myotubes fem (B) eller sex (C) dagar efter initiering av differentiering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Myotubes redo för mätning av syre förbruknings satser. Helt differentierade myotubes fem dagar efter plätering 20 000 myoblaster i differentiering media i varje brunn av en 96-brunn cellkultur Microplate. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Skelettmuskulaturen är avgörande för upprättande och underhåll av metabolisk homeostas11. Studiet av muskelfysiologi kompliceras av interindividuell variabilitet, samt svårighet att få prover, särskilt när det gäller humanstudier. Odlade primära myotubes har visat sig recapitulate många funktioner i muskelfysiologi, inklusive kalcium homeostas12, förnyelse av skadad muskelvävnad5, metaboliska förändringar som svar på övning13, och förändringar av metabolism till följd av sjukdomar som diabetes14. Primärkulturen av myoblaster och myotubes från möss möjliggör utredning av muskelceller hyser väl definierade genetiska manipulationer, och ger ett komplement till studier av myotubes härrör från mänskliga Muskelbiopsier12,15 ,16. Därför, metoder för isolering och kultur av mus primära myoblaster och myotubes är viktiga för att möjliggöra reproducerbara, hög genomströmning utredning av muskel cell funktion ex vivo. Det protokoll som beskrivs här möjliggör etablering och studier av primära mus myoblasts och myotubes under en mängd experimentella manipulationer.
Medan tidigare protokoll har beskrivit isolering av muskelstamceller från explantat kulturer, detta protokoll ger en metod för en lyckad isolering av myoblasts från flera olika typer av muskelvävnad. Dessutom ger denna metod en betydligt större population av stamceller för vidare experimentell manipulation. Vidare, denna metod har validerats som ger differentierade myotubes att uttrycka markörer för mogna muskelceller17, och uppvisar normal fysiologi, såsom dygnsrytm17 och mitogen aktiverat proteinkinas (MAPK) signal transduktion18.
De kritiska stegen i protokollet är dissektion och bearbetning av muskelvävnad explants, samt undvikande av kontaminering mellan skördningar. Försiktighet bör iakttas för att undvika Överbearbetning av vävnaderna. Medan mindre bitar av muskler avkastning större antal myoblasts, överdriven kapning av muskeln kan förhindra stamcells utväxt. Även om det är viktigt att inte ta bort de djur när de är pläterade, noggrann tvättning av plattorna med PBS/gentamicin är avgörande för att minska kontaminering. Skördade myoblaster kan frysas som P2 celler i kryovials med hjälp av en 10% DMSO/90% myoblast Media blandning. Medan myoblasts inte behöver underhållas på en hög densitet för att underlätta tillväxten, det rekommenderas att cellerna fryses vid 40-50% Confluence. Vanligtvis ger en T75 kolv 4 kryovials av celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma för Dr Matthew watt vid University of Melbourne och Dr Anastasia Kralli vid Johns Hopkins University för att få hjälp med att anta detta protokoll baserat på arbetet i Mokbel et al.6. Vi tackar också Dr Sabine Jordan för hjälp att utveckla och anta detta protokoll i vårt laboratorium. Detta arbete finansierades av National Institutes of Health R01s DK097164 och DK112927 till K.A.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating Solution: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Collagen | Life Technologies | A1064401 | 1.7 mL |
| Matrigel | Fisher | CB40234A | 1 mL |
| Plating Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Myoblast Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 min |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Differentiation Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Heat Inactivated Horse Serum | Sigma | H1138 | 1.5 mL |
| Insulin-Selenium-Transferrin | Life Technologies | 41400045 | 0.5 mL |
| Other Materials: | |||
| PBS | Gibco | 14040133 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells |
| Forceps | Any | ||
| Razor Blades | Any | ||
| Scissors | Any | ||
| Whatman paper | VWR | 21427-648 | |
| 60 mm plate | VWR | 734-2318 | |
| 10 cm plate | VWR | 25382-428 (CS) | |
| T25 Flasks | ThermoFisher | 156367 | |
| T75 Flasks | ThermoFisher | 156499 | |
| Centrifuge Tubes (15 mL) | BioPioneer | CNT-15 | |
| Oxygen Consumption Rates: | |||
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Seahorse XFe96 Analyzer | Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 96-well plates for use in XFe96 Analyzer |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate | Agilent | 102720-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Palmitic acid | Sigma | P5585-10G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Carnitine | Sigma | C0283-5G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Etomoxir | Sigma | E1905 | for measurement of fatty acid oxidation |
| BSA | Sigma | A7030 | used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation |
References
- Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults. American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).
- Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo. Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).
- Sjøberg, K. A., et al. Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling. Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).
- Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells. Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).
- Smith, J., Merrick, D. Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).
- Mokbel, N., et al. K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity. Brain. 136 (2), 494-507 (2013).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Musarò, A., Carosio, S. Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle. Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).
- Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness. Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).
- Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis. Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).
- Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy. BioMed Research International. , (2015).
- Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).
- Chen, M. B., et al. Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).
- Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. Immortalization of murine muscle cells from lysosomal α-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).
- Varga, B., et al. Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).
- Kriebs, A., et al. Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).
- Cho, Y., et al. Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle. FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).
