Summary
Мы описываем подход к визуализации для определения среднего олигомерного состояния mEGFP-тегами-рецепторами олигомеров, индуцированных связыванием лиганд в плазменной мембране живых клеток. Протокол основан на микроскопии Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) в сочетании с анализом числа и яркости (N и B).
Abstract
Несмотря на важность и повсеместность олигомеризации рецепторов, для обнаружения событий кластеризации и измерения степени кластеризации применяется несколько методов. Здесь мы описываем подход к визуализации для определения среднего олигомерного состояния mEGFP-тегами-рецепторами гомокомплексов в мембране живых клеток. Протокол основан на микроскопии Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) в сочетании с анализом числа и яркости (N и B). Н З/Б - это метод, похожий на флуоресценцию-корреляционную спектроскопию (FCS) и фотон, считающий гистограмму (PCH), которые основаны на статистическом анализе колебаний интенсивности флюорофорора, распространяющихся в и из освещения объема во время наблюдения. В частности, Н И Б является упрощением ПХГ для получения информации о среднем количестве белков в олигомерных смесях. Амплитуды интенсивности описываются молекулярной яркостью фторофора и средним количеством флюорофоров в объеме освещения. Таким образом, Н З/Б рассматривает только первый и второй моменты распределения амплитуды, а именно, средняя интенсивность и дисперсия. Это, в то же время, сила и слабость метода. Поскольку учитываются только два момента, Н И Б не может определить моляровую фракцию неизвестных олигомеров в смеси, но она оценивает только среднее состояние олигомеризации смеси. Тем не менее, он может быть применен к относительно небольшим сериям времени (по сравнению с другими методами) изображений живых клеток на пиксельной основе, просто отслеживая временные колебания интенсивности флуоресценции. Это уменьшает эффективное время на пиксель до нескольких микросекунд, что позволяет приобретения в диапазоне секунд до миллисекунд, что необходимо для быстрой кинетики олигомеризации. Наконец, можно исследовать большие клеточные области, а также субклеточные отсеки.
Introduction
Мы описываем подход к визуализации Total Internal Reflection Fluorescence-Number и Brightness (TIRF-N'amp;B) для определения среднего олигомерного состояния молекул рецепторов в плазменной мембране живых клеток, направленных на увязку рецепторной сборки динамика к биологической функции белков(Рисунок 1).
При внеклеточном связывании лиганд рецепторы инициируют трансдукцию внутриклеточного сигнала в зависимости от их конформации, олигомеризации, потенциальных корецепторов и мембранного состава. Несмотря на важность и повсеместность олигомеризации рецепторов, признанных ключевым событием в клеточной сигнализации1,2,3,4,5,6, 7, несколько методов могут обнаружить события кластеризации и измерить степень кластеризации экспериментально8,9. Конфокальный объем (x,y'300 nm, z z 900 nm) недостаточно решен для доказательства молекулярного взаимодействия и стоихиометрии, даже после оптимизации алгоритмами восстановления изображения10. Подедины состав белковых олигомеров не может быть решен на чисто пространственной основе даже с помощью супер-разрешения методов на х, разрешение 20-70 нм, таких как PALM11, STORM12, и STED13. Более того, их временное разрешение (в порядке минут на изображение) не может следовать за кинетиками в диапазоне секунд. Одномолекулярная ступенчатое отбеливание разрешает стойихиометрию белковых олигомеров только в том случае, если они неподвижны14.
Одним из наиболее универсальных методов измерения плотности и олигомеризации флуоресцентно отмеченных белков в пределах одного изображения является анализ распределения пространственной интенсивности (SpIDA), который опирается на пространственную выборку. Он применим как к химически фиксированным, так и к живым клеткам, и позволяет анализировать несколько областей, представляющих интерес для клетки, одновременно с помощью стандартной флуоресценции15. Кроме того, методы момента, такие как флуоресценция-корреляция спектроскопии (FCS)16, фотон подсчета гистограммы (PCH)17, и количество и яркость (N и B)18,19, подходят для количественного олигомера Измерения. Эти методы анализируют колебания интенсивности флуоресценции, которые могут наблюдаться во времени, когда фторфоры рассеивается в и из объема освещения. Амплитуда колебаний интенсивности можно однозначно описать молекулярной яркостью флюорофора (к) и средним количеством флюорофоров (n) в пределах объема освещения17 (Рисунок 2). Как правило, коэффициент диффузии фторфоров и среднее количество молекул (обратно связанных с значением G(0) в пределах объема освещения могут быть получены FCS20. Однако, так как время диффузии только масштабируется с кубической корнем массы, FCS не является достаточно чувствительным для обнаружения изменений в молекулярной массе21. На практике, один цвет FCS не может обнаружить димеризацию мембранных рецепторов. PCH разрешает смеси различных олигомеров точно. Используя более двух мгновений распределения амплитуды, он обнаруживает молекулы разной яркости, которые занимают один и тот же объем освещения. Сканирование FCS22 и разработки, такие как интересная парно-корреляция молекулярной яркости (pCOMB) подход23, введены для расширения диапазона применимости методов корреляции флуоресценции в биологических системах24 , остаются одноточечными методами, не имеющими возможности быстрых измерений на большой площади ячейки, требующих много последовательных наблюдений на каждом пикселе и получения данных в порядке секунд.
Н З/Б является упрощенной версией PCH, которая учитывает только первый и второй моменты амплитуды распределения флуоресценции, а именно, средняя интенсивность, lt; I'gt;, и дисперсия,No 2 (Рисунок 2)18,19 и, из-за этого, он не может определить моляровую фракцию неизвестных олигомеров в смеси, а лишь оценивает среднее состояние олигомеризации смеси. Тем не менее, Н И Б имеет то преимущество, что работает с относительно меньшими временные ряды изображений живых клеток, чем PCH на пиксель за пикселем основе, просто путем мониторинга колебаний во времени флуоресценции интенсивности. Поскольку Н И Б сокращает время за пикселем до нескольких микросекунд, он может следить за быстрой кинетикой олигомеризации на больших клеточных площадях, позволяя присугнять изображение в временной шкале секунд в сканирующей микроскопии (например, confocal, 2-фотон) и миллисекундах микроскопии на основе камеры (например, TIRFM).
В нескольких докладах была продемонстрирована способность Н И Б количественно очислять количество субъединиц в белковых кластерах с помощью визуализации расширенных клеточных регионов. Кластеры Paxillin-EGFP были обнаружены на участках адгезии в клетках CHO-K125,а внутриклеточная агрегация патогенного пептида Httex1p была описана в клетках COS-726. Н З/Б был применен для следующих лиганд-управляемых олигомеризации рецептора ErbB27, и влияние лиганд FGF21 на Klothob (KLB) и FGFR1c в клетках HeLa28. Сочетание tIRF изображений и N и B анализ был использован, чтобы показать, что динамин-2 в первую очередь тетрамерические всей клеточной мембраны29. Мы применили N и B как raster сканирования и TIRF изображения доказать лиганд-управляемый димеризации uPAR и FGFR1 клеточных мембранных рецепторов30,31.
Методы корреляции флуоресценции, такие как Н И Б, FCS и PCH, основаны на том, что в открытом томе число частиц следует за распределением Пуассона. Потому что только фотоны, что фторофоры излучают могут быть обнаружены, среднее значение для измеренной интенсивности флуоресценции по сравнению со временем в пикселе изображения, 
является продуктом среднего количества флюорофоров в объеме освещения,, и их молекулярная яркость, No17:
где выражено как количество фотонов, испускаемых на единицу времени (обычно в секунду) на молекулу, когда молекула находится в центре объема освещения.
Яркость является свойством каждого фторофора в данном приобретении создана, в то время как интенсивность сумма всех взносов от всех фторофоров. В биологических конкурсах, яркость будет увеличиваться с увеличением числа флюорофоров, которые колеблются вместе, давая информацию о состоянии олигомеризации флуоресцентно помечены белка. Амплитуда колебаний на данном пикселе измеряется из дисперсии сигнала флуоресценции,No 2:
Где среднее значение квадрата 
интенсивности, и квадрат среднего 
интенсивности, , вычисляются из индивидуальных значений интенсивности в каждом пикселе каждого кадра:
где K — это количество общих кадров в временных рядах. Экспериментально необходимо вычислить для всей серии изображений дисперсию, описывающая рассеяние значений индивидуальной интенсивности на каждом пикселе одного изображения вокруг значения средней интенсивности. Разница включает в себя все колебания разного происхождения. В первом приближении, дисперсия из-за рассеяния частиц в объеме освещения,20, могут быть отделены от дисперсии из-за шума выстрела детектора,2d. Эти два отклонения являются независимыми; таким образом, общая дисперсия дается их сумма:
Разница, из-за молекулярных колебаний в и из объема обнаружения, линейно зависит от молекулярной яркости и интенсивности:
Перестановка eq. 6 в соответствии с eq. 1:
Согласно типичной концепции флуоресценции корреляции спектроскопии, уравнение 7 гласит, что дисперсия из-за количества колебаний зависит от квадрата яркости частицы.
Затем, дисперсия из-за колебаний детектора является линейной функцией обнаруженной интенсивности, при предположении, что детектор работает ниже предела насыщения19:
В случае фотонововых детекторов 1и с0, таким образом, дисперсия детектора равна средней интенсивности:
Чтобы применить эти понятия к реальным измерениям в живых клетках, Gratton и его коллеги18 определяют кажущуюся яркость, B, для каждого пикселя как соотношение дисперсии над средней интенсивностью:
B является параметр, который измеряется экспериментально. В этой работе, временные ряды изображения рецепторов FGFR1 на плазменной мембране клеток HeLa захвачены tIRF микроскопии и средняя кажущаяся яркость, B, определяется анализом N и B. Затем, после добавления FGF2, последовательные временные ряды фиксируются, чтобы следить за изменениями в самосборке молекул рецепторов на поверхности мембраны после стимуляции рецептора каноническим лигандой.
Однако, поскольку детектором микроскопа TIRF является камера EMCCD, выражение видимой яркости должно быть изменено как19:
где смещение является смещение интенсивности обнаружения электроники, что является характерной для настроек детектора. Дисперсия и средняя интенсивность для аналогового детектора, соответственно, даются:
где G является аналоговым увеличением в цифровых уровнях (DL/фотоны), S, цифровые уровни на фотон19, дается наклон интенсивности против дисперсии участка для источника света с постоянной интенсивностью (без временных колебаний). Коэффициент q связан с формой объема обнаружения пикселей. По данным Hassler et al.32, коэффициент q равен 0,3 для tIRF изображения, работающего при максимальном выигрыше камеры обнаружения19. Параметры смещения, S и G являются характеристиками камеры и микроскопа. Очевидная яркость, B, получена путем перестановки eq. 11 в соответствии с eq. 12 и 13:
Экспериментально, является сложной функцией интенсивности лазера и эффективности обнаружения системы. Тем не менее, поскольку B/S линейно зависит от К, важно определить только относительную стоимость к для данного режима обнаружения:
где « пропорционально К. Тем не менее, калибровка выполняется с помощью внутренней ссылки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка образцов
- День 1. Семена HeLa клетки в полной среде в концентрации 100000-200000 клеток / мл в стеклянно-нижней посуды. Семена 6-8 реплицировать блюда.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере среда дополняется 10% теплоинактивированной сывороткой плода (FBS), 1 мМ пируватом натрия, 100 U/100 мкг пенициллина/стрептомицина. Несколько реплицировать блюда готовятся. - День 2-3. Когда клетки находятся на суб-сфолентности, трансфектная половина посуды с плазмид протеином и вторая половина с плазмидами справки (мономер омичьей и dimer), в среде сыворотки-свободной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трансфекция производится в сыворотке свободной среде дополняется антибиотиками, 0,1% Бовин сыворотки Альбумин и 25 мМ HEPES буфер, без фенола красного. - День 3-4. Убедитесь, что транс-инфицированные клетки придерживаются нижней части посуды и клеточной мембраны флуоресцентные. Откажитесь от посуды с заросшими клетками или с очень низкой флуоресценцией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте клеткам перерастать. Клетки должны быть хорошо распределены и должны быть привязаны к стеклянной области блюда(рисунок 1А). Предварительно покрытая стеклянная донная посуда может быть использована для благоприятствования сливк клеток. Культура клеток проверяется на наличие микоплазмы перед любым экспериментом. В этом примере клетки трансфицируются плазмидом (A207K)mEGFP-FGFR1, а эталонные клетки трансфицируются плазмидами GPI-(A207K) с использованием стандартных протоколов. Для живой клеточной микроскопии рекомендуется среда, свободная от индикаторов; 25 mM HEPES буфер добавляется для предотвращения изменений рН во время изображения.
2. TIRF Изображений - Выравнивание лазерной линии и оптимизация TIRF освещение
- За четыре часа до начала эксперимента активируйте температурный инкубатор микроскопа при температуре 37 градусов По Цельсию.
- Включите микроскоп, компьютеры и камеры и ждите, пока камеры достигнут надлежащей рабочей температуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочая температура камеры, используемой в данном исследовании, составляет -75 градусов по Цельсию. - Поместите немного капли масла на цель. Положите образец блюда на место. Закройте двери инкубатора и дайте температуре блюда уравновеситься (10 мин).
- Включите лампу эпифлюоресценции и лазер 488 нм.
- Выберите режим контраста эпифлюоресценции, чтобы исследовать образец, ища клетку, чтобы сосредоточиться на глаз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование флуоресцентной лампы для поиска клеток корыта глаз не является обязательным. Вместо этого можно использовать подходящую лазерную линию. - Выберите правильный фильтр для сбора зеленого выброса через микроскоп камеры (Band Pass Ex 490/20 (500) Band Pass Em 525/50, или аналогичный.
- Переключитесь с глазного на порт камеры (камера #1 в режиме 1)в режиме эпифлюоресценции, уточните фокус и переключитесь на режим TIRF. Режимы Epifluorescence и TIRF могут быть названы с другой номенклатурой в зависимости от марки микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Там могут быть проблемы фокусировки или выравнивания лазера, если Есть нет флуоресцентных маркеров на интерфейсе coverslip. Чтобы выровнять лазер правильно (необходимо для хорошего TIRF), сосредоточьтесь на coverslip. Часто очень трудно определить, находится ли в центре внимания покрытие. В качестве предложения сосредоточьтесь на краях клеток. - Активируйте автоматическое выравнивание в соответствии с инструкциями микроскопа TIRF.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кратко, для шагов от 2.4 до 2.8, сперва находите клетки через ocular и фокусируйте на их, после этого посылайте излучение к порту камеры микроскопа TIRF, перефокусируйте клетки на экране компьютера микроскопа и активируйте процедуру для выравнивания лазера. Выравнивание состоит в поиске критического угла, под которым освещение становится эвакуационным(рисунок 3). Коммерческие микроскопы могут иметь несколько иные протоколы выравнивания, а также быть полностью автоматизированы; другие могут иметь небольшую камеру для облегчения визуализации критических условий угла. - Выберите подходящую глубину освещения и оптимизируйте направление эвакуационного поля(рисунок 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина проникновения сохраняется постоянной для всех элементов управления и образцов.
3. TIRF Изображений: Захват серии времени
- Определите область интереса (ROI) не менее 256 х 256 пикселей.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом настройке, захват осуществляется с камерой #2 под программным обеспечением, которое непосредственно контролирует только камеру (см. Рисунок 1 легенда). - Установите воздействие на 1 мс и EM получить до 1000 (это фактор G в eq. 12 и 13). При такой скорости может потребоваться регулировка или увеличение мощности лазера. Здесь мощность лазера составляет 0,5 мВт.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от типа камеры и пределов, установленных коэффициентом диффузии белка, интенсивностью флуоресценции и фоном, общие критерии для установки лазерной мощности не насыщают детектор, минимизируют фотоотрубение и захватывают как быстро, как это возможно на разумные S / N. Прибыль EM всегда устанавливается на максимуме камеры (см. Введение). - Запустите первую пробную последовательность в начальных условиях и приблизительно оцените значение S/N. Условия приемлемы на S/N 2-3 или выше, как измеряется в первом кадре первого тайм-ряда.
- Используйте ползунок системы расщепления выбросов, соединяющей камеру #2 микроскопом для маскировки стороны изображения(Рисунок 1B, Рисунок 4A-B)
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом настройке многоканальный разъем изображения устанавливается на камеру #2, чтобы позволить приобретение двух пространственно идентичных изображений одновременно. Система оснащена слайдами для установки различных фильтров для выбросов. Один из ползунок монтирует черную маску, чтобы покрыть сторону изображения. Область в маске используется для внутренней калибровки каждой временной серии для определения параметров камеры (eq. 12 и eq. 13). Таким образом, нет необходимости в независимом шаге калибровки и, что немаловажно, калибровка выполняется параллельно захвату каждой временной серии. При отсутствии этой системы камера может быть откалибрована при применении опубликованных протоколов33. - Выберите опцию автоматического сохранения файла камеры.
- Начните приобретение серии изображений. Приобретите минимум 700 кадров при минимальном соотношении S/N 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество кадров, необходимых для анализа, зависит от устойчивости образца к фотоотбелению и от дисперсии данных. Таким образом, качество каждой временной серии оценивается в ходе анализа N и B. - Не вынимая блюдо из микроскопа, добавьте лиганд.
- Выберите клетку с яркой флуоресценцией мембраны и быстро начать первый раз серии кинетической перспективе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если добавление лиганда выполняется быстро, этот первый захват устанавливает точку 0 времени лиганды кинетики. Программное обеспечение регистрирует точное время захвата. - Обыщите вторую ячейку и приобретите вторую точку времени кинетики.
ПРИМЕЧАНИЕ: Точечные процедуры посещения доступны в некоторых микроскопах, оснащенных x,y, z моторизованных этапов. Они позволяют запоминать несколько позиций на клеточной тарелке, и может помочь в сохранении более постоянного интервала времени между изображениями серии на разных клетках. - Захват новой ячейки для каждой временной точки кинетической перспективе.
ПРИМЕЧАНИЕ: После захвата ячейка частично отбеливается и не может быть повторно изображений. Из-за этого, кинетика получается путем объединения временных рядов многих клеток, каждая из которых захвачена в разное время. - Для каждого нового блюда повторяйте протокол со ступени 2,3 до 3,9.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для эталонных блюд добавьте объем транспортного средства (PBS дополненный 0,01% бычьего сыворотоки альбумина), эквивалентный тому, который используется для лиганда.
4. Количество и яркость (N и B): Проверка качества временных рядов
- Конвертировать и сохранить как . TIFF файлы, приобретенные с помощью программного обеспечения камеры (.sif файлы в этом примере).
- Импорт. TIFF файлы в режиме программного обеспечения анализа, активируя графический пользовательский интерфейс N и B (GUI) MATLAB.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используется индивидуальная процедура Matlab, исполняемая n и B (анализ N и B на https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia). Открыв импортный . TIFF файл, рутина генерирует среднее изображение интенсивности, средний профиль интенсивности и позволяет проверить серии кадр за кадром(Дополнительная диаграмма 1). Другое программное обеспечение доступно для анализа N и B (например, программное обеспечение SimFCS). - Отбросить серии, для которых средняя интенсивность профиля показывает более 10% фотоотбелении, и серии, в которых было очевидно искажения мембраны клеток или перевода во время приобретения.
- Обрез кадров, которые, очевидно, вне фокуса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инструмент обрезки реализован в рутине для отбрасывания одного или нескольких кадров в серии изображений. Эта операция разрешена, поскольку время кадра в кадр не является критическим, в то время как время расположения пикселей (время экспозиции) (см. Обсуждение). - Храните для анализа только серии, по крайней мере 500 временных рамок.
5. Количество и яркость (N и B): Определение параметров камеры (Offset, и S)
- Активируйте обычную калибровоченную камеру.
- Выберите область не менее 20 х 50 пикселей в области шума детектора(рисунок 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рутина происходит гистограмма значений (также определены цифровой уровень, DL) и он возвращает logarithm участок частоты по сравнению с цифровыми уровнями. - В сюжете журнала Frequency по сравнению с цифровым уровнем переместите линейный красный курсор, чтобы разграничить гауссовскую и линейную часть кривой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Красный курсор разделяет две части кривой, и активирует рутину возвращения смещения, который является центром гауссийской функции реакции камеры, кв гауссианской подгонки, и s фактор, который является склонли линейной части камеры respons e(Рисунок 4C-D).
6. Количество и яркость (N и B): Вычисление B-значений в выбранном регионе интересов (ROI)
- Активируйте ключ B.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это действие генерирует изображение средней интенсивности(рисунок 5, первый столбец) и B-изображение, в котором каждый отдельный B-значение связано с соответствующим пикселем на изображении(Дополнительная диаграмма 1). - Примените минимальный биннинг (2 2), чтобы уменьшить рассеивание данных и создать гистограмму B-I(рисунок 5, второй столбец).
ПРИМЕЧАНИЕ: Гистограмма B-I представляет распределение B-значений всех пикселей изображения по сравнению с интенсивностью пикселей. Y и B/S; Х -
смещение)/S(Дополнительная диаграмма 1 и eq. 11 и 15). - Осмотрите гистограмму B-I с помощью интерактивного квадратного курсора.
- Выберите квадратную рентабельность инвестиций для анализа(рисунок 5, третья колонка).
ПРИМЕЧАНИЕ: Курсор синхронизирует мобильную маску на изображении средней интенсивности, подчеркивая пиксели, которые выбраны внутри квадратной области курсора(Дополнительная диаграмма 1). Этой инспекцией можно исключить из анализа фон и области с очень низкой интенсивностью. - Создайте B-карту выбранной рентабельности инвестиций(рисунок 5, четвертый столбец).
- Сохраните файл ASCII B-значений, связанных с выбором.
- Импортируйте файл ASCII в графическом программном обеспечении, чтобы вычислить распределение частот данных и получить среднее Значение B и S.E(рисунок 5, пятая колонка).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если данные однородны, распределение частот ы B-значения приблизительно гауссийское распределение. - Применить eq. 15 для получения
средней яркости - 1 (количество /молекула) в течение времени" для каждой клетки в каждой точке времени кинетической перспективе. Нормализация данных в соответствии с:
где
среднее Значение B измеряется во время "т" 
после добавления лиганда, и является средним B-значениеизмеряется в то время t'0 (10-20 s после лиганда того).
ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализация результатов позволяет прямо сравнивать эксперименты, которые проводятся в разные дни. Он компенсирует различия в измеренной яркости за счет лазерной мощности и технических колебаний. - Участок нормализованной Средней яркости по сравнению с приобретением времени для создания кинетической перспективе (Рисунок 6).
средней яркости - 1 (количество /молекула) в течение времени" для каждой клетки в каждой точке времени кинетической перспективе. Нормализация данных в соответствии с:
среднее Значение B измеряется во время "т" 
после добавления лиганда, и является средним B-значениеизмеряется в то время t'0 (10-20 s после лиганда того).Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты по двум репрезентативным клеткам HeLa-mEGFP-FGFR1, посеянным в одной и той же культуре, показаны на рисунке 5 и дополнительной таблице 1. Две клетки были захвачены в то время 0 мин(рисунок 5A, сверху) и 7 мин(рисунок 5A, дно) после добавления лиганда FGF2.
На рисунке 5 также показаны результаты двух репрезентативных клеток HeLa, выражающих либо чистый мономер, GPI-mEGFP(рисунок 5B,вверху), либо коваренно связанный димерический фторофор, GPI-mEGFP-mEGFP(Рисунок 5B, внизу ), подвергается на клеточной мембране и захвачен в тех же экспериментальных условиях.
Средняя кажущаяся яркость, B, в клетках HeLa-mEGFP-FGFR1 увеличивается с 1,070 и 0,001 S.E. до 1,141 и 0,001 S.E., в то время как эталонный мономерный(рисунок 5B,вверх) и dimeric(рисунок 5B, нижние образцы) возвращаютb B значения 1,070 и 0,001 S.E. и 1,141 и 0,001 S.E соответственно. Таким образом, для сравнения, рецептор FGFR1 присутствует в основном в мономической форме на поверхности клеточной мембраны в начале, но он продвигается к преобладающей димерической состоянии при стимуляции с его канонической лиганд FGF2. В среднем тогда распространенное состояние молекул FGFR1 в двух репрезентативных клетках явно отличается.
Применяя анализ к нескольким клеткам в одном блюде, каждая из которых запечатлена в разное время, получена средняя яркость как функция времени(рисунок 6А). Кинетическая работа на рисунке 6А описывает медленный процесс димеризации, который сохраняется в течение нескольких минут на поверхности клетки. FGF2-индуцированной FGFR1 димеризации и последующей интернализации рецептора является хорошо известным механизмом34; таким образом, результаты в полном согласии с нынешним понятием о трансдукции сигнала FGFR1, и подтверждают потенциал подхода TIRF-N и B для изучения олигомеризации клеточных мембранных белков до определения тонких тонких динамика момер-димера.
Нормализованный средний анализ яркости результатов является подходящим инструментом для сравнения влияния различных лиганд на один и тот же рецептор. Один пример приведен на рисунке 6B. Протокол повторялся с использованием тех же стандартов и стимулировал клетки с неканоническим лигандом FGFR1, NCAM-Fc (50 мкг/мл). В этом случае кинетический профиль показывает быстрые и циклические переходы рецептора в олигомерных смесях, которые также достигают значений яркости выше значений димера. Неоднократно наблюдалось нормализованное среднее значение 3. Однако ограничение анализа N и B (рассматриваются только два момента колебания интенсивности по сравнению со временем) не позволяет, несомненно, продемонстрировать формирование тримерической формы. Такая же нормализованная средняя яркость может быть результатом различных комбинаций более крупных олигомеров и мономеров рецептора. Тем не менее, результаты ясно демонстрируют пространственно-временное различие влияния двух лиганд овна на один и тот же рецептор.
Рисунок 1: Обзор экспериментального протокола. (A) Клетки покрываются на стеклянных посудах нижней и трансфицируются флуоресцентно помечены рецептора. (B) Время серии изображений, захваченных на коммерческом микроскопе TIRF оснащен TIRF 100x 1,46 нефти цели и инкубатор камеры. В этой коммерческой установке, программное обеспечение не позволяет встроенной камеры EMCCD #1 работать в очень короткие сроки экспозиции, необходимые для приобретения N и B временных рядов. Это важный момент, так как время воздействия ограничивает диапазон молекулярных диффузий, которые могут быть захвачены. Чем короче время экспозиции, тем быстрее молекулярная диффузия, которую можно проанализировать. Воздействие от 0,5 до 1 мс достаточно быстро для диффузии мембранного белка. Таким образом, вторая камера EMCCD (#2) добавляется в дополнительный порт микроскопа для работы непосредственно под программным обеспечением камеры, минуя программное обеспечение микроскопа. В этой адаптированной конфигурации программное обеспечение микроскопа и #1 камеры используются только для выравнивания TIRF. TIRF временные ряды затем приобретаются с помощью камеры #2, которая работает в очень короткие сроки экспозиции, такие как 1 мс и на максимальный выигрыш EM. Камера #2 также имеет размер пикселей 124 нм, что позволяет oversampling и binning изображений (см. раздел протокола 6.2). Другие конфигурации для получения скорости изображения возможны, в зависимости от характеристик различных микроскопов TIRF, в то время как использование камер SCMOS не рекомендуется, потому что шум не является случайным в изображении35. (C) После захвата, временные ряды проверяются в качестве проверки качества. Серия отбрасывается, если фотоотбеление превышает 10%, так как это может быть определено путем построения средней интенсивности кадра по сравнению с номером кадра. Серия также отбрасывается, если произошло очевидное искажение клеточной мембраны или перевод клетки во время приобретения. (D) Средняя интенсивность в каждом пикселе сохраняется. (E) Гистограмма B-I, представляющая кажущуюся яркость, B, в каждом пикселе изображения генерируется. (F) Гистограмма B-I используется для выбора рентабельности инвестиций, которая находится выше фона. (G) Распределение частот B-значений анализируется, чтобы определить среднее Значение B - S.E. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Принцип N и B. Н И Б количественно среднее состояние олигомеризации флюорофоров путем измерения флуоресценции колебания, которые происходят, когда они перемещаются в и из объема освещения во время приобретения серии стек времени "K" изображений. Амплитуда колебаний характеризуется статистически вычислением соотношения между дисперсией колеблющегося сигнала, No2,и средним значением интенсивности, . В простейших сценарияах(A), когда объем освещения пуст (т.е. без флюорофоров), соотношение описывает шум прибора. Если сигнал флуоресценции колеблется из-за мобильных флюорофоров(B,C),"лишняя" дисперсия прямо пропорциональна молекулярной яркости, к (обнаруженный фотон рассчитывает на молекулу и в секунду), диффуируя молекул. В (B), Есть 8 мономерных диффузии фторфоров и в (C), те же фторофоры рассеиваются как 2 тетрамерных олигомеров. В этих двух случаях средняя интенсивность одинакова, но стандартное отклонение и яркость различны (1 , 4), потому что амплитуды колебаний различны. 0 - когда фторофоры неподвижны или отсутствуют. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: TIRF микроскопии. Несмотря на то, что N и B работает одинаково хорошо с raster сканирования микроскопов, оснащенных мультифотон, непрерывная волна или импульсных одиночных фотонов лазеров и аналоговых или фотон-детекторов, TIRF микроскопия идеально подходит для быстрого временного изображения молекулярной динамики события, происходящие на поверхности ячейки или вблизи нее со скоростью, разрешением и соотношением сигнала/шума (S/N), которые не возможны с помощью других методов визуализации. (A) TIRF микроскопии использует принцип полного внутреннего отражения, по которому угловой возбуждания лазерный свет возбуждает только флюорофоры, которые находятся только под стеклянно-водный интерфейс крышки. Лазер облучает образец под углом падения, превышающем или равным критическому углу преломления, в то время как возбуждающий лазерный свет полностью отражается. Отражение генерирует очень тонкое электромагнитное поле в образце, называемом эвакуационной волной. Полученный флуоресцентный свет, испускаемый крошечной освещенной частью образца, собирается с помощью микроскопа, помещенного перпендикулярно ниже горку. (B) Панель показывает репрезентативный пример на данной длине волны относительной интенсивности evanescent поля против глубины, которая уменьшает экспоненциально с увеличивая расстоянием от поверхности, обеспечивая высокую флуоресценцию разрешения осевой колеи Изображения. Боковое разрешение устанавливается численным отверстием и увеличением цели и размером пикселя камеры обнаружения. Внутренняя часть клетки не освещена и не способствует сигналу с внутриклеточной аутофлуоресценцией. Многоугольные микроскопы TIRF позволяют выбирать различные глубины проникновения. Они обеспечивают шкалу, которая зависит от длины волн возбуждения и обычно идет от 70 нм до 250 нм глубины для одного цвета TIRF изображения. Глубина эвакуационного освещения, выбранная для этого протокола, составляет 110 нм, и это результат компромисса между необходимостью использования низкой мощности лазера и интенсивностью сигнала флуоресценции, который резко уменьшается с уменьшением глубины проникновения. Важно избегать чрезмерно больших evanescent полей, которые могут осветить многие внутриклеточные пузырьки и внутриклеточной популяции фторофоров. Поэтому, в зависимости от типа образца, следует изучить несколько глубин проникновения, ища наилучшее сочетание: высокое соотношение сигнала к шуму, низкая сила возбуждения, короткое время экспозиции, короткая глубина проникновения. Как только эта оптимизация сделана, глубина проникания держится постоянн амебинейкой для всех управлений и образцов. (C) Представитель эпифлюоресценции и TIRF изображения HeLa-GPI-mEGFP ячейки после программно-управляемой оптимизации глубины и направления evanescent поля. Многоугольные микроскопы TIRF также позволяют оптимизировать направление evanescent поля. Этот шаг рекомендуется для минимизации рассеяния (т.е. резкого увеличения интенсивности и менее четкого изображения), и он может быть выполнен в соответствии с инструкциями конкретного используемого микроскопа. В этом протоколе программное обеспечение микроскопа включает автоматическую оптимизацию направления evanescent поля. Для ручной оптимизации обратитесь к опубликованным протоколам36,37. (D) Представитель ячейки, выражающей mEGFP-FGFR1 построить в эпифлюоресценции и после оптимизации освещения TIRF. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Захват временных рядов и калибровка реакции камеры на одиночные фотоны. (A) Пример первого кадра из 700-кадровой временной серии, снятой на ячейке HeLa-mEGFP-FGFR1 в обрезанном режиме датчика. Чип камеры частично замаскирован (красные прямоугольники) с помощью разъема двойного представления, установленного на микроскопе TIRF(рисунок 1B). Внутренние области калибровки распознаются в изображении средней интенсивности (B)и обрабатываются(C) для оценки параметров камеры путем построения частоты журнала по сравнению с цифровыми уровнями(D). Аналоговая система обнаружения, такая как камера EMCCD, обнаруживает импульсы фототока вместо фотонов, а распределение высоты импульса фотона квазиэкспоненциально. Первая часть дистрибутива обусловлена усилителем и аналоговым цифровым преобразователем и способствует шуму считывания гауссов (дисперсия, возникает при записи сигнала). Наиболее населенным каналом (т.е. наиболее частым значением) дистрибутива является смещение (eq. 13). Используя вертикальный курсор в логовом участке, первая часть распределения отделена от экспоненциальной второй части, выше 250 DL, которая представляет собой средний ответ камеры на один фотон (наклон является фактором S в eq. 12). Измерение этих параметров позволяет оценить плотность фотонов, которые регистрируются во время приобретения. Графы (DL) находятся в псевдо цветовой гамме. Размер пикселей - 124 нм; Формат изображения 256х256 пикселей, глубина проникновения evanescent поля - 110 нм; Калибровка рентабельность инвестиций #1 19x256 пикселей; Калибровка рентабельность инвестиций #2 5x256 пикселей. Цифровые уровни DL. Экспозиция 1 мс и EMGain (коэффициент G в eq. 12, 13 и 14) - 1000. Обратите внимание, что камеры, работающие в режиме подсчета фотонов с фоном, эквивалентны аналоговым детекторам с S-1 (eq. 12) и с2d и смещением (eq. 13), измеренными так же, как и для аналоговой системы18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Анализ олигомеризации FGFR1. (A) Представитель результаты из двух клеток HeLa в том же блюде, выражая mEGFP-FGFR1 и захватили в то время 0 мин (вверху) и 7 мин (внизу) после добавления 20 нг/мл FGF2, и (B) две клетки HeLa, выражающие эталонные конструкции GPI-mEGFP (вверху) и GPI-mEGFP-mEGFP (внизу). Вся последовательность анализа показывает (слева направо): Средняя интенсивность временных рядов; Участок всех B-значений как функция интенсивности флуоресценции, в которой цветовой код представляет количество пикселей, имеющих одинаковую B-значение на изображении и прямоугольные курсоры разграничивают область интереса (ROI), фон (BG) и регионы очень низкого интенсивность (LI). Обратите внимание, что неподвижные фторофоры дадут B-значение No 1, так как при отсутствии колебаний - 0; B-карта выбранной рентабельности инвестиций и связанной с ней гистограммы распределения B. Распределение B-значения оснащено гауссийской функцией (пунктирной красной линией) для расчета средней очевидной яркости, B (полная красная линия) и статистики распределения(Дополнительная таблица 1) B-значение B' B/S (eq. 15); Интенсивность no ( - смещение)/S; М и мономер; D и димер; бары масштаба - 10 микрон. Сырье время серии данных в дополнительном фильме 1, Дополнительный фильм 2, Дополнительный фильм 3, и дополнительный фильм 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Кинетика олигомеризации FGFR1, индуцированная активацией лиганд. Представитель кинетические пробеги, описанные нормализованной средней яркостью (eq. 16) клеток HeLa-mEGFP-FGFR1 после стимуляции с 20 нг/мл FGF2 (A) или 50 мкг/мл NCAM-Fc(B). Клетки в том же блюде были захвачены в увеличивающихся временных точках, и явная средняя яркость, B и S.E., была вычислена из гистограмм распределения B. Цифра адаптирована с разрешения Замай и др. Журнал клеточной науки (2019)31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Быстрая кинетика и интерпретация данных. Рассеянный участок всех нормализованных значений средней яркости, полученных из репликации кинетических трасс, в которых клетки HeLa-mEGFP-FGFR1 стимулировались либо с помощью NCAM-Fc (50 мкг/мл), либо FGF2 (20 нг/мл). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная диаграмма 1: Снимок экрана рутины анализа в MatLab. Снимок экрана графического пользовательского интерфейса (GUI) MATLAB, показывающий начальные шаги анализа: временные ряды загрузки; вычислить изображение средней интенсивности, профиль интенсивности вычислений, вычислить B-карту и гистограмму B-I. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Параметр | GPI-mEGFP | GPI-mEGFP-mEGFP | mEGFP-FGFR1 (время No 0') | mEGFP-FGFR1 (время No 10') |
| Гауссиан означает B-значение | 1.070 | 1.141 | 1.070 | 1.141 |
| S.E. на средней B-стоимости | 0.001 | 0.001 | 0.001 | 0.001 |
| S.D. дистрибутива B-vaue | 0.059 | 0.067 | 0.077 | 0.075 |
| 95% Доверительный интервал среднего B-значения | от 1.069 до 1.071 | от 1,139 до 1,143 | от 1.069 до 1.072 | от 1,139 до 1,143 |
| S.D. 95% доверительного интервала B-стоимости | от 0,058 до 0,060 | от 0,065 до 0,069 | от 0,075 до 0,079 | от 0,073 до 0,078 |
| Ограничение установки | S.D. (S.D.; 0) | S.D. (S.D.; 0) | S.D. (S.D.; 0) | S.D. (S.D.; 0) |
| Стандартная ошибка S.E.; Стандартное отклонение S.D. | ||||
Дополнительная таблица 1: Анализ яркости. Были проведены статистические и гауссовские параметры распределения B на рисунке 5. Наименее квадратные гауссианские припадки были получены под ограничением стандартного отклонения, 0 с Автоматически выбранным X-диапазоном и максимальными итерациями 1000. R квадрат: mEGFP-FGFR1 мономер No 0,9957, mEGFP-FGFR1 димер 0,9940; GPI-mEGFP - 0,9985; GPI-mEGFP-mEGFP 0.9970.
Дополнительный фильм 1: Временные ряды клетки HeLa-mEGFP-FGFR1 в то время, 0 минут после стимуляции FGF2 (20 нг/мл в PBS дополнены 0,01% BSA), показанной на рисунке 5. Серия из 800 кадров воспроизводится несжатой при частоте 7 кадров в секунду. Формат изображения 256 x 256 пикселей; размер пикселя - 124 нм; Внутренняя область калибровки идентифицируется как темные боковые полосы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео (Право нажмите, чтобы скачать).
Дополнительный фильм 2: Временные ряды, показанные на рисунке 5 ячейки HeLa-mEGFP-FGFR1 во время 7 минут после стимуляции FGF2 (20 нг/мл в PBS дополненном 0,01% BSA) Серия из 800 кадров репромсирована несжатой при 7 fps. Формат изображения 256 x 256 пикселей; размер пикселя - 124 нм; Внутренняя область калибровки идентифицируется как темные боковые полосы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео (Право нажмите, чтобы скачать).
Дополнительный фильм 3: Временные ряды, показанные на рисунке 5 ячейки HeLa-GPI-mEGFP после добавления транспортного средства (PBS дополнен 0,01% BSA). Серия из 1000 кадров воспроизводится несжатой при частоте 7 кадров в секунду. Формат изображения 256 x 256 пикселей; размер пикселя - 124 нм; Внутренняя область калибровки идентифицируется как темные боковые полосы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео (Право нажмите, чтобы скачать).
Дополнительный фильм 4: Временные ряды, показанные на рисунке 5 ячейки HeLa-GPI-mEGFP-mEGFP после добавления транспортного средства (PBS дополнен0.01% BSA). Серия из 1000 кадров воспроизводится несжатой при частоте 7 кадров в секунду. Формат изображения 256 x 256 пикселей; размер пикселя - 124 нм; Внутренняя область калибровки идентифицируется как темные боковые полосы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео (Право нажмите, чтобы скачать).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Н ЗБи требует нескольких мер предосторожности при выборе модели ячейки и стратегии маркировки. Он может быть применен только к живым клеткам, которые остаются пристежными во время захвата изображения. Дополнительные колебания из-за всего жесткого смещения ячейки могут быть обработаны с соответствующими подходами восстановления изображения38. Однако, как правило, когда клетка движется, клеточная мембрана также деформируется, и деформация структуры, производя большой дополнительный дисперсии, вводит серьезные ограничения на анализ мембранных белков. В этой работе флуоресцентная конструкция выражается в линии клеток HeLa, поскольку составная FGFR1 ничтожна. Наличие составного белка является условием, чтобы избежать, в противном случае смешанные популяции флуоресцентных и нефлуоресцентных олигомеров рецепторов, скорее всего, форме. Следовательно, анализ N и B, который основан только на яркости флуоресцентно-тегами белковой популяции, вернет ненадежную оценку среднего состояния олигомерного. Этот аспект особенно важен при применении N и B для обнаружения событий димеризации рецепторов, при которых яркость увеличивается только в 2 раза, например, в dimerization FGFR1 в присутствии лиганда FGF2. В таком случае наличие смешанных димеров может полностью скрыть события димеризации, обнаруживаемые N и B. Загрязнение флуоресцентных олигомеров нефлуоресцентными составными формами является одной из потенциальных ловушек любого подхода, основанного на обнаружении флуоресценции, если только помеченный белок в значительной степени не выражен. Однако исследования олигомеризации в условиях белковой переэкспрессии вызывают опасения по поводу их функциональной значимости. Переходно трансинфицированные клетки, скорее всего, имеют переменные уровни флуоресценции (т.е. концентрации белка) и полезны для проверки независимости средней яркости на концентрации белка, так как N и B могут быть применены к широкому кругу концентрации, при условии линейной реакции детектора (см. определение яркости, eq. 1).
Другим ограничением является стойхиометрическая маркировка рецептора с использованием стабильного фторофора в живых клетках. Halo-теги, флуоресцентные белки (FP) или другие ковалентные флуоресцентные метки подходят этикетки для получения точного количества связанных флюорофоров на молекулу белка в клетке. Чтобы уменьшить сложность анализа N и B, мы используем либо флуоресцентные белки, либо гало-теги, дающие маркировку фторофора к белку 1 к 1. FP выбора должны быть мономерными в зрелой форме, имея незначительные тенденции самоассоциации, что, в противном случае, может вызвать искусственную олигомеризацию FP-тегами рецепторов. В этом протоколе мы используем (A207K)mEGFP, потому что эта единая точка мутации отменяет mEGFP самоагрегирующейся тенденции, как ранее показано31,39,40. Независимо от стратегии маркировки, флуоресцентно помеченный белок должен быть проверен на удержание биологической активности в выбранной модели клеток, так как функциональность помеченных молекул имеет важное значение для увязки событий олигомеризации с сигнализации рецепторов. В нашей модели, мы доказали аутофосфорилирование флуоресцентных (A207K)mEGFP-FGFR1 после стимулирования транс-инфицированных клеток с рецептором ligand FGF231.
Н З/Б основан на диффузии молекул в объеме освещения. В цифровом обнаружении камеры время экспозиции (т.е. время расположения пикселей в аналоговом обнаружении, т-хэтч)должно быть достаточно коротким, чтобы была захвачена одна и только одна конфигурация частиц в фокусном томе. Это говорит о том, что вероятность ввода фторфора или выхода из освещенного тома во время экспозиции очень мала. Время экспозиции должно быть короче, чем время проживания фторофора(NoD), который является среднее время, которое фторофор проводит в освещенном объеме. Поэтому, прежде чем начинать эксперимент n и B, необходимо иметь некоторое представление о времени пребывания (или коэффициенте диффузии) целевого белка, который в первом приближении, зависит от субклеточной локализации и молекулярной массы. Частота кадров является обратным времени, необходимого для камеры, чтобы приобрести изображение, а затем полностью прочитать это изображение, и это часто, рассчитывается примерно из общего числа пикселей и скорости считывания, в сочетании с временем экспозиции. Несмотря на то, что частота кадров не должна быть быстрой, время цикла(tцикла),которое является суммой частоты кадров и время для подготовки захвата следующего кадра, может повлиять на анализ. Эти ограничения могут быть обобщены, как: тцикла Если время цикла слишком быстрое, молекулы не будут заметно перемещаться из одного кадра в другой в это время, и будут отображаться как неподвижные (B No 1). Однако, поскольку сотни кадров необходимы для анализа, езда на велосипеде устанавливается как можно быстрее (увеличение или уменьшение формата изображения в количестве пикселей), чтобы избежать смещения клеток и искажения клеточной мембраны, что добавило бы большие дополнительные отклонения во время приобретения серии. В примере этого протокола самое медленное время цикла составляет 22 мс, так что 500 кадров могут быть приобретены в 11 с.
Молекулярная яркость не является абсолютным количеством; Это зависит от молекулярных свойств фторофора (сечение и квантовый выход), от экспериментального набора (детектор и оптика), а также от условий возбуждения, таких как лазерная сила. Таким образом, подход TIRF-N и B дает явную яркость, и из-за этого принципиально необходимо создать «модель эталонных ячеек», которая выражает эталонную конструкцию с одноголосым олигомерным состоянием. Эталонная конструкция несет в себе тот же флюорофорный тег исследуемого белка (здесь, (A207K)mEGFP) и локализуется в том же подклеточном отсеке (здесь, плазменной мембране). В этой работе мы используем гликозилфосфатидинозинозинол (GPI) якорь -(A207K)mEGFP построить, что мы неоднократно демонстрировали, чтобы быть надежным мономерным стандартом яркости для рецепторов поверхности клетки помечены же фторофор30, 31.
Одним из основных недостатков является появление флюорофора photobleaching, что очень вероятно, происходит, когда одна и та же клетка неоднократно подвергается воздействию света во время кинетической перспективе, и приводит к недооценке состояния олигомеризации. Чтобы предотвратить это, яркость кинетики получается путем объединения средней яркости различных клеток каждый захватили в разное время(рисунок 6). Это означает, что в чашке Петри каждая клетка является другой точкой времени кинетики и чашка Петри представляет собой весь кинетический пробег.
Когда динамика олигомеризации быстра и сложна, например, олигомеризация FGFR1, вызванная неканоническим лигангом, NCAM31, профиль нормализованной средней яркости по сравнению со временем может быть переменной и нестабильной (Рисунок 6B ). В таком случае, воспроизводимость не может быть определена путем чтения репликации блюд из клеток в точные моменты времени, из-за необходимости перемещения и фокусировки на новой ячейке каждый раз, выбрать рентабельность инвестиций, захвата и проверки / отбросить временные ряды. Таким образом, воспроизводимость может быть оценена с точки зрения кинетического профиля сходства и амплитуды изменения яркости.
Обзор результатов представлен на рисунке 7. Сюжет рассеяния иллюстрирует только среднюю яркость, измеряемую в клетках одного и того же блюда, пренебрегая временем каждого захвата. В этом сюжете основное различие, вызванное двумя лигандами на состояние олигомеризации рецептора, остается очевидным, хотя вся кинетическая информация удаляется. Тем не менее, для обоих набор экспериментов (FGF2- по сравнению с NCAM индуцированной олигомеризации), обычный подход к определению среднего S.D. каждого запуска на рисунке 7 приведет к вводящим в заблуждение выводов, поскольку молекулы FGFR1 стимулируется FGF2 четко транзит в два хорошо определенных состояния, в то время как NCAM индуцирует нестабильные и циклические олигомерные смеси FGFR1, которые не были бы хорошо представлены средним значением S.D.
Таким образом, с экспериментальной точки зрения, НЗИ б требует только доступа к микроскопу, оснащенному модулем быстрого приобретения и выделенным программным обеспечением. Белок интерес может быть помечен с различными мономерными флуоресцентными белками или органическими флюорофорами, но количественные измерения требуют выполнения нескольких условий: стоихиометрическая маркировка, эталонный стандарт яркости, детектор калибровка и без фотоотбелевания. В этом контексте подход N и B является мощным инструментом для расшифровки пространственно-временной олигомеризации белков в живых клетках. Кроме того, последние достижения в перевыборе необработанных данных для решения статистического взвешивания41 и сочетания флуоресценции кросс-корреляционной спектроскопии с кросс-корреляционной N и B42 являются уточнение и улучшение применимости N Подход и B к олигомеризации белка и исследованиям взаимодействия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
CNIC поддерживается Министерством Cencia, Innovacion y Universidades и Фондом Pro CNIC, а также является Центром передового опыта Северо-Очоа (SEV-2015-0505). Нас также поддерживает Европейский фонд регионального развития (ФЕДЕР) «Una manera de hacer Europa». UC признает поддержку со стороны Associazione Italiana Ricerca sul Cancro, Ассоциации международных исследований рака (теперь известный как Всемирное исследование рака), и итальянского министерства здравоохранения. A.T. признать Fondazione Banca дель Монте ди Ломбардия для частичной поддержки его работы с. стипендий Progetto Professionalit Ивано Бекки 2011-2012.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x 1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software. | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | ||
| Albumin from Bovine Serum 98% minimun | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA | A7906-100G | |
| DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 21063029 | Used serum free for microscopy |
| DMEM high-glucose GlutaMAX I | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10566-016 | Used for complete medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) | Biowest, Nuaillé, France | X0515-500 | |
| Emission splitting system Photometrics DV2 | TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 10270106 | 10% inactivated supplement for complete medium |
| Glass bottom 35 mm sterile 1.5 dishes | MatTek, Ashland, MA, USA | P35G-0.170-14-C | uncoated, glass thickness 0.17 microns |
| GraphPad Prism | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | ||
| Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells | Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany | CB_08011102 | |
| iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software | Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK | This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series | |
| Matlab Executable N&B routine | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain | download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia | |
| MatLab v.2018b | The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x | Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA | LONZA 17-602E | supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100 U/100µg. |
| pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector | Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy | Zamai et al., 2019 | |
| pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain | Hellriegel et al., 2011 | |
| pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector | Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain | Hellriegel et al., 2011 | |
| Recombinant FGF2 | PeproTech EC, Ltd., London, UK | Ligand solution: 20 ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA. | |
| Sodium pyruvate GIBCO | ThermoFisher Scientific | 11360070 | 1 mM supplement for medium |
| TransIt-LT1 Transfection Reagent | MirusBio LLC, Madison, WI, USA | MIR 2300 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA | 25200056 | |
| Type F Immersion liquid 10 mL | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11513 859 | |
| UltraPure BSA (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | AM2618 | 0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections |
References
- Agwuegbo, U. C., Jonas, K. C. Molecular and functional insights into gonadotropin hormone receptor dimerization and oligomerization. Minerva Ginecologica. 70 (5), 539-548 (2018).
- Ferre, S., et al. G protein-coupled receptor oligomerization revisited: functional and pharmacological perspectives. Pharmacological Reviews. 66 (2), 413-434 (2014).
- Marsango, S., Ward, R. J., Alvarez-Curto, E., Milligan, G.
- Oishi, A., Cecon, E., Jockers, R. Melatonin Receptor Signaling: Impact of Receptor Oligomerization on Receptor Function. International Review of Cell and Molecular Biology. 338, 59-77 (2018).
- Thelen, M., Munoz, L. M., Rodriguez-Frade, J. M., Mellado, M. Chemokine receptor oligomerization: functional considerations. Current Opinion in Pharmacology. 10 (1), 38-43 (2010).
- Van Craenenbroeck, K. GPCR oligomerization: contribution to receptor biogenesis. Subcellular Biochemistry. 63, 43-65 (2012).
- Wnorowski, A., Jozwiak, K. Homo- and hetero-oligomerization of beta2-adrenergic receptor in receptor trafficking, signaling pathways and receptor pharmacology. Cell Signaling Technology. 26 (10), 2259-2265 (2014).
- Fricke, F., Dietz, M. S., Heilemann, M. Single-molecule methods to study membrane receptor oligomerization. Chemphyschem. 16 (4), 713-721 (2015).
- Vidi, P. A., Ejendal, K. F., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Fluorescent protein complementation assays: new tools to study G protein-coupled receptor oligomerization and GPCR-mediated signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 331 (2), 185-193 (2011).
- Trussell, H. J., et al. Academic Press Library in Signal Processing. Trussell, J., et al. 4, Elsevier. 3-9 (2014).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18982-18987 (2008).
- Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Presse, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
- Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7010-7015 (2011).
- Qian, H., Elson, E. L. Distribution of molecular aggregation by analysis of fluctuation moments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (14), 5479-5483 (1990).
- Chen, Y., Muller, J. D., So, P. T., Gratton, E. The photon counting histogram in fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophysical Journal. 77 (1), 553-567 (1999).
- Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 69-81 (2008).
- Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of molecular concentration and brightness from fluorescence fluctuation data with an electron multiplied CCD camera. Biophysical Journal. 95 (11), 5385-5398 (2008).
- Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review. Biochemistry. 41 (3), 697-705 (2002).
- Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E.
- Levi, V., Ruan, Q., Kis-Petikova, K., Gratton, E. Scanning FCS, a novel method for three-dimensional particle tracking. Biochemical Society Transactions. 31 (Pt 5), 997-1000 (2003).
- Hinde, E., et al. Quantifying the dynamics of the oligomeric transcription factor STAT3 by pair correlation of molecular brightness. Nature Communications. 7, 11047 (2016).
- Waithe, D., et al. Optimized processing and analysis of conventional confocal microscopy generated scanning FCS data. Methods. 140-141, 62-73 (2018).
- Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
- Ossato, G., et al. A two-step path to inclusion formation of huntingtin peptides revealed by number and brightness analysis. Biophysical Journal. 98 (12), 3078-3085 (2010).
- Nagy, P., Claus, J., Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Distribution of resting and ligand-bound ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases in living cells using number and brightness analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16524-16529 (2010).
- Ming, A. Y., et al. Dynamics and Distribution of Klothobeta (KLB) and fibroblast growth factor receptor-1 (FGFR1) in living cells reveal the fibroblast growth factor-21 (FGF21)-induced receptor complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (24), 19997-20006 (2012).
- Ross, J. A., et al. Oligomerization state of dynamin 2 in cell membranes using TIRF and number and brightness analysis. Biophysical Journal. 100 (3), L15-L17 (2011).
- Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. FASEB J. 25 (9), 2883-2897 (2011).
- Zamai, M., et al. Number and brightness analysis reveals that NCAM and FGF2 elicit different assembly and dynamics of FGFR1 in live cells. Journal of Cell Science. 132 (1), (2019).
- Hassler, K., et al. Total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (TIR-FCS) with low background and high count-rate per molecule. Optics Express. 13 (19), 7415-7423 (2005).
- Di Rienzo, C., Gratton, E., Beltram, F., Cardarelli, F. From fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope. Journal of Visualized Experiments. (92), e51994 (2014).
- Beenken, A., Mohammadi, M. The FGF family: biology, pathophysiology and therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (3), 235-253 (2009).
- Joubert, J., Sharma, D.
- Gell, C., Berndt, M., Enderlein, J., Diez, S. TIRF microscopy evanescent field calibration using tilted fluorescent microtubules. Journal of Microscopy. 234 (1), 38-46 (2009).
- Burghardt, T. P. Measuring incidence angle for through-the-objective total internal reflection fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126007 (2012).
- Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76 (11), 1135-1146 (2013).
- Caiolfa, V. R., et al. Monomer-dimer dynamics and distribution of GPI-anchored uPAR are determined by cell surface protein assemblies. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1067-1082 (2007).
- Campbell, R. E., et al. A monomeric red fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 7877-7882 (2002).
- Cutrale, F., et al. Using enhanced number and brightness to measure protein oligomerization dynamics in live cells. Nature Protocols. 14 (2), 616-638 (2019).
- Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).
