Summary
Die chipbasierte optische Superauflösungsmikroskopie ist ein neuartiger Ansatz in der Fluoreszenzmikroskopie und bietet Vorteile in Bezug auf Wirtschaftlichkeit und Durchsatz. Hier werden die Protokolle für die Chipvorbereitung und -bildgebung gezeigt für die TIRF-Mikroskopie und die lokalisierungsbasierte Superauflösungsmikroskopie.
Abstract
Die gesamte interne Reflexionsfluoreszenz (TIRF) wird häufig in der auf einer lokalisierungsbasierten Mikromikroskopie mit einer einzigen Moleküllokalisation verwendet, da sie durch optische Schnitte einen verbesserten Kontrast bietet. Der herkömmliche Ansatz besteht darin, tirF-Objektive mit hohem numerischen Blendemikroskop sowohl für die Anregung als auch für die Erfassung zu verwenden, wodurch das Sichtfeld und der Durchsatz stark eingeschränkt werden. Wir präsentieren einen neuartigen Ansatz zur Erzeugung von TIRF-Erregung für die Bildgebung mit optischen Wellenleitern, der sogenannten chipbasierten Nanoskopie. Ziel dieses Protokolls ist es, zu demonstrieren, wie die chipbasierte Bildgebung in einem bereits erstellten Setup durchgeführt wird. Der Hauptvorteil der chipbasierten Nanoskopie besteht darin, dass die Anregungs- und Sammelwege entkoppelt sind. Die Bildgebung kann dann mit einer Linse mit geringer Vergrößerung durchgeführt werden, was zu einem großen Sichtfeld von TIRF-Bildern führt, zum Preis einer geringen Reduzierung der Auflösung. Lebersinus-Endothelzellen (LSECs) wurden mit der direkten stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie(dSTORM) abgebildet, die eine Auflösung zeigt, die mit herkömmlichen Superauflösungsmikroskopen vergleichbar ist. Darüber hinaus demonstrieren wir die Hochdurchsatz-Fähigkeiten, indem wir einen Bereich mit einer niedrigen Vergrößerungslinse mit einer Auflösung von 76 nm abbilden. Durch seinen kompakten Charakter lässt sich die chipbasierte Bildgebung in die gängigsten Mikroskope umrüsten und mit anderen optischen On-Chip-Techniken wie On-Chip-Sensing, Spektroskopie, optisches Trapping usw. kombinieren. Die Technik eignet sich somit ideal für hochauflösende Bildgebung mit hohem Durchsatz, bietet aber auch große Möglichkeiten für multimodale Analysen.
Introduction
Seit der ersten Demonstration der Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie wurden viele Variationen entwickelt, um verschiedene Herausforderungen zu lösen1,2,3. Eine Herausforderung, die geblieben ist, ist jedoch großes Sichtfeld dSTORM Bildgebung. Viele dSTORM-Setups verwenden das gleiche Objektiv, um die Probe zu begeistern und zu bebildern. Um das Sichtfeld zu vergrößern, ist eine Linse mit geringer Vergrößerung erforderlich. Objektivlinsen mit geringer Vergrößerung und niedriger numerischer Blende (NA) haben in der Regel eine große Schärfentiefe, was zu einem erhöhten Signal a-of-plane führt, das die Lokalisierungsgenauigkeit verringert. TIRF-Objektive werden häufig verwendet, um den Bildkontrast zu erhöhen, indem die Fluoreszenz a-ebenereduziert wird. Durch TIRF wird die Anregung mittels eines evaneszenten Feldes4auf eine optische Dicke von ca. 150 nm von der Oberfläche begrenzt. TIRF-Objektive benötigen eine große NA, was zu einem kleinen Sichtfeld (FOV) (z.B. 50 x 50'm2) führt, was den Durchsatz deutlich begrenzt. Es gibt jedoch alternative Möglichkeiten, ein evaneszierendes Feld zu generieren.
Ein optischer Wellenleiter ist eine Struktur, die Licht einschränkt und leitet, wenn es in die Struktur gekoppelt ist. Am häufigsten werden Wellenleiter in der faserbasierten Telekommunikation verwendet. Es wurden große Anstrengungen unternommen, um 2D-integrierte Wellenleiter als Hauptbestandteil photonischer integrierter Schaltungen zu entwickeln. Die Technologie hat sich so weit entwickelt, dass die Herstellung von verlustarmen nanostrukturierten optischen Wellenleitern routinemäßig durchgeführt werden kann5. Heute können mehrere Gießereien auf der ganzen Welt verwendet werden, um photonische integrierte Schaltungen zu entwickeln. Wellenleiter leiten Licht durch die gesamte innere Reflexion, die auch ein evaneszierendes Feld an der Oberfläche aufweist. Durch sorgfältiges Design der Wellenleiterstruktur kann eine hohe Intensität im evaneszenten Bereich erreicht werden. Eine direkt auf der Wellenleiteroberfläche platzierte Probe kann somit auch durch das evaneszente Feld für bildgebende Anwendungen beleuchtet werden. Das evanescent Feld wird über die gesamte Länge und Breite des Wellenleiters erzeugt und kann somit beliebig groß gemacht werden6.
Wir präsentieren einen neuartigen Ansatz zu TIRF dSTORM, der ein beliebig großes Sichtfeld bietet. Anstatt eine TIRF-Linse sowohl für Dieregung als auch für die Sammlung zu verwenden, begeistern wir das evanescent-Feld von optischen Wellenleitern. Dadurch entkoppelt sich der Anregungs- und Sammellichtweg und ermöglicht so eine völlige Freiheit entlang des Sammlungslichtwegs, ohne die optische Nip. für eine bestimmte Wellenlänge zu beeinträchtigen, die durch die Wellenleiter-Chip-Beleuchtung bereitgestellt wird. Objektive mit geringer Vergrößerung können somit verwendet werden, um sehr große Regionen im TIRF-Modus abzubilden, obwohl eine kleinere NA die seitliche Auflösung reduziert. Darüber hinaus wird die mehrfarbige Bildgebung mit Wellenleitern7stark vereinfacht, da mehrere Wellenlängen geführt und erfasst werden können, ohne das System neu justieren zu müssen. Dies ist vorteilhaft für dSTORM, da niedrige Wellenlängen verwendet werden können, um Fluorophor-Blinken zu verbessern und für mehrfarbige Bildgebung. Es ist erwähnenswert, dass sich die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes als Funktion der Wellenlänge ändert, obwohl sie keinen Einfluss darauf hat, wie das bildgebende Verfahren durchgeführt wird. Der Chip ist kompatibel mit Live-Zell-Bildgebung8 und eignet sich ideal für Anwendungen wie die Integration von Mikrofluidik. Jeder Chip kann Dutzende von Wellenleitern enthalten, die es dem Benutzer ermöglichen können, unter verschiedenen Bedingungen abzubilden oder optische Stolpermittel9 und Raman-Spektroskopie10anzuwenden.
Das Chip-basierte System funktioniert gleichermaßen gut für beugungsbegrenzte und super-Auflösung-Bildgebung. Ein ähnlicher Ansatz wurde 2005 mit einem Prisma eingeführt, um eine evaneszente Felderregung zu erzeugen4. Der photonische Chip begeistert auch durch das evanescent Feld, aber mit modernen Waveguide-Fertigungstechniken kann man exotische Lichtmuster mit Wellenleitern erzeugen. Die derzeitige Chip-basierte Nanoskopie-Implementierung ist auf 2D-Bildgebung beschränkt, da das Anregungsfeld innerhalb der Wellenleiteroberfläche gesperrt ist. Die zukünftige Entwicklung wird auf 3D-Anwendungen abzielen. Darüber hinaus werden weitere Super-Resolution-Techniken wie die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie mit dem gleichen Chip-basierten Mikroskop11entwickelt.
Protocol
1. Herstellung der Polydimethylsiloxan (PDMS) Schicht
- Bereiten Sie eine 10:1-Mischung aus Sylgard 184 Monomer und Härtungsmittel vor.
- Legen Sie die Mischung in eine Vakuumkammer, bis Luftblasen verschwunden sind.
- Gießen Sie 1,7 g PDMS-Mischung in der Mitte einer 3,5 Zoll (Durchmesser) Petrischale.
- Legen Sie die Petrischale auf das Vakuumfutter eines Spincoaters.
- Spin Beschichten Sie die Petrischale für 20 s bei 900 U/min, mit einer Beschleunigung von 75 U/min/s.
- Die Schale auf einer Kochplatte bei 50 °C mindestens 2 h aushärten.
2. Probenvorbereitung
-
Waveguide-Reinigung
- 100 ml einer 1% Verdünnung des Reinigungsmittelkonzentrats(Materialtabelle) in deionisiertem (DI) Wasser vorbereiten.
- Den Chip mit einer Wafer-Pinzette in eine glasende Petrischale geben und vollständig mit der Waschmittellösung abdecken.
- Die Petrischale 10 min bei 70 °C auf eine Kochplatte legen.
- Während Sie noch auf der heißen Platte sind, reiben Sie die Oberfläche mit einem Reinraum-Gewebeabstrich.
- Entfernen Sie den Chip aus der Petrischale. Spülen Sie mit mindestens 100 ml DI-Wasser.
- Spülen Sie mit mindestens 100 ml Isopropanol, wobei darauf zu achten ist, dass das Lösungsmittel nicht auf der Oberfläche trocknet, um Verdunstungsflecken zu verhindern.
- Spülen Sie mit mindestens 100 ml DI-Wasser. Blasen Sie den Chip trocken mit einer Stickstoffpistole.
-
Kammervorbereitung
- Bereiten Sie eine Schicht aus 150 m Polydimethylsiloxan (PDMS) in einer Petrischale (Abschnitt 1) vor.
- Verwenden Sie ein Skalpell, um einen 1,5 cm x 1,5 cm großen Rahmen aus der PDMS-Schicht zu schneiden.
- Heben Sie den Rahmen von der Petrischale mit einer Pinzette. Legen Sie es flach auf einem sauberen und polierten Chip. Die Probe ist nun bereit für die Zellaussaat.
-
Fluoreszierende Kennzeichnung
- Bereiten Sie folgende Chemikalien vor: phosphatgepufferte Salinelösung, Farbstofflösung(n), dSTORM-Bildgebungspuffer.
- Entfernen Sie nach dem Aussäen der Zelle den Chip vom Medium.
- Verwenden Sie eine Pipette, um überschüssige Flüssigkeit von außerhalb der PDMS-Kammer zu entfernen.
- Entfernen Sie die Stromflüssigkeit aus der PDMS-Kammer mit einer Pipette, während Sie gleichzeitig etwa 60 l saubere PBS hinzufügen.
HINWEIS: Der der Kammer hinzugefügte Betrag muss entsprechend der Kammergröße geändert werden. Achten Sie darauf, nicht alle Medien von der Zelloberfläche zu entfernen. - Ersetzen Sie die PBS durch 60 l saubere PBS und lassen Sie sie für 1 min brüten.
- Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, lassen Sie ihn dieses Mal 5 min brüten.
- Entfernen Sie die PBS und ersetzen Sie sie durch 60 l der Farbstofflösung. Lassen Sie die Probe etwa 15 Minuten inkubieren und schützen Sie sie vor Licht.
HINWEIS: Dieser Schritt muss sich je nach verwendeter Fluoreszenzfarbe möglicherweise erheblich ändern. Wir verwenden CellMask Deep Red, um die Zellmembran für dieses Experiment zu kennzeichnen - Waschen Sie die Probe mit PBS wie in den Schritten 2.3.3-2.3.5.
- Entfernen Sie das PBS, und ersetzen Sie es gleichzeitig durch 40 L des Bildgebungspuffers.
HINWEIS: Es gibt mehrere verschiedene Bildgebungspuffer für verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe. - Legen Sie einen Deckelschlupf auf die Oberseite, um zu verhindern, dass sich Luftblasen darunter bilden. Drücken Sie vorsichtig den Deckelschlupf gegen die Bildkammer, um überschüssige Medien zu entfernen.
- Verwenden Sie eine Pipette, um überschüssige Medien außerhalb des Deckscheins zu entfernen. Reinigen Sie den Bereich außerhalb des Deckels mit einem feuchten Wassertupfer, um Kristalle zu vermeiden, die durch getrocknete Tauchmittelrückstände gebildet werden.
3. Imaging-Verfahren
- Komponenteneinrichtung
HINWEIS: Diese Version des Setups besteht aus drei Hauptkomponenten: mikroskop, kupplungsstufe und Probenstufe. Siehe Materialtabelle.- Verwenden Sie ein Mikroskop mit Filterhalter, weißer Lichtquelle, Kamera und Objektivrevolver.
- Verwenden Sie eine 3-Achsen-Piezo-Kopplungsstufe mit einem fasergekoppelten Laser und einer Kupplungslinse.
- Verwenden Sie eine einachsige manuelle Probenstufe mit Spitze und Neigung und einem Vakuumhalter.
- Montieren Sie sowohl die Kupplung als auch die Probenstufe auf einer 2-Achsen-Motorbühne für die Probenübersetzung.
- Waveguide-Kupplung
- Legen Sie den Chip auf das Vakuumfutter mit der Kupplungsfacet in Richtung des Kupplungsobjektivs. Stellen Sie sicher, dass der Chip etwa eine Brennweite vom Kupplungsobjektiv entfernt ist.
- Schalten Sie die Vakuumpumpe ein.
- Schalten Sie den Laser auf 1 mW ein. Stellen Sie die Spanhöhe grob ein, so dass der Strahl auf die Kante trifft. Schalten Sie den Laser aus.
- Schalten Sie die weiße Lichtquelle ein. Wählen Sie eine objektive Linse mit geringer Vergrößerung (z.B. 10x). Konzentrieren Sie das Mikroskop auf einen Wellenleiter.
- Übersetzen Sie das Mikroskop entlang des Wellenleiters, um zu sehen, ob es gut auf den optischen Pfad ausgerichtet ist. Bewegen Sie das Mikroskop auf die Kupplungskante.
- Schalten Sie den Laser mit 1 mW oder weniger ein. Übersetzen Sie das Mikroskop entlang der Kupplungskante, um das Laserlicht zu finden. Fokussieren Sie den Strahl auf die Spankante.
- Passen Sie die Kopplungsstufe entlang des optischen Pfades in die Richtung an, die die Größe des Laserstrahlflecks reduziert, bis er verschwindet. Der Strahl befindet sich nun entweder über oder unter der Spanoberfläche.
- Passen Sie die Höhe der Kupplungsstufenhöhe an, bis der Strahlfleck wieder auftaucht und maximiert wird.
- Wiederholen Sie die beiden vorherigen Schritte, bis der Laser einen fokussierten Punkt bildet.
- Bewegen Sie den fokussierten Punkt zum Wellenleiter von Interesse.
- Übersetzen Sie das Mikroskop in kurzer Entfernung vom Rand, so dass der fokussierte Strahlfleck nicht mehr sichtbar ist. Schalten Sie das weiße Licht aus.
- Passen Sie den Kontrast an. Wenn der Wellenleiter lenkt, sollte das gestreute Licht entlang des Wellenleiters deutlich sichtbar sein.
- Passen Sie die Achsen der Kupplungsstufe an, um die Streulichtintensität zu maximieren. Schalten Sie den Laser aus.
- Schalten Sie das weiße Licht ein. Passen Sie ggf. den Kontrast an.
- Navigieren Sie zum Bildgebungsbereich.
- Beugung begrenzte Bildgebung
- Fokus mit dem gewünschten Bildgebungsziel. Schalten Sie das weiße Licht aus.
- Setzen Sie den Fluoreszenzfilter ein und drehen Sie die Laserleistung auf 1 mW.
- Stellen Sie die Belichtungszeit der Kamera auf ca. 100 ms ein. Passen Sie den Kontrast nach Bedarf an. Stellen Sie sicher, dass die Kupplung noch optimiert ist.
- Suchen Sie eine Region, die für die Bildgebung von Interesse ist. Schalten Sie die Piezo-Stufenschleife in den durchschnittlichen Out-Modus ein.
HINWEIS: Der Scanbereich von 20 m mit einer Schrittgröße von 50 nm eignet sich für die meisten Wellenleiterstrukturen. - Erfassen Sie mindestens 300 Bilder.
- Laden Sie den erfassten Image-Stack mit einem virtuellen Stack nach Fidschi. Wählen Sie im Bildmenü in Fidschi Stacks und z-projectaus.
- Berechnen Sie das TIRF-Bild, indem Sie die durchschnittliche Intensitätdes Projektionstyps auswählen.
- d STORM-Bildgebung
- Schalten Sie den Laser auf 1 mW ein und stellen Sie die Belichtungszeit der Kamera auf 30 ms ein.
- Passen Sie den Kontrast und den Fokus an.
- Erhöhen Sie die Laserleistung, bis das Blinken beobachtet wird.
HINWEIS: Dies kann je nach evaneszenzfeldintensität eine Weile dauern. - Vergrößern Sie einen kleinen Bereich der Stichprobe.
- Passen Sie den Kontrast an.
- Erfassen Sie ein paar Bilder, um zu sehen, ob die Blinzeln gut getrennt sind.
- Passen Sie die Belichtungszeit der Kamera für ein optimales Blinken an.
HINWEIS: Das Optimieren des Blinkens ist eine komplexe Aufgabe, aber es gibt eine Menge geeigneter Literatur12. - Schalten Sie die Piezo-Bühnenschleife ein.
- Zeichnen Sie einen Bildstapel mit mindestens 30.000 Bildern auf, abhängig von der blinkenden Dichte.
- d STORM Bildrekonstruktion
- Öffnen Sie Fidschi und laden Sie den dSTORM-Stack als virtuelle Bilder.
- Passen Sie ggf. den Kontrast an.
- Verwenden Sie das Rechteckwerkzeug, um den zu rekonstruierenden Bereich auszuwählen.
- Open Run Analyse in der Thunderstorm13 Plugin in Fidschi.
- Legen Sie die grundlegenden Kameraeinstellungen in Gewitter fest, die dem Gerät entsprechen. Die verbleibenden Standardparameter sind in der Regel zufriedenstellend.
- Beginnen Sie mit der Rekonstruktion.
HINWEIS: Für das gesamte Sichtfeld müssen die Daten aufgrund der großen Dateigröße möglicherweise in Unterstapel unterteilt werden. - Filtern Sie die von der Rekonstruktionssoftware bereitgestellte Lokalisierungsliste, um unspezifische Lokalisierungen zu entfernen. Apple eine zusätzliche Drift-Korrektur, falls erforderlich.
Representative Results
DIE TIRF-Mikroskopie ist eine beliebte Technik, da sie die fluoreszenzbasierte Fluoreszenz entfernt, den Kontrast erhöht und somit die Bildqualität verbessert und im Vergleich zu anderen fluoreszenzbasierten Mikroskopietechniken weniger phototoxisch ist. Im Vergleich zum herkömmlichen objektiven Ansatz bietet die chipbasierte Mikroskopie TIRF-Erregung ohne den begrenzten Durchsatz, der normalerweise mit einer TIRF-Linse einhergeht. Eine Übersicht über die vorgestellten Einstellungen finden Sie in Abbildung 1A. Wir präsentieren beugungsbegrenzte sowie dSTORM-Bilder von Lebersinus-Endothelzellen (LSEC), die von Mäusen extrahiert wurden. Ein großes Sichtfeldbild von LSECs mit beschriftetem Mikrotubuli wird ebenfalls präsentiert, das die Fähigkeiten der Bildgebung mit hohem Durchsatz demonstriert. Ein herkömmliches dSTORM-Setup mit einem Öl-Tauch-TIRF-Objektiv (entweder 60x oder 100x Vergrößerung) zeigt in der Regel eine Fläche von 50 x 50 'm, die 100-mal kleiner ist als das Chip-basierte Bild in Abbildung 2, abgebildet mit einem 25x, 0.8 NA Objektiv.
Bei dieser Methode verwenden wir multimoded Si3N4 Wellenleiter zur Erregung. Die verwendeten Chips bestehen aus einer streifengeätzten Führungsschicht von 150 nm Si3N4, die sich über eine 2 'm oxidierte Schicht eines Siliziumchips ablagert. Ein Schaltplan des Chips finden Sie in Abbildung 1B. Die Wellenleiterbreiten können zwischen 200 und 1000 m variieren. Durch Interferenzen zwischen den Sichtierungsmodi hat das Anregungslicht keine homogene Intensitätsverteilung, sondern ein räumlich variierendes Muster. Abbildung 2A zeigt ein Bild mit deutlich sichtbaren Modusmustern. Dieses Interferenzmuster ändert sich mit der Position des Laserstrahls am Rand des Wellenleiters. Um eine homogene Erregung in den letzten Bildern zu erreichen, verwenden wir eine Piezo-Bühne, um entlang der gekoppelten Facette zu oszillieren. Im Laufe des Bildgebungsverfahrens gibt es genügend Variationen der Interferenzmuster, so dass sie gemittelt werden können, wodurch Intensitätsschwankungen im Bild entfernt werden. Der Bildstapel besteht aus mehreren Bildern, z. B. in Abbildung 2A, wenn auch mit unterschiedlichen Mustern, aber wenn der Wert gemittelt wird, liefert der Stapel ein Bild mit homogener Anregung wie Abbildung 2B. Ein alternativer Ansatz ist die Verwendung von adiabatischer Verjüngung, um breite, einstämmige Wellenleiter8,14zu erreichen, was die Notwendigkeit der Modusmittelung beseitigt. Allerdings sind mehrere Millimeter Verjüngungslänge notwendig, um die Single-Mode-Bedingung zu erhalten, um eine Wellenleiterbreite von 100 m zu erreichen. Multimode-Wellenleiter umgehen diese Verjüngungsnotwendigkeit und lassen keine Einschränkungen bei der Strukturbreite. Über das Beleuchtungsmuster hinaus ermöglicht der hochwirksame Brechungsindex der Modi beispiellose Möglichkeiten zur strukturierten Beleuchtungsmikroskopie11 und Fluktuationsmikroskopiemethoden7.
Der erste Schritt in der Bildgebung besteht darin, ein beugungsbegrenztes Bild zu sammeln. Das Experiment führt zu einem Stapel von etwa 300 Bildern und das endgültige Bild wird unter Verwendung des Durchschnitts des Stapels erstellt. In Abbildung 2stellen wir beugungsbegrenzte und dSTORM-Bildgebung von LSECs dar, die mit CellMask Deep Red mit einem 60x, 1.2 NA Wasserimmersionsobjektiv gekennzeichnet sind. Abbildung 2A zeigt eine inhomogene Beleuchtung, die durch eine unzureichende Mittelung des Modus verursacht wird. Die Mittelung des erfolgreichen Modus wird in Abbildung 2Bangezeigt. Abbildung 2C ist ein dSTORM-Bild derselben Region mit dem markierten Bereich in Abbildung 2D. Leber sinusförmige Endothelzellen haben nanogroße Poren in der Plasmamembran15, die hier zu sehen sind. Eine Fourier Ring Korrelationsanalyse lieferte eine Auflösung von 46 nm.
Abbildung 3 zeigt ein dSTORM-Bild eines 500 x 500 m-Bereichs, das die hohen Durchsatzfähigkeiten der Technik demonstriert. Ein gezoomtes Bild von Abbildung 3A, das einem typischen dSTORM-Sichtfeld entspricht, wird zusammen mit dem beugungsbeschränkten Bild in Abbildung 3Bdargestellt. Eine Fourier-Ringkorrelation zur Schätzung der Auflösung wurde durchgeführt, was einen Wert von 76 nm ergibt.
Abbildung 1: Bildgebungssystem und Wellenleiter. (A) Foto des Bildgebungssystems. Die Probe wird auf einem Vakuumfutter auf der Probenstufe platziert, wobei die Kupplungsfacette des Wellenleiters zum Kupplungsobjektiv hin gelegt wird. Ein fasergekoppelter Laser und ein Kupplungsobjektiv werden auf einer 3D-Piezostufe platziert. Ein Objektivturm mit bildgebenden Objektiven erfasst das Bild von oben und leitet es an eine Kamera weiter. (B) Schaltplan des Wellenleiters mit Kupplungs- und Bildlinsen. Die Kupplungslinse koppelt Licht in den Wellenleiter. Die Proben (orange Perlen) werden in einer versiegelten PDMS-Kammer aufbewahrt. Das evaneszierende Feld entlang des Wellenleiters wird die Probe anregen und das Bildgebungsziel wird die emittierte Fluoreszenz erfassen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Beugungsbegrenzte und dSTORM-Bilder. (A) Bild von lebersinusförmigen Endothelzellen mit unzureichender Mittelung des Modus, was zu einem deutlich sichtbaren Anregungsmuster führt. (B) Die gleiche Region wie in (A), jedoch mit ausreichender Mittelung, was zu homogener Anregung führt. (C) Beugung begrenztes Bild des Einssets in (B); (D) dSTORM-Bild derselben Region. (E) Beginn von (D), der die Fenestrationen in der Plasmamembran der Zelle deutlich zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: dSTORM-Bild von Ratten-LSECs. (A) Großes Sichtfeld dSTORM Bild von Alexa 647 gebeiztem Tubulin in Ratten-LSECs. Maßstabsleiste = 50 m (B) Größerer markierter Bereich aus (A) Vergleichs-Beugungsbegrenzt (unten links) und dSTORM-Bild (oben rechts). (C) Kleiner markierter Bereich von (A). Skalenbalken = 1 m. Das Bild hat eine Auflösung von 76 nm. Angepasst mit Genehmigung von Helle et al. 20196. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Chipbasierte Bildgebung ähnelt der herkömmlichen dSTORM-Bildgebung. Die Bildqualität kann somit mit den gleichen Ansätzen wie bei der herkömmlichen dSTORM-Bildgebung gemessen werden. Der Hauptunterschied für den Anwender ist, dass die transparente Glasrutsche mit einem opaken Si-Wafer ausgetauscht wird. Obwohl sie sehr unterschiedlich erscheinen, ist die Probenhandhabung praktisch analog zu einer Glasrutsche. Die Chips sind recht robust und können leicht mit einer Wafer-Pinzette gehandhabt werden. Das bildgebende Verfahren und die Bildrekonstruktion sind die gleichen wie bei einem regulären dSTORM-Experiment. Die Einrichtung eines funktionellen Chip-basierten Mikroskops erfordert keine speziellen Komponenten, außer den photonischen Chips. Weitere Einzelheiten zum Aufbau finden Sie in früheren Arbeiten6,7. Die in dieser Arbeit verwendeten Chips wurden mit Standard-Photolithographie8hergestellt.
Die Probenvorbereitung umfasst die Vorbereitung der Probenkammer. Beim Anbringen des PDMS-Rahmens am Chip ist es wichtig, kleine Falten oder Risse zu vermeiden, bei denen Luft eindringen könnte. Wenn das PDMS beim Anbringen faltet, entfernen Sie es einfach vorsichtig mit einer Pinzette und befestigen Sie es wieder. Wenn die Probe in der PDMS-Kammer fertig ist, muss das Deckglas dagegen gedrückt werden, um den Bereich zu versiegeln. Es ist wichtig, Luftblasen zu vermeiden, die sich beim Anbringen des Deckglases bilden könnten. Wenn eine Luftblase gebildet wird, entfernen Sie vorsichtig das Deckglas und fügen Sie PBS in die Probenkammer, um sicherzustellen, dass die Probe abgedeckt ist. Die Vorbereitung und Befestigung des Deckelbelegs kann dann einfach wieder aufbereitet werden.
Die Kopplung von Licht in den Wellenleiter wird durch das in diesem Dokument vorgeschlagene Protokoll vereinfacht. Es gibt jedoch einige gemeinsame Herausforderungen, die die Kopplung einschränken können. Erstens, wenn der Chip nicht richtig gereinigt wurde und alle übrig gebliebenen PBS vollständig entfernt wurden, kann es Schmutz oder kristallisierte PBS auf dem Wellenleiter geben. Dies kann zu großen Verlusten führen, was zu sehr wenig Leistung im Bildbereich führen kann. Die Verwendung eines feuchten Tupfers, um den Bereich außerhalb des Deckglases zu reinigen, kann die Leistung erheblich verbessern. Zweitens kann sich der Kupplungsverlust drastisch erhöhen, wenn die Kupplungsfacette des Wellenleiters beschädigt ist (z.B. durch unsachgemäße Handhabung). Optische Inspektion der Kante wird in der Regel alle Schäden leicht aufdecken. Die gesamte Kupplungsfacette des Chips kann sorgfältig poliert werden, ähnlich wie eine optische Faser, und gibt eine glatte Kupplungsfacette, die dann die gekoppelte Leistung erhöht.
Nachdem das Licht gekoppelt wurde, ist das Bildgebungsverfahren das gleiche wie bei jedem herkömmlichen dSTORM-Setup. Wenn das Bild eine inhomogene Anregung hat, wie in Abbildung 2Agezeigt, dann hat die Mittelung des Modus höchstwahrscheinlich nicht gut funktioniert. Die beiden häufigsten Gründe dafür sind: 1) zu wenige Bilder, die aufgenommen wurden, um einen durchschnittlichen Stapel zu erstellen, und 2) zu kurz vor einem Schwingungsabstand/zu groß von einer Schrittgröße. Das Sammeln von zu wenigen Bildern kann einige Erregungsmuster auslassen und der Durchschnitt wird daher inhomogen sein. Dies kann leicht gelöst werden, indem die Anzahl der Bilder im durchschnittlichen Stapel erhöht wird. Zu kurz vor einem Schwingungsabstand kann auch zu einem inhomogenen Bild führen, da nicht genügend Modusmuster angeregt werden. Dies kann auch leicht durch Erhöhung des Schwingungsabstandes und/oder Verringern der Schrittgröße gelöst werden. In dieser Arbeit haben wir eine Piezo-Stufe verwendet, um den Eingangslaserstrahl über 20 m zu scannen und mindestens 300 Bilder zu erfassen. Ein anderer Ansatz könnte darin bestehen, mit Hochgeschwindigkeits-Galvo-Spiegeln das Licht innerhalb einer einzigen Erfassungszeit über die Eingangswellenführung zu scannen, z. B. 10-30 ms. Diese Option eignet sich für die TirF-Bildgebung von Lebendenzellen, bei denen subzelluläre Organellen in konstanter Bewegung sind.
Chip-basiertes dSTORM bietet eine beispiellose großflächige TIRF-Erregung, die es ideal für die Bildgebung mit hohem Durchsatz eignet. Der kompakte Charakter ermöglicht die Nachrüstung auf kommerzielle Systeme, bei denen der Chip für invertierte Setups auf den Kopf gestellt oder transparente Substrate entwickelt werden können. Die Chips sind massengefertigt und können an viele Bedürfnisse angepasst werden. Derzeit ist die Hauptbeschränkung, dass es auf 2D beschränkt ist. Das evaneszente Feld ist nur ca. 200 nm von der Wellenleiteroberfläche entfernt verfügbar, so dass nur Fluorophore in dieser Region angeregt werden. Insgesamt bietet der Bereich der integrierten Optik in naher Zukunft viele Möglichkeiten für die chipbasierte Mikroskopie, indem neue bildgebende Fragen angegangen und bestehende Möglichkeiten eröffnet werden.
Disclosures
B.S. Ahluwalia hat das Patent GB1606268.9 für die chipbasierte optische Nanoskopie angemeldet. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Die Autoren möchten den Europäischen Forschungsrat (Zuschuss Nr. 336716 an B.S.A.) würdigen. Die Autoren danken auch Irati Lagfragua für ihre unschätzbare Unterstützung bei der Aufnahme und Bearbeitung des Videos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-axis sample stage | Standa | 7T173-20 | |
| 2-axis sample translation stage | Mad City Labs | Custom order | |
| 3-axis NanoMax stage | Thorlabs | MAX311D | |
| BXFM microscope body | Olympus | OLY-LSM-037018 | |
| CellMask Deep Red, Life technologies | ThermoFisher | C10046 | |
| Cleanroom grade swabs | MRC Technology | MFS-758 | |
| Fiber-coupled laser | Cobolt | Flamenco | |
| Filter Holder | Homemade | ||
| Hellmanex III, Hellma Gmbh | Sigma-Aldrich | Z805939 | Cleaning detergent concentrate |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935-1L | |
| KL 1600 LED | Olympus | OLY-LSM-E0433314 | |
| Olympus Coupling lens | Olympus | LMPLFLN 50x/0.5 | |
| Orca Flash 4.0 V2 | Hamamatsu | ||
| PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Mix according to descriptions |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer 1.1 kg kit | Dow | 1673921 | |
| Tip-tilt stage | Thorlabs | APR001 | |
| Vacuum holder | Thorlabs | HWV001 | |
| Wafer Tweezers Type 2W | Agar scientific | AGT5051 |
References
- Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nature Methods. 5 (6), 527-529 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
- Wazawa, T., Ueda, M. Total internal reflection fluorescence microscopy in single molecule nanobioscience. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 77-106 (2005).
- Jalali, B., Fathpour, S.
- Helle, ØI., Coucheron, D. A., Tinguely, J. C., Øie, C. I., Ahluwalia, B. S. Nanoscopy on-a-chip: super-resolution imaging on the millimeter scale. Optics Express. 27 (5), 6700-6710 (2019).
- Diekmann, R., et al.
- Tinguely, J. C., Helle, ØI., Ahluwalia, B. S. Silicon nitride waveguide platform for fluorescence microscopy of living cells. Optics Express. 25 (22), 27678-27690 (2017).
- Ahluwalia, B. S., McCourt, P., Huser, T., Hellesø, O. G. Optical trapping and propulsion of red blood cells on waveguide surfaces. Optics Express. 18 (20), 21053-21061 (2010).
- Coucheron, D. A., Wadduwage, D. N., Murugan, G. S., So, P. T. C., Ahluwalia, B. S. Chip-Based Resonance Raman Spectroscopy Using Tantalum Pentoxide Waveguides. IEEE Photonics Technology Letters. 31 (14), 1127-1130 (2019).
- Helle, ØI., Dullo, F. T., Lahrberg, M., Tinguely, J. C., Ahluwalia, B. S. Structured illumination microscopy using a photonic chip. ArXiV. , https://arxiv.org/abs/1903.05512v1 (2019).
- Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Archetti, A., Glushkov, E., Sieben, C., Stroganov, A., Radenovic, A., Manley, S. Waveguide-PAINT offers an open platform for large field-of-view super-resolution imaging. Nature Communications. 10, (2019).
- Braet, F., Wisse, E. Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review. Comparative Hepatology. 1, 1 (2002).
