Summary
췌장 덕트 선암의 환자 유래 오르가노이드 배양은 높은 충실도를 가진 상피 종양 세포 구획을 나타내는 급속하게 확립된 3차원 모형, 이 치명적인 악성에 번역 연구를 가능하게 합니다. 여기에서, 우리는 이 모형을 사용하여 관련 생물학 생물학 생물학 적인 생물학 적인 생물학 적인 생물학 적인 생물학 을 능력을 발휘하기 위하여 오르가노이드를 설치하고 전파하기 위하여 상세한 방법을 제공합니다.
Abstract
췌장 덕트 선암 (PDAC)은 가장 치명적인 악성 종양 사이에 있습니다. 최근에는 이 질병의 3차원(3D) 모델링을 가능하게 하는 차세대 오르가노이드 배양 방법이 기술되고 있다. 환자 유래 오르가노이드(PDO) 모델은 수술 표본뿐만 아니라 작은 생검에서 분리될 수 있으며 배양에서 빠르게 형성될 수 있다. 중요한 것은, organoid 모형은 환자의 종양에서 검출된 병원성 유전 변경을 보존하고 환자의 처리 반응의 예측, 따라서 번역 연구를 가능하게 합니다. 여기서, 우리는 3D, 매트릭스 임베디드, 오르가노이드 모델을 연구하기 위해 조직 배양 워크플로우를 적응시키기 위한 포괄적인 프로토콜을 제공합니다. 우리는 1 차적인 PDAC 오르가노이드를 격리하고 전파하기 위한 방법 그리고 고려사항을 상세히 설명합니다. 또한 맞춤형 오르가노이드 미디어가 실험실에서 어떻게 준비되고 품질이 조절되는지 설명합니다. 마지막으로, 우리는 핵산 (DNA와 RNA)의 격리와 같은 오르가노이드 모형의 하류 특성화를 위한 실험 (DNA와 RNA), 및 약 시험을 기술합니다. 중요한 것은 우리는 연구 실험실에서 유기적 방법론을 구현하기위한 중요한 고려 사항을 제공합니다.
Introduction
췌장 덕트 선암(PDAC)은 대부분의 환자에서 늦은 진단, 효과적인 치료법의 부족, 그리고 10% 미만으로 남아 있는 5년 전체 생존율이 낮은 치명적인질환이다. 환자의 20%만이 치료외과적 개입에 적합한 국부성 질환으로 진단된다2,3. 나머지 환자는 전형적으로 소수의 환자4,5에서효과적인 화학치료제의 조합으로 치료된다. 이러한 긴급한 임상 적 요구를 해결하기 위해 연구자들은 조기 발견 전략과 보다 효과적인 치료법 개발에 적극적으로 노력하고 있습니다. 중요한 발견의 임상 번역을 가속화하기 위하여는, 과학자는 유전으로 조작한 마우스 모형, 참을성 있는 파생된 이종이식, 단층 세포 선 및, 가장 최근에, organoid 모형6를채택하고 있습니다.
변형되지 않은 전구세포의 증식을 자극하는 성장인자 및 Wnt-리간드를 이용한 3차원 상피 오르가노이드 배양은 마우스장(7)에 대해 최초로 기술되었고 정상 인간 췌장 조직에 신속하게 적응시켰다8. 일반적인 덕트 조직 이외에, organoid 방법론은 인간 PDAC8의격리, 확장 및 연구를 허용합니다. 중요한 것은, 이 방법은 수술 표본에서 오르가노이드의 확립뿐만 아니라 미세 및 코어 바늘 생검을 지원하여 연구원이 질병의 모든 단계를 연구 할 수있도록9,10. 흥미롭게도, 환자 유래 오르가노이드는 잘 기재된 종양 전사체 아류형을 재입증하고 정밀 의학 플랫폼9,11의개발을 가능하게 할 수 있다.
PDAC를 위한 현재 organoid 프로토콜은 화학 순진한 환자에게서 참을성 있는 견본의 70% 이상 의 성공적인 확장을 가능하게합니다 9. 여기에서 우리는 환자 유래 PDAC 오르가노이드를 분리, 확장 및 특성화하기 위해 실험실에서 사용하는 표준 방법을 제시합니다. 다른 PDAC 조직적 방법론은12,13에 기술되었지만 이들 방법의 비교는 철저히 수행되지 않았다. 이 기술은 비교적 새롭고 빠르게 발전하기 때문에 이러한 프로토콜은 계속 진화하고 개선될 것으로 기대합니다. 그러나 조직 취급 및 오르가노이드 문화의 원리는 계속 유용할 것입니다.
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Protocol
연구 사용을 위한 모든 인간 조직 수집은 내부 검토 위원회(IRB)에 의해 검토되고 승인되었습니다. 다음 의정서는 모두 포유류 조직 배양 실험실 환경에서 무균 조건하에서 수행된다.
1. 미디어 준비
- 컨디셔닝된 미디어 준비.
참고: 인간의 췌 장 오르가노이드 매체는 유기 체 확장에 대 한 충분 한 성장 자극을 제공 하기 위해 풍부한 성장 인자 및 영양소 뿐만 아니라 조건부 미디어 보충 필요. 아래에 기술된 두 조절 배지는 시판되는 세포주로부터 제조된다(재료 표참조). 전체 프로토콜 및 자료는 제조업체의 웹 사이트를 참조하십시오.- 제조업체의 프로토콜에 따라 R-spondin1 컨디셔닝 미디어를 생산합니다.
- 먼저, 풍부한 혈청(10%)이 있는 상황에서 적절한 항생제(Zeocin) 선택 방법을 사용하여 R-spondin1을 발현하는 293T 세포를 확장한다. 컨디셔닝된 매체를 생산할 때, 항생제 선택과 혈청을 철회하고 씻어내지 않고 최종 조절된 매체에 항생제와 혈청이 존재하지 않는다. 중요한 것은, 컨디셔닝된 매체는 교차 오염을 방지하기 위해 수집 후(0.2 μm) 후 필터멸균되어야 합니다.
- 단기간 사용(6개월 이내) 또는 장기 보관을 위해 -20°C(6개월 이상)에 4°C에서 aliquoted 컨디셔닝 된 매체를 저장하십시오. 동결 해동 주기는 피해야 한다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 L-Wnt-3A 컨디셔닝 미디어를 생산합니다.
- 먼저, 풍부한 혈청(10%)이 존재하는 적절한 항생제(G-418) 선택 방법을 사용하여 L-Wnt-3A를 발현하는 L-M(TK-) 세포를 확장한다. 컨디셔닝 된 매체를 제조 할 때, 항생제 선택을 철회하고 씻어 내지 않고 최종 조절 된 매체에 항생제가 존재하지 않는다; 그러나, 배양 및 컨디셔닝 전반에 걸쳐 혈청을 유지하십시오. 중요한 것은 수집된 컨디셔닝 된 매체는 교차 오염을 방지하기 위해 필터 멸균 (0.2 μm)해야 합니다.
- aliquoted 컨디셔닝된 매체를 단기 용으로 4°C, 또는 장기 보관을 위해 -20°C에 저장합니다. 동결 해동 주기는 피해야 한다.
- 품질 관리를 위해, 이전에 게시된 프로토콜14에따라 단독으로 그리고 조합하여 R-spondin1 및 L-Wnt-3A 컨디셔닝 된 미디어의 Wnt 활성을 테스트하기 위해 TOPFLASH 분석실험을 수행한다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 R-spondin1 컨디셔닝 미디어를 생산합니다.
- 기저 매체 준비: 완전한 오르가노이드 매체의 준비뿐만 아니라 오르가노이드 작업을 위한 세척 단계를 위해 기초 매체를 사용하십시오. 글루타민과 함께 고급 DMEM/F-12를 1x, HEPES(10 mM), 페니실린/스트렙토마이신(100 U/mL)의 최종 농도로 보충하십시오. 기저 매를 4 °C에서 저장하십시오.
- 오가노이드 완전 미디어 준비: R-spondin1 컨디셔닝 매체로 기저 매체를 최종 농도 10% v/v, L-Wnt-3A 컨디셔닝 된 매체를 50% v/v의 최종 농도로 보충하고, 휴먼 EGF (50 ng/mL), 휴먼 FGF (100 ng/mL), 휴먼 가스트린 I (10 nM), 마우스 노긴 (100 ng/mL), A83-01 (50 0 nM), B27 보충 (1x), 니코틴 아미드 (10 mM), N-아 세 틸 시스테인 (1.25 mM), 그리고 프리모신 (100 μg/mL).
- 1차 오르가노이드 분리의 경우, 해동된 오르가노이드 배양, 및 단일 세포로 시작하는 배양물의 경우, 10.5 μM의 최종 농도에서 Rho 키나아제 억제제 Y-27632를 포함한다.
- 인체 오르가노이드 완전 매체를 얼음 위에 준비하고 1개월 이내에 사용하기 위해 4°C에서 보관하십시오. 이러한 이유로, 우리는 미디어의 신선한 주간 준비를 권장합니다.
2. PDAC 오르가노이드의 격리
참고: 지하 멤브레인 추출물(BME) 용액(성장 인자 감소; 재료 표참조)을 사용하기 전에 적어도 12시간 동안 4°C 환경(냉장고 또는 냉장실)의 얼음 위에 녹입니다. 유기체 배양판에 대한 조직 배양판을 사용 전에 적어도 12시간 동안 37°C 인큐베이터에서 배양한다.
- 조직의 생존가능성을 유지하기 위해 완충된 저장 용액에서 연구를 위해 외과적으로 제거된 종양 시편을 수집하고 수송한다. 기저 매 또는 시판되는 조직 저장 용액을 사용하십시오.
- 시편을 받은 후 가능한 한 빨리 오르가노이드를 분리하십시오. 조직은 수술 후 최대 24시간까지 저장 용액에 보관할 수 있으며 여전히 오르가노이드를 산출할 수 있습니다.
- 일단 실험실에서, 10cm 조직 배양 접시에 종양을 옮기고 저장 용액을 제거하십시오.
- 금속 집게로 조직을 처리하는 동안, 1mm3 이하의 작은 조각으로 #10 메스로 종양을 다진다. 더 큰 조각은 소화하는 데 시간이 오래 걸릴 것입니다. 따라서 균일 한 조직 단편 크기를 생성하는 것을 목표로합니다. 조직이 이미 분해되어 있거나 1mm3 개보다 작은 조각인 경우이 단계를 건너 뜁니다.
- 조직 단편을 10 mL의 기저 매지를 포함하는 15 mL 원추형 튜브로 옮김을 전달합니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 섞는다. 튜브를 200 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 스핀 후 조직 단편을 잃지 않도록 기저 매체를 조심스럽게 제거하십시오.
- 조직 단편을 포함하는 관에 기초 매체의 9 mL 및 10x 젠틀 콜라게나아제/히알루로니다제 용액의 1 mL을 추가합니다. 소화 중에 세포의 응모를 피하려면 이 용액을 10 mg/mL DNAse I 용액 20 μL로 보충하십시오. 튜브를 여러 번 뒤집어 섞는다.
- 영양기 또는 회전자위에 37°C에서 효소 소화를 배양합니다. 소화 중에 적절한 혼합을 위해 조직 단편은 용액을 통해 끊임없이 이동해야합니다.
참고 : 종양의 이 효소 해리를위한 타이밍은 모든 표본에 대해 경험적으로 결정해야합니다. 종양의 성공적인 소화는 육안으로 명확하게 식별 할 수없는 조직 단편의 크기가 감소하는 것을 특징으로합니다. 이에 따라 현미경 조직 단편이 방출됨에 따라 용액의 불투명도가 증가할 것입니다. - 30분 후, 37°C 인큐베이터로부터 원엽튜브를 제거하고 관찰한다. 조직 단편이 여전히 명확하게 보이는 경우, 일정한 혼합으로 37 °C에서 해리를 계속하십시오. 대부분의 또는 모든 조직 조각이 해리 될 때까지 30 분마다이 관찰을 반복합니다. 종양 단편의 크기 및 양뿐만 아니라 혼합의 엄격성에 따라, 이 단계는 작은 견본을 위해 30 분 또는 더 큰 종양 견본을 위해 12 시간만큼 적게 취할 수 있습니다.
- 효소 해리가 완료되면 튜브를 200 x g에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 스핀 후, 세포 펠릿이 표시되어야하며 상류는 모든 세포가 용액에서 회전되었음을 나타내는 명확해야합니다. 그렇지 않은 경우 스핀을 반복합니다.
- 조심스럽게 세포 펠릿을 잃지 않도록 상류를 제거하십시오. 튜브를 반전과 부드럽게 혼합하여 10 mL 기저 매체로 즉시 세포를 씻으십시오. 튜브를 200 x g에서 5 분 동안 조심스럽게 제거하여 세포 손실을 피하고 총 2 번 세탁을 위해이 세척 단계를 한 번 더 반복하십시오.
- 두 번째 세척 후, 모든 기초 매체를 조심스럽게 제거하고 튜브를 얼음 위에 5 분 동안 놓습니다.
- 이때, 37°C의 수조에 오르가노이드 완전 매질의 알리쿼트(aliquot)를 미리 데운다.
- 얼음에 튜브를 유지하면서 얼음 차가운 BME와 세포 펠릿을 혼합. 사종 밀도는 오르가노이드 격리를 위해 높어야 합니다. 작은 펠릿 (~50 μL 부피)의 경우 BME 200 μL을 사용하고 큰 펠릿 (~ 200 μL 부피)은 800 μL의 BME를 사용합니다. 용액에 기포를 생성하는 것을 피하면서 용액이 균일하게 나타날 때까지 p200 파이펫을 사용하여 얼음에 세포와 BME를 혼합하십시오.
- p200 파이펫을 사용하여 미리 따뜻해진 12웰 플레이트의 중앙에 100 μL 돔을 놓습니다. 모든 BME 솔루션이 디스펜싱될 때까지 이 작업을 반복합니다. 플레이트를 37°C 인큐베이터로 조심스럽게 옮겨 BME 겔이 고화될 수 있도록 합니다.
- 10 분 후, 접시를 회수하고 잘 당 미리 온난 한 오르가노이드 완전 매체 1 mL을 추가합니다. BME 돔의 중단을 방지하기 위해 우물 측면에 있는 미디어를 분배합니다.
- 밝은 필드에 있는 4x 렌즈를 사용하여 반전된 조직 배양 현미경을 사용하여 세포 단편을 관찰하십시오.
참고 : 단일 세포와 현미경 조직 조각은 명확하게 볼 수 있어야합니다. 성공적인 고립은 24-48 시간 후에 10 개 이상의 오르가노이드가 나타나는 것을 특징으로합니다. 문화는 1 주일 이내에 융합되어야한다. 종양 견본이 이질적이기 때문에, 그림 1에도시된 것과 같이 몇몇 오르가노이드가 잘 성장하기 때문에 몇몇 오르가노이드 격리는 더 도전적입니다. 이 경우, 배양이 최대 2주 동안 계속되도록 하여 패시징에 사용할 수 있는 셀의 수를 최대화한다. 배양 중 미디어 소비와 증발을 고려하기 위해 5일마다 200 μL의 미리 온난한 오르가노이드 완전 배지로 배양을 마무리합니다.
3. PDAC 오르가노이드의 통과
- 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 회수합니다. 멸균 셀 리프터를 사용하면 BME 돔을 부드럽게 들어 올려 전체 미디어에 떠 있습니다. 플라스틱에 부착된 단층 세포를 제거하지 않도록 우물 바닥을 긁어내는 것은 일반적으로 섬유아세포이기 때문에 피하십시오.
- p1000 파이펫을 사용하여 BME 돔과 미디어를 15mL 원엽 튜브로 조심스럽게 옮김을 전달합니다. 잘 포함 된 모든 오르가노이드에 대해이 단계를 반복하십시오.
- 차가운 기저 부전 1 mL로 수확 한 각 우물을 부드럽게 씻고, 오르가노이드를 함유 한 15 mL 튜브로 옮김.
- 용액과 오르가노이드를 p1000 파이펫과 철저히 혼합하고 200 x g에서 5분 동안 스핀다운합니다. 회전 후, 현탁액과 오르가노이드 펠릿에 오르가노이드를 포함하는 BME 층이 관의 바닥에 나타납니다. 조심스럽게 BME / 오르가노이드 층의 손실을 피하면서 상층을 제거하십시오. 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
- 튜브에 10 mL의 얼음 차가운 세포 회수 용액 (CRS)을 추가하고 반전하여 철저히 혼합하십시오. 이는 겔화 된 BME의 단백질 매트릭스를 4 °C에서 중합시킬 것이다. 3분마다 반전에 혼합하면서 얼음에 30분 동안 배양합니다. 사용 가능한 경우 튜브를 냉실 또는 4°C 냉장고에 30분 동안 회전 믹서에 놓습니다.
- 30 분 배양 후, 5 분 동안 200 x g에서 아래로 돌입니다. BME 층이 사라져야 하는 동안 오르가노이드 펠릿은 명백해야 합니다. BME 층의 크기가 감소하지만 여전히 보이는 경우, 혼합 및 반복 스핀과 함께 4 °C에서 추가로 30 분 동안 배양하십시오.
- BME가 중합되면, 유기체 펠릿 뒤에 떠나는 CRS를 제거하십시오. 반전과 혼합하여 10 mL 기저 매체로 오르가노이드를 씻으소서. 200 x g에서 5 분 동안 회전하고 상류를 제거하십시오. 오가노이드 펠릿이 있는 튜브를 얼음 위에 적어도 5분 동안 놓습니다.
- 선택적으로, 단일 세포 제제를 원하는 경우, 소화 중에 세포의 응모를 피하기 위해 30 μL의 10 mg/mL DNAse I 용액으로 보충된 3 mL 트립신으로 오르가노이드를 배양한다.
- 37°C에서 효소 반응을 배양하고 2분마다 최대 10분 동안 부드러운 반전을 혼합합니다.
- 효소 반응을 막으려면 10 mL의 얼음 차가운 기저 매체를 넣고 200 x g에서 5 분 동안 회전하십시오.
- 부드러운 반전과 혼합하여 10 mL 기저 부로 세포를 씻으소서. 200 x g에서 5 분 동안 스핀 다운하고 상류를 제거하고 한 번 더 세척을 반복하십시오. 적어도 5 분 동안 얼음에 세포 펠릿튜브를 놓습니다.
참고 : 우리는 오르가노이드의 많은 수의 균일 한 문화를 생성하기 위해 오르가노이드의 정기적 인 유지 보수 동안 모든 3-5 구절이 단계를 수행하는 것이 좋습니다.
- 얼음 차가운 BME를 세포 펠릿에 넣고 p200 파이펫을 사용하여 용액이 균일해질 때까지 얼음에 부드럽게 섞습니다. 혼합물에서 거품을 생성하는 것을 피하면서, 파이펫을 적어도 5-10x 위아래로, 파이프의 바닥에 가까운 파이펫의 끝을 배치하여 기계적으로 오르가노이드를 분해하는 데 도움이됩니다. 가이드로서, 분할 비율이 한 구절에서 다른 통로로 1:2 이하가 되도록 BME/셀 펠릿의 부피의 4-6배를 사용하십시오.
- p200 피펫을 사용하여 미리 따뜻인 12웰 플레이트의 웰 의 중앙에 100 μL 돔을 스팟; 모든 BME 솔루션이 분배될 때까지 반복합니다. 플레이트를 37°C 인큐베이터로 조심스럽게 옮겨 BME 겔이 고화될 수 있도록 합니다. 10 분 후, 접시를 회수하고 잘 당 미리 온난 한 오르가노이드 완전 매체 1 mL을 추가합니다. BME 돔의 중단을 방지하기 위해 우물 측면에 있는 미디어를 분배합니다.
- 오르가노이드는 24시간 이내에 성장하고 시작해야 합니다. 필요한 경우, 성장 인자 고갈 및 증발을 보상하기 위해 5 일마다 200 μL의 미리 온난 한 오르가노이드 완전 배지로 배양을 위로 합니다.
4. PDAC 오르가노이드의 동결 및 해동
- 오르가노이드를 동결하려면, 오르가노이드를 수확하고 단계 3.1-3.7에 설명된 대로 BME를 중합한다.
- 세포 펠릿에, 동결 매체 의 1 mL를 추가, 부드럽게 혼합, 미리 표지 된 cryovial에 혼합물을 전송.
- 냉동 용기에 저온을 놓고 안전한 일정한 온도 감소를 유지하고 -80°C 냉동실에 놓습니다. 24~48시간 후에 냉동 바이알을 액체 질소 저장으로 옮김을 옮김. 오가노이드는 이 방법을 사용하여 수개월에서 수년 동안 냉동 보존될 수 있습니다.
- 오르가노이드를 해동하려면 액체 질소 저장에서 냉동 된 저온을 회수하십시오. 드라이 아이스에 얼어붙은 바이알을 조직 배양실로 운반합니다.
- 냉동 저온을 37°C 수조에 놓고 오르가노이드를 빠르게 해동하고 유리병의 내용물을 실온으로 데운 기저 매질 9 mL를 함유하는 15 mL 원추형 튜브로 옮니다.
- 200 x g에서 5 분 동안 회전하고 상류를 제거하십시오. 오가노이드 펠릿이 있는 튜브를 얼음 위에 적어도 5분 동안 놓습니다.
- 단계 3.9-3.11에 기재된 바와 같이 BME에서 재중단하고 오르가노이드를 플레이트화한다.
참고: 유기체 배양은 동결/해동 주기 후에 천천히 회복되므로 배양은 통과하기 전에 최대 2주 동안 재배될 수 있습니다.
5. PDAC 오르가노이드의 특성화
참고 : 오르가노이드의 특성은 섬유 아세포 및 면역 세포와 같은 비 상피 세포 유형에서 오염의 위험을 감소시키기 위해 여러 구절 후 확립 된 배양에서 수행되어야한다.
- PDAC 오르가노이드에서 핵산 추출
- 핵산 추출에 전념하는 12 개의 웰 플레이트에 판오르가노이드. 플레이트 는 웰 당 BME의 100 μL 이하. 적절한 DNA/RNA 수율을 위해, 배양당 적어도 2-4웰을 플레이트. 컬쳐가 수렴에 가깝지만 장기간 배양물에 축적되는 과도한 세포 파편이 없는 때까지 최대 5일 동안 오르가노이드를 키우세요.
- 37 °C 인큐베이터에서 플레이트를 회수하고 오르가노이드가 들어있는 BME 돔만 플레이트에 남기고 오르가노이드 완전 매체의 모든 흔적을 완전히 제거합니다.
- 900 μL의 산 페놀 시약(재료 표참조)을 각 우물에 넣고 용액이 균질해질 때까지 p1000 파이펫을 사용하여 완전히 섞습니다. BME는 페놀 시약에 완전히 용해될 것이고, 오르가노이드는 짧은 5분 배양 후에 용해될 것이다.
주의: 산성 페놀은 화학적 화상을 일으킬 수 있는 유해 화학물질입니다. 적절한 보호 및 기술을 사용하여 주의하여 취급하십시오. - 균일 한 용액을 2 mL 튜브로 옮기고 200 μL의 클로로포름을 추가합니다. 4 °C에서 15 분 동안 12,000 x g에서 5 분 및 원심 분리기를 배양하십시오.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 RNA 및 DNA 추출을 진행합니다. RNA는 수성 상에서 추출될 수 있고 DNA는 상 간 및 유기상으로부터 추출될 수 있다. 일단 정제되고 정량화되면, 동일한 배양물의 상이한 웰로부터 분리된 RNA 및 DNA는 수율을 증가시키기 위해 풀화될 수 있다.
참고 : (1) RNA에 대한이 핵산 추출 방법을 사용하는 것이 좋습니다, 배양 세포에서 DNA를 분리하기위한 많은 좋은 방법이 있다. (2) 오르가노이드 배양 내 종양 세포의 존재를 확인하기 위해, PDAC 특징 유전자(KRAS, TP53, SMAD4, CDKN2A)내에서 돌연변이를 식별하기 위해 선호하는 차세대 염기서열 분석법을 사용하여 DNA를 시퀀싱하는 것이 좋습니다.
- PDAC 오르가노이드의 약전
- 단계 3.1-3.8에서 전술한 바와 같이 오르가노이드로부터 단일 세포를 분리한다. 셀 수를 최대화하기 위해 12개의 웰 플레이트중 최소 10개의 웰을 수확합니다.
- 1 mL 인간 오르가노이드 완전 매체에 단 하나 세포를 다시 중단하십시오. 작은 세포 덩어리 (~2-10 세포)의 존재는 허용됩니다, 그러나 더 큰 세포 덩어리는 다운스트림 분석에 부정적인 영향을 미칠 것입니다.
- 자동화된 셀 카운터를 사용하여 셀을 계산하고 셀 생존 가능성을 기록합니다. 1 mL 현탁액에 존재하는 세포 및 생존 세포의 총 수를 계산합니다.
- 치료 테스트를 위해, 플레이트 1,000 웰 당 384 웰 플레이트. 384 웰 플레이트의 경우 400,000개의 가능한 셀을 사용할 것으로 예상됩니다(400웰에 대해 계산).
- 세포를 포함하는 오르가노이드 완전 매체의 7.2 mL와 BME의 얼음 800 μL에 혼합하여 도금을 위한 세포를 준비한다. 384 웰 플레이트의 우물 당 얼음과 접시 에 혼합물을 20 μL 유지합니다. 12채널 파이펫과 저수지를 얼음 위에 보관하여 세포를 효율적으로 플레이트합니다. 플레이트에서 과도한 증발을 방지하기 위해 외부 우물은 저수지 (60 μL PBS 또는 우물 당 물)로 사용할 수 있지만 76 개의 실험 용 우물이 손실될 수 있습니다.
- 스윙 버킷에서 1분 동안 100 x g으로 플레이트를 회전시면 됩니다. 이를 통해 20 μL의 작은 부피와 오르가노이드가 플레이트 바닥에 정착할 수 있습니다.
- 37°C 조직 배양 인큐베이터에 플레이트를 놓아 오르가노이드가 형성되도록 하였다. 24 시간 후, 밝은 필드 현미경을 사용하여 오르가노이드의 존재를 확인하십시오.
- DMSO에 용해된 치료 화합물을 약물 프린터 또는 동등한 기기를 사용하여 플레이트 상에 주입하는 것을 진행한다. 적어도 세 배의 우물에서 각 약물 용량을 테스트합니다. 효과적인 복용량 응답 분석을 수행 하려면, 경험적으로 각 약물에 대 한 복용량 범위를 결정, 낮은 시작, 효과, 복용량 및 최대 효과 관찰 높은 복용량으로 끝나는. 화학요법 화합물에 대한 투여 량 범위의 예는 최근에9.
- 3-5 일 동안 치료 화합물에 세포를 노출하십시오.
- 선택적으로, 분석의 끝에서, 유기체 크기, 수 및 형태학에 대한 치료 효과를 평가하기 위해 플레이트를 이미지화한다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 발광 세포 생존 성 시약 당 20 μL을 사용하여 생존 가능성을 평가합니다(재료 표참조). 데이터 수집및 데이터 분석을 위한 그래프 소프트웨어에는 광도계가 필요합니다.
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Representative Results
PDAC에서 오르가노이드를 분리하는 것과 관련된 문제를 설명하기 위해, 우리는 작은 세포내 종양 샘플로부터 환자 유래 오르가노이드 배양물의 확립을 보여준다. 초기 도금 후 그림 1과같이 웰당 몇 개의 오르가노이드만 보였습니다. 오가노이드는 2주 동안 더 크게 성장할 수 있었고, 초기 및 후기 통로 1의 대표적인 사진에 나타난 바와 같이 보다 견고한 문화를 확립하기 위해 우리의 프로토콜에 따라 통과되었다(그림1). 2.13단계에서 설명한 바와 같이, 후기 1차 분리기에서 관찰된 더 큰 낭포성 오르가노이드는 오르가노이드와 얼음-차가운 BME를 혼합하는 동안 더 작은 조각으로 쉽게 분해되었다는 점에 유의하는 것이 중요하다.
약리화 프로토콜의 결과를 입증하기 위해, 우리는 이 프로토콜에 기재된 바와 같이 확립되고 빠르게 성장하는 대표적인 PDAC 오르가노이드로부터 단일 세포를 준비하였다. 1,000개의 생존 가능한 세포를 웰당 도금하고 세포독성 화학요법제, 젬시타빈 및 파클리탁셀전에 24시간 이상 회복할 수 있도록 하였다. 우리는 100 pM의 낮은 복용량으로 시작하고 2 μM의 고용량으로 끝나는 삼중항에 있는 9 점 복용량 반응 분석기를 수행했습니다. 5일 치료 후, 대표적인 사진을 비히클(DMSO), 2 μM 젬시타빈, 및 2 μM 파클리탁셀 처리웰(그림 2)에대해 촬영하였다. 사진을 찍은 직후, 발광 세포 생존성 시약을 사용하여 세포 생존 가능성을 평가하고 그래프 소프트웨어를 사용하여 플롯하였다(그림2).
그림 1: 대표적인 사진은 첫 번째 통로 이후뿐만 아니라 PDAC 오르가노이드 격리를 위해 도시된다. 초기 (1-3 일) 및 늦은 (7-10 일) 시간 포인트는 시간이 지남에 따라 유기 성 성장을 설명하기 위해 표시됩니다. 배율 표시줄 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 투여량 응답 분석. (왼쪽) 확립된 PDAC 오르가노이드 배양을 사용하여 얻은 대표적인 투여량 반응 분석은 오차 막대로 나타난 삼중체의 표준 편차와 함께. (오른쪽) 비히클(DMSO) 처리의 끝부분과 2 μM 젬시타빈 및 2 μM 파클리탁셀의 효과를 보여주는 사진. 배율 표시줄 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에서는 환자 유래 PDAC 오르가노이드를 분리, 확장 및 특성화하기 위한 현재 프로토콜을 제시합니다. 오르가노이드 문화를 확립하는 우리의 현재 성공률은 70 % 이상입니다; 따라서 이러한 방법은 아직 완성되지 않았으며 시간이 지남에 따라 개선되고 진화할 것으로 예상됩니다. PDAC는 낮은 신생물 세포성을 가지고 있기 때문에 샘플 크기에 중요한 고려 사항을 주어야합니다. 따라서, 작은 견본은 몇몇 종양 세포를 포함하고, 단지 오르가노이드의 소수를 생성할 것입니다. 추가적으로, 많은 환자는 외과 적 개입15의앞에 화학요법 및/또는 화학방사선 기지를 둔 neoadjuvant 처리를 수신합니다. 치료가 특정 환자에게 효과적이면, 종양 조직은 생존 세포가 결여될 수 있다. 화학-순진한 환자 샘플의 취득은 이 방법의 초기 최적화를 위해 바람직하지만, 이것이 항상 가능한 것은 아니다. 흥미롭게도 우리는 샘플이 24 시간 이내에 처리되는 한 종양 조직의 외과 적 제거 후 허혈 시간이 성공적인 오르가노이드 격리를위한 주요 기준이 아니라는 것을 발견했습니다.
췌장 덕트 선암은 조밀 한 기질 매트릭스의 강한 탈모 반응 및 침착을 특징으로하는 질병입니다. 오르가노이드는 상피 구획의 신속한 분리 및 확장을위한 훌륭한 도구이지만, 모델은 PDAC의 복잡한 기질을 되풀이하지 않습니다. 환자 유래이종이식(16) 또는 공기 액체 계면배양(17)과 같은 다른 방법론은 기질 구획을 허용하지만, 빠르게 확장하기가 어려울 수 있다. 모델 시스템을 선택할 때, 연구원은 신중하게 각6의강점과 약점을 고려해야한다 .
이 질병의 이기종 생물학은 몇몇 환자 파생된 오르가노이드가 우리의 조건에서 극단적으로 잘 성장하는 반면 다른 비교에 의해 훨씬 느리기 때문에 오르가노이드 설립에 영향을 미칩니다. 상기 프로토콜은 모든 환자 유래 오르가노이드를 분리하고 확장하기 위한 Wnt 리간드 의 풍부한 상태를 기술하지만, 다른 것들은 일부 환자의 종양이 Wnt 컨디셔닝 된 매체11,12의부재에서 성장할 수 있음을 보여주었다. 추가 시험은 최근에 난소암 오르가노이드18에대해 입증된 바와 같이, 다양한 미디어 조건을 사용하여 오르가노이드의 성공적인 확립을 향상시키는지 여부를 결정하는 데 필요할 것이다. 이 멀티플렉스 접근법은 그러나 작은 참을성 있는 견본에서 단리될 수 있는 종양 세포의 낮은 수에 의해 제한됩니다. 추가적으로, 일반적인 비전형 덕트 오르가노이드는 오르가노이드 격리에서, 특히 종양 조직이 정상 조직에 인접한 경우에 생길 수 있습니다9. 일반적인 오르가노이드 오염의 리스크를 감소시키기 위하여는, 더 큰 조직 견본은 혈관화한 것과 같은 형태학적인 다름을 사용하여 더 작은 독립적인 단편으로 분할될 수 있습니다 (혈액은 보입니다) 대 hypovascular 지구, 및 연약한 조직 대 단단한 작은혹.
여기에 설명된 방법과 프로토콜은 오르가노이드 격리를 위해 당사 실험실에서 사용되는 현재 표준 접근법이며 각 실험실 환경에 대해 테스트및 조정되어야 합니다. 예를 들어, 종양 조직의 효소 해리(단계 2.6~2.9단계)는 최적화하는 데 특히 중요하다. 작은 장비 차이(영양기 대 회전자 믹서)는 이 단계에서 상당히 다른 타이밍을 초래할 수 있습니다. 더욱이, 조직 해리는 콜라게나아제/히알루로니다아제 혼합물의 농도를 증가 또는 감소시킴으로써 미세 조정될 수 있다. 모든 샘플을 동일한 방식으로 취급하지 않도록 주의해야 합니다. 예를 들어, 어떤 경우에는 오르가노이드는 기계적 또는 효소 해리없이 고급 PDAC 환자로부터 의 족수로부터 분리 될 수있다.
DNA 염기서열 분석은 PDAC가 KRAS, TP53, SMAD4 및 CDKN2A에서 빈번한 돌연변이에 의해 구동됨에 따라 종양 오르가노이드의 존재 또는 부재를 결정하는 현재의 금 본위제이다. 전사체 분석은 다른 종양 특수형을 밝힐 수 있고 약전은 환자 특정 치료 취약점을 밝힐 수 있는 동안9. 이 프로토콜은 PDAC 연구원이 환자 파생 오르가노이드의 그들의 자신의 도서관을 개발하고 이 모형의 생물학을 단면도하는 가능하게 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 UC 샌디에고 무어 암 센터 생물 저장소 및 조직 기술 공유 자원의 지원에 감사드립니다, 로위 실험실의 구성원, 수술의 UC 샌디에고 부서, 외과 종양학의 부문. AML은 NIH CA155620, SU2C CRUK 루스트가르텐 재단 췌장암 드림 팀 상(SU2C-AACR-DT-20-16)과 췌장암 치료 기금에 대한 기부자들의 후원을 받고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
| 12 well plates | Olympus | 25-106 | |
| 15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
| 15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 37 °C water bath | |||
| 384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
| A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
| ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Automated cell counter | |||
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
| CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Computer | |||
| CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
| Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
| DMEM | ATCC | 30-2002 | |
| DNase I | Sigma | D5025 | |
| Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
| Excel | For data analysis | ||
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
| G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
| Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
| Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
| GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
| GraphPad Prism | For data analysis | ||
| HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
| Laminar flow tissue culture hood | |||
| Luminometer | |||
| L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| p1000 pipette with tips | |||
| p200 pipette with tips | |||
| PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
| primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
| Tissue culture centrifuge | |||
| Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
| TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
| TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
| Zeocin | ThermoFisher | R25001 |
References
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