Summary
Внеклеточные матричные лиганды могут быть узорчатына на гидрогели полиакриламид, чтобы культура эмбриональных стволовых клеток человека в ограниченных колониях на совместимых субстратах. Этот метод может быть объединен с микроскопией силы тяги и биохимическими анализами для изучения взаимодействия между геометрией тканей, силами, генерируемыми клетками, и спецификацией судьбы.
Abstract
Эмбриональные стволовые клетки человека демонстрируют уникальную способность реагировать на морфогены в пробирке самоорганизующиеся модели спецификации судьбы клеток, которые соответствуют первичному образованию зародышевого слоя во время эмбриогенеза. Таким образом, эти клетки представляют собой мощный инструмент для изучения механизмов, которые управляют ранним развитием человека. Мы разработали метод культуры эмбриональных стволовых клеток человека в замкнутых колониях на совместимых субстратах, который обеспечивает контроль как над геометрией колоний, так и над их механической средой, чтобы резюмировать физические параметры, которые в основе эмбриогенеза. Ключевой особенностью этого метода является способность генерировать гидрогели полиакриламид с определенными паттернами внеклеточного матричного лиганда на поверхности для содействия вложению клеток. Это достигается путем изготовления трафаретов с желаемыми геометрическими узорами, использования этих трафаретов для создания узоров внеклеточного матричного лиганда на стеклянных крышках, и переноса этих узоров на гидрогели полиакриламидов во время полимеризации. Этот метод также совместим с микроскопией силы тяги, что позволяет пользователю измерять и картировать распределение клеточных сил в пределах ограниченных колоний. В сочетании со стандартными биохимическими анализами, эти измерения могут быть использованы для изучения роли механических сигналов в спецификации судьбы и морфогенеза в начале человеческого развития.
Introduction
Эмбриональные стволовые клетки человека (HESCs) имеют большие перспективы для использования в регенеративной медицине и применениях тканей. Плюрипотентная природа этих клеток дает им возможность дифференцироваться в любой тип клеток взрослого. Хотя большие успехи были сделаны в направлении судьба hESCs к конкретным типам клеток, она остается очень трудно генерировать целые ткани или органы de novo1,2,3,4, 5. Это в значительной степени объясняется ограниченным пониманием механизмов, которые приводят к образованию этих тканей в процессе развития человека. Для того, чтобы восполнить этот пробел в знаниях, в последние годы появился ряд методов моделирования раннего эмбриона и последующих стадий развития с эмбриональными стволовыми клетками6,7,8,9 ,10,11,12,13.
Вскоре после получения первых линий hESC14, было продемонстрировано, что эмбриональные тела, образованные из hESCs были способны спонтанно производить клетки из трех основных слоев зародыша6. Однако из-за присущего ему отсутствия контроля над размером и морфологией эмбриональных тел организация зародышевых слоев значительно изменилась и не соответствовала организации раннего эмбриона. Совсем недавно, Warmflash и др. разработали метод, чтобы ограничить колонии hESCs на стеклянных субстратов через микропаттернинг, обеспечивая контроль и согласованность над размером и геометрией колоний8. В присутствии BMP4, важного морфогена в раннем развитии, эти замкнутые колонии были способны самоорганизовать воспроизводимые модели спецификации к судьбам, представляющим первичные слои микробов. Хотя это дало полезную модель для изучения механизмов, с помощью которых устанавливаются первичные слои микробов, модели спецификации судьбы точно не соответствовали организации и морфогенезу, наблюдаемым во время эмбриогенеза15. Более верный повторение раннего эмбрионального развития было достигнуто путем встраивания hESCs в трехмерную внеклеточную матрицу (ECM) матригель11, обеспечивая на сегодняшний день убедительные доказательства способности ГССК самоорганизоваться и моделировать ранних стадиях эмбриогенеза ex vivo. Однако этот метод дает противоречивые результаты и, таким образом, несовместим с рядом анализов, которые могут быть использованы для выявления основополагающих механизмов самоорганизации и спецификации судьбы.
Учитывая эти существующие методы и их соответствующие ограничения, мы стремились разработать метод воспроизводства колоний hESC определенных геометрий в условиях, которые моделируют внеклеточной среды раннего эмбриона. Для этого мы использовали гидрогели полиакриламидового упругости для управления механическими свойствами субстрата. Используя атомную силовую микроскопию на куриных эмбрионах на стадии гастрирования, мы обнаружили, что эластичность эпибласта варьировалась от сотен паскалей до нескольких килопаскалей. Таким образом, мы сосредоточились на генерации гидрогелей полиакриламидов с эластичностью в этом диапазоне, чтобы служить в качестве субстрата для колоний HESC. Мы модифицировали наши предыдущие методы культивирования ГЭС на полиакриламидных гидрогелях7,9, чтобы обеспечить надежный контроль над геометрией колоний. Мы достигли этого путем первого узора ECM лиганды, а именно matrigel, на стеклянные крышки через микрофабрикаты трафаретов, как ранее сообщалось16. Затем мы разработали новую технику для переноса узорчатого лиганда на поверхность гидрогелей полиакриламидов во время полимеризации. Метод, который мы описываем здесь включает в себя использование фотолитографии для изготовления кремниевой пластины с желаемыми геометрическими узорами, создание марок диссертаций геометрических особенностей с полидиметилсилоксаном (PDMS), и с помощью этих марок для создания трафаретов, которые в конечном счете позволяют узор лиганда на поверхность стеклянных покрывающих и переносить на полиакриламид.
В дополнение к повторению механической среды раннего эмбриона, ограничение hESC колоний на полиакриламид позволяет измерения клеточных сил с помощью маслечной микроскопии силы (TFM), как сообщалось в нашем предыдущем методе9. Короче говоря, флуоресцентные бусы могут быть встроены в полиакриламид и использоваться в качестве фидуциальных маркеров. Силы, генерируемые клетками, рассчитываются путем визуализации смещения этих бусин после посева hESCs на узорчатый субстрат. Кроме того, полученные карты силы тяги могут быть объединены с традиционными анализами, такими как иммуностогирование, для изучения того, как распределение клеточных сил в замкнутых колониях HESC может регулировать или модулировать вниз по течению сигнализации. Мы ожидаем, что эти методы покажут, что механические силы играют важную роль в моделиции спецификации судьбы клеток во время раннего эмбрионального развития, которое в настоящее время упускается из виду.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь, относящиеся к использованию hESCs были одобрены человека Gamete, эмбрионов и стволовых клеток исследований (GESCR) Комитета в Университете Калифорнии в Сан-Франциско.
1. Приготовление кремниевой пластины с геометрическими особенностями
- Создайте фотомаску с желаемыми геометрическими особенностями. Используйте программное обеспечение для разработки функций с помощью компьютера. Для использования с отрицательным фоторезис, сделать функции непрозрачными и оставшуюся часть маски прозрачной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для узора на 18 мм диаметр охватывает, групповые функции для каждого экспериментального состояния в 10 х 10 мм областях для обеспечения трафаретов, генерируемых в шаге 3 подходят на крышки. - Спин пальто отрицательное фотоустойчивость на 100 мм кремниевой пластины. Используйте лист данных photoresist для определения скорости и длины вращения для создания толщины пленки 100-250 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина пленки должна быть скорректирована таким образом, чтобы соотношение сторон ширины узоров к высоте трафарета было максимально приближено к 1:1. Тем не менее, мы рекомендуем минимальную толщину 100 мкм, так как все меньше производит деликатные трафареты, которые легко рвутся. - Обработка фотоустойчивость в соответствии с листом данных продукта. Это обычно включает в себя мягкую выпечку, УФ-экспозицию с фотома-маской в маске выравнивания, после экспозиции испечь, развитие, и жесткий выпекать. Например, процедура, используемая для обработки пластин, используемых в этом протоколе, изложенав таблице 1 .
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при обработке кремниевых пластин, поскольку они хрупкие. После сгенерированного, могут быть использованы повторно до тех пор, пока они не повреждены.
2. Подготовка обложек
-
Приготовление кислотно-промытых «верхних» чехлов
- Поместите 18 мм диаметром #1 толщиной покрывает в стеклянную чашку Петри. Соответствующее количество покрывало зависит от размера блюда. Для 100-мм блюда приготовьте 50-100 чехлов за один раз. Объемные суммы, выделяемые на оставшуюся часть этого раздела, соответствуют 100-миллиметровому блюду.
- Добавьте 20 мл 1 м HCl в чашку Петри и осторожно встряхните блюдо, чтобы разогнать крышки. Убедитесь, что все крышки погружены и высвобождают пузырьки воздуха между крышками. Инкубировать на ночь при комнатной температуре с нежной тряской.
ВНИМАНИЕ: HCl кислый и коррозионный. Используйте осторожность и носите соответствующие СИЗ во время работы с HCl. - Декант HCl из блюда. Добавьте 20 мл ультрачистой воды и промойте нежной тряской в течение 10 мин. Отбросьте воду и повторите в общей сложности пять стирков.
- После отбрасывания окончательной стирки, добавить 20 мл 100% этанола в блюдо. Используя щипц, удалите крышки по отдельности и расположите между двумя кусками фильтровальной бумаги, чтобы высохнуть.
- Храните сушеные крышки в запечатанном контейнере. Кислотные крышки могут быть подготовлены заранее и храниться в течение месяца или дольше в условиях, свободных от пыли.
-
Приготовление глютаральдегида активированных "нижних" чехлов
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к предыдущим методам для получения дополнительной информации7,9.- Поместите 18 мм диаметром #1 толщиной покрываетв в чашку Петри.
- Добавьте 20 мл 0,2 М HCl в чашку Петри и осторожно встряхните блюдо, чтобы разогнать крышки. Убедитесь, что все крышки погружены и высвобождают пузырьки воздуха между крышками. Инкубировать на ночь при комнатной температуре с нежной тряской.
- Декант HCl из блюда. Добавьте 20 мл ультрачистой воды и промойте нежной тряской в течение 10 мин. Отбросьте воду и повторите в общей сложности пять стирков.
- После отбрасывания окончательной стирки, добавить 20 мл 0,1 М НаОХ и встряхнуть осторожно, чтобы разойтись и погрузить крышки. Инкубировать при комнатной температуре с нежной тряской в течение 1 ч.
- Декант NaOH из блюда. Добавьте 20 мл ультрачистой воды и промойте нежной тряской в течение 10 мин. Отбросьте воду и повторите в общей сложности пять стирков.
- После отбрасывания окончательной стирки, добавить 20 мл 1:200 разбавления 3-aminopropyltrimethoxysilane в ультрачистой воде и встряхнуть осторожно, чтобы разойтись и погрузить крышки. Инкубировать при комнатной температуре с нежной тряской в течение 1 ч или на ночь.
ВНИМАНИЕ: 3-аминопропилтриметоксилан является легковоспламеняющимся и может вызвать раздражение кожи. Обработайте с осторожностью, изнашивайте соответствующие СИЗ и выбрасывайте отходы в соответствии с местными правилами утилизации. - Декант разбавленный 3-аминопропилтриметоксилановый раствор из блюда. Добавьте 20 мл ультрачистой воды и промойте с нежной тряской в течение 10 мин. Отбросьте воду и повторите в общей сложности не менее пяти стирков. Очень важно, чтобы удалить все 3-aminopropyltrimthoxysilane перед началом работы.
- После отбрасывания окончательной стирки, добавить 20 мл 1:140 разбавления 70% глютаральдегида в фосфат буферных солей (PBS) и встряхнуть осторожно, чтобы разогнать и погрузить крышки. Инкубировать при комнатной температуре с нежной тряской в течение 1 ч или на ночь.
ВНИМАНИЕ: 70% глютаральдегид является токсичным и может вызвать раздражение кожи. Обработайте с осторожностью, изнашивайте соответствующие СИЗ и выбрасывайте отходы в соответствии с местными правилами утилизации. - Декант разбавленный раствор гюмтаральдегида из блюда. Добавьте 20 мл ультрачистой воды и промойте нежной тряской в течение 10 мин. Отбросьте воду и повторите в общей сложности пять стирков.
- После отбрасывания окончательной стирки, добавить 20 мл 100% этанола. Используя щипц, удалите крышки по отдельности и расположите между двумя кусками фильтровальной бумаги, чтобы высохнуть.
- Храните сушеные крышки в запечатанном контейнере. Глютаральдегид активированные крышки могут быть подготовлены заранее и храниться до шести месяцев.
3. Поколение трафаретов для узоров ECM лиганда
- Генерация промежуточных марок пополиметилсилоксана (PDMS)
- Смешайте базу PDMS с агентом лечения PDMS в соотношении 10:1, по весу. Тщательно перемешайте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для первоначального применения PDMS, подготовить около 100 г PDMS для заполнения 100 мм блюдо. Для последующего применения удалите PDMS только из центра блюда, где расположены кремниевые пластины, и приготовьте 20-30 г новых PDMS. - Дега смесь PDMS в desiccator в течение 30-60 минут или до тех пор, пока все пузырьки воздуха удаляются.
- Поместите модифицированную кремниевую пластину от шага 1 в пластиковую тарелку 100 мм. Медленно и равномерно вылейте смесь PDMS на поверхность. Нажмите блюдо на рабочей поверхности, чтобы освободить любые пузырьки воздуха с поверхности.
- Дега смесь PDMS налил на вафу в течение 10 минут или до тех пор, пока все пузырьки воздуха удаляются или пришли на поверхность PDMS.
- Выпекать PDMS при температуре 70 градусов по Цельсию в течение 2 ч. Дайте остыть до комнатной температуры.
- Используя скальпель или фрезу коробки, вырежьте участок PDMS из центра блюда, который содержит геометрические особенности.
- Разрежьте PDMS примерно на 10 х 10 мм квадратов, каждый из которых содержит функции для одного экспериментального состояния. В последующих этапах протокола они называются «штампами».
- Смешайте базу PDMS с агентом лечения PDMS в соотношении 10:1, по весу. Тщательно перемешайте.
- Создание плоских плит PDMS
- Смешайте базу PDMS с агентом лечения PDMS в соотношении 8:1, по весу. Приготовьте примерно 20 г для каждой 100-мм тарелки, которая будет использоваться. Тщательно перемешайте.
- Дега смесь PDMS в desiccator в течение 30-60 минут или до тех пор, пока все пузырьки воздуха удаляются.
- Медленно и равномерно налейте PDMS в чистую 100-мм тарелку. Нажмите блюдо на рабочей поверхности, чтобы освободить любые пузырьки воздуха.
- Выпекать PDMS при температуре 70 градусов по Цельсию в течение 2 ч. Дайте остыть до комнатной температуры.
- Удалите PDMS из блюда. Инвертировать так, что поверхность PDMS, который был в контакте с нижней части блюда лицом вверх.
- Для каждой марки, генерируемой в шаге 3.1, вырежьте квадрат PDMS 15 x 15 мм. В последующих этапах протокола они называются «плоскими плитами».
- Генерация трафаретов
- Упорядочить плоские плиты PDMS на крышке 150 мм блюдо, или другой плоской поверхности для облегчения обработки. Обеспечить достаточную интервал между плитами (например, для 150-мм блюда, организовать девять плоских плит с ровным интервалом).
- Переворачивать каждую марку, генерируемую в шаге 3.1, на плоскую плиту PDMS, чтобы функции на марке соприкасаются с плоской плитой PDMS. Аккуратно нажмите на верхней части марки с щипками, чтобы обеспечить даже контакт.
- Тщательно подпирайте крышку, держа pdMS штамп / плита пары на базе блюда, так что крышка лежит под углом. Это помогает фитиль УФ-излечимых полимеров на следующем шаге.
- Поместите небольшую каплю УФ-излечимого полимера в верхний интерфейс каждой пары штампа/плиты. Полимер будет нечестивым между ними поверхностным натяжением, с помощью гравитации.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе могут работать различные УФ-излечивые полимеры. Мы выбрали Norland Optical Adhesive 74 для следующих свойств: i) Быстрое лечение при воздействии УФ-излучения, ii) Легкое удаление от штампов PDMS при лечении, iii) Крепление к стеклянным крышкам с ручным давлением. - После того, как полимер был полностью злой через, поместите крышку с печатью / плиты пары плоские на рабочей поверхности. Поместите небольшую каплю УФ-излечимого полимера на каждой из оставшихся трех сторон интерфейса марки/плиты.
- Используя наконечник пипетки в 200 л, соедините капли полимера по краям интерфейса штампа/плиты. Это создает границу, которая будет держать лиганд решение в шаге 4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при работе полимера по краям марки. Если интерфейс штампа/плиты нарушен, полимер будет фитиль под функциями и трафарет не будет формироваться должным образом. - Аккуратно поместите пары штампа/плиты в уф-стерилизацию. Используйте стерильную настройку питания "Str" и разоблачай в течение 10 мин.
- Удалите пары штампа/слябиизм из окна УФ-стерилизации. Используя две пары щипцы, осторожно удалите штамп PDMS, удерживая плоскую плиту и трафарет, который образовался из УФ-излечимого полимера.
- Используя щипцы, тщательно удалите трафарет и инвертируйте его таким образом, чтобы поверхность, которая была в контакте с плоской плитой PDMS, обращена вверх.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трафареты деликатны. Будьте осторожны при передаче их, особенно при первоначальном удалении их из PDMS, так что они не рвутся. - Поместите перевернутые трафареты обратно в УФ-стерилизации поле. Используйте стерильную настройку питания "Str" и выставляй в течение 3 мин.
4. Узоринг ECM лиганд на крышках
-
Нажатие трафаретов на кислотно-промытые крышки
- Поместите один кислотно-промытый крышкой для каждого трафарета на чистый кусок лабораторной пленки.
- Используя щипцы, аккуратно поместите каждый трафарет, плоский вниз, на кислотно-промытый coverslip. Разместите такие, что объекты сосредоточены на крышке.
- Поместите небольшой кусок лабораторной пленки поверх каждого трафарета. Твердо и равномерно нажмите на трафарет, чтобы создать сильный контакт между трафаретом и крышкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это важный шаг! Нажмите твердо и по всей поверхности трафарета. Если не будет создан достаточный контакт, лигандное решение протечет между трафаретом и крышками, и узор не утихнет. ФАКЦИОН: Чтобы подтвердить достаточный контакт между трафаретом и крышкой, пипетка 100 л ультрачистой стерильной воды на поверхность каждого трафарета и инкубировать при комнатной температуре. После 1 ч, проверьте на утечку. Аспирируй воду из успешно связанных трафаретов и продолжить.
-
Плазменная очистка поверхности трафаретных крышкдляв для повышения гидрофилики
- Поместите крышки с трафаретами в плазменный очиститель. Нанесите плазму высокой мощности на 30 с.
-
Приготовление раствора ECM ligand
ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие шаги должны быть завершены в стерильных условиях, если это возможно.- Поместите стерильные 100 мМ HEPES, 100 мМ NaCl, pH 8.0 раствор на льду. После ледяного холода добавьте матригель и коллаген для достижения концентраций 225 мкг/мл и 25 мкг/мл, соответственно. ФАКЦИОН: Для устранения неполадок или для визуализации лиганда, включите флуоресцентно помеченный лиганд в растворе лиганда.
- ПРИМЕЧАНИЕ: Различные лиганды ECM могут быть использованы с этим методом. Для различных лигандов может потребоваться дополнительная оптимизация для определения идеальной концентрации, времени инкубации и температуры инкубации. Дополнительную информацию можно узнать в разделе обсуждения.
- Пипетка лигандовый раствор на поверхность каждого трафарета. Для трафаретов, изготовленных из 10 х 10 мм квадратных марок, нанесите 100 л л на трафарет.
- Проверьте наличие пузырьков воздуха в функциях трафарета. При необходимости используйте пузыри с тонкими наконечниками или наконечником пипетки в размере 2 л, чтобы удалить пузырьки воздуха с функций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это важный шаг! Если пузырьки воздуха остаются в ловушке на поверхности крышки, лиганд не будет адсорбировать на поверхность и в результате картина будет неполным. - Поместите трафаретные крышки с лигандой в блюдо, оберните лабораторной пленкой и инкубировать при 4 градусах Цельсия на ночь.
- Поместите стерильные 100 мМ HEPES, 100 мМ NaCl, pH 8.0 раствор на льду. После ледяного холода добавьте матригель и коллаген для достижения концентраций 225 мкг/мл и 25 мкг/мл, соответственно. ФАКЦИОН: Для устранения неполадок или для визуализации лиганда, включите флуоресцентно помеченный лиганд в растворе лиганда.
5. Передача лиганда в полиакриламидный гель
- Удаление раствора лиганда и трафарета с каждого покрытия
- Примачить раствор лиганда с поверхности трафарета. Раствор Ligand можно собирать и хранить при 4 градусах Цельсия и повторно использовать в течение месяца.
- Используя щипцы, кратко погрузите крышку с трафаретом в тарелку содержащую стерильную PBS для мытья.
- Кратко погрузите крышку с трафаретом во второе блюдо стерильной PBS для мытья.
- Снимите трафарет с поверхности крышки. Будьте осторожны, чтобы не сломать крышку.
- Кратко погрузите покрывало в блюдо, содержащее ультрачистую стерильную воду, чтобы удалить соли из смывает PBS. Нажмите на край coverslip к деликатной задаче протрите фитиль от лишней воды.
- Высушите крышку под инертным газом, таким как азот. Отметьте нижней части coverslip, чтобы отслеживать ориентацию с этого момента вперед. Будьте осторожны, чтобы держать узорчатую сторону вверх.
- Повторите шаги 5.1.1 до 5.1.6 для каждого трафаретного coverslip.
- Изготовление гидрогелей полиакриламидов с узорчатыми крышками
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к предыдущим методам для дополнительных деталей7,9 Стерилизовать все крышки держатели, трубки и прокладки, используемые для полиакриламидных гелей путем мытья с 10% отбеливателя на ночь, промывка водой по крайней мере пять раз, чтобы удалить отбеливатель, и мытье кратко в 70% этанола. Поместите все части на деликатные салфетки задачи в стерильных биобезопасности шкаф высохнуть перед использованием.- Подготовка полиакриламидного раствора для получения желаемой упругости гидрогеля(таблица 2). Смешайте все компоненты, кроме флуоресцентных микросфер и перульфата калия (PPS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 1% раствор персульфата калия свежий каждый раз. - Дега раствор полиакриламид, микросферы и PPS в отдельных трубах под вакуумом в течение 30 минут.
- Для каждого узорчатого обкрытия, подготовить глютаральдегидактивированный активированный "нижний" coverslip с прокладкой (18 мм внешнего диаметра, 14 мм внутреннего диаметра), размещенных на вершине.
- После дегазации кратко снотворно езтье микросферы и добавить соответствующий объем в раствор полиакриламид. Смешайте путем pipetting вверх и вниз, стараясь не ввести пузырьки воздуха. Кратко sonicate.
- Добавьте соответствующий объем PPS в раствор полиакриламид. Пипетка вверх и вниз, чтобы смешать раствор, стараясь не вводить пузырьки воздуха.
ПРИМЕЧАНИЕ: После добавления PPS, работать быстро, чтобы завершить шаги 5.2.6 до 5.2.11 до полимеризации полимеризации полимеризации полимеризации. - Пипетка 75-150 л (в зависимости от толщины прокладки) к центру каждого гюмтараальдегида активированного coverslip.
- Используя щипцы, поместите узорчатый покрывало на каждый глютаральдегид-активированный покрывало с полиакриламидом и прокладкой, так что узорчатый лиганд сталкивается с раствором полиакриламид. Если будет добавлендостаточный раствор полиакриламид, поверхностное натяжение будет цифировать полиакриламид между двумя крышками и никаких пузырьков воздуха не будет.
- Возьмите каждый полиакриламид "сэндвич" и осторожно прикоснуться к стороне деликатной задачей протрите фитиль от избыточного раствора полиакриламид.
- Аккуратно поместите каждый полиакриламид "сэндвич" в крышку держателя с нитями, которые совместимы с 15 мл конической нижней трубки. Ориентация должна быть такой, чтобы нижняя часть крышки глютаральдегида соприкасалась с нижней частью крышки держателя, а узорчатый обкрытие находится сверху.
- Винт 15 мл конической нижней трубки в каждый держатель крышки провести полиакриламид "сэндвичи" на месте. Трубки должны быть плотными, чтобы предотвратить утечку, но будьте осторожны, чтобы не затягивать и трещины крышки.
- Центрифуги полиакриламид "сэндвичи" в трубах в качели-ведра на 200 х г в течение 10 минут при комнатной температуре. Удалите трубки из центрифуги и поместите в трубку стойки для поддержания ориентации в течение дополнительных 50 минут, чтобы обеспечить полимеризацию. Держите покрыты фольгой, чтобы предотвратить отбеливание флуоресцентных микросфер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Центрообразуя критически при использовании этого метода для выполнения TFM. Центробежная сила перемещает все микросферы в одну плоскость, которая в конечном итоге будет находиться чуть ниже поверхности гидрогеля. Это идеально подходит для визуализации микросфер смещения, которые используются для расчета клеточных напряжений тяги. Если не выполнять ТФМ, микросферы могут быть оставлены из раствора полиакриламид и полимеризации может произойти на скамейке без центрифугации. - Удалить полимеризованные полиакриламидные "сэндвичи" из труб и погрузиться в PBS в 100-мм блюдо. Оберните в лабораторную пленку и инкубировать в течение 3 ч при комнатной температуре или на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию.
- Подготовка полиакриламидного раствора для получения желаемой упругости гидрогеля(таблица 2). Смешайте все компоненты, кроме флуоресцентных микросфер и перульфата калия (PPS).
- Подготовка узорчатых гелей для посевных клеток
- Используйте скальпель и щипцы, чтобы тщательно удалить узорчатый coverslip и прокладка из полиакриламид "сэндвич", пока он остается погруженным в PBS. Узорчатый лиганд перейдет в полиакриламид во время полимеризации и останется после снятия крышки. Полиакриламид гель будет оставаться прикрепленным к глютаральдегида активированный coverslip.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это важный шаг! Полиакриламид должен быть погружен в PBS при удалении coverslip или лиганд ы модели будут уничтожены. - Поместите каждый coverslip с узорчатым полиакриламидом в крышку держателя. Поместите прокладку (18 мм внешнего диаметра, 14 мм внутреннего диаметра) на верхней части крышки и вокруг полиакриламид, где был расположен прокладка. Винт распиленный 15 мм конической нижней трубки в крышку держателя, образуя хорошо с узорчатым полиакриламид в нижней части. Эти сборки вписываются в колодцы стандартной 12-хорошей пластины для легкой обработки.
- Вымойте каждый гель, добавив 500 л PBS в хорошо сборки. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре с нежной тряской. Удалить PBS и повторить дважды в общей сложности три стирания.
- После окончательного мытья PBS, добавьте 500 qL средств knockout-DMEM к гелям и инкубировать на 37 qS на ночь. Гели могут храниться при 37 градусах Цельсия со средствами массовой информации в течение 5 дней до посева клеток.
- За день до посева клетки, заменить нокаут-DMEM для полного KSR средств массовой информации и инкубировать на 37 градусов по Цельсию в одночасье.
- Используйте скальпель и щипцы, чтобы тщательно удалить узорчатый coverslip и прокладка из полиакриламид "сэндвич", пока он остается погруженным в PBS. Узорчатый лиганд перейдет в полиакриламид во время полимеризации и останется после снятия крышки. Полиакриламид гель будет оставаться прикрепленным к глютаральдегида активированный coverslip.
6. Культивирование hESCs на узорчатых гелях
ПРИМЕЧАНИЕ: Если планируете исправить образцы для иммуно-пятна после TFM, принимать изображения неподчеркнутых состояний микросферы до посева клеток. В этом случае флуоресцентно помеченный лиганд следует использовать в шаге 4.3.1, чтобы возможные места расположения клеток были известны до того, как посев ные и микросферы можно будет отобразить в этих регионах.
- Поддержание запасов hESC культур и вторичных фидер-свободных культур, подготовленных на матригеле покрытием пластин в условных средств КСР до посева на узорчатые гели полиакриламид, как ранее описано9.
ПРИМЕЧАНИЕ: Создание условных средств KSR путем культивирования облученных эмбриональных фибробластов мыши в средствах кСР, дополненных 4 ng/mL основным фактором роста фибробластов (bFGF). Сбор и замена носителей каждые 24 ч. - Аспирируй средства массовой информации из hESCs. Кратко мыть с нокаутом-DMEM средств массовой информации. Добавьте 0,05% трипсин-ЭДТА, дополненный 10 мкм Y27632 (ингибитор киназы Rho) и инкубировать при 37 градусах По области в течение 5-10 мин.
- Добавить средства массовой информации с сывороткой, чтобы ингибировать трипсин. Аккуратно аспирировать средства массовой информации и пипетки над блюдом, чтобы удалить клетки. Продолжить pipetting осторожно, чтобы удалить все клетки и разъединить клеточные кластеры на одиночные ячейки.
- Соберите суспензию и центрифугу при 200 х г в течение 3 мин.
- Приспособите супернатант и resuspend гранулы в эквивалентном объеме ksR средств для мытья. Центрифуга при 200 х г в течение 3 мин.
- Приготовьте супернатант и resuspend гранулы в условных средств кср дополнены 10 нг /мл bFGF и 10 мкм Y27632.
- Подсчитайте клетки гемоситометром и отрегулируйте суспензию клетки до концентрации 300 000 клеток на мл. Пипетка 500 л клеточной подвески на каждый узорчатый гель (150 000 клеток на гель).
- 3 ч после посева, используйте пипетку, чтобы тщательно аспирировать средства массовой информации от каждого геля и заменить свежими условными средствами КСР дополнены 10 нг/мл bFGF и 10 мкм Y27632. Это удаляет избыточные клетки, которые не придерживались узорчатых областей полиакриламид.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это важный шаг! На этом этапе клетки будут слабо прилипать к узорчатому лиганду. Будьте очень осторожны при замене носителей, чтобы не отсоединить клетки. В последующих шагах следует соблюдать равную осторожность при каждом из обменов средств массовой информации. - 24 ч после посева, используйте пипетку, чтобы тщательно аспирировать средства массовой информации и обмена на условные средства консилиум кСР дополнены 10 нг/мл bFGF и 5 мКМ Y27632.
- 48 ч после посева, используйте пипетку, чтобы тщательно аспирировать средства массовой информации и обмена на условные средства консилиумдов дополните 10 нг/мл bFGF. Это удаляет ингибитор Род киназы из средств массовой информации и эксперименты могут начаться на следующий день, 72 ч после посева.
7. Выполнение TFM
- При желании выполните TFM, как ранее описано9 при желаемых экспериментальных условиях.
- Если неподчеркнутые позиции микросферы были изображены перед посевными клетками, зафиксировать клетки после того, как они занимают подчеркнутое положение микросферы, и выполните иммуностоинг для определения локализации белков, представляющих интерес по отношению к регионам с высокими и низкими тяговыми силами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Основная задача, которую необходимо преодолеть при попытке культуры HESC в колониях контролируемой геометрии на совместимых субстратах, заключается в выработке однородной модели ECM-лигана на поверхности субстрата. Стратегия, представленная в этом методе включает в себя сначала генерации желаемого шаблона на поверхности стеклянного coverslip, а затем впоследствии переноса этого шаблона на поверхность полиакриламид гидрогеля во время полимеризации геля (Рисунок 1 A).Таким образом, важно обеспечить, чтобы желаемый шаблон был успешно создан на поверхности стеклянного покрывала до начала полимеризации гидрогеля и переноса узора(рисунок 1В). На основе изображения флуоресцентных лигандовых узоров, переданных в полиакриламид, лиганд, как представляется, присутствует только в одной плоскости на поверхности полиакриламид, хотя мы точно не характеризуют толщину этого слоя. Есть два распространенных типа дефектов наблюдается следующие генерации шаблона на стеклянном крышке, каждый со своим собственным источником ошибки. Во-первых, появление флуоресцентного лиганда выходит за пределы желаемого шаблона(рисунок 1C, top), что является результатом утечки флуоресцентного раствора лиганда из-за небольшой слезы в трафарете или недостаточного уплотнения трафарет к стеклянному покрывалу. Во-вторых, появление неполного шаблона(рисунок 1C, дно), который, как правило, из-за воздушного пузыря в ловушке на интерфейсе coverslip, что предотвращает адсорбцию флуоресцентного лиганда.
Конечной мерой успеха этого метода является способность к культуре hESCs в желаемой геометрии на узорчатых гидрогелях(рисунок 2). Для достижения этой цели, hESCs посеяны при относительно высокой плотности (300 000 клеток/мл) в присутствии ингибитора киназы Rho (Y27632) и инкубируются в течение 3 ч для облегчения привязки к моделям лиганда. Затем средства массовой информации заменяются для удаления неприсоединенных ячеек. В течение 72 ч, Y27632 постепенно разбавленной из средств массовой информации в серии обменов средств массовой информации на 24 и 48 ч после посева. Как правило, hESCs размножаются для завершения узорчатых геометрий на 48-72 ч, таким образом, что эксперименты могут начаться с 72 ч после посева, как только Y27632 полностью удален из средств массовой информации.
Культивирование колоний hESC в ограниченной геометрии на гидрогелях полиакриламидов позволяет измерять силы тяги, генерируемые клетками, с помощью TFM. Эти измерения производятся путем встраивания флуоресцентных микросфер в гидрогель и визуализации положения этих бусин до и после посева hESCs(Рисунок 3A). Смещение бисера после посева клеток является функцией клеточных сил и эластичности гидрогеля, таким образом, изображения позиций бисера могут быть использованы для создания карт смещения бисера и впоследствии использоваться для расчета основных тяги подчеркивает. В круговых колониях ГЭС, крупнейшие тяговые напряжения находятся вблизи периферийного края колоний, в то время как центр колоний отображает равномерно низкие тяговые напряжения(рисунок 3B). Интересно, что самые высокие тяговые напряжения встречаются в кластерах вблизи края колоний, а не образуют непрерывное кольцо максимального стресса. Это означает, что, хотя геометрия колонии играет ключевую роль в определении распределения тяговых напряжений, более локализованное регулирование и обратная связь определяют точное место максимального стресса. Кроме того, до тех пор, пока изображение расположения микросферы без присоединенных клеток принимается до посева клеток, колонии hESC могут быть зафиксированы для иммуно-стабилизации белков, представляющих интерес после измерений силы тяги. Несмотря на наблюдаемое неравномерное распределение тяговых напряжений, hESCs культивируется как узорчатые круги в условиях обслуживания отображают равномерное выражение pluripotency маркерOct3/4 и молекулы клеточной адгезии E-cadherin (Рисунок 3C ).
Представленный метод использования трафаретов для генерации узоров лиганда явно превосходит общий метод микроконтактной печати для относительно больших геометрий, используемых в этом методе (т.е. для круговых колоний диаметром 1 мм, а также треугольники и квадраты эквивалентной площади). Микроконтактные печатные узоры лиганда при такой шкале длины приводят к неоднородном переносу по краям узоров, при этом очень мало лиганда откладывается в центральных регионах шаблонов(рисунок 4А). Этого явно недостаточно для последовательного производства колоний hESC конкретных геометрий. Снижение плотности посева клеток также приводит к несогласованности в достижении завершенных колоний. Клетки, посеянные на уровне 200 000 клеток/мл, а не 300 000 клеток/мл, не способны генерировать достаточное количество контактов клеток, чтобы выжить при снижении концентрации Y27632 при 24 ч после посева(рисунок 4B). Это может быть возможным для создания полных моделей с более низкой плотностью клеток путем продления периода разбавления Y27632; однако, в целом это более эффективно, чтобы семена на более высокой 300000 клеток / мл плотности. Иногда ошибки в генерации шаблонов, которые не были обнаружены ранее в протоколе, становятся очевидными при посеве hESC. Одной из таких ошибок является утечка лиганда раствора под трафарет из-за плохого контакта с крышкой. Это в конечном итоге приводит к лиганду, передаваемому в регионы полиакриламидза за пределами желаемой геометрии, и неограниченным ростом HESCs при посевной(рисунок 4C).
Рисунок 1: Узорирование ECM лиганда на кислотно-промытые крышки и передача на гидрогели полиакриламидов. (A) Схематическое представление протокола для узорства ECM лиганда на кислотно-промытых крышках и переноса узорчатого лигана на гидрогели полиакриламидов. (B) Иммунофлуоресцентные изображения узорчатого лиганда ECM на кислотно-промытых крышках (слева) и после переноса на гидрогель полиакриламид (справа). Матригель с меткой биотина был узором на обложке и помечен ы Алекса Флюор 555 стрептавидин до передачи в полиакриламид. Вставки показывают увеличенное представление о полном генерируемом шаблонах. (C) Представитель флуоресцентные изображения, демонстрирующие дефекты узора лиганда на стеклянном крышке. Они являются результатом распространенных ошибок в протоколе, таких как утечка лиганда раствора за пределами узорчатой геометрии (вверху, стрелка указывает место утечки), и захват пузырьков воздуха внутри узорчатых геометрий трафарета при добавлении лиганда решения ( дно, стрелка указывает место воздушного пузыря). Все бары масштаба 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Посев ГЭС на узорчатые гидрогели полиакриламидов. Представитель ярко-полячатые изображения, демонстрирующие успешное посев ГЭС на полиакриламидные гидрогели с узорчатым лигандом. Временная шкала в верхней части указывает на ряд изменений мультимедиа, используемых для удаления неприкрепленных ячеек и разбавления Y27632. Обратите внимание, что после первоначального посева, клетки придерживаются stochastically в различных регионах в пределах узорной лиганд, а затем размножаться, чтобы заполнить узорчатые регионы в течение 72 ч. Шкала бар 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Региональная локализация тяговых напряжений и иммуностогирование замкнутых колоний ГЭСК. (A) Флуоресцентные изображения микросфер в гидрогеле полиакриламида до и после посева ГЭС. (B) Представитель изображения частицы велоциметрии (PIV) сюжет, изображающий смещение микросфер из-за тяговых напряжений (слева) и соответствующих реконструированных тяговых напряжений (справа). (C) Иммуностоинирование замкнутых колоний HESC на узорчатых гидрогелях полиакриламидов, демонстрирующих способность сравнивать локализацию белков, представляющих интерес, с тяговыми стрессами. Все бары масштаба 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Неидеальные результаты, полученные альтернативными методами и ошибками. (A) Представитель флуоресцентные изображения ECM лиганда узором на кислотно-мыть ели через микроконтакт печати. (B) Брайтфилд изображения hESCs, которые не образуют завершенных колоний из-за недостаточного присоединения клеток. Ранним показателем этого вопроса являются большие пробелы, оставшиеся в колониях на уровне 24 ч после посева (стрелки). (C) Яркие изображения hESCs, которые не образуют ограниченные колонии из-за ошибок в шаблоне, которые привели к присутствию лиганда за пределами желаемой геометрии. Все бары масштаба 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Пример SU8 Изготовление | |
| 1. для спинового пальто с SU8-3050 | Спин при 1000 об/мин на 30 с |
| 2. Мягкая вафла выпечки на горячей тарелке | i. 3 мин при 65 градусах Цельсия |
| ii. 45 мин при 95 градусах По Цельсия | |
| iii. 3 мин при 65 градусах Цельсия | |
| iv. Прохладный до комнатной температуры | |
| 3. Выставить в маске выравниватель | i.Align и фотомаска в маске выравниватель |
| Ii. Экспозиция с энергией 250 мДж/см2 | |
| Например, для лампы с интенсивностью 11 мВт/см2,подвергать 23 с | |
| 4. Пост экспозиции испечь на горячей тарелке | i. 1 мин при 65 градусах Цельсия |
| ii.15 мин при 95 градусах По Цельсию | |
| iii. 1 мин при 65 градусах Цельсия | |
| Iv. Прохладный до комнатной температуры | |
| 5. Разработка | i. Агитация в SU8 Разработчик, приблизительно 5-10 мин |
| Ii. Проверьте развитие с изопропиловым спиртом (IPA) | |
| Если недоразвитая, мяпайте будет производить белый остаток | |
| 6. Твердая выпечка на горячей тарелке (по желанию) | 1-2 ч при 150 градусах Цельсия |
Таблица 1: Пример SU8 протокол изготовления пластин. Силиконовые пластины, используемые для создания марок PDMS и последующих трафаретов, были изготовлены с использованием шагов, изложенных в этой таблице. Этот протокол был создан с использованием листа данных SU8 3000 с целью создания толщины пленки примерно 100-250 мкм.
| Полиакриламид Гель Формулы | |||||||||
| Объемы для 1 мл полного решения | |||||||||
| Упругий модуль (Па) | Окончательный % акриламид | Окончательный % Бис-акриламид | ddH2O (КЛ) | 40% акриламида (Зл) | 2% Бис-акриламид (КЛ) | 10x PBS (Зл) | 1% TEMED в ddH2O (Зл) | Микросферы 0,5% твердых веществ в ddH2O (Зл) | 1% PPS в ddH2O (Зл) |
| 1050 | 3 | 0.1 | 565 | 75 | 50 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 2700 | 7.5 | 0.035 | 485 | 187.5 | 17.5 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 4000 | 7.5 | 0.05 | 477.5 | 187.5 | 25 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 6000 | 7.5 | 0.07 | 467.5 | 187.5 | 35 | 100 | 75 | 60 | 75 |
Таблица 2: Составы геля полиакриламида. Объемы компонентов для генерации гидрогелей полиакриламидов различных эластичных модули с флуоресцентными микросферами для ТФМ. Объемы могут быть уменьшены или уменьшены на основе количества полиамиламидного раствора, необходимого. Все компоненты, кроме флуоресцентных микросфер и PPS смешиваются вместе до дегазтирования. PBS - фосфат-буферный солен, TEMED - тетраметилэтиленедиамин, PPS и персульфат калия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для упрощения длинного и детального протокола этот метод состоит из трех критических стадий: 1) генерации моделей ECM ligand на стеклянных крышках, 2) переноса узоров на гидрогели полиакриламидов во время полимеризации геля и 3) посевных ГЭС на узорчатый гидрогель. Есть критические шаги, которые должны быть рассмотрены на каждом из этих трех этапов. Для того, чтобы создать высокой точностью моделей на стеклянные крышки, трафарет должен быть твердо нажата на крышку, чтобы предотвратить утечку раствора лиганда и все пузырьки воздуха должны быть удалены после добавления лигандного раствора на поверхность трафарета ( Рисунок 1C). Если лиганд раствор протекает через трафарет из-за плохого контакта с крышкой, лиганд будет перенесен на всю поверхность гидрогеля полиакриламидина и ГЭС не будет ограничиваться желаемой геометрией колонии(рисунок 4C). Наиболее важным шагом в передаче узорчатого лиганда на полиакриламид мягко отделяет верхний покрывало от гидрогеля, в то время как все компоненты остаются погруженными в PBS. Если гидрогель не остается погруженным во время разделения, узоры могут быть полностью разрушены. Кроме того, если разделение происходит слишком быстро, поверхность гидрогеля может разорвать сярприг или быть повреждена. Чем мягче гидрогель, тем больше он подвержен риску повреждения во время разделения. Наконец, пользователь должен pipette очень тщательно при обмене средствами массовой информации во время посева и культуры hESCs на узорчатых гидрогелей. HESCs остаются слабо придерживаются на протяжении всего протокола и узорчатые колонии могут быть легко нарушены по неосторожности или бросился пипетки.
В дополнение к критическим шагам, рассмотренным выше, существует ряд других шагов, которые могут потребовать модификации и устранения неполадок при адаптации этого протокола для различных приложений. В то время как модели, продемонстрированные здесь, находятся на длине сотни микронов до миллиметра, генерации узорчатых функций на кремниевых пластинах с прозрачностью фотомаски и отрицательные photoresist позволяет размеры функций вплоть до 7-10 мкм. Таким образом, этот протокол может быть адаптирован для ограничения геометрии одиночных ячеек или меньших колоний нескольких ячеек на совместимых субстратах.
Два параметра, которые, вероятно, потребует оптимизации при адаптации этого протокола для различных типов клеток являются тип ECM лиганд используется и концентрация лиганда в растворе во время адсорбции на стеклянный крышкой через трафареты. Общая концентрация лиганда в 250 мкг/мл была достаточна для выработки однородных моделей матригеля и облегчения крепления гЭСК(рисунок 1В и Рисунок 2),хотя можно достичь аналогичных результатов с более низкими Концентрации. С другой стороны, может возникнуть необходимость в дальнейшем повышении концентрации лиганда для типов клеток, которые менее привержены или для приложений, которые требуют более короткого времени инкубации. Повышенная концентрация лиганда также может потребоваться для различных лигандов ECM, таких как фибронектин или коллаген, которые менее гидрофобны, чем матригеля и, следовательно, не может адсорб гидрогеля, как сильно. Поскольку перенос лиганда из крышки в гидрогель происходит во время полимеризации гидрогеля, широко используемые методы надежного перекрестного соединения лиганда ECM с поверхностью гидрогеля (например, обработка сульфо-САНПАХ) невозможны. Использование флуоресцентно обозначенных лигандов ECM для визуализации шаблонов на каждом этапе протокола чрезвычайно полезно при оптимизации и устранении этих параметров.
Кроме того, протокол для посевных ячеек может потребовать оптимизации в зависимости от типа ячейки и используемых медиа-условий. Для клеток, которые придерживаются более быстро или эффективно, более низкая плотность посева может потребоваться для предотвращения клеточных спаек, которые охватывают между шаблонами и привести к агрегатов, а не узорчатые монослой колоний. Для клеток, которые отображают очень плохое вложение, большая плотность посева или более длительный срок до первоначального свопа мультимедиа может потребоваться для содействия полному образованию ограниченных колоний(рисунок 4B).
Ключевым ограничением этого метода является его техническая сложность, что приводит к относительно низким результатам пропускной способностью по сравнению с аналогичными методами, которые включают культивирование клеток на узорчатых стеклянных субстратах8. Однако этот недостаток намного перевешивает физиологическую значимость, достигнутую путем культивирования ограниченных колоний hESC на совместимых субстратах. Эффективно повышая механические свойства раннего эмбриона, мы можем лучше моделировать и понимать процессы, которые приводят к самоорганизации первичных слоев микробов.
Дополнительным преимуществом ограничения колоний HESC на гидрогелях полиакриламидов является то, что он позволяет использовать ТФМ для изучения связи между организацией колонии HESC в качестве модели раннего эмбриона и распределением клеточных сил, которые могут в основе морфогенеза и спецификации судьбы клеток. Ограничение колоний hESC приводит к распределению тяговых напряжений, которые зависят от геометрии колонии(рисунок 3B). Несмотря на неравномерность этих напряжений тяги, клетки по всей колонии остаются плюрипотентными в условиях технического обслуживания(рисунок 3C). Тем не менее, мы предполагаем, что распределение тяги стресс может быть вовлеченв в регулирование моделей спецификации судьбы клеток путем настройки ответа на индукционные сигналы, такие как растворимые морфогены. Мы ожидаем, что этот метод позволит нам и другим группам лучше моделировать ранний человеческий эмбрион с помощью HESC, что приведет к более полному пониманию фундаментальных процессов, лежащих в основе эмбриогенеза человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы отметить финансирование из гранта CIRM RB5-07409. JMM хотел бы поблагодарить FuiBoon Кай, Dhruv Thakar, и Роджер Ория для различных дискуссий, которые руководствовались генерации и устранения неполадок этого метода. JMM также благодарит UCSF Discovery Стипендию за постоянную поддержку его работы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
References
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
- Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).
- Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications. Biofabrication. 9 (3), 032001 (2017).
- Stevens, K. R., Murry, C. E. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations. Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M. Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels. Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Mace, K., Braun, K. 916, Humana Press. Totowa, NJ. 317-350 (2012).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia. Methods. 94, 101-113 (2016).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).
- Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development. Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144, 976-985 (2017).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).
- Li, Q., et al. Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension. Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).
