Summary
אנחנו מציגים מכשיר מיקרופלואידיסי צנטריפוגלי מנוע שיכול לטפח את התאים הניידים. באמצעות התקן זה, הספרואידים של סוגי תא יחיד או מרובים יכול להיות בקלות מתורבת בתנאי כבידה גבוהה.
Abstract
תרבות תא ספרואיד תלת מימדי יכולה להשיג תוצאות שימושיות יותר בניסויים בתאים, משום שהוא יכול לדמות טוב יותר מיקרוסביבות תאים של הגוף החי מאשר תרבות תא דו-ממדית. במחקר זה, אנו מפוברק מנוע חשמלי מונחה מעבדה-on-a-CD (קומפקט דיסק) פלטפורמה, המכונה מערכת מבוססי מיקרופלואידיג צנטריפוגלי (CMS) התרבות, כדי ליצור תלת מימדי (3D) מספרי טלפון של תאים המיישמים כוח צנטריפוגלי גבוה. התקן זה יכול לשנות את מהירויות הסיבוב כדי ליצור תנאי הכבידה מ 1 x g כדי 521 x g. מערכת CMS היא 6 ס מ קוטר, יש 500 יקרומטר המיקרוגל, והוא נעשה על ידי דפוס עם polydiמתיל siloxane בתבנית פוליקרבונט מראש על ידי מחשב בקרה מספרית. חומת מחסום בכניסה לערוץ של מערכת CMS משתמשת בכוח צנטריפוגלי כדי לפזר תאים באופן שווה בתוך השבב. בסוף הערוץ, יש אזור שקופית המאפשר לתאים להיכנס למיקרוגל. כהדגמה, נוצרו הספרואידים על ידי תרבות חד-תרבותית ומקודת של תאי גזע האדם הנגזר של אדיפוז והריאות האנושית בתנאי כבידה גבוהה באמצעות המערכת. מערכת ה-CMS השתמשה בתוכנית פעולה פשוטה כדי לייצר מספרי התרבות של מבנים שונים של קונצנטריים, יאנוס וכריכים. מערכת CMS יהיה שימושי בביולוגיה התא ולימודי הנדסת רקמות הדורשות spheroids ותרבות אורגאידית של סוגי תא יחיד או מרובים.
Introduction
קל יותר לדמות ביולוגי בvivo מיקרו-סביבות עם תלת מימדי (3D) תרבות תא ספרואיד מאשר עם 2-מימדי (2D) תרבות התא (g., המקובלת בצלחת פטרי התרבות תאים) כדי לייצר ניסוי מציאותי יותר מבחינה פיזיולוגית תוצאות1. שיטות היווצרות הספרואיד הזמינות כוללות את טכניקת השחרור התלויה2, טכניקת כיסוי נוזלי3, טכניקה תאית מגנטית4, טכניקת microfluidic מגנטי מבוסס כוח5, והשימוש ב שחקני המשך6. למרות שלכל שיטה יש יתרונות משלה, שיפור נוסף באופן הנקרא, פרודוקטיביות ויצירת הספרואידים מניבים הכרחי. לדוגמה, בעוד טכניקת microflu, מבוססי כוח מגנטית5 היא זולה יחסית, ההשפעות של שדות מגנטיים חזקים על תאי החיים חייבים להיחשב בזהירות. היתרונות של תרבות ספרואיד, במיוחד בחקר תא גזע mesenchymal והתפשטות, דווחו במספר מחקרים7,8,9.
מערכת מיקרופלואידיג צנטריפוגלי, הידוע גם בשם lab-על-a-CD (קומפקט דיסק), הוא שימושי עבור בקלות שליטה על הנוזל הפנימי וניצול הסיבוב של המצע, ובכך מנוצל יישומים ביו כגון חיסוני10, מטרי הצביעה בחני לזיהוי סמנים ביוכימיים11, הגברה חומצות גרעין (PCR) בחני, מערכות ניתוח דם אוטומטי12, ו-all-in-one צנטריפוגלי מיקרופלואידיc מכשירים13. הכוח המניע השולט בנוזל הוא כוח הצנטריות שנוצר בסיבוב. בנוסף, פונקציות מרובות של ערבוב, ולינג, פיצול לדוגמה ניתן לעשות פשוט בפלטפורמה זו תקליטור יחיד. עם זאת, בהשוואה לשיטות הניתוח הנ ל, היו פחות ניסיונות להחיל פלטפורמות תקליטור לתאי תרבות, במיוחד spheroids14.
במחקר זה, אנו מראים את הביצועים של מערכת ספרואיד מבוססי מיקרופלוטואידים (CMS) על ידי המערכת המבוססת על בסיס חד-תרבותי או התרבות של תאי הגזע האנושי הנגזר של אדיפוז (hASC) ופיברוהכדורים לריאות האדם (MRC-5). המאמר מתאר בפרוטרוט את מתודולוגיית המחקר של הקבוצה שלנו15. כך ניתן לשכפל בקלות את התרבות הספרואידית המעבדת על-גבי התקליטור. מערכת להפקת CMS הכוללת שבב תרבות CMS, מחזיק שבב, מנוע DC, הר מוטורי, ופלטפורמה מסתובבת, מוצג. הר המנוע הוא 3D מודפס עם יריעות אקריניטריל בוטטירן (ABS). מחזיק שבב ופלטפורמה מסתובבת הם CNC (שליטה מספרית המחשב) מחובר עם המחשב (פוליקרבונט). המהירות המסתובבת של המנוע נשלטת מ 200 כדי 4,500 סל ד על ידי קידוד (PID-אינטגרלי-נגזרים) אלגוריתם מבוסס על אפנון רוחב הדופק. הממדים שלה הם 100 mm x 100 mm x 150 mm וזה שוקל 860 g, מה שהופך אותו קל לטפל. באמצעות מערכת CMS, spheroids ניתן לייצר בתנאי כבידה שונים מ 1 x g כדי 521 x g, כך המחקר של בידול התא קידום תחת כבידה גבוהה ניתן להאריך מ 2d תאים16,17 כדי 3d ספרואיד. Coculture של סוגים שונים של תאים היא גם טכנולוגיה מרכזית לחיקוי יעיל של הסביבה vivo18. מערכת ה-CMS יכולה בקלות לייצר מונורואידים, כמו גם הספרואידים של מבנים מסוגים שונים (למשל, קונצנטריים, יאנוס וכריכים). מערכת CMS יכול להיות מנוצל לא רק במחקרים ספרואיד פשוט אלא גם במחקרים אורגאיד 3D, כדי לשקול מבנים איברים אנושיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הייצור המבוסס על שבב התרבות של מיקרופלוטואידים (CMS)
- הפוך את תבניות המחשב לשכבות העליונות והתחתונות של שבב התרבות של CMS על ידי עיבוד שבבי CNC. מידות מפורטות של השבב ניתנות באיור 1.
- מערבבים בסיס PDMS ו PDMS לריפוי הסוכן ביחס של 10:1 (w/w) עבור 5 דקות ומקום desiccator עבור 1 h כדי להסיר בועות אוויר.
- לאחר שיוצקים את התערובת PDMS לתוך תבניות של שבב התרבות של CMS, להסיר בועות אוויר עבור 1 h יותר ולרפא בחדר חום ב 80 ° c עבור 2 h.
- מניחים אותם במנקה פלזמה שואב אבק עם המשטחים להיות מאוחדים כלפי מעלה ולחשוף אותם לפלזמה בסיוע אווירי בכוח של 18 ואט עבור 30.
- בונד את שתי השכבות של שבב התרבות של CMS ולמקם אותו בתא החום ב 80 ° c עבור 30 דקות כדי להגביר את חוזק ההדבקה.
- לחטא את שבב התרבות של CMS בעיקור בחיטוי ב 121 ° c ו 15 psi.
2. הכנת תא
- הפשרת 1 mL של הבקבוקון המכיל 5 × 105– 1 × 106 hASCs or mrc-5 תאים באמבט מים ב 36.5 ° c עבור 2 דקות.
- הוסף 1 מ ל של מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) למבחנה ולערבב בעדינות עם הפיפטה 1,000 μL.
- שים 15 מ ל של DMEM קדם מראש עד 36.5 ° צ' לתוך מיכל פטרי בקוטר 150 מ"מ באמצעות פיפטה ולהוסיף את התאים מתוך הבקבוקון.
- לאחר יום אחד, לאכול את dmem ולהחליף עם 15 מ ל של DMEM טרי. לאחר מכן, שנה את המדיה כל יומיים או שלושה.
- כדי לנתק את התאים מצלחת פטרי, להוסיף 4 מ ל טריפסין לצלחות פטרי ולמקם אותם בחממה ב 36.5 ° c ו-5% CO2 עבור 4 דקות.
3. מערך חד-תרבותי מסוג ספרואיד
- לשים 2.5 mL של 4% (w/v) הריבוי של F-127 פתרון לתוך החור של התרבות של CMS (איור 2A) תוך כדי סיבוב השבב ב 500 – 1000 סל ד ולאחר מכן לסובב את השבב ב 4,000 rpm עבור 3 דקות באמצעות מערכת CMS (איור 2a).
הערה: הציפוי הפלורליסטית מונע הצמדה לתא ליציאת האוויר בזמן שהשבב מסתובב. תוודא שהאוויר לא לכוד. במיקרוגל - מודנית את שבב התרבות CMS מלא בפתרון הריבוי לילה ב 36.5 ° c ב 5% CO2.
- הסר את התמיסה הפלורליסטית, שטוף את פתרון הריבוי הצורות הנותר עם DMEM, ויבש את השבב עבור 12 שעות על ספסל נקי.
- הוסף 2.5 mL של DMEM לשבב התרבות של CMS ולסובב את השבב בתוך ~ 4,000 rpm עבור 3 דקות להרטיב את החלק הפנימי של השבב.
- לעצור את הסיבוב ולשלוף את 100 μL של DMEM כדי להפוך מקום להזרקת השעיית התא.
- הוסף 100 μL של שתלים סלולריים המכילים 5 × 105 hASCs או 8 × 105 mrc-5s על ידי ליטוף באופן אחיד להפיץ את התאים על ידי ליטוף 3 – 5s עבור השעיה.
- לסובב את השבב ב 3,000 סל ד עבור 3 דקות למלכודת תאים בכל המיקרוגל על ידי כוח צנטריפוגלי.
הערה: מהירות סיבוב מוגזמת עלולה לגרום לבריחה תא דרך חורים הפליטה פתרון. - תרבות התאים 3 ימים בחממה ב 36.5 ° c, > 95% לחות, ו 5% CO2, סיבוב ב 1000-2000 rpm. לשנות את התרבות בינונית כל יום.
4. מבנה ספרואיד
-
מבנה קונצנטריים
- להוסיף את התאים הראשונים, 2.5 × 105 hASCs, ולסובב את השבב ב 3,000 סל ד. לאחר 3 דקות, להוסיף את התאים השני, 4 × 105 mrc-5s, ולסובב את השבב ב 3,000 rpm עבור 3 דקות. הכנס סכום כולל של 100 μl של השעיות בתאים באמצעות ליטוף. כאשר התאים מוזרקים, הזזת המהירות המסתובבת ל-500-1000 סל ד.
- תרבות התאים בחממה ב 36.5 ° c, > 95% לחות%, ו 5% CO2 על ידי סיבוב ב 1000-2000 rpm. ההרורואידים הקונצנטריים. נוצרים בתוך 24 שעות עבור תרבות ארוכת טווח, שנה את מדיום התרבות כל יום.
-
מבנה ספרואיד
- הוסף 100 μL של שתלים סלולריים המכילים את התאים הראשונים, 2.5 × 105 hASCs, על ידי ליטוף בזמן השבב מסתובב 500-1000 סל ד. לאחר מכן, לסובב את השבב ב 3,000 סל ד עבור 3 דקות.
- מודאת השבב ב 36.5 ° c, > 95% לחות, ו 5% CO2 על ידי סיבוב ב 1000 – 2000 rpm עבור 3 h.
- הוסף 100 μL של השעיות התא המכילות את הסט השני של תאים, 4 × 105 mrc-5s, על ידי ליטוף בזמן השבב מסתובב 500-1000 סל ד. לאחר מכן, לסובב את השבב ב 3,000 סל ד עבור 3 דקות.
- תרבות התאים בחממה ב 36.5 ° c, > 95% לחות, ו 5% CO2 על ידי סיבוב ב 1000-2000 rpm. הספרואידים של יאנוס נוצרים בתוך 24 שעות. עבור תרבות ארוכת טווח, שנה את מדיום התרבות כל יום.
-
היווצרות כריך ספרואיד
- הוסף 100 μL של שתלים סלולריים המכילים את התאים הראשונים, 1.5 × 105 hASCs, על ידי ליטוף בזמן השבב מסתובב 500-1000 סל ד. לאחר מכן, לסובב את השבב ב 3,000 סל ד עבור 3 דקות.
- מודאת השבב ב 36.5 ° c, > 95% לחות, ו 5% CO2 על ידי סיבוב ב 1000 – 2000 rpm עבור 3 h.
- הוסף 100 μL של שתלים סלולריים המכילים את התאים השני, 3 × 105 mrc-5s, על ידי ליטוף בזמן השבב מסתובב 500-1000 סל ד. לאחר מכן, לסובב את השבב ב 3,000 סל ד עבור 3 דקות.
- מודיית את השבב ב 36.5 ° c, > 95% לחות%, ו 5% CO2 על ידי סיבוב ב 1000 – 2000 rpm עבור 3 h.
- הוסף 100 μL של שתלים סלולריים המכילים את התאים השלישי, 1.5 × 105 hASCs, על ידי ליטוף בזמן השבב מסתובב 500-1000 סל ד. לאחר מכן, לסובב את השבב ב 3,000 סל ד עבור 3 דקות.
- תרבות התאים בחממה ב 36.5 ° c, > 95% לחות%, ו 5% CO2 על ידי סיבוב ב 1000-2000 rpm. ההרואידים של הסנדוויץ ' נוצרו. בתוך 12 שעות עבור תרבות ארוכת טווח, שנה את מדיום התרבות כל יום.
5. צביעת תאים
- חמם את צבע הזריחה של התא לטמפרטורת החדר (20 ° c).
- הוסף 20 μL של dimethylsulfoxide (DMSO) לכל בקבוקון כדי לבצע פתרון 1 מ"מ.
- דלל את הזריחה לריכוז העבודה הסופי של 1 μM באמצעות DMEM.
- הוסיפו את הקרינה הפלואורסצנטית לתא ההשעיה והשהה בעדינות מחדש באמצעות פיפטה.
- דגירה 20 דקות ב 36.5 ° צ', לחות של > 95%, ו 5% CO2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שבב התרבות CMS בקוטר 6 ס מ (איור 2) נעשה בהצלחה בעקבות הפרוטוקול הנ ל. ראשית, השבב נעשה בנפרד משכבה עליונה ושכבה תחתונה ולאחר מכן התחברה יחד על ידי התחברות פלזמה. ניתן לאסוף בקלות spheroids על-ידי ניתוק השבב. הערוץ של שבב התרבות של CMS כולל יציאת מפרץ ואזורי מרכז, שקופית ולמיקרוגל (איור 3). התא, בינוני, והפתרונות הפלורליסטית מוזרקים דרך חור מפרץ עם קוטר של 5 מ"מ. התאים המוזרקים מופצים באופן שווה על ידי השעיה מחדש 3 – 5x באזור הנמל מפרץ. התאים חשופים לכוח צנטריפוגלי באזור המרכזי ומתפשטים החוצה. מכיוון שהאזור המרכזי גבוה יותר מהמיקרוגל, הוא יכול להכיל אמצעי תקשורת רבים יותר, ולאפשר לספרואידים לשרוד זמן רב יותר. גובה המיקרוגל הוא 0.4 מ"מ וגובהו של האזור המרכזי הוא 1.5 מ"מ. חורי יניקה נמצאים במרכז האזור המרכזי כדי להסיר בקלות את הפתרונות הפנימיים. אזור השקופית הוא אזור משופע המחבר את האזור המרכזי ואת אזור המיקרוגל. התאים לנוע לאורך מדרון 45 ° ולהתיישב באזור המיקרוגל, שבו התאים ליישב, לגדול, ולסבך טופס spheroids. המיקרוגל הממוקם 14 מ"מ ממרכז השבב הם semicylindrical עם גובה של 400 יקרומטר קוטר של 400 יקרומטר. סך של 100 spheroids ניתן לייצר בו זמנית ב 100 המיקרוגל.
באמצעות שבב CMS מוכן, ניתן ליצור spheroids בסדר המוצג בפרוטוקול (איור 4). מונרואידים ומחרורנים שנוצרו באמצעות תאי hASC ו-MRC-5. כדי ליצור ספרואיד מונוקולטורה של כל סוג של תא, 5 × 105 hASCs or 8 × 105 mrc-5s הוזרק. מספר התאים שהוזרק היה בלתי תלוי בגודל התא. תמונות בזמן הקפיצה של שני סוגי תאים נלקחו ב 2,000 rpm עד היום 3 של תרבות התא (איור 5). מספרי התרבות של hASCs ו-MRC-5s נוצרו גם עם מבנים קונצנטריים, יאנוס וכריכים. כדי ליצור spheroids קונצנטריים, התאים הראשונים (2.5 × 105 hASCs) הוזרק ואת התאים השני (4 × 105 mrc-5s) הוזרק 3 דקות לאחר מכן (איור 6a). כאשר התאים הראשונים הוזרק, הם נהיו בצורת U בגלל כוח הכבידה גבוה, וכאשר התאים השני הוזרק, הם עברו לאמצע הצורה U. במשך הזמן, התאים הראשונים בצורת U כיתרו את התאים השני והשלימו את ההרורואידים הקונצנטריים. כדי להפוך את הספרואידים של יאנוס, התאים הראשונים (2.5 × 105 hASCs) הוזרקו, והתאים השני (4 × 105 mrc-5s) הזריקו 3 מאוחר יותר (איור 6b). כאשר מרווח ההזרקה בין שני התאים היה ארוך, צורת התאים הראשונים השתנתה מצורת U לצורה אליפטית על-ידי צבירת תאים. לאחר שהתאים השני נוספו לצורה אליפטית של התאים הראשונים, נוצרו הספרואידים של יאנוס. במקרה של כריך spheroids, התאים הראשונים (1.5 × 105 hASCs) הוזרק, את התאים השני (3 × 105 mrc-5s) הוזרק 3 h מאוחר יותר, ואת התאים השלישי (1.5 × 105 hASCs) הוזרק אחרי עוד 3 h (איור 6c ). בדומה לדואיד של יאנוס, כל תא מצטבר לצורה אליפטית, ושלוש השכבות נערמו ליצירת מספרי כריכים. לבסוף, כדי להדגים את יכולת התרבות ארוכת הטווח של CMS, hASCs היו תרבותיים, חשופים לכבידה גבוהה במשך 7 ימים ואחריו ביצע חי/מת להראות כי רוב התאים שרדו (איור 7). כמו כן, תמונות של כל המיקרוגל של CMS נלקחו לאחר 3 ימים של טיפוח MRC-5s כדי להראות אחידות מעולה ספרוגניות של spheroids (איור 8).
איור 1: מידות השכבות העליונות והתחתונות של שבב תרבות CMS. תבנית המחשב האישי נעשתה באמצעות מכונת CNC ומשוכפלת עם PDMS כדי להפוך את שבב התרבות CMS מבוסס על הציור שנוצר על ידי CAD 3D (עיצוב בעזרת מחשב) תוכנית. ארבעת העיגולים בקצות השכבות העליונות והתחתונות הם ליישור שתי השכבות. מידות הן במילימטרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תצלומי מערכת CMS. (א) תצלומים של שבב התרבות של CMS שהושלם. קוטרו של השבב הוא 6 ס מ וקוטר המיקרוגל הוא 400 μm. המספרים מעל המיקרוגל מייצגים את. המספרים הבודדים של המיקרוגל מ -1 עד 100 . המספרים האלה חרוטים על העובש סרגל קנה מידה = 400 μm. (ב) צילום של מערכת ה-CMS כולה. מערכת CMS כוללת את שבב התרבות של CMS, מחזיק שבב, DC מנוע, ופלטפורמה מסתובבת. התקני CMS יכולים ליצור תנאי הכבידה עד 521 x g דרך הכוח הסיבוב. בעל השבב מונע הפרדה של שבב התרבות של CMS בשל כוח הכבידה גבוה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: רכיבי הערוץ של CMS. (א) תמונות סכמטית ו-(ב) תצלומים של השבב התרבותי של ה-CMS. שבב התרבות של CMS מורכב מיציאת מפרץ ואזורי מרכז, שקופית ולמיקרוגל. מכיוון שהתאים המוזרקים אינם עוברים דרך המכשול במהירות סיבובית של פחות מ-1,000 סל ד, המכשול מסייע בהשעיה של התא ואפילו הפצה למיקרוגל. סרגל בקנה מידה = 2 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תהליך הטעינה של התאים לתוך שבב התרבות של CMS. (א) כדי למנוע מתאים לדבוק בחלק התחתון של השבב, מעיל עם 2.5 mL של הפתרון הריבוי של F-127 ב 4,000 rpm. המתן יום להחלת הציפוי. (ב) להסיר את התמיסה הפלורליסטית ולמלא מראש את הערוץ עם 2.5 mL של מדיום dmem. (ג) להסיר 100 ΜL של dmem ולהוסיף 100 μl של השעיית תא. בשלב זה, השעיית מחדש 3 – 5x כך שהתאים מופצים באופן שווה. (ד) להעביר את התאים למיקרוגל על ידי סיבוב השבב, ולאחר מכן תרבות התאים עבור 3 ימים ב 1,000 כדי 2,000 rpm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הזמן לצלם תמונה של הספרואידים של hASC ו-MRC-5 תאים. תאים גדלו עבור 24 h ב 2,000 סל ד. הספרואיד נוצר בתוך 24 h. סרגל קנה מידה = 400 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: תמונות הזריחה של הספרואידים coheroids. (א) צורות קונצנטריות שבהן תאי hasc (ירוק) מקיפים את mrc-5 תאים (אדום). (ב) הצורה הספרואידית בעלת שני תאים סימטריים. (ג) כריך ספרואיד צורה שבה שכבות hasc מוערמים בין שתי שכבות mrc-5. סרגל קנה מידה = 400 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: התקן חי/מת של hASC ביום 7. צבע פלורסנט ירוק מייצג תאים חיים צבע פלורסנט אדום מייצג תאים מתים. סרגל קנה מידה = 400 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: MRC-5 spheroids ביום 3. מספר קבוע יחסית של תאים נכנסים לכל מערכת המיקרוגל והספרואידים היוצרים בעלי ספרוגניות קבוע יחסית במערכת CMS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: קציר הרואידים. ניתן לקצור את הספרואידים מתורבתים על ידי חלוקת שתי השכבות של שבב התרבות של CMS. שתי שכבות פלזמה בונדד ניתן להפריד בקלות באמצעות היד. לאחר מכן נאספים הספרואידים מהמיקרוגל בשכבה התחתונה פשוט על ידי ליטוף. סרגל קנה מידה = 400 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CMS הוא מערכת סגורה שבה כל התאים המוזרקים להיכנס למיקרוגל ללא בזבוז, מה שהופך אותו יעיל יותר וחסכוני יותר מאשר שיטות הדור המבוסס על מבוססי המיקרוגל. במערכת CMS, התקשורת מוחלפת מדי 12-24 שעות דרך חור יניקה שנועד להסיר את המדיה בשבב (איור 3A). במהלך השאיבה מדיה, בקושי כל אמצעי התקשורת בורח מתוך המיקרוגל בגלל המתח פני השטח בין התקשורת לבין קיר של המיקרוגל. משתמש יכול בקלות להסיר את המדיה לכוד על ידי לחיצה ליד אזור המיקרוגל של השבב עם אצבע, כי השבב עשוי PDMS הוא גמיש גמישה. תאים במיקרוגל נשארים יציבים מבלי לברוח, אפילו עם מספר שינויים במדיה. כדי להשיג את אותה איכות של ספרואיד בכל 100 המיקרוגל, את הסיבוב של המכשיר לא צריך להיות תמהוני, ואת השבב צריך להיות axisymmetrical. אחרת, מספר משתנה של תאים עשוי להיכנס כל באר והגודל והצורה של הספרואיד עשויים להיות שונים. במערכת למיקרוגל קונבנציונאלי, כי האוויר הוא לכוד לעתים קרובות במיקרוגל, יש צורך להסיר את בועות האוויר. עם זאת, מערכת CMS אינו דורש תהליך הסרת בועה, כי כוח צנטריפוגלי גבוה שנוצר על ידי הסיבוב גורם התקשורת לדחוף את הבועות ולסחוט אותם מן המיקרוגל.
למערכת CMS יש גם מגבלות לעומת שיטות קונבנציונליות. מערכת CMS דורש שטח תרבות גדול יותר (g., שטח חממה גדול) כפי שהיא כוללת מנוע, מסתובב פלטפורמה, והוא הגודל הכולל שלה הוא כ 100 mm x 100 mm x 150 מ"מ (איור 2B). כמו-כן, היא גורמת לרטט קל אך מתמשך. אנו מצפים כי המזעור של המערכת (בתקווה דומה לגודל של 6 צלחות היטב) יפתור בעיות אלה.
יש לציין כי ניתן לאסוף את הספרואידים התרבותי על-ידי הפרדת שתי השכבות הבחסות פלזמה של מערכת CMS (איור 9). החיבור בין שתי השכבות חזק מספיק כדי למנוע את דליפת המדיה במהלך פעולת המערכת. עם זאת, בשל אזור המליטה הקטן, הוא ספרבילי ביד. ניתן לאסוף את הספרואידים פשוט מהשכבה התחתונה באמצעות ליטוף.
מערכת ה-CMS מקבלת בצורה טובה יותר ופרודוקטיביות מאשר שיטות קונבנציונליות של דור ספרואיד. השיטות הקונבנציונליות, כגון המיקרוגל הרגיל או שיטות ה-droplet התלויות, הינן עתירות עבודה. עם זאת, במערכת CMS, קל הרבה יותר להגדיל את מספר spheroids על ידי הגדלת גודל השבב. באמצעות התקן זה, ניתן גם ליצור אורגנואידים הדורשים תרבות של סוגים מיוצרים, אשר לא קל לעשות בשיטות התרבות הקונבנציונלית. בנוסף לתאים במחקר זה (hASC ו-MRC-5), CMS יכול לשמש עבור ייצור ספרואיד באמצעות סוגים שונים של תאים שיכולים ליצור spheroids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
מחקר זה היה נתמך על ידי התוכנית הבסיסית לחקר המדע (2016R1D1A03934418) ותוכנית ביו & טכנולוגיה רפואית (2018M3A9H1023141) של ה-NRF, וממומן על ידי הממשלה הקוריאנית, MSIT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Cubicon | 3DP-210F | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) | ATCC | PCS-500-011 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Contained 1% of completed medium and buffer |
| CellTracker Green CMFDA | Thermo Fisher Scientific | C2925 | 10 mM |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 10 mM |
| Computer numerical control (CNC) rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| DC motor | Nurielectricity Inc. | MB-4385E | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | Contained 10% of completed medium |
| human lung fibroblasts (MRC-5) | ATCC | CCL-171 | |
| Inventor 2019 | Autodesk | 3D computer-aided design program | |
| Petri dish Φ 150 mm | JetBiofill | CAD010150 | Surface Treated |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 11/6/9003 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Polycarbonate (PC) | Acrylmall | AC15PC | 200 x 200 x 15 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Trypsin | Gibco | 12604021 |
References
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
- Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J.
- Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies. Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).
- Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Li, Y., et al. Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance. Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).
- Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential. Bmc Biotechnology. 14 (1), 105 (2014).
- Koh, C. Y., et al. Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin. Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).
- Steigert, J., et al. Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics. Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).
- Park, Y. -S., et al. Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood. Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).
- Lee, A., et al. All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity. Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).
- Gorkin, R., et al. Centrifugal microfluidics for biomedical applications. Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).
- Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform. Biofabrication. 9 (4), (2017).
- Rocca, A., et al. Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).
- Genchi, G. G., et al. Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E.
