Summary
ونحن وصف نهج التصوير لتحديد الدولة المعتدلة القلة من الأقليات megfp-الموسومة-مستقبلات التي يسببها يجند ملزمه في غشاء البلازما من الخلايا الحية. يعتمد البروتوكول علي المجهر الداخلي للانعكاس الكلي (TIRF) المدمج مع تحليل العدد والسطوع (N & B).
Abstract
علي الرغم من اهميه وانتشار القلة المستقبلة ، فان بعض الطرق قابله للتطبيق للكشف عن احداث التجميع وقياس درجه التجميع. هنا ، ونحن وصف نهج التصوير لتحديد الدولة المعتدلة القلة من mEGFP-الموسومة-مستقبلات المتجانسات في غشاء الخلايا الحية. يعتمد البروتوكول علي المجهر الداخلي للانعكاس الكلي (TIRF) المدمج مع تحليل العدد والسطوع (N & B). N & B هو أسلوب مشابه للتحليل الطيفي للعلاقة الفلورية (FCS) والرسم البياني للعد الفوتون (PCH) ، والتي تستند إلى التحليل الإحصائي للتقلبات في كثافة الفلورية من الفلورية التي تنشر داخل وخارج الاضاءه حجم خلال فتره المراقبة. علي وجه الخصوص ، N & B هو تبسيط PCH للحصول علي معلومات عن متوسط عدد البروتينات في مخاليط القلة. وتوصف شده تذبذب الكثافة بالسطوع الجزيئي للفلوكوفيري ومتوسط عدد الفلوبوهورس داخل حجم الاضاءه. التالي ، لا يعتبر N & B سوي اللحظتين الاولي والثانية من توزيع السعه ، وهما متوسط الكثافة والتباين. هذا هو ، في الوقت نفسه ، وقوه وضعف الأسلوب. لأنه يتم النظر في لحظات فقط ، N & B لا يمكن تحديد الجزء المولي من القلة غير المعروفة في خليط ، ولكنه فقط يقدر متوسط حاله قله العدد من الخليط. ومع ذلك ، فانه يمكن تطبيقها علي سلسله زمنيه صغيره نسبيا (بالمقارنة مع أساليب لحظه أخرى) من الصور من الخلايا الحية علي أساس بكسل بكسل ، وذلك ببساطه عن طريق رصد تقلبات الوقت من كثافة مضان. فانه يقلل من الوقت الفعلي لكل بكسل إلى بضعة ميكروثانية ، مما يسمح الاستحواذ في النطاق الزمني من ثوان إلى مللي ثانيه ، وهو أمر ضروري لحركيه القلة السريعة. وأخيرا ، يمكن استكشاف مناطق الخلايا الكبيرة وكذلك المقصورات شبه الخلوية.
Introduction
ونحن وصف إجمالي انعكاس الداخلية الفلورية-عدد والسطوع (TIRF-N & B) نهج التصوير لتحديد متوسط الدولة القلة من جزيئات مستقبلات في غشاء البلازما من الخلايا الحية ، وتهدف إلى ربط التجمع مستقبلات ديناميات الوظيفة البيولوجية للبروتينات (الشكل 1).
عند الربط خارج الخلية وملزمه ، والمستقبلات بدء محول الاشاره داخل الخلايا اعتمادا علي التشكيل الخاصة بهم ، والقلة ، والمستقبلات المشتركة المحتملة وتكوين الغشاء. علي الرغم من اهميه وانتشار القلة المستقبلة ، المعترف بها كحدث رئيسي في الإشارات الخلوية1،2،3،4،5،6، 7, طرق قليله يمكن الكشف عن تجمع الاحداث وقياس درجه التجميع تجريبيا8,9. وحده التخزين البؤري (x ، y ≈ 300 nm ، z ≈ 900 nm) غير محلول بشكل كاف لإثبات التفاعل الجزيئي والقياس ، حتى بعد التحسين بواسطة خوارزميات استعاده الصورة10. لا يمكن حل تكوين الوحدة الفرعية من قله البروتين علي أساس المكانية بحته حتى من خلال أساليب فائقه الدقة في x, y القرار من 20-70 nm مثل النخيل11, العاصفة12, وتيد13. وعلاوة علي ذلك ، فان الدقة الزمنيه (بترتيب الدقائق لكل صوره) لا يمكن ان تتبع الحركية في نطاق الثواني. جزيء واحد خطوه التبييض علي حل القياس من قله البروتين فقط إذا كانت غير المتنقلة14.
واحده من الطرق الأكثر تنوعا لقياس الكثافة وقله الفلوريسسينتلي من البروتينات الموسومة داخل صور واحده هو تحليل توزيع كثافة المكانية (SpIDA) ، والتي تعتمد علي أخذ العينات المكانية. وهو ينطبق علي كل من الخلايا الثابتة كيميائيا والحية ، ويسمح تحليل العديد من المناطق التي تهم الخلية في وقت واحد باستخدام المجهر القياسية الفلورية15. بدلا من ذلك ، وأساليب لحظه ، مثل الطيفية الارتباط فلوري (FCS)16، المدرج التكراري العد الفوتون (pch)17، وعدد والسطوع (N & B) 18،19، هي مناسبه لقلهالسنالكمية القياسات. وتحلل هذه الطرق تقلبات الكثافة الفلورية التي يمكن ملاحظتها في الوقت الذي ينتشر فيه الفلوريد ويخرج من حجم الاضاءه. الاتساع من التقلبات شده يستطيع كنت بشكل فريد وصفت بالسطوع جزيئيه من ال [فلوفيبور] (ε) والرقم معدله [فلوبفرس] (ن) ضمن الاناره حجم17 (شكل 2). عاده ، يمكن الحصول علي معامل انتشار الفلوروبيورس ومتوسط عدد الجزيئات (المرتبطة عكسيا بقيمه G (0)) داخل حجم الاضاءه بواسطة FCS20. ومع ذلك ، منذ نشر الوقت فقط الجداول مع جذر مكعب من كتله ، FCS ليست حساسة بما فيه الكفاية للكشف عن التغيرات في الكتلة الجزيئية21. في الممارسة العملية ، لا يمكن الكشف عن اللون واحد FCS ديميريشن من مستقبلات الغشاء. PCH يحل مخاليط من قله المواليد المختلفة بدقه. باستخدام أكثر من لحظتين من توزيع السعه ، يكتشف جزيئات السطوع المختلفة التي تشغل نفس حجم الاضاءه. المسح الضوئي FCS22 والتطورات ، مثل الزوج مثيره للاهتمام-ارتباط السطوع الجزيئي (pcomb) النهج23، وعرضت لتوسيع نطاق تطبيق أساليب الارتباط فلوري في النظم البيولوجية24 ، تبقي الطرق نقطه واحده تفتقر إلى القدرة علي القياسات السريعة في مساحة كبيره من الخلية ، والتي تتطلب العديد من الملاحظات المتتابعة في كل بكسل والحصول علي البيانات في ترتيب الثواني.
N & B هو نسخه مبسطه من pch التي تعتبر فقط اللحظات الاولي والثانية من سعة التوزيع الفلوري ، وهي متوسط الكثافة ، < I > ، والفرق ، σ2 (الشكل 2)18،19 وبسبب ذلك ، فانه لا يمكن تحديد الجزء المولي من القلة غير المعروفة في خليط ، ولكن فقط تقديرات الدولة المعتدلة القلة من الخليط. ومع ذلك ، N & B لديه ميزه العمل مع سلسله زمنيه أصغر نسبيا من الصور من الخلايا الحية من PCH علي أساس بكسل بكسل ، وذلك ببساطه عن طريق رصد التقلبات في الوقت المناسب من كثافة مضان. لان N & B يقلل من الوقت لكل بكسل إلى بضع ميكروثانية ، فانه يمكن ان تتبع حركيه القلة السريعة علي مناطق الخلايا الكبيرة ، مما يسمح اكتساب الصورة علي مقياس الوقت من الثواني في المسح الضوئي المجهر (علي سبيل المثال ، التنسيق ، 2-الفوتون) ومللي ثانيه في المجهر القائم علي الكاميرا (علي سبيل المثال ، TIRFM).
وقد أظهرت عده تقارير قدره N & B علي قياس عدد الوحدات الفرعية في مجموعات البروتين عن طريق تصوير مناطق الخلايا الموسعة. تم الكشف عن مجموعات باكيلين-EGFP في مواقع التصاق في الخلايا تشو-K125، وتم وصف التجميع داخل الخلايا من الببتيد Httex1p المسببة للامراض في الخلايا كوس-726. وقد تم تطبيق N & B لاتباع القلة التي يحركها الأمر من مستقبلات erbb27، وتاثير يجند علي كلوثوب (klb) و FGFR1c في الخلايا هيلا28. تم استخدام الجمع بين التصوير TIRF وتحليل N & B لإظهار ان دينامين-2 هو رباعيه في المقام الأول في جميع انحاء الغشاء الخلوي بأكمله29. قمنا بتطبيق N & B لكل من المسح النقطي والصور tirf لإثبات ديميريشن الموجهة من upar ومستقبلات غشاء الخلية FGFR130,31.
طرق الارتباط الفلورية ، مثل N & B ، FCS و PCH ، وتستند إلى فكره انه في حجم مفتوح الاحتلال عدد من الجزيئات يتبع توزيع Poisson. لأنه فقط الفوتونات التي تنبعث منها الفلوروبيورس يمكن الكشف عنها ، والقيمة المتوسطة لكثافة مضان قياس 
مقابل الوقت في بكسل من الصورة ، ، هو نتاج متوسط عدد الفلوبورس في حجم الاضاءه ، ن ، وبهم السطوع الجزيئي ، ε17:
حيث يتم التعبير عن ε كعدد من الفوتونات المنبعثة لكل وحده من الوقت (تقليديا في الثانية) لكل جزيء عندما يكون الجزيء في مركز حجم الاضاءه.
السطوع هو خاصيه لكل فلوكوفيري في عمليه استحواذ معينه ، في حين ان الكثافة هي مجموع جميع المساهمات من جميع الفلوبورس. في المسابقات البيولوجية ، سيزداد السطوع مع زيادة عدد الفلوريد الذي يتقلب معا ، مما يعطي معلومات عن حاله قله الفلوريسسينتلي من البروتين الموسوم. يتم قياس سعة التذبذب في بكسل معينه من التباين في اشاره مضان ، σ2:
حيث المتوسطة من المربع الشدة 
,, والمربع من المدى الشدة 
,, يحسب من الفردية كثافة قيم في كل [بكسل] من كل اطار:
حيث K هو عدد الإطارات الاجماليه في سلسله الوقت. من الناحية التجريبية ، فمن الضروري حساب لسلسله الصورة بأكملها الفرق الذي يصف مبعثر قيم كثافة الفردية في كل بكسل من صوره واحده حول قيمه كثافة متوسط. ويشمل الفرق جميع التقلبات من أصول مختلفه. في تقريب اولي, التباين واجبه ال ينتشر جسيمات في الاناره حجم, σ20, يستطيع كنت فصلت من التباين واجبه إلى الكاشف طلقه خردق ضوضاء, σ2[د.]. والفرق بينهما مستقل ؛ التالي ، يتم إعطاء الفرق الإجمالي من خلال المبلغ الخاص بهم:
الفرق ، بسبب التقلبات الجزيئية داخل وخارج حجم الكشف ، يعتمد خطيا علي السطوع الجزيئي وكثافة:
أعاده ترتيب المكافئ 6 وفقا لمكافئ 1:
وفقا للمفهوم النموذجي في الطيفي الترابط الفلوري ، المعادلة 7 تنص علي ان الفرق بسبب عدد من التقلبات يعتمد علي مربع من سطوع الجسيمات.
ثم, الفرق بسبب تقلبات كاشف هو وظيفة خطيه من كثافة الكشف, تحت افتراض ان يتم تشغيل كاشف تحت الحد التشبع19:
في حاله الفوتون العد كاشفات a= 1 و c= 0 ، التالي فان الفرق كاشف يساوي متوسط كثافة:
لتطبيق هذه المفاهيم علي القياسات الحقيقية في الخلايا الحية ، Gratton وزملاءه18 تحديد سطوع واضح ، B ، لكل بكسل كنسبه الفرق علي مدي كثافة متوسط:
B هي المعلمة التي تقاس بالتجربة. في هذا العمل ، يتم التقاط صور السلسلة الزمنيه لمستقبلات FGFR1 في غشاء البلازما من الخلايا هيلا من قبل المجهر TIRF ومتوسط سطوع واضح ، B ، يتم تحديده من قبل تحليل N & B. بعد ذلك ، بعد أضافه FGF2 ، يتم التقاط سلسله زمنيه متتالية لمتابعه التغييرات في التجميع الذاتي لجزيئات المستقبلات في سطح الغشاء بعد تحفيز المستقبلات مع ligand المتعارف عليه.
ومع ذلك ، منذ كاشف المجهر TIRF هو كاميرا EMCCD ، والتعبير عن سطوع واضح يحتاج إلى تعديل كما19:
حيث أزاحه هو أزاحه كثافة الكترونيات الكشف التي هي سمه من سمات إعدادات كاشف. يتم إعطاء الفرق ومتوسط كثافة للكشف التناظرية علي التوالي من قبل:
حيث G هو كسب التناظرية في المستويات الرقمية (DL/الفوتونات) ، S، والمستويات الرقمية لكل فوتون19، وتعطي من قبل منحدر كثافة مقابل مؤامرة الفرق لمصدر الضوء مع كثافة ثابته (اي تقلبات الزمنيه). يرتبط عامل γ بشكل وحده تخزين الكشف عن البكسل. وفقا ل Hassler وآخرون32، عامل γ يساوي 0.3 للتصوير tirf العمل في الكسب الأقصى من الكاميرا الكشف19. الازاحه ، S و G المعلمات هي خصائص الكاميرا والمجهر. السطوع الظاهر ، B ، يتم الحصول عليه عن طريق أعاده ترتيب المكافئ 11 وفقا لمكافئ 12 و 13:
تجريبيا ، ε هو وظيفة معقده من كثافة الليزر وكفاءه الكشف عن النظام. ومع ذلك ، بما ان B/S يعتمد خطيا علي ε ، فمن المهم تحديد القيمة النسبية لε لوضع الكشف المعطي:
حيث ε ' يتناسب مع الε. ومع ذلك ، يتم اجراء المعايرة باستخدام مرجع داخلي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. اعداد العينات
- اليوم الأول البذور هيلا الخلايا في المتوسط الكامل في تركيز من 100000-200000 خليه/مل في الاطباق الزجاجية القاع. البذور 6-8 تكرار الاطباق.
ملاحظه: في هذا المثال ، يتم تكمله المتوسطة مع 10 ٪ الحرارة الجنين البقري المنشط مصل (الجندي) ، 1 ملليمتر بيروفات الصوديوم ، 100 U/100 ميكروغرام البنسلين/ستربتوميسين. ويتم اعداد العديد من الاطباق المتماثلة. - اليوم 2-3 عندما تكون الخلايا في الكونفلوينسي الفرعية ، transfect نصف الاطباق مع البلازميد البروتين والنصف الثاني مع مرجع البلازميدات (مونومر وديمير) ، في وسط خاليه من المصل.
ملاحظه: يرصد التحويل في المصل المتوسطة الحرة تستكمل مع المضادات الحيوية ، 0.1 ٪ البقري مصل الزلال و 25 مم HEPES العازلة ، دون الفينول الأحمر. - اليوم 3-4 تاكد من ان الخلايا المقسمة ملتصقة بالجزء السفلي من الاطباق وان غشاء الخلية فلوري. تجاهل الاطباق مع الخلايا متضخمة أو مع فلوري منخفضه جدا.
ملاحظه: لا تدع الخلايا تكبر. يجب ان تكون الخلايا موزعه بشكل جيد وان تلتزم بالمنطقة الزجاجية للصحن (الشكل 1ا). يمكن استخدام الاطباق أسفل الزجاج precoated لصالح التصاق الخلية. يتم اختبار ثقافة الخلية للتلوث الميكوبلازما قبل اي تجربه. في هذا المثال ، يتم نقل الخلايا بواسطة (A207K) megfp-FGFR1 البلازميد ويتم نقل الخلايا المرجعية مع gpi-(A207K) megfp و gpi-(A207K) megfp-(A207K) megfp البلازميدات باستخدام البروتوكولات القياسية. للحصول علي المجهر الخلوي الحي ، ينصح باستخدام وسيطه خاليه من المؤشرات ؛ يتم أضافه 25 مم HEPES العازلة لمنع تغييرات الأس الهيدروجيني اثناء التصوير.
2. TIRF التصوير-محاذاة خط الليزر والأمثل للاضاءه TIRF
- قبل أربع ساعات من التجربة ، وتنشيط حاضنه درجه الحرارة من المجهر في 37 درجه مئوية.
- قم بتشغيل المجهر وأجهزه الكمبيوتر والكاميرات وانتظر حتى تصل الكاميرات إلى درجه حرارة العمل المناسبة.
ملاحظه: درجه حرارة العمل من الكاميرا المستخدمة في هذه الدراسة هي-75 درجه مئوية. - ضع قطره صغيره من الزيت علي الهدف. وضع طبق عينه في المكان. إغلاق أبواب الحاضنة والسماح للحرارة من طبق تتوازن (~ 10 دقيقه).
- بدوره علي مصباح العدسة والليزر 488 nm.
- حدد وضع التباين الكتابي لاستكشاف العينة ، والبحث في خليه للتركيز من العين.
ملاحظه: استخدام مصباح الفلورسنت للبحث الخلايا الحوض العين ليست إلزاميه. ويمكن استخدام خط ليزر مناسب بدلا من ذلك. - حدد فلتر المناسبة لجمع الانبعاثات الخضراء من خلال كاميرا المجهر (باند باس Ex 490/20 (500) الفرقة تمرير Em 525/50 ، أو ما شابه ذلك.
- التبديل من العين إلى منفذ الكاميرا (كاميرا #1 في الشكل 1) في وضع العدسة ، وصقل التركيز والتغيير إلى وضع tirf. قد يتم تسميه وسائط TIRF والعدسات مع تسميه مختلفه اعتمادا علي العلامة التجارية للمجهر.
ملاحظه: قد يكون هناك قضايا التركيز أو محاذاة الليزر إذا لم تكن هناك علامات الفلورسنت في واجهه كوفيرسليب. لمحاذاة الليزر بشكل صحيح (الاساسيه ل TIRF جيده) ، والتركيز علي coverslip. غالبا ما يكون من الصعب جدا تحديد ما إذا كان المشارك في التركيز. كاقتراح ، والتركيز علي حواف الخلايا. - تنشيط المحاذاة التلقائية التالية للتعليمات المجهر TIRF.
ملاحظه: لفتره وجيزة ، للخطوات من 2.4 إلى 2.8 ، أولا العثور علي الخلايا من خلال العين والتركيز عليها ، ثم إرسال الانبعاثات إلى منفذ الكاميرا من المجهر TIRF ، أعاده تركيز الخلايا علي شاشه الكمبيوتر المجهر وتفعيل الاجراء لمحاذاة الليزر. وتتكون المحاذاة من العثور علي الزاوية الحرجة التي تصبح فيها الاضاءه غير المستوية (الشكل 3). قد يكون المجاهر التجارية بروتوكولات محاذاة مختلفه قليلا وأيضا ان تكون مؤتمتة بالبالكامل; قد يكون لدي الآخرين كاميرا صغيره لتسهيل التصور من الظروف زاوية حرجه. - اختيار عمق الاضاءه المناسبة وتحسين اتجاه الحقل evتخدير (الشكل 3).
ملاحظه: يتم الاحتفاظ عمق الاختراق ثابت لجميع الضوابط والعينات.
3. TIRF التصوير: التقاط السلسلة الزمنيه
- تحديد منطقه الاهتمام (ROI) علي الأقل 256 x 256 بكسل.
ملاحظه: في هذا الاعداد ، يتم التقاط مع الكاميرا #2 تحت البرنامج الذي يتحكم مباشره فقط الكاميرا (انظر الشكل 1 اسطوره). - تعيين التعرض إلى 1 مللي ثانيه وكسب EM إلى 1,000 (وهذا هو عامل G في eq. 12 و 13). في مثل هذه السرعة ، قد يكون من الضروري لضبط أو زيادة قوه الليزر. هنا قوه الليزر 0.5 ميغاواط.
ملاحظه: اعتمادا علي نوع من الكاميرا والحدود التي يفرضها معامل انتشار البروتين ، وكثافة الفلورية والخلفية ، والمعايير العامة لتحديد قوه الليزر ليست لتشبع الكاشف ، والحد من التسرب الضوئي ، والقبض علي النحو أسرع وقت ممكن في S/N معقولة. يتم تعيين كسب EM دائما في الحد الأقصى من الكاميرا (انظر مقدمه). - تشغيل التسلسل التجريبي الأول ضمن الشروط الاوليه وتقريبا تقدير قيمه S/N. الشروط مقبوله في S/N = 2-3 أو اعلي ، كما تقاس في الإطار الأول من سلسله الوقت الأول.
- استخدام المنزلق من نظام تقسيم الانبعاثات ربط الكاميرا #2 إلى المجهر لإخفاء جانب من الصورة (الشكل 1ب، الشكل 4ا-ب)
ملاحظه: في هذا الاعداد يتم تثبيت موصل تصوير متعدد القناات علي #2 الكاميرا لتمكين الحصول علي صورتين متطابقتين مكانيا في نفس الوقت. وقد تم تجهيز النظام مع الشرائح لتركيب مرشحات الانبعاثات المختلفة. أحد المنزلقات يتصاعد قناع اسود لتغطيه جانب من الصورة. يتم استخدام المنطقة المقنعة للمعايرة الداخلية لكل سلسله زمنيه ، لتحديد معلمات الكاميرا (مكافئ 12 و eq. 13). وبهذه الطريقة لا توجد حاجه لخطوه معايره مستقله ، والاهم من ذلك ، يتم اجراء المعايرة بالتوازي مع القبض علي كل سلسله زمنيه. في غياب هذا النظام ، يمكن معايره الكاميرا تطبيق البروتوكولات المنشورة33. - حدد خيار الحفظ التلقائي لملف الكاميرا.
- بدء الاستحواذ علي سلسله الصور. الحصول علي الحد ادني من 700 الإطارات بنسبه S/N الحد الأدنى من 2.
ملاحظه: يعتمد عدد الإطارات الضرورية للتحليل علي استقرار العينة إلى الرشح الضوئي وعلي تشتت البيانات. لذلك ، يتم تقييم جوده كل سلسله زمنيه اثناء تحليل N & B. - دون أخذ الطبق من المجهر ، أضافه ligand.
- حدد خليه مع غشاء فلوري مشرق وتبدا بسرعة أول سلسله من الوقت لتشغيل الحركية.
ملاحظه: إذا تمت أضافه الربط بسرعة ، فان هذا التقاط الأول يحدد النقطة = 0 من الوقت الحركي والحركية. يسجل البرنامج الوقت الدقيق للتقاط. - البحث في الخلية الثانية والحصول علي نقطه الوقت الثاني من الحركية.
ملاحظه: تتوفر إجراءات الزيارة النقطية في بعض المجاهر المجهزة بالمراحل اليه x و y و z. هذه تسمح لتحفيظ مواقف متعددة علي طبق الخلية ، ويمكن ان تساعد في الحفاظ علي فاصل زمني أكثر ثابته من الوقت بين سلسله الصور علي خلايا مختلفه. - التقاط خليه جديده لكل نقطه زمنيه من التشغيل الحركي.
ملاحظه: بعد التقاط ، يتم تصوير الخلية جزئيا ولا يمكن أعاده وضعها. وبسبب ذلك ، يتم الحصول علي حركيه من خلال الجمع بين سلسله زمنيه من العديد من الخلايا ، كل القبض في نقطه زمنيه مختلفه. - لكل طبق جديد ، كرر البروتوكول من الخطوة 2.3 إلى 3.9.
ملاحظه: ل مرجع اطباق, أضفت حجم من العربة ([ببس] يلحق مع 0.01% بقري مصل البومات) معادله إلى ان يستعمل ل ال [ليغو].
4. عدد & السطوع (N & B): جوده الاختيار من السلسلة الزمنيه
- تحويل وحفظ باسم. TIFF الملفات التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج الكاميرا (ملفات .sif في هذا المثال).
- استيراد. ملفات TIFF في روتين برنامج التحليل عن طريق تنشيط واجهه المستخدم الرسوميه N & B (GUI) MATLAB.
ملاحظه: يتم استخدام روتين Matlab القابل للتنفيذ N & B المخصص هنا (تحليل N & B في https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia). عن طريق فتح المستوردة. TIFF ، يقوم الروتين بإنشاء صوره الكثافة المتوسطة ، ومتوسط الكثافة الشخصية ويسمح بفحص اطار السلسلة بإطار (الشكل التكميلي 1). وهناك برامج أخرى متاحه للتحليل N & B (علي سبيل المثال ، برنامج SimFCS). - تجاهل السلسلة التي يظهر فيها متوسط الكثافة الضوئية أكثر من 10% من الرشح بالصور ، والسلسلة التي تم فيها تشويه غشاء الخلية الواضح أو ترجمته اثناء الاستحواذ.
- إطارات الاقتصاص التي من الواضح انها خارج التركيز.
ملاحظه: يتم تطبيق أداه اقتصاص في الروتين لتجاهل إطارات مفرده أو متعددة ضمن سلسله الصور. يتم السماح بهذه العملية لان وقت اطار الإطار ليس حرجا بينما يكون وقت السكون بكسل (وقت التعريض) (راجع المناقشة). - الحفاظ علي سلسله التحليل فقط مع ما لا يقل عن 500 الأطر الزمنيه.
5. عدد & السطوع (N & B): تحديد معلمات الكاميرا (الازاحه ، σ و S)
- تنشيط الكاميرا معايرهالروتينية.
- حدد مساحة لا تقل عن 20 × 50 بيكسل في منطقه ضوضاء الكاشف (الشكل 4).
ملاحظه: يتكون الروتين من الرسم البياني للقيم (أيضا تعريف المستوي الرقمي ، DL) ويقوم بإرجاع مؤامرة لوغاريتم من التردد مقابل المستويات الرقمية. - في السجل التردد مقابل مؤامرة المستوي الرقمي ، حرك المؤشر الخطي الأحمر لتحديد غوسيه والجزء الخطي من المنحني.
ملاحظه: المؤشر الأحمر يقسم القسمين من المنحني ، وينشط الروتين العائد الازاحه ، والذي هو مركز الدالة غوسيه من استجابه الكاميرا ، والσ من نوبة غاوسي ، وعامل S ، وهو الميل من الجزء الخطي من الكاميرا (ه) (الشكل 4-جيم-دال).
6. عدد & سطوع (N & B): حساب القيم B في منطقه مختاره من الفائدة (ROI)
- تنشيط المفتاح B .
ملاحظه: يقوم هذا الاجراء بإنشاء صوره الكثافة المتوسطة (الشكل 5، العمود الأول) و b-الصورة التي يقترن بها كل فرد من القيمة b إلى بكسل ذات الصلة في الصورة (الشكل الإضافي 1). - تطبيق الحد الأدنى من التسلق (2 2) للحد من تشتت البيانات وتوليد الرسم البياني ب-I (الشكل 5، العمود الثاني).
ملاحظه: يمثل الرسم البياني بي-I توزيع القيم B لكافة البيكسلات الخاصة بالصورة مقابل كثافة البكسل. Y = B/S ؛ X = (
أزاحه)/s (الشكل التكميلي 1 ومكافئ 11 و 15). - افحص الرسم البياني بي-اي باستخدام المؤشر المربع التفاعلي.
- حدد عائد مربع للتحليل (الشكل 5، العمود الثالث).
ملاحظه: المؤشر بمزامنة قناع محمول علي صوره كثافة متوسط ، تسليط الضوء علي البيكسلات التي تم تحديدها داخل منطقه المؤشر مربع (الشكل الإضافي 1). من خلال هذا التفتيش ، فمن الممكن ان تستبعد من التحليل الخلفية والمناطق ذات كثافة منخفضه جدا. - إنشاء خريطة B لعائد الاستثمار المحدد (الشكل 5، العمود الرابع).
- حفظ ملف ASCII من القيم B-المقترنة بالتحديد.
- استيراد ملف ASCII في برنامج رسومي لحساب توزيع الترددات للبيانات والحصول علي متوسط B-قيمه ± s. E (الشكل 5، العمود الخامس).
ملاحظه: وإذا كانت البيانات متجانسة ، فان توزيع الترددات الخاصة بالقيم باء يقترب من توزيع غاوسي. - تطبيق eq. 15 لاشتقاق متوسط السطوع
= 
-1 [(التهم/جزيء) لكل وقت السكون] لكل خليه في كل نقطه زمنيه من التشغيل الحركي. تطبيع البيانات وفقا لما يلي:
حيث
هو متوسط b-القيمة تقاس في الوقت "t" بعد الربط والاضافه ، وهو 
متوسط b-القيمة تقاس في الوقت t = 0 (10-20 s بعد يجند الاضافه).
ملاحظه: تطبيع النتائج يسمح المقارنة المباشرة للتجارب التي يتم تنفيذها في أيام مختلفه. هو يعوض لفروق في ال يقاس سطوع واجبه إلى ليزر قوه وتقلبات فنيه. - ارسم متوسط السطوع العادي مقابل وقت الاكتساب لبناء التشغيل الحركي (الشكل 6).
= 
-1 [(التهم/جزيء) لكل وقت السكون] لكل خليه في كل نقطه زمنيه من التشغيل الحركي. تطبيع البيانات وفقا لما يلي:
هو متوسط b-القيمة تقاس في الوقت "t" بعد الربط والاضافه ، وهو 
متوسط b-القيمة تقاس في الوقت t = 0 (10-20 s بعد يجند الاضافه).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
النتائج لاثنين من الخلايا الممثلة هيلا-mEGFP-FGFR1 المصنفة في نفس الطبق الثقافة وترد في الشكل 5 والجدول التكميلي 1. تم القبض علي الخليتين في وقت 0 دقيقه (الشكل 5a، اعلي) و 7 دقيقه (الشكل 5a، أسفل) بعد أضافه FGF2 ligand.
ويبين الشكل 5 أيضا نتائج خليتين من الخلايا الممثلة لاثنتينين تعبر اما عن المونومر النقي ، gpi-megfp (الشكل 5ب، الأعلى) ، أو عن الديميريك فلوروفلوري المرتبطة به ، Gpi-Megfp-megfp (الشكل 5ب، القاع ) ، يتعرض في غشاء الخلية والقبض عليهم في ظل نفس الظروف التجريبية.
السطوع الظاهر المتوسط ، ب ، في الخلايا هيلا-megfp-FGFR1 يزيد من 1.070 ± 0.001 S.E. إلى 1.141 ± 0.001 S.E. ، في حين ان موحودي المرجعي (الشكل 5ب، اعلي) وديميريك (الشكل 5ب، أسفل) عينات العودة b القيم من 1.070 ± 0.001 S.E. و 1.141 ± 0.001 s. E علي التوالي. لذلك, بمقارنه, ال [FGFR1] يتواجد مستقبل في الدرجة الرئيسية في الشكل [مونوريك] في الخلية غشاء سطح في بداية, غير ان هو يتقدم نحو [ديميريك ستت] سائده علي تحريض مع ه قانونيه [ليغو] FGF2. وفي المتوسط ، تختلف الحالة السائدة لجزيئات FGFR1 في الخليتين التمثيليتين اختلافا واضحا.
وبتطبيق التحليل علي عده خلايا في نفس الطبق ، يتم التقاط كل منها في نقطه زمنيه مختلفه ، يتم الحصول علي متوسط السطوع كداله للوقت (الشكل 6ا). التشغيل الحركي في الشكل 6ا يصف عمليه بطيئه من الانحلال التي استمرت لعده دقائق علي سطح الخلية. ال [FGF2-بسد] FGFR1 [ديميرايشن] واستيعاب لاحقه من المستقبلات اليه معروفه34; ولذلك ، فان النتائج هي في اتفاق كامل مع الفكرة الحالية علي FGFR1 اشاره محول ، وتاكيد إمكانات النهج TIRF-N & B لدراسة قله البروتينات غشاء الخلية حتى تحديد خفيه ديناميات المونومر-dimer.
تحليل السطوع المتوسط المعدل للنتائج هو أداه مناسبه لمقارنه تاثير الاختلافات المختلفة علي نفس المستقبلات. ويرد مثال واحد في الشكل 6باء. وكرر البروتوكول باستخدام نفس المعايير وتحفيز الخلايا مع FGFR1 ligand غير الكنسي ، NCAM-Fc (50 ميكروغرام/مل). في هذه الحالة ، يكشف الشخصية الحركية التحولات السريعة والدورية للمستقبلات في مخاليط القلة ، والتي تصل أيضا إلى قيم السطوع فوق تلك التي من dimer. ويلاحظ مرارا وتكرارا متوسط القيمة العادية 3. ومع ذلك ، لا يسمح الحد من تحليل N & B (فقط لحظات من تقلب كثافة مقابل الوقت) لإثبات دون شك تشكيل شكل تريميريك. ويمكن ان يكون السطوع المتوسط العادي نفسه نتيجة لمجموعات مختلفه من القلة الكبيرة والمونومرات للمستقبلات. ومع ذلك ، فان النتائج تبين بوضوح الاختلافات المكانية للتاثير الثنائيين علي نفس المستقبلات.
الشكل 1: لمحه عامه عن البروتوكول التجريبي. (ا) يتم طلاء الخلايا علي الاطباق السفلية الزجاجية والمتحولة مع مستقبلات فلوريسسينتلي الموسومة. (B) يتم التقاط صور السلاسل الزمنيه علي المجهر tirf التجارية المجهزة مع tirf 100x 1.46 الهدف النفط وغرفه حاضنه. في هذا الاعداد التجاري ، والبرنامج لا يسمح المدمج في كاميرا EMCCD #1 للعمل في أوقات التعرض قصيرة جدا اللازمة للحصول علي N & B سلسله الوقت. هذه نقطه مهمة لان وقت التعرض يحد من نطاق الكدمات الجزيئية التي يمكن التقاطها. أقصر وقت التعرض ، وأسرع انتشار الجزيئية التي يمكن تحليلها. التعرض تتراوح بين 0.5 إلى 1 مللي ثانيه بما فيه الكفاية سريعة لنشر البروتين الغشاء. ولذلك ، يتم أضافه كاميرا EMCCD الثانية (#2) إلى منفذ إضافي من المجهر للعمل مباشره تحت برنامج الكاميرا ، وتجاوز البرنامج المجهر. في هذا التكوين تكييفها ، وتستخدم البرمجيات المجهر وال#1 الكاميرا فقط لمحاذاة TIRF. ثم يتم الحصول علي سلسله الوقت TIRF باستخدام الكاميرا #2 التي تعمل في أوقات التعرض قصيرة جدا مثل 1 مللي ثانيه وعلي الحد الأقصى لكسب EM. #2 الكاميرا أيضا بحجم بكسل من 124 نانومتر الذي يسمح الإفراط في المعاينة والتسلق من الصور (انظر بروتوكول القسم 6.2). تكوينات أخرى للحصول علي سرعه التصوير ممكنة ، اعتمادا علي خصائص المجاهر TIRF مختلفه ، في حين ان استخدام كاميرات sCMOS ليس من المستحسن ، لان الضوضاء ليست عشوائية في الصورة35. (ج) بعد التقاط ، يتم فحص السلاسل الزمنيه كفحص للجودة. يتم تجاهل السلسلة إذا كانت الارتشاح الضوئي اعلي من 10% لأنه يمكن تحديدها بالتامر علي متوسط كثافة الإطار مقابل رقم الإطار. كما يتم تجاهل السلسلة إذا كان هناك تشوه واضح في غشاء الخلية أو ترجمه الخلية اثناء الاستحواذ. (د) يتم حفظ متوسط الكثافة في كل بكسل. (ه) يتم إنشاء الرسم البياني b-I الذي يمثل السطوع الظاهر ، b ، في كل بيكسل من الصورة. (و) يستخدم الرسم البياني بي-I لاختيار عائد الاستثمار الذي هو فوق الخلفية. (ز) يتم تحليل توزيع الترددات من b-القيم لتحديد متوسط b-قيمه ± S.E. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مبدا N &Amp; B. N & B ثبت قيمه الحالة المتوسطة للندرة من الفلوبورس من خلال قياس التقلبات الفلورية التي تحدث عندما تتحرك داخل وخارج حجم الاضاءه اثناء اكتساب سلسله مكدس الوقت من الصور "K". ميزت الاتساع من التقلبات إحصائيا ب يحسب النسبة بين تباين من ال يتذبذب اشاره, σ2, ومتوسطه شده قيمه,. وفي ابسط السيناريوهات (ا) ، عندما يكون حجم الاضاءه فارغا (اي بدون فلوروبوريس) ، تصف النسبة ضجيج الاداه. إذا كانت الاشاره الفلورية تتقلب بسبب الفلوبورس المتنقلة (B ، C) ، فان التباين "الإضافي" يتناسب طرديا مع السطوع الجزيئي ، ε (تحسب الفوتونات لكل جزيء وفي الثانية) ، من جزيئات النشر. في (ب) ، وهناك 8 الاحاديه الانتشار فلوموريك وفي (ج) ، ونفس فلوبهورس منتشرة كما 2 اوليميمرات رباعيه. في هاتين الحالتين ، فان متوسط الكثافة هو نفسه ، ولكن الانحراف المعياري والسطوع مختلفه (1ε ، 4ε) ، لان اتساع التقلبات مختلفه. ε = 0 عندما الفلوروبيورس غير المنقولة أو غائبه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: المجهر المجهري TIRF. علي الرغم من ان N & B يعمل بشكل جيد علي قدم المساواة مع المجاهر المسح النقطية مجهزه متعددة الفوتونات ، موجه مستمرة أو نبض ليزر فوتون واحد وكاشفات العد التناظرية أو الفوتون ، TIRF المجهر مثاليه للتصوير الزماني السريع لديناميكية الجزيئية الاحداث التي تحدث في أو بالقرب من سطح الخلية مع سرعات ودقه ونسبه الاشاره/الضوضاء (S/N) التي لا يمكن تحقيقها من خلال تقنيات التصوير الأخرى. (ا) يستخدم المجهر التيرف مبدا الانعكاس الداخلي الكلي الذي يثير فيه ضوء الليزر الاثاره الزاوية فقط فلوفورس التي هي فقط تحت واجهه زجاجيه المياه من الشفة. يشع الليزر العينة في زاوية الاصابه أكبر من أو يساوي زاوية الانكسار الحرجة في حين ينعكس ضوء الليزر الاثاره تماما. الانعكاس يولد مجالا كهرومغناطيسيا رقيقا جدا في العينة يسمي موجه التخدير. ويتم جمع ضوء الفلورسنت الناتج عن المقطع المضيء الصغير من العينة من خلال هدف مجهر يوضع عموديا أدناه إلى الشريحة. (ب) يظهر الفريق مثالا تمثيليا علي طول موجه معين من الكثافة النسبية لحقل التخدير مقابل العمق ، الذي ينخفض اضعافا مضاعفه مع زيادة المسافة من السطح ، مما يوفر درجه عاليه من الدقة المحورية الصور. يتم تعيين الدقة الجانبية بواسطة الفتحة العددية والتكبير للهدف وبحجم البكسل لكاميرا الكشف. الداخلية الخلية ليست مضيئه وانها لا تسهم في اشاره مع الفلورية داخل الخلايا. متعدد الزاوية TIRF المجاهر تسمح باختيار أعماق اختراق مختلفه. انها توفر مقياس يعتمد علي الطول الموجي الاثاره وعاده ما يذهب من 70 نانومتر يصل إلى عمق 250 نانومتر لصوره واحده TIRF اللون. عمق الاضاءه الذي تم اختياره لهذا البروتوكول هو 110 نانومتر ، وهو نتيجة لحل وسط بين ضرورة استخدام طاقة الليزر المنخفضة وشده الاشاره الفلورية التي تنخفض بشكل حاد مع انخفاض عمق الاختراق. من المهم تجنب الحقول الكبيرة بشكل مفرط التي يمكن ان تضيء العديد من الحويصلات داخل الخلايا والسكان داخل الخلايا من الفلوروبيورس. ولذلك ، اعتمادا علي نوع العينة ، ينبغي استكشاف العديد من أعماق الاختراق ، والبحث عن أفضل مزيج: ارتفاع نسبه الاشاره إلى الضوضاء ، وانخفاض قوه الاثاره ، ووقت التعرض القصير ، وعمق الاختراق القصير. وبمجرد الانتهاء من هذا التحسين ، يتم الاحتفاظ عمق الاختراق ثابت لجميع الضوابط والعينات. (ج) صوره تمثيليه وصور tirf لخليه هيلا-Gpi-megfp بعد توجيه البرمجيات الأمثل لعمق واتجاه حقل التخدير. متعددة الزوايا TIRF المجاهر تسمح أيضا لتحسين اتجاه الحقل evتخدير. ويوصي بهذه الخطوة للتقليل من تشتت (اي زيادة حاده في كثافة واقل وضوحا الصورة) ، ويمكن ان يتم ذلك وفقا لتعليمات المجهر محدده المستخدمة. في هذا البروتوكول يتضمن برنامج المجهر الأمثل التلقائي لاتجاه حقل evتخدير. للتحسين اليدوي ، راجع البروتوكولات المنشورة36،37. (د) الخلية التمثيلية التي تعبر عن بناء FGFR1 في الشكل الكتابي وبعد الاستفادة المثلي من الاضاءه الخاصة بالطراز tirf. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التقاط السلسلة الزمنيه ومعايره استجابه الكاميرا لفوتونات المفردة. (ا) مثال للإطار الأول من سلسله زمنيه 700 الإطار الذي تم التقاطه علي خليه FGFR1 في وضع المستشعر المقصوصة. يتم حجب رقاقه الكاميرا جزئيا (مستطيلات حمراء) باستخدام موصل العرض المزدوج المثبت علي مجهر TIRF (الشكل 1B). يتم التعرف علي مناطق المعايرة الداخلية في صوره الكثافة المتوسطة (B) ومعالجتها (C) لتقدير معلمات الكاميرا عن طريق التامر علي تردد السجل مقابل المستويات الرقمية (D). نظام الكشف التناظرية ، مثل كاميرا EMCCD ، بالكشف عن نبضات الضوئية بدلا من التهم الفوتون ، وتوزيع ارتفاع نبض الفوتون هو شبه الاسي. الجزء الأول من التوزيع ويرجع ذلك إلى مكبر للصوت والتناظرية إلى الرقمية محول وانه يسهم ضجيج قراءات غاوسي (الفرق التي أدخلتها تسجيل اشاره). والقناة الأكثر اكتظاظا بالسكان (اي القيمة الأكثر شيوعا) للتوزيع هي الازاحه (مكافئ 13). باستخدام مؤشر عمودي في مؤامرة سجل ، يتم فصل الجزء الأول من التوزيع من الجزء الثاني الاسي ، فوق 250 DL ، والذي يمثل متوسط استجابه الكاميرا لفوتون واحد (المنحدر هو عامل S في eq. 12). قياس هذه المعلمات يسمح بتقدير كثافة الفوتونات التي يتم تسجيلها اثناء الاستحواذ. التهم (DL) في مقياس اللون الزائف. حجم بكسل = 124 نانومتر; تنسيق الصورة = 256x256 بكسل ، عمق الاختراق للحقل evتخدير ~ 110 nm; معايره عائد الاستثمار #1 = 19x256 بكسل; معايره عائد الاستثمار #2 = 5x256 بكسل. DL = المستويات الرقمية. التعرض = 1 مللي ثانيه و EMGain (عامل G في مكافئ 12 و 13 و 14) = 1000. لاحظ ان الكاميرات التي تعمل في وضع العد الفوتون مع الخلفية هي ما يعادل للكشف عن التناظرية مع S = 1 (eq. 12) ومع σ2d وأزاحه (eq. 13) تقاس بنفس الطريقة كما لنظام التناظرية18. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحليل N &Amp; B لقله الFGFR1. (ا) النتائج التمثيلية من خليتين في الطبق نفسه تعبران عن FGFR1 وتلتقط في الوقت 0 دقيقه (اعلي) و 7 دقائق (أسفل) بعد أضافه 20 نانوغرام/مل FGF2 ، و (ب) خليتين هيلا تعبران عن الاشاره بنيات Gpi-megfp (اعلي) و GPI-mEGFP-mEGFP (أسفل). يظهر تسلسل التحليل بأكمله (من اليسار إلى اليمين): متوسط كثافة السلسلة الزمنيه ؛ مؤامرة من جميع القيم B كداله لكثافة الفلورية التي تمثل رمز اللون عدد بكسل وجود نفس B-القيمة في الصورة والمؤشرات مستطيله تحديد المنطقة من الفائدة (ROI) ، والخلفية (BG) ومناطق منخفضه جدا كثافة (LI). لاحظ ان فلوبيدورس الغير متحركة سوف تعطي B-القيمة = 1 منذ في غياب التقلبات ε = 0; B-خريطة لعائد الاستثمار المختار والرسم البياني للتوزيع B المرتبط. تم تجهيز توزيع القيمة B بوظيفة غوسيه (خط احمر متقطع) لحساب متوسط السطوع الظاهر ، B (الخط الأحمر الكامل) وإحصاءات التوزيع (الجدول التكميلي 1) b-القيمة = b ' = b/S (eq. 15) ؛ كثافة = ( - أزاحه)/s; M = مونومر ؛ D = dimer; قضبان المقياس = 10 ميكرون. سلسله وقت البيانات الخام في الفيلم التكميلي 1، الفيلمالتكميلي 2 ، الفيلم التكميلي 3، والفيلم التكميلي 4. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: حركيه FGFR1 القلة التي يسببها التنشيط. الحركات الحركية التمثيلية الموصوفة بالسطوع المتوسط العادي (مكافئ 16) للخلايا هيلا-mEGFP-FGFR1 بعد التحفيز مع 20 نانوغرام/مل FGF2 (A) أو 50 ميكروغرام/مل Ncam-Fc (B). تم التقاط الخلايا في نفس الطبق في النقاط الزمنيه المتزايدة والسطوع المتوسط الظاهر ، B ± S.E. ، تم حسابه من الرسوم البيانية للتوزيع B. وقد تم تعديل هذا الرقم باذن من Zamai et al. مجلة علوم الخلايا (2019)31. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: الحركية السريعة وتفسير البيانات. مخطط مبعثر لجميع قيم السطوع المتوسط العادي التي تم الحصول عليها من نسخ متماثلة من التشغيل الحركي الذي تم تحفيز خلايا هيلا-mEGFP-FGFR1 اما مع NCAM-Fc (50 ميكروغرام/مل) أو FGF2 (20 نانوغرام/مل). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: لقطه شاشه لروتين التحليل في MatLab. لقطه شاشه من روتين MATLAB واجهه المستخدم الرسوميه N & B التي تظهر خطوات التحليل الاوليه: تحميل السلسلة الزمنيه; حساب متوسط كثافة الصورة ، وحساب كثافة الملف الشخصي ، وحساب B-خريطة والرسم البياني بي-I. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| المعلمه | GPI-mEGFP | GPI-mEGFP-mEGFP | mEGFP-FGFR1 (الوقت = 0 ') | mEGFP-FGFR1 (الوقت = 10 ') |
| [غوسيه] يعني [ب-فلو] | 1.070 | 1.141 | 1.070 | 1.141 |
| S.E. علي متوسط B-القيمة | 0.001 | 0.001 | 0.001 | 0.001 |
| ذاكره من ال [ب-فوه] توزيع | 0.059 | 0.067 | 0.077 | 0.075 |
| 95% الفاصل الزمني للثقة لمتوسط B-القيمة | 1.069 إلى 1.071 | 1.139 إلى 1.143 | 1.069 إلى 1.072 | 1.139 إلى 1.143 |
| ذاكره الفاصل الزمني للثقة 95% من القيمة B | 0.058 إلى 0.060 | 0.065 إلى 0.069 | 0.075 إلى 0.079 | 0.073 إلى 0.078 |
| تركيب القيود | ذاكره > 0 | ذاكره > 0 | ذاكره > 0 | ذاكره > 0 |
| S.E. خطا القياسية; ذاكره الانحراف المعياري | ||||
الجدول التكميلي 1: تحليل السطوع الظاهر. وأجريت الإحصاءات والمعلمات المناسبة لل B-التوزيعات في الشكل 5 . وقد تم الحصول علي الحد الأدنى من النوبات المربعة تحت قيود الانحراف المعياري > 0 مع النطاق الذي تم اختياره تلقائيا والتكرارات القصوى = 1000. R مربع: megfp-FGFR1 مونومر = 0.9957 ، megfp FGFR1 ديمر 0.9940 ؛ GPI-mEGFP = 0.9985; GPI-mEGFP-mEGFP = 0.9970.
الفيلم التكميلي 1: وقت [سري] من [هيلا-مغب-FGFR1] خليه في وقت = 0 دقائق بعد FGF2 تحفيز (20 [نغ/مل] في [ببس] يلحق مع 0.01% [بوسنيا]) يبدي في شكل 5. يتم أعاده إنتاج سلسله من الإطارات 800 غير مضغوط في 7 اطارا في الثانية. تنسيق الصورة = 256 x 256 بكسل; حجم بكسل = 124 nm; يتم تحديد منطقه المعايرة الداخلية علي انها عصابات جانبيه داكنه. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
الفيلم التكميلي 2: السلسلة الزمنيه المبينة في الشكل 5 من خليه هيلا-MEGFP-FGFR1 في الوقت المناسب = 7 دقائق بعد FGF2 التحفيز (20 نانوغرام/مل في التلفزيونية تستكمل مع 0.01 ٪ جيش صرب البوسنيين) سلسله من 800 الإطارات هي مستنسخه غير مضغوط في 7 اطارا في الدقيقة. تنسيق الصورة = 256 x 256 بكسل; حجم بكسل = 124 nm; يتم تحديد منطقه المعايرة الداخلية علي انها عصابات جانبيه داكنه. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
الفيلم التكميلي 3: المسلسلات الزمنيه المبينة في الشكل 5 من خليه هيلا-Gpi-megfp بعد أضافه السيارة (التي تستكمل مع 0.01 ٪ جيش صرب الجمهورية). يتم أعاده إنتاج سلسله من الإطارات 1,000 غير مضغوط في 7 اطارا في الثانية. تنسيق الصورة = 256 x 256 بكسل; حجم بكسل = 124 nm; يتم تحديد منطقه المعايرة الداخلية علي انها عصابات جانبيه داكنه. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
الفيلم التكميلي 4: المسلسلات الزمنيه المبينة في الشكل 5 من خليه هيلا-Gpi-megfp-megfp بعد أضافه السيارة (التي تستكمل مع 0.01 ٪ جيش صرب الجمهورية). يتم أعاده إنتاج سلسله من الإطارات 1,000 غير مضغوط في 7 اطارا في الثانية. تنسيق الصورة = 256 x 256 بكسل; حجم بكسل = 124 nm; يتم تحديد منطقه المعايرة الداخلية علي انها عصابات جانبيه داكنه. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
N & B يتطلب العديد من الاحتياطات في اختيار نموذج الخلية واستراتيجية وضع العلامات. ويمكن تطبيقه فقط علي الخلايا الحية التي لا تزال ملتزمه بثبات خلال وقت التقاط الصورة. ويمكن التعامل مع التقلبات الاضافيه الناجمة عن النزوح الجامد للخلية بأكملها مع نهج استعاده الصورة المناسبة38. ومع ذلك ، عموما عندما تتحرك الخلية ، وغشاء الخلية أيضا تشوات ، وتشوه هيكل ، وإنتاج الفرق الكبيرة الاضافيه ، ويدخل قيود خطيره علي تحليل البروتينات الغشائية. في هذا العمل ، يتم التعبير عن بناء الفلورسنت في خط الخلية هيلا لان FGFR1 التاسيسيه لا يكاد يذكر. وجود البروتين التاسيسي هو شرط لتجنب ، والا فان السكان المختلطة من الفلورسنت وغير الفلورية مستقبلات القلة من المحتمل ان تشكل. ونتيجة لذلك ، فان تحليل N & B ، والذي يستند فقط علي سطوع السكان البروتين الموسومة فلوريسسينتلي ، سيعود تقدير غير موثوق به من الدولة المعتدلة القلة. هذا الجانب مهم بشكل خاص عند تطبيق N & B للكشف عن الاحداث ديميريشن مستقبلات التي يزيد السطوع فقط بعامل 2 ، مثل FGFR1 الثنائية في وجود FGF2 ligand. في مثل هذه الحالة ، يمكن لوجود الدمامل مختلطة إخفاء تماما الاحداث ديميريشن كشفها N & B. تلوث الفلورسنت الفلورية مع الاشكال التاسيسيه غير الفلورية هي واحده من المزالق المحتملة لأي نهج يستند إلى الكشف عن الفلورية ، ما لم يتم التعبير عن البروتين الموسومة إلى حد كبير. ومع ذلك ، فان دراسات قله القيمة في ظروف التعبير الفوقي للبروتين تثير مخاوف بشان أهميتها الوظيفية. ومن المرجح ان يكون للخلايا العابرة للحدود مستويات متغيرة من الفلورية (اي تركيز البروتين) وتكون مفيده لاختبار استقلاليه متوسط السطوع علي تركيز البروتين ، حيث يمكن تطبيق N & B علي مجموعه واسعه من تركيزات ، تحت شرط الاستجابة الخطية للكشف (انظر تعريف السطوع ، eq. 1).
وثمة قيد آخر هو وضع علامات علي المستقبلات باستخدام الفلوروفيمور المستقر في الخلايا الحية. هاله-العلامات ، والبروتينات الفلورية (FP) أو غيرها من العلامات الفلورية التكافؤ هي تسميات مناسبه للحصول علي عدد دقيق من الفلوروبيورس ملزمه لكل جزيء من البروتين في الخلية. للحد من تعقيد تحليل N & B ، فاننا نستخدم اما البروتينات الفلورية أو علامات الهالة التي ينتج عنها وسم من 1 إلى 1 بالبروتين. يجب ان يكون FP من الاختيار موحودي في شكل ناضجه ، وجود ميل ضئيله الارتباط الذاتي التي ، والا ، قد تحفز القلة الاصطناعية من مستقبلات الموسومة FP. في هذا البروتوكول ، ونحن نستخدم (A207K) megfp لان هذه الطفرة نقطه واحده يلغي الميل megfp التجميع الذاتي كما هو مبين سابقا31،39،40. وبغض النظر عن استراتيجية وضع العلامات ، ينبغي التحقق من البروتين الموسوم فلوريسسينتلي للاحتفاظ بالنشاط البيولوجي في نموذج الخلية المختارة ، حيث ان وظيفة الجزيئات الموسومة ضرورية لربط احداث القلة مستقبلات الإشارات. في نموذج لدينا ، ونحن اثبت اوتوفوسفريلاتيون من الفلورسنت (A207K) megfp-FGFR1 بعد تحفيز الخلايا المحولة مع مستقبلات يجند FGF231.
ويستند N & B علي انتشار الجزيئات في حجم الاضاءه. في الكشف عن الكاميرا الرقمية ، والتعرض للوقت (اي الوقت يسكن بكسل في الكشف التناظرية ، tيسكن) يجب ان تكون قصيرة بما يكفي ان يتم التقاط واحد وتكوين واحد فقط من الجزيئات في وحده التخزين البؤري. هذا ان يقول ان الاحتمال من فلوكوفيري يدخل أو يخرج الحجم مضيئه اثناء الانكشاف وقت صغيره جدا. يجب ان يكون وقت التعريض الضوئي أقصر من وقت الاقامه فلوكوفيري (τD) وهو متوسط الوقت الذي يقضيه فلوكوفيري في الحجم المضيء. ولذلك ، قبل البدء في تجربه N & B ، فمن الضروري ان يكون بعض فكره عن وقت الاقامه (أو معامل الانتشار) من البروتين المستهدف ، والذي في التقريب الأول ، يعتمد علي التوطين تحت الخلوية والكتلة الجزيئية. معدل الإطار هو معكوس الوقت المطلوب للكاميرا للحصول علي صوره ومن ثم قراءه تلك الصورة بالبالكامل ، وغالبا ما يتم حسابه تقريبا من العدد الإجمالي للبيكسلات ومعدل القراء ، مع وقت التعرض. علي الرغم من ان معدل الإطار لا تحتاج إلى ان تكون سريعة ، دوره الوقت (دورهt) ، الذي هو مجموع معدل الإطار والوقت لاعداد القبض علي الإطار التالي ، قد تؤثر علي التحليل. ويمكن تعميم هذه القيود علي النحو التالي: دوره t > > τD > > tيسكن. وإذا كان وقت الدورة سريعا جدا ، فان الجزيئات لن تنتقل بشكل ملموس من اطار إلى آخر في ذلك الوقت ، ستظهر علي انها غير منقوله (B = 1). ومع ذلك ، لان هناك حاجه إلى مئات من الإطارات للتحليل ، يتم تعيين ركوب الدراجات في أسرع ما يمكن (زيادة أو تقليل تنسيق الصورة في عدد من بكسل) لتجنب نزوح الخلايا وتشويه غشاء الخلية التي من شانها ان تضيف فرقا كبيرا إضافيا اثناء ال [سري] اكتساب. في مثال هذا البروتوكول ، إبطا دوره الوقت هو 22 مللي ثانيه ، بحيث يمكن الحصول علي 500 إطارات في 11 ثانيه.
السطوع الجزيئي ليس كميه مطلقه. هو يعتمد علي الخاصية جزيئيه من ال [فلوفيبور] (مقطع عرضي وكميه غله), علي التجريبية ثبتت فوق (كاشفه وبصريات) [اس ول س] علي الاثاره شروط مثل الليزر قوه. التالي ، فان نهج TIRF-N & B ينتج سطوعا واضحا وبسبب انه من الأساسي اعداد "نموذج خليه مرجعيه" يعبر عن بناء مرجعي مع دوله القلة الصوتية أحاديه الصوت. ويحمل البناء المرجعي نفس العلامة الفلورية للبروتين قيد الدراسة [هنا ، و (A207K) mEGFP] ويقوم بالتمركز في نفس المقصورة الفرعية (هنا ، غشاء البلازما). في هذا العمل ونحن نستخدم جليكوسيلفوسفاتيديلينوسيتول (GPI) الراسية (A207K) بناء mEGFP اننا قد أظهرت مرارا وتكرارا ان يكون معيار سطوع مونوميريك موثوق بها لمستقبلات سطح الخلية الموسومة مع نفس فلوفيمور30، 31-
ومن العيوب الرئيسية في هذا الأمر حدوث الارتشاح الضوئي فلوكوفيري الذي يحدث علي الأرجح عندما تتعرض الخلية نفسها بشكل متكرر للضوء اثناء التشغيل الحركي ، وتؤدي إلى التقليل من شان حاله القلة. لمنع ذلك ، يتم الحصول علي حركيه السطوع عن طريق الجمع بين متوسط سطوع الخلايا المختلفة التي تم التقاطها في نقطه زمنيه مختلفه (الشكل 6). وهذا يعني انه في طبق بتري كل خليه هي نقطه زمنيه مختلفه من الحركية وطبق بتري يمثل تشغيل كامل الحركية.
عندما تكون ديناميات القلة سريعة ومعقده ، مثل الFGFR1 الذي يسببه القلة غير المتعارف عليها ، NCAM31، فان الملف الشخصي لمتوسط السطوع العادي مقابل الوقت يمكن ان يكون متغيرا وغير مستقر (الشكل 6ب ). في مثل هذه الحالة ، لا يمكن تحديد استنساخ عن طريق قراءه النسخ المتماثلة من الخلايا في نقاط زمنيه محدده ، وذلك بسبب ضرورة التحرك والتركيز علي خليه جديده في كل مره ، واختيار العائد علي الاستثمار ، والتقاط وفحص/تجاهل السلسلة الزمنيه. التالي ، يمكن تقييم استنساخ من حيث تشابه الشخصية الحركية واتساع التغيرات في السطوع.
ويرد في الشكل 7عرض عام للنتائج. المؤامرة مبعثر يوضح فقط متوسط سطوع تقاس في الخلايا من نفس الطبق ، وإهمال وقت كل التقاط. في هذه المؤامرة الفرق الرئيسي المستحث من قبل اثنين من يغاندس علي حاله القلة من مستقبلات لا تزال واضحة ، علي الرغم من ان يتم أزاله جميع المعلومات الحركية. ومع ذلك ، علي حد سواء مجموعه من التجارب (FGF2-مقابل NCAM-التي يسببها القلة) ، فان النهج التقليدي لتحديد متوسط ± ذاكره من كل تشغيل في الشكل 7 يؤدي إلى استنتاجات مضلله منذ جزيئات FGFR1 حفزها FGF2 بوضوح العبور إلى دولتين محددتين بشكل جيد ، في حين ان NCAM يدفع غير مستقره ودوري FGFR1 القلة الخلائط التي لن تكون ممثله بشكل جيد من قبل متوسط قيمه ± ذاكره.
باختصار ، من وجهه نظر تجريبية ، N & B يتطلب فقط الوصول إلى المجهر مجهزه وحده الاستحواذ السريع وبرنامج مخصص. ويمكن الموسومة البروتين من الفائدة مع مجموعه متنوعة من البروتينات الفلورية موحودي أو الفلوروهورس العضوية ، ولكن القياسات الكمية تتطلب العديد من الشروط التي ينبغي الوفاء بها: وضع العلامات المعيارية ، مرجع سطوع القياسية ، كاشف المعايرة وعدم الرشح الضوئي. وفي هذا السياق ، يعتبر نهج N & B أداه قويه لفك القلة المكانية للبروتينات في الخلايا الحية. وعلاوة علي ذلك ، فان التطورات الاخيره في أعاده تشكيل البيانات الخام لحل الترجيح الإحصائي41 والجمع بين الطيف الطيفي التبادلي بين الترابط وبين الترابط التبادلي n & B42 هي صقل وتحسين قابليه تطبيق n نهج & B لدراسات قله البروتين والتفاعل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ويدعم هذا المركز وزاره الاستخبارات والابتكار واليقع والمؤسسة المناصرة للمؤسسة الخيرية ، وهو أحد مراكز الامتياز في سيفيرو اوتشوا (سيف-2015-0505). ويدعمنا أيضا الصندوق الأوروبي للتنمية الاقليميه "Una manera de هاجر Europa". وتنوه جامعه كاليفورنيا بالدعم المقدم من الرابطة الايطاليه للبحث عن السرطان ، وجمعيه البحوث الدولية للسرطان (المعروفة الآن باسم بحوث السرطان في جميع انحاء العالم) ، ووزارة الصحة الايطاليه. وتقر تحكيم بان "مؤسسه بيانكا ديل مؤنتي دي لومباردي" لدعمها الجزئي لعمله مع الزمالة الكهروضوئية "Progetetetalita ايفانو Becchi" 2011-2012.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x 1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software. | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
| Albumin from Bovine Serum 98% minimun | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | A7906-100G | |
| DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 21063029 | Used serum free for microscopy |
| DMEM high-glucose GlutaMAX I | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10566-016 | Used for complete medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) | Biowest, Nuaillé, France | X0515-500 | |
| Emission splitting system Photometrics DV2 | TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10270106 | 10% inactivated supplement for complete medium |
| Glass bottom 35 mm sterile 1.5 dishes | MatTek, Ashland, MA, USA | P35G-0.170-14-C | uncoated, glass thickness 0.17 microns |
| GraphPad Prism | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | ||
| Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells | Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany | CB_08011102 | |
| iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software | Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK | This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series | |
| Matlab Executable N&B routine | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain | download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia | |
| MatLab v.2018b | The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x | Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA | LONZA 17-602E | supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100 U/100µg. |
| pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector | Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy | Zamai et al., 2019 | |
| pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain | Hellriegel et al., 2011 | |
| pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain | Hellriegel et al., 2011 | |
| Recombinant FGF2 | PeproTech EC, Ltd., London, UK | Ligand solution: 20 ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA. | |
| Sodium pyruvate GIBCO | ThermoFisher Scientific | 11360070 | 1 mM supplement for medium |
| TransIt-LT1 Transfection Reagent | MirusBio LLC, Madison, WI, USA | MIR 2300 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 25200056 | |
| Type F Immersion liquid 10 mL | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513 859 | |
| UltraPure BSA (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | AM2618 | 0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections |
References
- Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization. Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).
- Ferre, S., et al. G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives. Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).
- Marsango, S., Ward, R. J., Alvarez-Curto, E., Milligan, G.
- Oishi, A., Cecon, E., Jockers, R. Melatonin Receptor Signaling: Impact of Receptor Oligomerization on Receptor Function. International Review of Cell and Molecular Biology. 338, 59-77 (2018).
- Thelen, M., Munoz, L. M., Rodriguez-Frade, J. M., Mellado, M. Chemokine receptor oligomerization: functional considerations. Current Opinion in Pharmacology. 10 (1), 38-43 (2010).
- Van Craenenbroeck, K. GPCR oligomerization: contribution to receptor biogenesis. Subcellular Biochemistry. 63, 43-65 (2012).
- Wnorowski, A., Jozwiak, K. Homo- and hetero-oligomerization of beta2-adrenergic receptor in receptor trafficking, signaling pathways and receptor pharmacology. Cell Signaling Technology. 26 (10), 2259-2265 (2014).
- Fricke, F., Dietz, M. S., Heilemann, M. Single-molecule methods to study membrane receptor oligomerization. Chemphyschem. 16 (4), 713-721 (2015).
- Vidi, P. A., Ejendal, K. F., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Fluorescent protein complementation assays: new tools to study G protein-coupled receptor oligomerization and GPCR-mediated signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 331 (2), 185-193 (2011).
- Trussell, H. J., et al. Academic Press Library in Signal Processing. Trussell, J., et al. 4, Elsevier. 3-9 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18982-18987 (2008).
- Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Presse, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
- Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
- Qian, H., Elson, E. L. Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (14), 5479-5483 (1990).
- Chen, Y., Muller, J. D., So, P. T., Gratton, E. The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophysical Journal. 77 (1), 553-567 (1999).
- Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 69-81 (2008).
- Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
- Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
- Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E.
- Levi, V., Ruan, Q., Kis-Petikova, K., Gratton, E. Scanning FCS, a novel method for three-dimensional particle tracking. Biochemical Society Transactions. 31 (Pt 5), 997-1000 (2003).
- Hinde, E., et al. Quantifying the dynamics of the oligomeric transcription factor STAT3 by pair correlation of molecular brightness. Nature Communications. 7, 11047 (2016).
- Waithe, D., et al. Optimized processing and analysis of conventional confocal microscopy generated scanning FCS data. Methods. 140-141, 62-73 (2018).
- Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
- Ossato, G., et al. A two-step path to inclusion formation of huntingtin peptides revealed by number and brightness analysis. Biophysical Journal. 98 (12), 3078-3085 (2010).
- Nagy, P., Claus, J., Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Distribution of resting and ligand-bound ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases in living cells using number and brightness analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16524-16529 (2010).
- Ming, A. Y., et al. Dynamics and Distribution of Klothobeta (KLB) and fibroblast growth factor receptor-1 (FGFR1) in living cells reveal the fibroblast growth factor-21 (FGF21)-induced receptor complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (24), 19997-20006 (2012).
- Ross, J. A., et al. Oligomerization state of dynamin 2 in cell membranes using TIRF and number and brightness analysis. Biophysical Journal. 100 (3), L15-L17 (2011).
- Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. FASEB J. 25 (9), 2883-2897 (2011).
- Zamai, M., et al. Number and brightness analysis reveals that NCAM and FGF2 elicit different assembly and dynamics of FGFR1 in live cells. Journal of Cell Science. 132 (1), (2019).
- Hassler, K., et al. Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS) with low background and high count-rate per molecule. Optics Express. 13 (19), 7415-7423 (2005).
- Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope. Journal of Visualized Experiments. (92), e51994 (2014).
- Beenken, A., Mohammadi, M. The FGF family: biology, pathophysiology and therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 235-253 (2009).
- Joubert, J., Sharma, D.
- Gell, C., Berndt, M., Enderlein, J., Diez, S. TIRF microscopy evanescent field calibration using tilted fluorescent microtubules. Journal of Microscopy. 234 (1), 38-46 (2009).
- Burghardt, T. P. Measuring incidence angle for through-the-objective total internal reflection fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126007 (2012).
- Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
- Caiolfa, V. R., et al. Monomer-dimer dynamics and distribution of GPI-anchored uPAR are determined by cell surface protein assemblies. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1067-1082 (2007).
- Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 7877-7882 (2002).
- Cutrale, F., et al. Using enhanced number and brightness to measure protein oligomerization dynamics in live cells. Nature Protocols. 14 (2), 616-638 (2019).
- Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).
