Summary
Myoblasts er voksende forløper celler som skiller å danne polynucleated myotubes og eventuelt skjelettlidelser muskel myofibers. Her presenterer vi en protokoll for effektiv isolering og kultur av primær myoblasts fra unge voksne mus skjelett muskler. Metoden muliggjør molekylær, genetisk, og metabolske studier av muskelceller i kulturen.
Abstract
Primær myoblasts er udifferensierte voksende forløpere for skjelettlidelser muskel. De kan være kultivert og studert som muskel forløpere eller indusert å differensiere i senere stadier av muskelutvikling. Protokollen gitt her beskriver en robust metode for isolering og kultur av en svært proliferativ befolkning på myoblast celler fra unge voksen mus Skjelettmuskel explants. Disse cellene er nyttige for studiet av metabolske egenskaper av skjelettmuskulatur av forskjellige musemodeller, så vel som i andre nedstrøms applikasjoner som transfeksjoner med eksogene DNA eller Transduction med viral uttrykk vektorer. Nivået av differensiering og metabolsk profil av disse cellene avhenger av lengden på eksponering, og sammensetningen av mediene som brukes til å indusere myoblast differensiering. Disse metodene gir et robust system for studiet av mus muskel celle metabolisme ex vivo. I motsetning til in vivo-modeller, er metodene beskrevet her gir en celle befolkning som kan utvides og studert med høye nivåer av reproduserbarhet.
Introduction
Mens ofte sitert som en indikasjon på total metabolsk helse, har flere studier vist at Body Mass Index (BMI) hos eldre voksne er ikke konsekvent forbundet med høyere risiko for dødelighet. Hittil, den eneste faktoren vist å være forenlig med redusert dødelighet i denne populasjonen er økt muskel masse1. Muskel vev representerer en av de største kildene til insulin-sensitive celler i kroppen, og er derfor kritisk i vedlikehold av samlede metabolske homeostase2. Aktivering av skjelettlidelser muskel vev via trening er forbundet med økninger i både lokale insulinfølsomhet og generell metabolsk helse3. Mens in vivo-modeller er avgjørende for å studere muskel fysiologi og virkningen av muskel funksjon på integrert metabolisme, primære kulturer av myotubes gi et medgjørlig system som reduserer kompleksiteten av dyrestudier.
Myoblasts avledet fra post-Natal muskler kan brukes til å studere virkningen av en rekke behandling og vekstforhold i en svært reproduserbar måte. Dette har lenge vært anerkjent og flere metoder for myoblast isolasjon og kultur har blitt beskrevet4,5,6,7,8,9. Noen av disse metodene bruker nyfødte muskler og gir relativt lavtantall myoblasts,som krever flere dyr for større skala studier. Også mest brukte metoder for dyrking myoblasts bruke "pre-plating" for å berike for myoblasts, som er mindre tilhenger enn andre celletyper. Vi har funnet den alternative berikelse metoden beskrevet her for å være mye mer effektiv og reproduserbar for berikende en svært proliferativ myoblast befolkning. Oppsummert muliggjør denne protokollen isolering av svært proliferativ myoblasts fra unge voksne muskel explants, via utvekst til kultur medier. Myoblasts kan høstes gjentatte ganger, over flere dager, raskt utvidet, og indusert å differensiere til myotubes. Denne protokollen reproduserbar genererer et stort antall sunne myoblast celler som robust differensiere til spontant rykninger myotubes. Det har gjort det mulig for oss å studere metabolisme og døgnrytme i primær myotubes av mus av en rekke genotyper. Til slutt inkluderer vi metoder for å utarbeide myotubes for studiet av oksidativt metabolisme, ved bruk av målinger av oksygen forbruks rater i 96 brønn plater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen følger dyre omsorgen retningslinjer for Scripps Research.
1. innsamling og bearbeiding av muskel vev Explants
- Dagen før disseksjon, sterilisere alt disseksjon utstyr (pinsett, barberblad og saks) og forberede alle nødvendige medier: fosfat bufret saltvann (PBS), MB plating Media (12,5 mL DMEM, 12,5 mL av SKINKE F12, 20 mL av varme-deaktivert fosterets storfe serum (FBS), 5 mL fostervann væske medium supplement), og coating løsning (24 mL DMEM, 24 mL SKINKE F12, 1,7 mL kollagen, 1 mL matrigel).
- Dagen disseksjon, pels en 6 cm parabolen med coating løsning for hver muskel å være dissekert. Tilsett 2 mL coating-løsning på overflaten av hver plate, rist forsiktig for å lage en jevn pels på overflaten, og ruge platene med oppløsning ved 4 ° c for 1 time.
- Fjern coating løsning fra platene og gå tilbake til lagerløsning.
Merk: Coating Solution kan gjenbrukes i opptil seks måneder og bør oppbevares ved 4 ° c. - Skyll platene to ganger med 2 mL PBS for å fjerne ubundet kollagen og matrigel.
- Plasser platene i en 37 ° c vev kultur inkubator under dissections.
- Forbered et fuktig kammer ved å plassere 2-3 ark med tykt absorberende papir i en plastpose eller en steril 15 cm parabol og bruk en pipette for å fukte overflaten av papiret med sterilt vann.
- Plasser kammeret under UV-lys i 5 min for å sterilisere.
- Analysere ønsket musklene fra en 4 til 8-ukers gammel mus. For å sterilisere muskel vev, skyll forsiktig i PBS som inneholder 40 μg/mL Gentamicin.
Merk: For quadriceps og gastrocnemius muskler, plate en muskel per plate. For soleus, plantaris og EDL, kombinere muskler fra begge bena i en tallerken. - Bruk steril tang for å overføre muskelen til en steril 10 cm ikke-belagt Petri parabolen. Tilsett 0,5-1,0 mL plating Media over muskelen slik at vevet er fuktig, men ikke flytende (figur 1a).
- Bruk en steril skalpell eller barberblad til å forsiktig skjære muskelen i små fragmenter (ca. 1-3 mm3).
Merk: Det er viktig å minimere håndtering av muskel vev for best resultat. - Bruk pinsett eller en pipette for å overføre muskel fragmenter på overflaten av en pre-belagt 6 cm plate. Veldig forsiktig overlappe en ekstra 0,8 mL av plating Media over vevet. Det bør være nok Media til å holde vevet brikkene hydrert, men ikke flytende (figur 1B).
- Plasser 6-cm retter som inneholder muskel fragmenter inne i fuktig kammer og gå tilbake til en inkubator (37 ° c, 5% CO2) for 48 h (figur 1c).
Merk: Det er viktig at muskel fragmenter holder seg til overflaten av platen for å muliggjøre myoblast utvekst. Ikke Flytt platene/kammeret i minst 48 h. - Etter 48 h, nøye sjekke platene for å sikre at muskel fragmenter har levd. Overlegg med 2 mL plating Media, ta vare ikke å løsne fragmenter.
Merk: Hvis det er synlig forurensning eller rusk på platene, forsiktig vaske muskelen stykker. Plate 2 mL PBS/Gentamicin løsning på kanten av platen og spissen forsiktig å vaske over muskel vev. Fjern PBS og gjenta vaske trinnet. Etter den andre vasken, overlegg 2 mL av plating Media. - Oppbevar platene i 37 ° c inkubator i opptil ytterligere 3 dager (5 dager fra original disseksjon) før høsting av myoblasts. Sjekk annenhver dag for utvekst av myoblasts.
Merk: Utseendet av celler som dukker opp fra muskel explants vil være variabel og heterogen. Primær myoblasts vises som små, runde og lyse celler. Det er imidlertid verken nødvendig eller pålitelig å identifisere dem ved deres opptreden på dette stadiet (figur 2).
2. høsting outgrowing Myoblasts
- Forbered og pre-Warm Myoblast Media (17,5 mL DMEM, 17,5 mL av SKINKE F12, 10 mL FBS, 5 mL fostervann væske medium supplement), Trypsin, og PBS/Gentamicin. Coat en T25 kolbe per muskel gruppe høstes med coating Solution og som beskrevet i trinn 1,2 (se tabell 1).
- Fjern plating Media og forsiktig skyll muskel explants med 2 mL PBS/Gentamicin. Raskt fjerne PBS (skyll en tallerken om gangen og ikke la platen sitte i PBS på dette trinnet).
- Tilsett 1 mL PBS/Gentamicin forsiktig og Plasser platen i 37 ° c inkubator i 1 min.
- Bruk en P1000 pipette for å samle PBS/celler i et 15 mL sentrifugerør.
- Tilsett 1 mL Trypsin til platen og gå tilbake til 37 ° c inkubator i 3 min. Trykk forsiktig på platene for å løsne myoblasts. Samle Trypsin/celler og Kombiner med PBS samlingen. Tilsett 8 mL Myoblast Media til sentrifuge røret og Vend forsiktig for å mikse.
- Forsiktig overlegg 2 mL plating løsning på muskel platene og gå tilbake til 37 ° c inkubator.
- Snurr sentrifuge rørene som inneholder celler i en sentrifuge for 3 min ved 200 x g.
- Aspirer supernatanten til ~ 1 mL, pass på å unngå celle pellet. Forsiktig legge Myoblast Media (se tabell 1) og overføre cellene til pre-belagt kolbe og plass i 37 ° c inkubator. Dette er p0 innhøstingen. Hvis observert under et mikroskop, kan det være svært få celler (Figur 3).
- Gjenta innhøstingen beskrevet ovenfor annenhver dag opptil tre ganger. Etter den tredje innhøstingen, kast explants.
3. ekspansjon og berikelse av voksende Myoblasts
Merk: Den p0 innhøstingen vil være heterogen (~ 60% myoblasts). De neste 2 passasjer bruker PBS å selektivt høste myoblasts. Mange av de mer tilhenger cellene vil bli liggende igjen og den raskt voksende myoblasts vil være ≥ 95% ren innen 2 passasjer. Når myoblasts er etablert, bør de opprettholdes ved lav tetthet for å unngå spontan differensiering.
- For hver T25 kolbe av ~ 40-50% confluent celler fra § 2, frakk en T75 kolbe med 5 mL av belegg Solution og sted ved 4 ° c for 1-4 h.
- Fjern coating løsning fra flaskene og gå tilbake til lagerløsning. Skyll flaskene to ganger med 2 mL PBS/Gentamicin og plasser i 37 ° c inkubator.
- Aspirer mediene fra p0 myoblast T25 flasker. Skyll cellene kort med 2 mL varm PBS/Gentamicin. Aspirer PBS fra flasken.
Merk: Formålet med dette trinnet (3,3) er å redusere muligheten for bakteriell forurensning. Hvis det utføres raskt og forsiktig, bør det ikke føre til tap av myoblasts. Det kan utelates for å maksimere myoblast bevaring hvis ønskelig. - Pipetter 2 mL varm PBS (ikke Trypsin) i hver kolbe som inneholder myoblasts. Plasser flaskene med PBS i 37 ° c inkubator i 3 min.
Merk: Myoblasts bør enkelt løsne fra kanner med PBS. Bruk av PBS i stedet for Trypsin på dette trinnet er avgjørende for å redusere forurensning av myoblast befolkningen med andre celletyper. - Fjern cellene fra 37 ° c inkubator og fast trykk side av flaskene for å løsne cellene. Sjekk under et lett mikroskop for fritt flytende myoblasts.
- Plasser flaskene oppreist i en vev kultur hette og skyll bunnen av flaskene med 10 mL Myoblast Media 2-3 ganger for å sikre at alle cellene er forskyves.
- Samle inn celle-/medie blandingen i et 15 mL sentrifugerør. Sentrifuger for 3 min ved 200 x g.
- Aspirer mediene til rundt 1 mL, være forsiktig for å unngå celle pellet. Legg forsiktig et passende volum av Myoblast Media til sentrifuger tube og bland forsiktig.
- Distribuer celle blandingen til nye T75 flasker. Tilsett 10 mL Myoblast Media til hver nye T75 kolbe. Rist flaskene forsiktig horisontalt for å fordele cellene og plasser dem i 37 ° c inkubator over natten.
- To dager senere, passasje igjen med PBS, splitting hver T75 kolbe i tre T75 flasker.
Merk: Ikke la myoblasts til å bli mer enn 50%-60% confluent, da dette ville føre dem til å begynne å skille og miste prolifaterive kapasitet. - For ytterligere passasjer, bruk Trypsin. Passaging to ganger med PBS gir > 95% myoblasts; forsøk på å ytterligere forbedre renheten har en tendens til å resultere i dårligere differensiering.
4. differensiering av primær Myoblasts til Myotubes
- Plate P2 (eller senere passasje) myoblasts i Myoblast Media på belagte plater (se tabell 1 for forslag til coating og plating volumer og celle tall). To eller tre dager senere, når cellene er på 70-80% confluency, endre Media til differensiering Media (24 mL DMEM, 24 mL av SKINKE F12, 1,5 mL varme deaktivert hest serum, 0,5 mL insulin-selen-transferrin).
- Endre differensiering Media annenhver dag under differensiering av primære myoblasts i myotubes. Differensiering er vanligvis fullført av dag 4-5 og vil bli preget av langstrakte, smeltet celler som spontant trekning. Utfør eksperimenter på differensiert myotubes innen 6 dager. Vanligvis celler er analyseres fem eller seks dager etter initiering differensiering.
5. måling oksygenforbruk rate i Myoblasts eller Myotubes i 96-brønn plater
- Coat 96-brønn plater med 25 μL belegg løsning per brønn. Sentrifuger platene på 58 x g i 1 min for å fjerne eventuelle bobler.
- Ruge platene i belegg løsning for 1-4 h ved 4 ° c. Bruk flerkanals pipette for å fjerne malings oppløsningen og vask tre ganger i 25 μL av kald PBS/Gentamicin. Sentrifuger minst en av disse vasker for å sikre at ingen bobler er fanget.
- Tilsett 40 μL av differensiering Media til hver brønn. Sentrifuger mediene på belagt plate uten celler i 1 min ved 58 x g for å unngå bobler og fjerne overflatespenning for å få et ensartet lag av Media.
- Legg til celler suspendert i ytterligere 40 μL av medier til hver brønn. Spinn igjen på 58 x g.
Merk: Konsistens i plating er viktig for best resultat og antall celler belagt per brønn bør være optimalisert for hver eksperimentell oppsett, og vil trolig være i størrelsesklasse ~ 10000-25000 myoblasts belagt i differensiering Media per brønn av en 96-brønn plate. - Forsiktig endre Media daglig under differensiering. Ikke aspirer Media, men heller fjerne den med en pipette, etterlot et lite volum bak for å unngå dislodging cellene eller utsette dem for luft. Erstatt for eksempel 50 μL om gangen i tre repetisjoner i stedet for alle 80 μL samtidig.
- Bruk 8-15 brønner per betingelse. Det kan være nødvendig å utelate noen brønner Hvis celler ikke danner et ensartet lag med myotubes.
Merk: Utelat brønner på kantene av platen fordi de er svært mottakelige for fordampning. Varier plate oppsettet for eksperimentelle replikerer for å unngå systematiske feil. - Utfør ønsket analysen på differensiert myotubes innen 1-2 dager med full differensiering (dag 4-6 fra starten av differensiering). Anbefalte instrumenter og reagenser for måling av oksygen forbruks rater er listet opp i materialfortegnelsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter § 1 i den oppgitte protokollen skal gi primære celler dukker opp fra explants som vil være synlig under et standard lys mikroskop (figur 2). En heterogen celle befolkning vil bli sett vokser ut av og rundt hver muskel vev explant. Myoblasts vises som små, runde, lyse kuler. Etter § 2 i protokollen vil gi tidlige avlinger av myoblasts fra vev explants, som vil inneholde noen celler og vil være heterogen (Figur 3). § 3 i protokollen beskriver passaging tidlige avlinger med PBS (snarere enn Trypsin), som vil gi en relativt ren befolkning på myoblasts for videre dyrking. Etter § 4 i protokollen vil gi fullt differensiert myotubes for videre eksperimentell manipulasjon. Differensiering av myoblasts vanligvis tar 4-6 dager, der morfologi av cellene vil endre fra enkle, runde kuler til langstrakt, smeltet, lange multinucleated fibre (Figur 4). Etter § 5 i protokollen vil produsere differensiert myotubes i 96-brønn plater for å muliggjøre en rekke metabolske characterizations basert på endringer i oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring priser10 (figur 5).
Figur 1: disseksjon og bearbeiding av quadriceps muskel. (A) quadriceps muskel som har blitt fersk dissekert og SKYLLES med PBS før overføring til en 10 cm parabol. 1 mL plating Media har vært overlappet for behandling. (B) quadriceps muskel vev brikker etter overføring til pre-belagt 6 cm plate. (C) 6 cm plater inne i fuktig kammer før plassering i 37 ° c inkubator. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: utvekst av myoblasts. Utvekst av myoblasts fra quadriceps muskel explants. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: tidlig passasje myoblasts. P0 myoblasts etter overføring og feste til T25 kolbe. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: plating og differensiering av primær myotubes. (A) Myoblasts en dag etter igangsetting eksponering for differensiering Media. (B, C) Differensiert myotubes fem (B) eller seks (C) dager etter initiering differensiering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Myotubes klar for måling av oksygen forbruks rater. Fullt differensiert myotubes fem dager etter plating 20 000 myoblasts i differensiering Media i hver brønn av en 96-brønn cellekultur mikroplate. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Skjelettmuskel er avgjørende for etablering og vedlikehold av metabolske homeostase11. Studiet av muskel fysiologi er komplisert ved interindividuelle variasjon, så vel som vanskeligheter med å skaffe prøver, spesielt i tilfelle av menneskelige studier. Kultivert primære myotubes har vist å recapitulate mange funksjoner i muskel fysiologi, inkludert kalsium homeostase12, regenerering av skadede muskel vev5, metabolske forandringer som svar på øvelse13, og endringer i stoffskiftet som følge av sykdommer som diabetes14. Primær kultur myoblasts og myotubes fra mus muliggjør gransking av muskelceller harboring godt definerte genetiske manipulasjoner, og gir et supplement til studier av myotubes avledet fra menneskelig muskel biopsier12,15 ,16. Derfor metoder for isolasjon og kultur av mus primære myoblasts og myotubes er avgjørende for å muliggjøre reproduserbar, høy gjennomstrømming undersøkelse av muskel celle funksjon ex vivo. Protokollen er beskrevet her gir mulighet for etablering og studier av primær mus myoblasts og myotubes under en rekke eksperimentelle manipulasjoner.
Mens tidligere protokoller har beskrevet isolering av muskel stamceller fra explant kulturer, denne protokollen gir en metode for vellykket isolering av myoblasts fra flere ulike typer muskel vev. I tillegg gir denne metoden en betydelig større befolkning på stamceller for videre eksperimentell manipulasjon. Videre har denne metoden blitt validert som gir differensiert myotubes som uttrykker markører for modne muskelceller17, og viser normal fysiologi, slik som døgn rytmer17 og mitogen aktivert protein kinase (MAPK) signal Transduction18.
De kritiske trinnene i protokollen er disseksjon og behandling av muskel vev explants, samt unngåelse av forurensning mellom avlinger. Forsiktighet bør utvises for å unngå over-prosessering av vev. Mens mindre biter av muskel yield større antall myoblasts, overdreven skjæring av muskelen kunne hindre stilk cellen utvekst. Mens det er viktig å ikke løsne explants når de er belagt, er forsiktig vasking av platene med PBS/Gentamicin avgjørende for å redusere forurensning. Høstet myoblasts kan fryses som P2 celler i cryovials ved hjelp av en 10% DMSO/90% Myoblast Media blanding. Mens myoblasts ikke trenger å bli opprettholdt på en høy tetthet for å lette veksten, er det anbefalt at cellene er frosset på 40-50% samløpet. Vanligvis gir en T75 kolbe 4 cryovials av celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlige for Dr. Matthew watt ved University of Melbourne og Dr. Anastasia Kralli ved Johns Hopkins University for hjelp til å vedta denne protokollen basert på arbeidet til Mokbel et al.6. Vi takker også Dr. Sabine Jordan for assistanse utvikle og vedta denne protokollen i laboratoriet vårt. Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health R01s DK097164 og DK112927 til K.A.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coating Solution: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Collagen | Life Technologies | A1064401 | 1.7 mL |
| Matrigel | Fisher | CB40234A | 1 mL |
| Plating Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Myoblast Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 min |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Differentiation Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Heat Inactivated Horse Serum | Sigma | H1138 | 1.5 mL |
| Insulin-Selenium-Transferrin | Life Technologies | 41400045 | 0.5 mL |
| Other Materials: | |||
| PBS | Gibco | 14040133 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells |
| Forceps | Any | ||
| Razor Blades | Any | ||
| Scissors | Any | ||
| Whatman paper | VWR | 21427-648 | |
| 60 mm plate | VWR | 734-2318 | |
| 10 cm plate | VWR | 25382-428 (CS) | |
| T25 Flasks | ThermoFisher | 156367 | |
| T75 Flasks | ThermoFisher | 156499 | |
| Centrifuge Tubes (15 mL) | BioPioneer | CNT-15 | |
| Oxygen Consumption Rates: | |||
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Seahorse XFe96 Analyzer | Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 96-well plates for use in XFe96 Analyzer |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate | Agilent | 102720-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Palmitic acid | Sigma | P5585-10G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Carnitine | Sigma | C0283-5G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Etomoxir | Sigma | E1905 | for measurement of fatty acid oxidation |
| BSA | Sigma | A7030 | used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation |
References
- Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults. American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).
- Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo. Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).
- Sjøberg, K. A., et al. Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling. Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).
- Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells. Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).
- Smith, J., Merrick, D. Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).
- Mokbel, N., et al. K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity. Brain. 136 (2), 494-507 (2013).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Musarò, A., Carosio, S. Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle. Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).
- Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness. Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).
- Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis. Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).
- Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy. BioMed Research International. , (2015).
- Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).
- Chen, M. B., et al. Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).
- Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. Immortalization of murine muscle cells from lysosomal α-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).
- Varga, B., et al. Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).
- Kriebs, A., et al. Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).
- Cho, Y., et al. Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle. FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).
