Summary
מוצג כאן הוא פרוטוקול כדי ללמוד תגובות תרופתי ב אפיתל הערמונית אורגנואידים. אורגנואידים דומה מאוד בביולוגיה vivo וגנטיקה של החולה המטופל, מה שהופך אותם מערכות מודל אטרקטיבי. אורגנואידים הערמונית ניתן להקים מתוך prostates מודלים העכבר מהונדסים גנטית, רקמת האדם שפיר, וסרטן הערמונית מתקדם.
Abstract
מוצג כאן הוא פרוטוקול לחקור פרמקודינמיקה, תא גזע פוטנציאל, סרטן בידול הערמונית אורגנואידים. אורגנואידים הערמונית הם אנדרוגן תגובה, תלת מימדי (3D) תרבויות גדל במדיום מוגדר הדומה אפיתל הערמונית. אורגנואידים הערמונית ניתן להקים מסוג פראי ומהונדסים גנטית מודלים העכבר, רקמת האדם שפיר, וסרטן הערמונית מתקדם. חשוב מכך, המטופל נגזר אורגנואידים הדומה לגידולים בגנטיקה ובביולוגיה גידול vivo. יתר על כן, אורגנואידים יכול להיות מניפולציות גנטית באמצעות CRISPR/Cas9 ו שרין מערכות. אלה גנטיקה מבוקרת להפוך את התרבות אורגאיד אטרקטיבי כפלטפורמה בדיקות במהירות את ההשפעות של גנוטיפים ופרופילי מוסיקה על תגובות תרופתי. עם זאת, פרוטוקולים ניסיוניים חייב להיות מותאם במיוחד לטבע תלת-ממדי של תרבויות אורגנואיד כדי להשיג תוצאות הניתנות לאחזור. המתואר כאן הם פרוטוקולים מפורטים לביצוע זריעת שאומר לקבוע קיבולת היווצרות אורגאיד. לאחר מכן, דו ח זה מראה כיצד לבצע טיפולי סמים ולנתח את התגובה הפרמקולוגית באמצעות מדידות כדאיות, בידוד חלבונים ובידוד RNA. לבסוף, הפרוטוקול מתאר כיצד להכין אורגנואידים עבור השתלה של שתלה לאחר מכן בעקבות צמיחה vivo באמצעות השתלה תת עורית. פרוטוקולים אלה מניבים נתונים מאוד מתוכחלים ומתאימים באופן נרחב למערכות התרבות התלת-ממדית.
Introduction
התנגדות לסמים היא אחת הבעיות הקליניות הגדולות בטיפול בסרטן. סרטן הערמונית גרורתי (PCa) הטיפול מופנה בעיקר על ציר האנדרוגן-איתות. הדור הבא נגד אנדרוגן טיפולים (למשל, enzalutamide ו abiraterone) הראו הצלחה קלינית גדולה, אבל כמעט כל PCa בסופו של דבר מתקדם לקראת המדינה אנדרוגן עצמאי, או סרטן הערמונית עמידים בפני סירוס (CRPC).
לאחרונה גנומית ופרופיל transcript של CRPC חשף יש שלושה מנגנונים כלליים של התנגדות בסרטן הערמונית: 1) הפעלת מוטציות וכתוצאה מכך שחזור של קולטן האנדרוגן (AR) איתות1; 2) הפעלה של מעקף איתות, כפי שניתן לדוגמה במודל טרום קליני עבור הדור הבא אנטי אנדרוגן התנגדות טיפול שבו הפעלה של קולטן glucocorticoid (GR) יכול לפצות על אובדן AR איתות2; ו 3) את התהליך שזוהה לאחרונה של הפלסטיות היוחסין, שבו תאי הגידול לרכוש התנגדות על ידי מיתוג שלינים מסוג תא תלוי ביעד התרופה לסוג תא אחר שאינו תלוי בפעולה זו (אשר, ב-PCa, מיוצגת כ-AR-שלילי ו/או מחלה נוירואנדוקריניים [nepc])3,4. עם זאת, המנגנונים המולקולריים הגורמים להתנגדות לסמים אינם מובנים. יתרה מזאת, ההתנגדות הנרכש נגד אנדרוגן עלולה להוביל לפגיעויות טיפוליות שניתן לנצל. לכן, זה חיוני כדי להעריך את התגובות הסמים במערכות מודל לחקות פנוטיפים המטופל, גנוטיפים.
אורגנואידים של הערמונית הם תרבויות אורגאוטימית שגדלו במטריצת חלבון תלת ממדית עם מדיום מוגדר. חשוב מכך, אורגנואידים הערמונית ניתן להקים מרקמת שפירים סרטניים של מוריין או מוצא אנושי, והם שומרים על תכונות פנוטימית ו-גמישות פנוטיפית נמצאו ב vivo5,6. חשוב מכך, הן אנטי אנדרוגן רגיש PCa ו-CRPC תאים מיוצגים באוסף הנוכחי של אורגנואידים. יתר על כן, אורגנואידים הערמונית הם בקלות מניפולציות גנטית באמצעות CRISPR/Cas9 ו שרין5. לפיכך, אורגנואידים של הערמונית הם מערכת המודל המתאים לבדיקת היענויות לסמים ולהבהיר מנגנוני התנגדות. כאן, פרוטוקול מפורט מתואר לבצע בדיקות סמים ולנתח תגובות תרופתי באמצעות אורגנואידים הערמונית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל העבודה המתוארת בפרוטוקול זה בוצעה עם אורגמונואידים שהוקמו בעבר ומטופלים שמקורם בחולה. כל עבודת בעלי החיים בוצעה בהתאם להנחיות המרכז למשאבי מחקר בעלי חיים של האנדרטה סלואן הטרינג מרכז הסרטן (IACUC: 06-07-012). כל רקמות המטופלים הנגזרות נאספו בהתאם לכללים והתקנות של הזיכרון סלואן הטרינג מרכז הסרטן (IRB: 12001).
1. הכנה בינונית ומאגר
- הפשרת מטריצת קרום המרתף (למשל מטריוג'ל) ב -4 ° c לפני תחילת הניסוי. . שמור על הקרח בזמן השימוש
- מניחים לוחות התרבות ב 37 ° c עבור 24 שעות לפני ניסויים. זה יעזור המרתף קרום הממברנה כיפת (להלן המכונה כיפת מטריצה) כדי פולימל. מארגני הציפוי מתוארים בשלב 2.1.2.
- הכינו את המדיום האורגאיד לפי הפרוטוקול הוקם5.
- הכן את המדיום האורגאיד ללא תוספת של גורם גידול באפידרמיס (EGF; ראה טבלת חומרים לרכיבים). EGF מדכאת את התפוקה AR ההמרה ואת הקשר נגד אנדרוגן עמידות5.
- הכנת מדיום הנשר השונה של דולבקה עם 10% סרום של שור עוברי (FBS).
הערה: מדיה זו משמשת כדי לעכב את העיכול האנזימטיות באמצעות החלפת טריפסין בסעיפים 2-4. - הכינו פתרונות סמים בהתאם לפרוטוקול היצרן. עבור enzalutamide/mdv3100 (להלן המכונה הדור השני אנטי אנדרוגן), להכין פתרון מניות של 100 μM ב diמתיל סולפוקסיד (DMSO). ניתן לאחסן את המניה ב-20 ° צ' עד 6 חודשים ואינו צריך להיות טרי.
2. בידוד, עיכול אנזימטי והקמת אורגנואידים
- בידוד אורגנואידים הערמונית מן העכבר או רקמת האדם על פי הפרוטוקולים שנקבעו בעבר5,7. תיאור קצר מסופק להלן.
- האוהב ומעכל את רקמת הערמונית כדי לייצר השעיה תא יחיד. בניסוי זה, 1 מ ל של 5 מ"ג/mL קולגן סוג II ב ADמאמ/F12 שימש לעיכול של 50 מ"ג של רקמת הערמונית.
- לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות, לספור את התאים, להשעות אותם בתוך מטריצת קרום המרתף, ואת הצלחת בצפיפות המתאימה5,7 ב מטריקס כיפות לוחות התרבות טרום החמם (ציפוי שיטה מוצגת באיור 1א).
- הניחו לכיפות לגבש ולהוסיף מדיה לחלק העליון של הכיפות, כך שיהיו מכוסים לחלוטין.
- לגדל אורגנואידים לכמות הרצויה עבור יישומים במורד הזרם. ניתן לקבוע מספר תא לפי שיטות ספירה סטנדרטיות. עיין בסעיף הספציפי ליישום של הפרוטוקול לקבלת פרטים נוספים על דחיסות.
- באמצעות P1000, למשוך את המדיום ואת הפיפטה למעלה ולמטה כדי לשבש. כאשר מטריצת קרום המרתף מופרת לחלוטין, להעביר את ההשעיה ל 15 מ"ל צינור חרוט. אין למקם יותר מ-10 כיפות לשנייה אחת 15 mL בצינור חרוט. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות.
- ותשטוף את הגלולה הסלולרית. עם 5 מ ל של PBS צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות.
- משוך את הסופרנט והשהה מחדש את הגלולה ב-4 מ ל של החלפת טריפסין. לעכל עבור 5-10 דקות עם טלטול ב 37 ° c. הוסף נפח שווה של מדיום אורגנואיד + 10% FBS כדי לעכב את החלפת טריפסין. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות.
- שלוף את הסופר והשהה מחדש. ב-100 מ ג של PBS
- סנן את ההשעיה עם פילטר מ40 יקרומטר כדי להבטיח השעיית תא בודד. לכמת את מספר התא באמצעות התקן הומוציטוטומטר או ספירה שוות ערך.
הערה: אם השגת תאים בודדים בעלי הקיימא קשה, השתמש במיון זרימה כדי להשיג פתרון תא בודד.
3. הערכת קיבולת היווצרות אורגנואיד
הערה: כדי לקבוע את אחוז התאים שיכולים ליצור אורגנואיד, ניתן לבצע שיטת זריעה כפרוקסי לפוטנציאל הגזע/מחולל קדמון. קיבולת היווצרות האורגאיד חשובה גם להגדרת מספר זריעת תאים עבור הכדאיות שאומרת.
- לדלל את ההשעיה התא שהושג בשלב 2.7 כדי 100 תאים לכל 10 μL של ההשעיה באמצעות מדיום אורגאיד המכיל 10 μM Rho מעכב את Y-27632.
- העבר 1,100 תאים (110 μL של השעיה) לצינור חרוט חדש.
- הוסף 285 μL של מטריצת קרום המרתף והשהה מחדש את התאים. פעולה זו תגרום לריכוז מטריצות ~ 70%.
הערה: דילול מטריצת קרום המרתף במהלך זריעת מפחיתה במידה ניכרת את הווריאציה בגודל הכיפה, הנגרמת על ידי צמיגות של מטריצת החלבון. - תאים הזרע ב 35 μL של כיפות מטריקס בצלחת טרום מחומם 24 היטב, וכתוצאה מכך 200 תאים/טוב. לוח 3-5משכפל לכל מדגם (ראה גם שיטת הציפוי באיור 1A ו-step 2.1.2).
- כדי להבטיח כי התאים יישארו בתוך כיפת המטריצה, להעיף את הצלחת ולמקם אותו בחממה תא לגבש את מטריצת קרום המרתף.
- לאחר 10 דקות, להסיר את הצלחת מן החממה ולהוסיף בינוני המכיל את מעכבי Rho קינאז.
- . תרענן את המדיום כל יומיים , לאחר 7 ימים. מכמת את מספר האורגנואידים שמרו על מעכבי הRho קינאז בתקשורת לאורך הניסוי.
- לספור את מספר אורגנואידים הוקמה לכל כיפה ולחשב את אחוז האורגנואידים נוצר מתוך המספר הכולל של תאים מצופה (200 תאים).
הערה: יחסי מוסד אורגנואיד משתנים מ-3%-60% בהתאם לסוג התא ולסוג הגנוטיפ.
4. קביעת התגובות תרופתי של אורגנואידים
- המשך משלב 2.7, זרע 1000-10000 תאים בכיפה של מטריצה. השתמש ביעילות היווצרות ארגונית ובמהירות הגדילה כפרוקסי לקביעת מספר התא הסופי.
הערה: מספרי התאים המומלצים מסופקים בטבלה 1. השתמש בשלוש עד חמש שכפול לכל תנאי לכל ניתוח. השתמש בריכוז הסופי של 70% מטריצות קרום המרתף כדי להפחית את שגיאות ליטוף הנגרמת על ידי צמיגות. - זרעי 35 μL של כיפות מטריקס בצלחת 24 ומאפשרים לכיפות להיות בסעיף 3 (ראה גם שיטת הציפוי באיור 1a ו-step 2.1.2). הוסף מדיום המכיל את מעכבי Rho קינאז ואת סם הבחירה. שיטה זו ניתן להחיל על כל התרופות, אבל בפרוטוקול זה, דור שני אנטי אנדרוגן משמש 10 μM לדוגמה. כדי לקבוע חצי ריכוז העכבות המקסימלי (IC50), בצע log10 מצטבר וכפקד, השתמש ברכב שבו התרופה התפרקה.
- לרענן את המדיום כל שניים או שלושה ימים ולנתח את האורגנואידים ביום 7 כדי לקבוע את התגובה הפרמקולוגית של הסם. נקודות הזמן עשויות להשתנות בין בחירת הניסוי והתרופה.
הערה: אורגנואידים אינם חייבים להיות טריסינטזציה לביצוע הפעולות הללו. - כדי לשמור על אורגנואידים שלמים, באמצעות P1000, למשוך את המדיום ואת הפיפטה למעלה ולמטה כדי לשבש את מטריצת קרום המרתף.
- כאשר מטריצת קרום המרתף מופרת לחלוטין, להעביר את ההשעיה ל 15 מ"ל צינור חרוט. אין להעביר יותר מ-10 כיפות מטריצה לכל 15 מ"ל בשפופרת חרוט.
- צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות. לצייר את הסופרנטאנט ולשטוף עם 5 מ ל של PBS.
- השהה מחדש את האורגנואידים ב-1 מ ל של PBS ושבש את האורגנואידים באמצעות הטריטורציה ומסכת פסטר מזכוכית.
- מכמת את מספר הקטעים האורגאידים. Seed 5 משכפל המכיל 100 מקטעים אורגנואיד כמתואר בשלב 2.1.2.
- בצע את שיטת הכדאיות הסלולרית כמתואר להלן בסעיף 7.
5. בידוד רנ א מאורגנואידים
הערה: שיטות מסחריות המבוססות על עמודות מפיקות כמות טובה ואיכות של RNA. כדי להבטיח כמות טובה של RNA, השתמש במינימום של כיפה אחת לכל מדגם; עם זאת, שימוש בשלוש כיפות מומלץ, אשר ניתן לזריעה בבאר אחת של 12 היטב צלחת.
- הוסף את זה-mercaptoethanol (1%) למאגר לפירוק גלוטתיון בערכת הבידוד של ה-RNA.
- לצייר את המדיום מתוך כיפות קרום המרתף המכילים אורגנואידים ולהוסיף 750 μL של מאגר זה. הפיפטה עולה ויורדת. בעזרת פיפטה P1000 בדוק כי כל מטריצת קרום המרתף התפרקה.
- הוסף 750 μL של 70% אתנול ולערבב על ידי ליטוף. לאחר מכן העברת 700 μL של התערובת לעמודה, צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 1 דקות, ולחזור עם שאר הליפוסט.
- ביצוע שוטף הטיפול DNase בעמודה על פי הוראות היצרן. אליוט RNA ב 30-50 μL של מים בחינם.
- מדוד את הריכוזים באמצעות פלואורומטר ב-OD = 260 nm ו 280 ננומטר ומאחסנים ב-80 ° צ' או להמשיך עם יישומים במורד הזרם.
6. בידוד חלבונים מאורגנואידים
הערה: עבור בידוד חלבונים, הכן מאגר ריפה סטנדרטי המכיל פוספספטאז ומעכבי פרוטאז (שולחן חומרים). מומלץ להשתמש לפחות בשלוש כיפות, שניתן לזריעה באחת עשרה היטב.
- באמצעות P1000, לצייר את המדיום מתא עם כיפות קרום המרתף המכיל אורגנואידים ו פיפטה למעלה ולמטה כדי לשבש את מטריצת קרום המרתף.
- כאשר שיבשו לחלוטין, להעביר את ההשעיה של 15 מ"ל צינור חרוט. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות.
- משוך את הסופר ולשטוף עם 5 מ ל של הקרח קר PBS. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות.
- משוך את הסופרנט והשהה מחדש את הגלולה ב-4 מ ל של החלפת טריפסין. עכל עבור 5-10 דקות תוך כדי טלטול ב 37 ° c.
- הוסף נפח שווה של מדיום אורגנואיד + 10% FCS כדי לעכב את החלפת הטריפסין. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות.
הערה: לאחר צנטריפוגה, אין מטריצה קרום המרתף צריך להיות גלוי הגלולה. - משוך את הסופר ולשטוף עם 5 מ ל של הקרח קר PBS. לצייר את supernatant ולהשעות מחדש את הגלולה תא ב 300 μL של מאגר הליזה באמצעות P1000 pipet, ולאחר מכן להעביר לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL.
- דגירה על קרח 10 דקות ולאחר מכן sonicate 2x עבור 30 כל אחד במים מקורר עם טמפרטורה של 4 ° c. מניחים את הצינור בחזרה על הקרח ומבצעים כימות חלבונים בשיטות סטנדרטיות.
- הספרות חלבון על ידי הוספת נתרן dodecyl סולפט (SDS) המכיל לטעון צבע ומרתיחים עבור 5 דקות ב 95 ° c. אחסן ליטים ב-80 ° צ' או להמשיך עם יישומים במורד הזרם.
7. שיטת הכדאיות התאית עם אורגנואידים
הערה: ניתן להעריך את הכדאיות של התא באמצעות ערכת שיטת הכדאיות הניידת הזמינה באופן מסחרי ומדידת מהירות. הכן מאגרים לפי הוראות היצרן. מומלץ חמש משכפל לכל תנאי: אחד לשכפל המורכב של 1 35 μL מרתף קרום כיפת מטריקס בבאר אחת של 24 צלחת הבאר.
- למשוך את המדיום של התרבות אורגאידית, להיות זהיר להשאיר את הכיפות מטריצה ללא פגע.
- הוסף 65 μL של PBS ו פיפטה למעלה ולמטה כדי לשבש את כיפת המטריצה.
- הוסף 100 μL של מאגר ערכת שיטת הכדאיות של התא והשהה מחדש באמצעות ליטוף.
- דגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 10 דקות עם טלטול.
- העבר 100 μL של התערובת לצלחת שאינה שקופה המתאימה ללומטר ולבצע קריאה בהתאם להוראות היצרן של ערכת הכדאיות של התא.
8. הכנת אורגנואידים להשתלת השתלה
הערה: הארגון מאפשר גם להשתלת תת עורית בבעלי חיים פרוצים, כמו גם עכברים איזוגניים. כדי להבטיח אורגנואידים מוזרק הם להבדיל בvivo, התווית אורגנואידים עם ביטוי מבחינה מצטברת fluorophore5. מומלץ לבצע ניסוי פיילוט להשתלת השתלה באמצעות 5 x 105 תאים ל-2 x 106 תאים לכל הזרקה, עם דרגות של 5 x 106 תאים, כמו השתלת יעילות משתנה בין קווים אורגנואיד.
- באמצעות P1000 הצינורות, לצייר את המדיום ואת הפיפטה למעלה ולמטה כדי לשבש את מטריצת קרום המרתף. כאשר שיבשו לחלוטין, להעביר את ההשעיה של 15 מ"ל צינור חרוט. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות.
הערה: אין להעביר יותר מ-10 כיפות מטריצה לכל 15 מ"ל בשפופרת חרוט. - שלוף את הסופרנטאנט ותשטוף. עם 5 מ ל של PBS צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות.
- משוך את הסופרנט והשהה מחדש את הגלולה ב-4 מ ל של החלפת טריפסין. עכל עבור 5-10 דקות תוך כדי טלטול ב 37 ° c.
- הוסף נפח שווה של מדיום אורגנואיד + 10% FBS כדי לעכב את החלפת טריפסין. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות.
- שלוף את הסופר והשהה מחדש. ב-100 מ ג של PBS סנן את ההשעיה עם פילטר מ40 יקרומטר כדי להבטיח השעיית תא בודד. מכמת תאים באמצעות שיטות סטנדרטיות.
- ספין למטה ולהשעות מחדש את התאים ב-PBS + Rho מעכב לריכוז של 2 x 106 תאים לכל 100 μl (ראה טבלה 2 עבור ריכוזי תאים ומספר תא מוחלט הדרושים ריכוזים שונים). השתמש בנפח שווה של מטריצת קרום המרתף כדי ליצור השעיה 1:1. . שים את ההשעיה על הקרח
- הכנס את התאים בהתאם לפרוטוקולים הסטנדרטיים של הגידול באמצעותהשיטותהסטנדרטיות של המסך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זריעת יעילות
קיבולת היווצרות אורגאיד נקבעת על-ידי פנוטיפ וגנוטיפ. מסוג פראי (WT) הערמונית תאים בסיס הראה קיבולת היווצרות ארגונית מעולה (30%-40%) לעומת תאי לומיאל (3%) (איור 1א). , לאחר הקמתה של הארגון. קיבולת המבנה הוגדלה באופן דרסטי בדרך כלל, 25%-30% מהתאים הנגזרים מאורגנואיד של WT יכולים ליצור אורגאיד חדש (איור 1B). CRISPR/Cas9-בתיווך אובדן Pten (PtenΔ/Δ) או p53 (p53Δ/Δ) הביא לעלייה משנית קיבולת היווצרות אורגאיד. אובדן קיבולת היווצרות של p53 ו-Pten נוספת מוגברת (איור 1B).
תגובה פרמקולוגית
מבוסס על זריעת יעילות, זריעת של 1000-10000 תאים ב-35 μL של כיפת מטריצות קרום המרתף ב 24 צלחת בוצע. מספרי התאים המומלצים המבוססים על יעילות היווצרות אורגנואיד מסופקים בטבלה 1. עם זאת, מהירויות הפצת אורגנואיד יכולות להיות שונות באופן משמעותי בהתאם ל-גנוטיפ. שינויים נוספים במספר מזורעי התא יכולים להתבצע על בסיס התפשטות.
באיור 2, ההשפעות של מולקולות אנטי androgenic על הצמיחה נבדקו באורגנואידים מוראידים עם גנוסוגים שונים. סך של 2,500 תאים שופרה מאורגנואידים murine עם גנוטיפ WT, אובדן p53, הפסד Pten, או כפול p53 ו Pten הפסד. p53 ו-Pten הפסד ביוזמת הקדמה ויראלית של gRNA מיקוד p53 ו/או pten לוקוס באופן מכונן מבחינה מצטברת Cas9 תחת השליטה של היזם Rosa26 עם C57/Bl6 רקע גנטי9.
אובדן p53 לא גרם התנגדות מולקולות אנטי androgenic. אובדן של Pten התנגדות מוגברת למתחם אנטי androgenic, כפי שמוצג בעבר10. אובדן כפול של p53 ו-Pten, עם זאת, הביא התנגדות מלאה הדור השני נגד אנדרוגן (איור 2א). עיכוב AR גם שונה פנוטיפים אורגנואיד. בשליטה Cas9+/+ אורגנואידים, כמו גם P53Δ/Δ-נמחק ו-ptenΔ/Δ אורגנואידים, ירידה בגודל של לומן אורגנואיד נצפתה (איור 2B). p53Δ/Δ PtenΔ/Δ אורגנואידים היו פנופנאידים בדרך כלל (איור 2ב). בשורה עם תוצאות אלה, כאשר 1 x 106 תאים היו מושתלים תת-עורי באגף, רקP53 Δ/Δ ptenΔ/Δ אורגנואידים גדל (איור 2ג). בסך הכל, תוצאות אלה מוכיחים כי p53Δ/Δ PtenΔ/Δ שיתוף מחיקה תוצאות התנגדות הדור השני אנטי אנדרוגן ב אורגנואידים murine.
המטופל הנגזר pca אורגנואידים הם הטרוגנית פנוטיפ ו-גנוטיפ11,12; לכן, התגובות לסמים יכולים להיות שונים מאוד בין קווי האורגנואיד של האדם. באיור 3, את התגובה נגד androgenic מולקולות של שני האדם שונים pca אורגנואידים, MSKPCA2 ו MSKPCA3 מוצגים. התפשטות של MSKPCA2 אורגנואידים היה מעוכב מאוד על ידי מולקולות אנטי androgenic, בעוד MSKPCA3 אורגנואידים נשאר מושפע (איור 3A, B). MSKCPCA2 אורגנואידים הביע רמות גבוהות של AR ואת AR-target FKBP5, והם הביעו חלבונים מובטאים כגון CK8 ו CK18. לעומת זאת, MSKPCA3 אורגנואידים גם ביטא בסיס (CK5) ו mesenchymal (Vimentin) סמנים והראה שום ביטוי של FKBP5. תוצאות אלה מצביעים על כך מודל אורגנואידים זה לא לומיל אנדרוגן-פנוטיפים עצמאיים.
איור 1: מדידת שיעורי היווצרות אורגנואיד של האדם והעכבר בתאי הערמונית. (א) תרשים סכימטי של תא מחדש בתוך מטריצת קרום המרתף (משמאל) וזריעת אורגאיד בכיפות (מימין). (ב) היווצרות בסיס באופן יחסי של האדם (CD49f +)-הבסיס הנגזר ו (CD26 +)-תאי הלומיאל הנגזרים (%, ציר y; ממוצע ± SD) בנוכחות 1 ננומטר DHT. סך של 200 תאים נזרע ואת מספר אורגנואידים היה כימות 7 ימים לאחר זריעה (n = 3, * * * p < 0.01, t-test). (ג) היווצרות הארגון היחסי של murine WT, ptenΔ/Δ, P53Δ/Δ, ו P53Δ/Δ ptenΔ/Δ אורגנואידים (%, ציר y; ממוצע ± SD) בנוכחות של 1 ננומטר DHT. סך של 200 תאים נזרע ומספר האורגנואידים היה לכמת 7 ימים לאחר זריעה (n = 3). p53 ו pten הפסד היה בתיווך על ידי המיקוד של grna של p53 ו/או מקום pten באורגנואידים המבטא Cas9 מתחת למקדם Rosa26. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הערכת התגובה הפרמקולוגית של אורגנואידים הנגזרים מעכברים מהונדסים גנטית. (א) התפשטות התא היחסי של מורלין WT, PtenΔ/Δ, P53Δ/Δ, P53Δ/Δ ptenΔ/Δ אורגנואידים (y-ציר, מתכוון ± SD, נמדד על ידי הכדאיות תא ערכת שיטת) של 2,500 תאים 7 ימים לאחר הקמתה של אורגנואידים; (n = 3, * p < 0.05, t-test) עם 1 ננומטר DHT או 10 μM של הדור השני antiandrogen כפי שצוין. (ב) נציג ברייטפילד תמונות של WT, PtenΔ/Δ, P53Δ/Δ, ו P53Δ/Δ ptenΔ/Δ אורגנואיד התרבויות שטופלו 1 ננומטר DHT או 10 μm הדור השני אנטי אנדרוגן כפי שצוין. (ג) מייצג עקומת הצמיחה של WT, PtenΔ/Δ, P53Δ/Δ, ו P53Δ/Δ ptenΔ/Δ אורגנואידים מוזרק תת-עורי באגף של C57 איזוגניים/Bl6 עכברים. רק P53Δ/Δ PtenΔ/Δ אורגנואידים הראה צמיחה. סך של 1 x 106 תאים הוזרק. שלושה עיקולים עצמאיים של P53Δ/Δ PtenΔ/Δ אורגנואידים מוצגים להראות טרוגניות במהירות הצמיחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הערכת התגובה הפרמקולוגית של האדם הנגזר ביופסיה של סרטן הערמונית. (א) התפשטות התא היחסי של החולה-נגזר MSKPCA2 ו MSKPCA2 אורגנואידים (צירy, מתכוון ± SD, נמדד על ידי הכדאיות של תאים בערכת) של 5,000 תאים 7 ימים לאחר הקמתה של אורגנואידים (n = 4, * p < 0.05, t-Test) עם 1 ננומטר DHT או 10 μm הדור השני אנטי אנדרוגן כפי שצוין. (ב) נציג ברייטפילד תמונות של תרבויות MSKPCA2 ו MSKPCA3 אורגנואידים שטופלו עם 1 ננומטר DHT או 10 μm הדור השני אנטי אנדרוגן כפי שצוין. (ג) אנליזה מערבית כתמי AR, FKBP5 (ar-target גן), CK8 ו CK18 (לומיאל סמנים), CK5 (סמן בסיס), ו Vimentin (סמן mesenchymal) ב MSKPCA2 ו MSKPCA3 אורגנואידים. השימוש ב-העברת שימוש כבקרת טעינה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| היעילות של זריעת אורגאיד (%) | מספר זריעת תאים (לכל כיפה) |
| 1-10% | 100000 |
| 10-20% | 5000 |
| 20-60% | 2500 |
| 60-100% | 1000 |
טבלה 1: מספרי התאים המשמשים להערכת התגובה הפרמקולוגית בהתבסס על קיבולת היווצרות אורגאיד. טבלה לפי עמודה (משמאל לימין) כוללת טווחי קיבולת של היווצרות אורגנואיד והמספר המתאים של תאים לתוך כיפת מטריצה.
| סה כ מספר תא | PBS0 + Y-27632 | נפח מטריצות | ריכוז תא/הזרקה |
| 5 x 106 | 500 | 500 | 5 x 105 |
| 10 x 106 | 500 | 500 | 1 x 106 |
| 15 x 106 | 500 | 500 | 1.5 x 106 |
| 20 x 106 | 500 | 500 | 2 x 106 |
טבלה 2: מספרי תאים מומלצים לניסויים בהשתלת אורגנואיד. עמודות משמאל לימין כוללות את מספר התאים המוחלט הכולל עבור 10 זריקות, נפח כולל של PBS + Y-27632 עבור 10 זריקות, נפח מטריצות של מטריצת המרתף, ומספר התא לכל זריקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הבנת מנגנונים מולקולריים בבסיס אנטי אנדרוגן התנגדות וגילוי פגיעויות טיפוליות פוטנציאליות דורש בדיקה של תגובות תרופתי במערכות מודל מחקה סרטן הערמונית. המתואר כאן הוא פרוטוקול מפורט עבור ניתוח אמין של תגובות תרופתי בחולה נגזר ומהונדסים גנטית אורגנואידים הערמונית והכנת דגימות אלה אורגנואיד עבור יישומים במורד הזרם.
קיימים שני שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. הראשון הוא קביעת יעילות הזריעה וקצב הגדילה של האורגנואידים. מהירות הגדילה של אורגנואיד משתנה מאוד. הדבר תלוי במינים, כאשר האורגנואידים הנגזרים מורצין גדלים במהירות כפולה מהירה יותר מאשר אורגנואידים אנושיים. מלבד מינים, מהירות הגדילה תלויה בגנוטיפ ובפנוטיפים. עם זאת, כאשר הצמיחה היעילות ואת מהירות הגדילה נקבעים, פרוטוקול זה ניתן להתאים לכל סוגי הערמונית אורגאיד.
השלב הקריטי השני עובד עם תרבות תלת-ממדית המבוססת על חלבון-מטריצה, כדי להתכונן ליישומים הבאים במורד הזרם. המבוא של זריעת וריאציה על ידי צמיגות של מטריצת קרום המרתף במהלך הציפוי ניתן להימנע על ידי שימוש מדולל (70%) מטריצות קרום המרתף, כפי שמתואר. כראוי לשבור את המטריצה הפילמור ללא הפרעה מוגזמת של האורגנואידים מתואר גם בפרוטרוט. פרוטוקול זה מאפשר הפרעה של המטריצה מבלי להציג וריאציה בבדיקה ארגונית, אשר ניתן להתאים להקרנה של ספריות התרופות עבור רקעים גנטיים שונים ב-PCa. יתר על כן, על ידי ביצוע מעורבות CRISPR/Cas9-או מבוססי שביטוי מבוסס הפרעות, גנים הענקת עמידות לסמים ניתן לבצע שאילתה.
נקודת התחשבות היא כי ההרכב הבינוני של תרבות אורגאיד הערמונית יכול להשפיע על התגובה הפרמקולוגית. לדוגמה, EGF, רכיב של תרבות הערמונית והאדם האנושי, מפחית במידה ניכרת את הרגישות נגד אנדרוגן. מכאן, EGF מושמט בפרוטוקול זה מן המדיום, ואת הרגישות נגד אנדרוגן הוא שוחזר. מומלץ לקבוע אם מרכיבים אורגנואיד משפיעים על רגישות לתרופה הנבדקת. זה מחזיק נכון במיוחד עבור המדיום האנושי המורכב הערמונית אורגאיד התרבות, אשר (מלבד EGF, הראש, R-spondin1, DHT, ו-A83-001 [ההרכב של מדיום אורגנואיד מוראיד]) מכיל גורם צמיחה פיברופיצוץ 10 (FGF10), FGF2, proגלנדין E2, ניקולט, ו p38i מעכב SB202190.
הרכב בינוני אורגאיד מעדיף את התפתחותם של אפיתל הערמונית שפיר על רקמת סרטן, ולכן אין הורמון ראשי ההורמון PCa אורגנואיד הקווים הוקמו. כיום, כל ארגון PCa האנושי נגזר מחולים עם מתקדם גרורות נגד אנדרוגן עמיד PCa; מכאן, רוב הקווים האלה הם אנטי אנדרוגן עמידים ומתאים לזיהוי טיפולים חדשים. כמו הוכחה-of-קונספט, דלתא כמו 3 (DLL3) זוהה כיעד טיפולית באמצעות מטופל נגזר NEPC אורגנואידים כי הם המטרה עם rovalpituzab tesirine13. שיטה זו מתאימה לסוגים אלה של ניסויים והוא גם מתאים לאורגנואידים הערמונית מרקמות שפיר נורמלי, סרטן הערמונית העיקרי, ו CTCs.
מחסור אחד בתרבות אורגאידית של הערמונית הוא העדר נישה תאית. לפיכך, תרומות להתנגדות לסמים באמצעות תאים שאינם סרטניים לא ניתן ללמוד באמצעות הפלטפורמה הנוכחית. עם זאת, שיתוף תרבויות של סרטן המעי הגס וסרטן ריאות אורגנואידים עם תאים עצמיים T הוקמו לאחרונה, המאפשר מחקרים של אינטראקציות בין הגידול למערכת החיסונית14. מערכות שיתוף התרבות האחרות ניתן להקים למחקר נוסף שאינם-תאים אוטונומית אינטראקציה.
לסיכום, דו ח זה מספק פרוטוקול מפורט עבור הערכה הניפרקות של תגובות תרופתי באורגנואידים הערמונית ויישומים הבאים במורד הזרם. וחשוב מכך, פרוטוקול זה ישים באופן נרחב וניתן להשתמש בו לתרבויות אורגנואיד של איברים אחרים, כולל המעי הגס15, מעיים קטנים16 , קיבה17,18, כבד19, לבלב20, כליה21, ובלוטת החלב22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ג. ל. ס משרתת את מועצת המנהלים של נובארטיס; הוא מהמייסדים של תרופות וממציא של enzalutamide ו apalutamide; הוא יועץ מדעי של אגיוס, בייגן, תוכנית, טור קבוצה, פוגהורן, הודיני פרמה, Nextech, KSQ, פטרה, ו PMV; והוא המייסדים של סרגון, שנרכש על ידי גנאנטק/רוש ב2014. W.R.K. הוא ממציא ומחזיק פטנטים של טכנולוגיית אורגאיד.
Acknowledgments
K.P. נתמך על ידי NIH 1F32CA236126-01. C.L.S. נתמך על ידי HHMI; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; וכוכב סרטן קונסורציום. W.R.K. נתמך על ידי הקרן לסרטן הולנדית/KWF Buit 2015-7545 ו סרטן הערמונית הקרן PCF 17YOUN10.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid medium component: Final concentration 200 nM |
| ADMEM/F12 | Gibco/Life technologies | 12634028 | Organoid medium component |
| B27 | Gibco/Life technologies | 17504-044 | Organoid medium component |
| Cell culture plates | Fisher | 657185 | |
| Cell Titer Glo | Promega | G7571 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073 | Organoid medium component: Final Concentration 1 nM |
| DMSO | Fisher | BP231-100 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Organoid medium component: Final concentration 50 ng/ml for mouse, 5 ng/nl for Human |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 ng/ml |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Human specific organoid medium component: Final concentration 5 ng/ml |
| Glutamax | Gibco/Life technologies | 35050079 | Organoid medium component |
| HEPES | MADE IN-HOUSE | N/A | Organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| Matrigel (Growthfactor reduced & Phenol Red free) | Corning | CB-40230C | Organoid medium component |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | Organoid medium component: Final concentration 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 mM |
| NOGGIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with Noggin construct (Karthaus et al. 2014) | 120-10C | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 100 ng/ml |
| Penicillin/Streptavidin | Gemini Bio-Products | 400-109 | Organoid medium component |
| Phospatase inhibitors | Merck Millipore | 524629 | |
| Prostaglandin E2 | Tocris | 3632464 | |
| Protease Inhibitors | Merck Millipore | 539131 | |
| R-SPONDIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with R-Spondin1 construct (Karthaus et al. 2014) | 120-38 | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 500 ng/ml |
| RIPA buffer | Merck | 20-188 | |
| RNA-easy minikit | Qiagen | 74104 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 μM |
| TryplE | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 | Organoid medium component: Final Concentration 10 μM |
References
- Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162 (2), 454 (2015).
- Arora, V. K., et al. Glucocorticoid Receptor Confers Resistance to Antiandrogens by Bypassing Androgen Receptor Blockade. Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).
- Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
- Mu, P., et al. SOX2 promotes lineage plasticity and antiandrogen resistance in TP53- and RB1-deficient prostate cancer. Science. 355 (6320), 84-88 (2017).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Bose, R., et al. ERF mutations reveal a balance of ETS factors controlling prostate oncogenesis. Nature. 546 (7660), 671-675 (2017).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Carver, B. S., et al. Reciprocal feedback regulation of PI3K and androgen receptor signaling in PTEN-deficient prostate cancer. Cancer Cell. 19 (5), 575-586 (2011).
- Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
- Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Puca, L., et al. Delta-like protein 3 expression and therapeutic targeting in neuroendocrine prostate cancer. Science Translational Medicine. 11 (484), eaav0891 (2019).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell stem cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. , 1-25 (2017).
