Summary
在这里，我们介绍了酵母中SNX-BAR异体物的表达、纯化和脂质结合的工作流程。
Abstract
SNX-BAR 蛋白是一种进化保存的膜重塑蛋白，在内分泌期间蛋白质和脂质的分拣和贩运、内皮系统内的分泌和自噬中起着关键作用。SNX-BAR 蛋白质功能的核心是能够形成同质体或异构体，使用高度保守的磷同源学 （PX） 和 BAR（宾/假体素/Rvs）域结合膜。此外，在膜上对SNX-BAR二聚体进行寡聚可以引起膜小管和囊泡的形成，这种活性被认为反映了其作为内生物源运输载体的涂层蛋白的功能。长期以来，研究人员利用重组SNX-BAR蛋白在合成脂质体或巨型单片菌囊泡（GUVs）上进行体外结合研究，揭示驱动膜重塑所需的脂质的精确组成，从而揭示其作用机制。然而，由于双表达系统的技术挑战、细菌中SNX-BAR蛋白表达的毒性以及单个SNX-BAR蛋白的溶解性差，迄今为止的大多数研究都检查了SNX-BAR同质体，包括细菌表达过程中形成的非生理二分体。最近，我们优化了一种方案，克服了典型细菌表达系统的主要缺陷。使用此工作流，我们演示如何成功表达和纯化大量 SNX-BAR 异体，以及如何在合成脂体上重新构成它们，以便进行结合和管状测定。
Introduction
膜结合的细胞器，如血浆膜、内质视网膜、Golgi装置、溶血菌（酵母乳酸）和内膜体构成真核细胞的内膜系统。大多数细胞器能够通过囊泡运输载体与其他细胞器进行通信和交换材料。细胞如何协调内膜系统内囊泡运输载体的包装和形成，目前还没有得到很好的理解。然而，构成大部分内膜系统的蛋白质和脂质已知源自血浆膜（PM）内切内切内切囊泡。内体是这些囊泡的主要接受器，由多组相互关联的管状细胞器组成。内源体的主要功能是促进营养获取，调节蛋白质和脂质流动，防止病原体感染，并作为血浆膜脂质的主要补充来源。当内欧体从血浆膜中接收大量货物蛋白质和脂质时，通过将货物分离到管状内皮运输载体（ETCs）中，充当分拣室。任何未被隔离到ETCs的蛋白质都会通过内裂体系统降解。货物分类到ETC的调节不良可能导致营养摄入、蛋白质周转或脂质平衡的丧失，导致大量代谢、发育和神经系统疾病1、2。然而，尽管ETC在内源体中起着核心作用，但内源体如何有选择地协调大量异质货物包装成管状载波的基本机制尚不清楚。
分拣nexin（SNX）系列是一种进化保存的蛋白质类别，已发现对细胞3、4、5中的许多囊泡运输反应至关重要。分拣内膜，通过其特有的磷异体（PX）域帮助货物捕获，该域结合磷脂酰胆醇-3-单磷酸（PtdIns（3）P，一种富含内膜的脂质。哺乳动物编码33个SNX蛋白质，根据其他域1的存在，这些蛋白质可以进一步分为多个子家族。最值得注意的是，SNX-BAR亚家族是最大的亚家族，由12个人类组成，而在萌芽的酵母中，糖母糖，亚家族减少到只有7个SNX-BARs。SNX-BAR 蛋白同时具有 PX 域和 Bin-Amphisin-Rvs （BAR） 域，可触发脂质储液罐结合正曲率膜。因此，SNX-BAR系列对内膜体具有天然的亲和力，可以通过膜重塑能力来介导ETC的形成。在体外，通过在合成脂质体中加入纯化的SNX-BARs，可以诱导SNX-BARs的重塑特性，随后形成狭窄的涂层小管可以通过电子显微镜进行可视化。利用这些方法，研究人员已经确定，在SNX-BAR家族中，寡头集中和收缩强度似乎各不相同，这表明它们可以帮助ETC的形成和分裂。
SNX-BARs 可以按其独有的二聚特性进一步分类。体外结合测定和结构研究表明，SNX-BAR蛋白只能形成特定的同构体或异构体。因此，原则上，每个潜在的 SNX-BAR 二聚体可为特定货物的贩运途径提供小管涂层，同样，其他 SNX-BAR 原物体的受限寡头化也可以定义不同的出口途径。但是，由于 SNX 系列中 SNX-BARs 数量众多且多样性，因此不太可能出现一个排序的 nexin-one 货运假说。相反，使用 SNX-BARs、货物、脂质特异性和其他依赖关系等多种因素进行协调工作的可能性更大。同样，最近对酵母SNX4家族的研究表明，除了PtdIns（3）P，还有增效内质性运输载体6的脂质特异性。在这项研究中，SNX-BAR homodimer Mvp1-Mvp1从细菌和原生异体物Snx4-Atg20和Vps5-Vpss17中表达和纯化，从酵母高产中表达和纯化，而只有Snx4-Atg20被发现优先结合磷脂酰丝氨酸（PS），并在脂质体结合研究中形成狭窄的管状结构。虽然该领域的其他人已经揭示了SNX-BARs使用重组纯化的SNX-BAR同质体从细菌的重要属性，与表达SNX-BAR异构体在类似系统中的毒性阻碍了其原生特性7，8，9，10。因此，如果没有一个可靠的系统来获得纯重组表达的本地异质体，研究人员必须放弃这些调查路线。在图 1中，我们提出了一个四部分工作流，以 1） 构建一个酵母菌株过度表达 SNX-BAR 异构体用于串联亲和纯化， 2） 表达和纯化原生 SNX-BAR 异构体， 3） 制备单层合成脂质体， 4） 建立脂质管或沉淀测定，为研究人员研究在自然界中发现的分拣内辛的不断增长的目录提供了重要工具。
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Protocol
1. 酵母应变结构
- 以 TVY614（pep4_：：LEU2 prb1_：：hisG prc1_：：HIS3）11作为父应变。这种菌株缺乏真空蛋白酶，导致细胞解压后大多数蛋白质降解，因此允许更清洁和更有效的纯化。
- 设计引物12，并使用同源重组在 Atg20 （SNX-BAR ORF 1） 的 C 总站集成串联亲和纯化 （TAP） 标记。使用聚合酶链反应 （PCR） 确认集成 （图 2）。
- 对TAP标记执行细胞分解液的西方印块，以确认适当的整合13。
注：我们建议收获 3 个 OD （1 OD = 1 x 107细胞） 的细胞，用于 SDS-PAGE 和西方污点验证。请注意，在用 GAL1 提升剂替换内源启动器之前，应集成 TAP 标记，以便通过西方污点更轻松地验证 TAP 标记。 - 使用每个ORF14的顺序同源重组和转换步骤，将内源性Snx4（SNX-BAR ORF1）和Atg20（SNX-BAR ORF 2）启动器替换为未标记的GAL1启动子。
- 在集成站点外部使用侧翼引体来确认成功集成（图 2）。这将导致目标 SNX-BARs 的空表型，在生长介质中不存在半乳酸。
2. 酵母感应和 SNX-BAR 丁二器纯化
注：酵母细胞可以在标准YPD（酵母提取物、肽和2%葡萄糖）琼脂板上繁殖，因为修饰是染色体整合的。
- 将大量细胞拭子接种到50 mL的标准YP（酵母提取物和肽）培养基中，在烧瓶中以2%的拉菲诺和0.1%葡萄糖作为碳源，其体积至少是培养物体积的4倍，并在30°C摇床中过夜，以允许适当的曝气。预计与标准 YPD 相比，该介质的增长将放缓。
- 第二天早上，使用50 mL预培养剂，用2%的拉菲诺和0.1%的葡萄糖接种到1L的标准YP培养基中，在30°C摇床中生长4-5小时。
注：用于接种 1 L 培养的培养前体积可根据预栽培的 OD600进行调整。接种后1 L培养法的OD600应为0.2左右，以便在4-5小时生长期间至少增加两倍。- 使用一个困惑的Fernbach烧瓶生长，允许适当的曝气，2.8L体积瓶就足够了。少曝气可能导致生长缓慢和收获时细胞颗粒变小。
- 检查 OD600以确保培养值在 4-5 小时增长后处于对数阶段 （0.5-1）。根据应变的生长情况，对生长时间进行调整，使生长时间至少翻倍两倍。加入2%的锥度酶，在30°C摇床中一夜生长。
注：隔夜增长后的 OD600可能会有所不同，但文化应该饱和。请注意，在加入此生长方案的 2% 加糖之前，无需从 0.1% 葡萄糖中去除细胞。我们建议在此步骤中收获3个未诱导和诱导细胞的OD，用于SDS-PAGE和西带的验证（图3A，B，通道1-2）。 - 在4500 x g下通过离心收细胞15分钟。可在此处使用适合 1 L 体积培养的摆动铲斗转子。
- 将酵母颗粒转移到50 mL锥形管中;可根据需要执行第二个离心步骤。细胞颗粒的体积一般在10-15 mL左右，通过分级标记测量，可以立即使用或储存在-80°C。
- 在15 mL净化缓冲液中重新悬浮颗粒（50 mM Tris pH 7.4，300 mM NaCl，1.5 mM MgCl2，1mM 二硫硫醇 （DTT），蛋白酶抑制剂鸡尾酒），使最终体积约为 30 mL。
- 使用前先冷却均质器 4°C，并将其与纯化缓冲液平衡。使用机械细胞干扰器或均质器的酶细胞。将样品加载到均质器和酶中，以 20，000-25，000 psi 进行 2-3 轮;请注意，当细胞被分化时，需要更多的输入压力来维持20，000-25，000 psi。在冰上50 mL锥形管中收集细胞乳化。
注：如果需要对其他样品进行分片处理，则应在装载下一个样品之前彻底清洁和平衡均质器。将所有细胞分物放在冰上。 - 在4°C下，立即清除35，000 x g的细胞分麦1小时。小心地将上清液转移到新管中。请注意，细胞分流中的脂质在离心过程中会浮到顶部，不会影响纯化。
注：我们建议为 SDS-PAGE 样品保存 0.5-1% 的利沙和颗粒。通常，没有观察到重大差异，并可能做额外的西印体来确认TAP蛋白溶解性（图4，车道1和2，分别）。 - 用纯化缓冲液平衡300 μL IgG分离玫瑰珠子。加入清除的细胞解结，孵育2小时，在4°C下旋转。
- 在 10 mL 色谱柱中收集珠子，并允许未结合的解糖流过。
- 使用 10 mL 的洗涤缓冲液（50 mM Tris pH 7.4，300 mM NaCl，1.5 mM MgCl2， 1 mM DTT）清洗珠子，一次添加 1 mL，使其完全流过。
注：我们建议为 SDS-PAGE 样品保存 2% 的绑定 IgG 磁珠。通常，我们观察四个主要波段;两个SNX-BAR蛋白和IgG重链和轻链（图4，巷3）。我们建议节省同等数量的"eluate"和"TEV之后的IgG磁珠"，以比较TEV裂解效率。 - 收集珠子并将其转移到微离心管中。加入500μL的总体积与新鲜的洗涤缓冲液和2μL的10毫克/mL TEV蛋白酶和孵育过夜，旋转在4°C。
- 第二天早上，使用27G针头完全去除上清液，用10%的聚丙烯酰胺SDS-PAGE评估蛋白质纯度（图4，巷4）。
注：我们通常获得500 μL的0.5-1毫克/mL的95%纯异体（图4，巷4）。也可以使用镇静剂树脂进行额外的纯化，但我们通常看到产量显著下降，如果纯度为 >90%，建议在此停止。TEV不干扰脂体结合测定，虽然TEV可以额外删除使用Ni-NTA抗胶珠15。 - 要进行浓缩，将样品转移到带 10 KDa 截止的 0.5 mL 离心过滤器中，并根据制造商的说明将离心机转移到 50 μL 或更少。使用布拉德福德蛋白测定定量浓缩蛋白。储存在4°C，并在一周内使用。
3. 脂体制备
- 购买市售脂类：磷脂酰丝氨酸（PS）、PI3P、二甲醇和磷脂酰胆碱（PC）。如果需要，在推荐的溶剂中重新悬浮以制造血脂。
注：根据制造商的建议，脂质被重新悬浮在甲醇/氯仿混合物中。在使用前，确保脂质储存清晰并加热至室温。再悬浮的脂质可储存在气下，并使用蜡膜（或等效物）在-20°C密封6-12个月，或直到观察到活动损失。 - 计算每种脂质库存所需的体积，以创建具有所需脂质成分的混合物（见表1）。假设脂质混合物中共有1摩尔脂质。
- 在化学烟气罩中执行此步骤。通过绘制完整的氯仿注射器体积并将其丢弃在废物容器中，清洁玻璃注射器。再重复两次。转移氯仿时，仅使用玻璃注射器或移液器。提取氯仿时，缓慢拉上塞子，以防止气泡进入注射器。
- 使用玻璃注射器将库存脂质按计算转移到干净的玻璃培养管中，使最终脂质混合物为 1% PI3P、20% ergosterol、30% PS、PC（表 1）。根据每种脂质的溶剂，当加入每个脂质后，混合物可能会变浑浊。
注：要改变 PS 的浓度 （0-30%），请相应地调整音量，并用不同的 PC 进行补偿 （表 1）。 - 用氮气小心地干燥脂质混合物，以循环运动的方式将脂质混合物均匀地干燥。在干燥过程中，使用低气体流量将脂质保持在玻璃管底部。用铝箔包裹玻璃培养管，使开口未覆盖，并在真空中进一步脱水 1 小时。
- 加入400 μL的结合缓冲液（50 mM Tris pH 7.4，300 mM NaCl，1 mM MgCl2），使脂质完全脱水，最终脂质浓度为2.5 mM。
注：最终脂体浓度可以通过增加更多或更少的结合缓冲液来调节。例如，如果需要，可以添加 200 μL 结合缓冲液以产生 5 mM 的脂体浓度（见下文）。- 在室温下以中等速度在涡旋处摇动脂质30分钟。当脂质重新悬浮时，缓冲液应出现多云。
- 将悬浮脂体转移到微离心管。从那时起，塑料移液器尖端可用于脂质不再在氯仿中重新悬浮。请注意，脂液溶液应看起来浑浊。
- 冷冻解冻脂体七至八次，先将微离心管浸入液氮中，然后在37°C水浴中。脂体混合物在解冻前应完全冷冻和眼部固体。
- 在化学烟气罩中执行涉及氯仿的步骤。通过提取和丢弃全套氯仿注射器，每支三次，清除两个 1 mL 玻璃注射器，以去除任何残留脂质。通过绘制两个注射器体积，将每个玻璃注射器与超纯水平衡，然后通过绘制两个注射器体积与结合缓冲液进行平衡。
- 根据制造商的建议组装微型挤出机。通过在结合缓冲液中浸入一个 200 nm 膜和两块滤芯支架（参见材料表），使每个膜平衡。
- 将膜夹在过滤器支架之间并放置在微型挤出机中。为了减少组装的微型挤出机的死体积并确保组件气密，使用 1 mL 玻璃注射器通过微型挤出机传递与脂体混合物体积相当的装订缓冲液。
- 使用 1 mL 玻璃注射器之一，并绘制脂体混合物。反转微离心管，收集管盖中最后一种脂体混合物，以绘制到玻璃注射器中。
- 通过200nm膜19-21次挤出脂体。在新的微离心管中收集挤出的脂体。
注：挤出的脂体在挤出前应比脂体显得少多云。脂质体应在同一天使用，并储存在冰上。最后一次挤出应将脂体放在注射器的对面，因为它开始。
4. SNX-BAR 脂体结合和管状
- 在进行脂素结合和沉淀实验之前，在超离心器中预清除100，000 x g的纯化蛋白，在4°C下20分钟。去除上清液并将其转移到新的微离心管中;如果有，请勿干扰颗粒。
- 为了执行脂体结合和输卵管测定，孵育4μM纯化的Snx4-Atg20和2.5 mM脂体的总反应体积为20μL，改变添加的脂体体积。
注：在同一实验中，应使用相同的脂量体。 - 在30°C下孵育反应30分钟。
注：我们建议使用不少于10μL脂体，以在沉积过程中实现可视化，从而最大限度地增加每次反应中2.5 mM脂体的数量。如果在20μL反应中使用10μL的2.5 mM脂体，脂体的最终浓度为1.25 mM。如果稀释了纯化的蛋白质，并且 4 μM 蛋白质需要更大的体积，则在补液步骤期间，脂质可在 200 μL 中重新悬浮，使脂质体的浓度加倍（参见步骤 3.6）;然而，这需要在制造脂体之前知道蛋白质的浓度。 -
可视化和量化脂体管。
- 立即处理脂体结合反应，用于电子显微镜分析。用1%的醋酸尿酸（图5B）16将样品点到碳涂层铜网网格和负污渍上。
- 在透射电子显微镜（200 kV）上分析样品。
- 使用图像分析软件测量和量化小管直径。要准确量化单个小管的管直径，请沿小管的长度和平均值进行三个直径测量（图 5B）。
注：方差的双向分析用于确定统计显著性（图5E）。醋酸乙烯是放射性的和有毒的。执行此步骤需要经过适当的实验室安全认证。
-
脂体结合和沉淀。
- 将反应（20 μL，从步骤4.3）转移到聚碳酸酯离心管，并使用兼容转子在超离心机中以100，000 x g在4°C下旋转20分钟。小心地去除上清液并转移到新的微离心管中。请注意，颗粒应保持完好无损。
- 在SDS-PAGE 40 μL样品缓冲液中重新悬浮颗粒，并转移到新的微离心管中。将20μL样品缓冲液添加到上清液。在10%聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶中加载等量的颗粒和上清液，并执行Coomassie染色，以可视化与脂质体结合的SNX-BARs（图5A）。
- 要量化颗粒分数中的 SNX-BAR 复合物量，请使用密度测定量量化带强度，并量化颗粒分数中 SNX-BAR 蛋白质的比例。
注：方差的双向分析用于确定统计显著性（图5C）。
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Representative Results
该协议描述了一种可重复和强健地生产内源酵母SNX-BAR复合物的方法，可用于下游膜重塑测定（图1）。用于纯化的酵母菌株的构建利用了萌芽酵母的同源重组效率，允许在目标 SNX-BARs 的基因组位点进行修改（图 2）。这种设计有两个优点，（i）由于选择不需要进行修改，可以使用标准的YP介质，从而允许生长到更高的细胞密度，从而更高的蛋白质生产，（ii）目标SNX-BARs的表达水平将均匀，优化异体复合物的生产。在添加半乳酸酯之前，目标 SNX-BARs 将表现出空表型，因此可能导致生长缺陷或特定于目标 SNX-BARs 的其他已知缺陷。此外，2%的拉菲诺和0.1%的葡萄糖的生长比2%葡萄糖的生长慢。因此，在锥酸诱导之前的生长期可能需要优化每个特定的菌株。为了检查 SNX-BAR 表达的正确诱导，可能需要对 TAP 标记进行西印，因为 SNX-BARs 的蛋白质水平可能无法通过 Coomassie 染色检测出来（图 3）。但是，由于 SNX-BAR 复合物中只有一个成员具有标记，因此除非完成纯化的所有步骤，否则无法确认未标记蛋白的表达。在净化 SNX-BAR 异构体后，两个 SNX-BARs 的频段应显示为 1：1 的化学计量比，并且应该有很少或没有污染带（图4，通道 4）。如果存在额外的污染带，并且起始酵母菌株已经缺乏蛋白酶，则在细胞解压期间可能会添加更多蛋白酶抑制剂。此外，可以使用镇静剂树脂执行第二个纯化步骤。
当进行膜重塑测定时（图5），同一实验必须使用相同的脂体和纯化蛋白的制备。如果需要蛋白质的多重纯化制剂达到所需浓度，在进行实验之前将所有纯化的蛋白质合并。脂体应在同一天内制造和使用（表1）。进行脂体沉积测定测定时，在用脂体沉淀蛋白进行沉淀前20分钟，使用100，000 x g的相同沉淀条件预清除纯化蛋白至关重要，因为沉淀蛋白可能会扭曲结果。此外，脂液颗粒在沉淀后应保持完好无损。
图 1：SNX-BAR 绑定测定流程图。简而言之，在步骤 1-2 中，我们将 GAL 促进器设计成两个 SNX-BAR 基因组位点，替换每个内源启动子，并将一个 C 端 TAP 标记设计成两个 SNX-BAR 位点之一。接下来，在步骤3-7中，我们诱导细胞与乳酸酶和纯化SNX-BAR异质体均质。在步骤8-12中，我们计算和制备单层脂体。最后，我们可以将SNX-BAR异体与单体脂体结合，并进行两种检测;步骤14a-16a涉及膜管和14b-16a涉及沉淀测定。有关详细信息，请参阅文本。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：SNX-BAR 集成策略。两个 SNX-BAR 位点被定位为 GAL 表达式使用同源重组。SNX-BAR ORF1 （Atg20） 还用于表示 C 终端 TAP 标记。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：加拉克托塞感应验证。（A-B）为了验证Atg20-TAP的GAL诱导，我们建议对诱导2%锥形酶（A、B、车道2）和未诱导（A、B、车道1）的细胞提取物进行SDS-PAGE和西斑分析。（C） 西块膜也被剥离，用抗pgk1进行探测，以控制负载。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：Atg20-Snx4异体纯化示例。设计用于表达Atg20-TAP和Snx4的酵母细胞由锥形酶促进剂驱动，用2%的乳突酶诱导，使用IgG分离素进行解毒和结合，并用TEV蛋白酶洗脱。每个纯化步骤的样本以 10% SDS-PAGE 显示。巷1：导引下液的上清。巷2：致使的利萨的颗粒。车道3：结合蛋白到IgG分离的样本。车道4：来自IgG sepharose的纯Atg20-Snx4异体物的TEV eluate。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：代表性脂体结合和输油测定。（A） SNX-BAR 异质体、Atg20-Snx4 和 Vps5-Vps17 来自酵母，如文本中所述，被表达、纯化并绑定到合成脂质体。请注意，Mvp1 形成同质体，并在细菌中表达。（B） Snx4-Atg20 脂体管测定和管状测量（插页）的 EM 显微图。（C） SNX-BAR 与不同脂体组合物的结合通过密度测定学进行了量化。图表表示均值的均值和标准误差。\p < 0.002.（D） 图管直径已量化并绘制了文字中所述的图形。刻度条 = 200 nm。误差条表示方差的双向分析。请点击此处查看此图的较大版本。
| 典型的脂体成分 | DOPC | DOPS | 埃尔戈斯特罗尔 | PI3P-C16 |
| M w | 786.1 | 810.0 | 396.7 | 957.0 |
| 摩尔分数 | 49% | 30% | 20% | 1% |
| 库存 mM | 32.0 | 12.0 | 25.0 | 1.0 |
| 质量（毫克） | 385.2 | 243.0 | 79.3 | 9.6 |
| 浓度（毫克/升） | 25.2 | 9.7 | 9.9 | 1.0 |
| 卷到 RXN（mL） | 15.3 | 25.0 | 8.0 | 10.0 |
表1：脂液配方。合成脂体是使用DOPC、DOPS、ergosterol和PI3P的组合制备的。我们计算最终浓度为脂质的1摩尔。我们的标准成分包括 20% 的二氯醇、1% PI3P、DOPS（高达 30%）和不同数量的 DOPC。表包括400μL 30%DOPS的典型配方。
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Discussion
在这里，我们演示了优化的工作流程，以纯化酵母中的SNX-BAR二聚体和两种检测，以评估其在合成脂质体上的生物物理特性。与大肠杆菌或其他系统中典型的重组蛋白表达相反，其主要优势是能够在原生宿主中均匀地表达 SNX-BAR 蛋白质，从而避免在其它系统中净化 SNX-BARs 时发现的毒性和溶解性问题。值得注意的是，我们的系统不需要分子克隆或窝藏多个表达载体17。我们的双 SNX-BAR 酵母菌株由染色体工程的锥形增子促进剂驱动，从而确保诱导时均匀表达。一个重要的考虑因素是，如果没有半食酶，目标 SNX-BAR 的表达将很少或根本没有，从而导致空表型。此外，我们发现 SNX-BARs 倾向于很好地容忍 C 终端标记，从而使我们能够在 C 终端添加 TAP 标记。然而，根据被标记的蛋白质，N端TAP标签也可以使用12。此外，由于 SNX-BARs 仅形成 1：1 的二分器，因此只需标记一种蛋白质即可进行纯化。然而，一些SNX-BARs，通常形成异构体在细胞已被证明形成同构体在非生理浓度7。因此，在净化异体时，两个 SNX-BARs 的化学计量比应为 1：1，这可以通过在 SDS-PAGE 凝胶上运行纯化复合物的等分值和执行 Coomassie 染色来验证。一旦设计，这些酵母菌株可以永久保存为15%（v/v）甘油库存在-80°C和/或额外修改查询其他结合伙伴。我们的工作流程通常需要2-3周的应变建设，3-4天的表达和纯化和1天的脂体结合测定。我们相信，这一工作流程可以帮助研究人员进一步了解SNX-BAR蛋白的脂质特异性，使用原生BAR蛋白在合成脂质体或巨型单片菌囊（GUVs）上，并揭示驱动膜重塑所需的脂质的精确组成，从而揭示其作用机制。
关键步骤
在我们首次尝试从非蛋白酶缺陷细胞中纯化SNX-BAR异体物时，我们经常发现产量降低和降解产物。因此，在应变结构的初始步骤中，我们认为从一种或一种主要脂质蛋白系统缺乏的亲酵母菌株开始至关重要。特别是，我们发现酵母菌株TVY614，这是耗尽的pep4，prb1和prc1，是最佳的。 使用 TVY614 应变，我们通常获得 >90% 纯 Snx4-Atg20 异体器（图 4和图 5A）。但是，所有三种蛋白酸酯的消融可能是 SNX-BAR 组合特定的。例如，Vps5-Vps17异体在非蛋白酶缺陷菌株10中已成功纯化，当我们加入PEP4消融时，我们看到产量和纯度略有增加（图5A）。因此，根据用户的下游应用和对纯度或可选标记的需求，在设计表达应变时可能会有灵活性。
基因构造的顺序也很重要。我们建议先使用 C 端 TAP 标记 SNX-BAR ORF 1，以确认西方印贝的表达，而无需半乳酸感应（图 1）。在加乳糖诱导期间，在2%的乳糖和0.1%的葡萄糖中对细胞进行过夜预置至关重要。未能预置细胞会导致生长极其缓慢或细胞死亡。然而，在一夜生长期间，细胞耗尽剩余的葡萄糖也是至关重要的，否则糖诱导可能会受到负面影响。还建议检查西方斑点的多个分离物，以评估TAP标记的SNX-BAR蛋白的表达同质性。我们通常筛选 2-3 隔离，并选择最健壮的表达候选。
修改、替代方法和未来应用程序
在步骤2.8中，串联亲和纯化（TAP）通常需要使用IgG和镇静剂珠在TEV裂解12后进行两步亲和纯化。然而，在此协议中，我们通过TEV蛋白酶对SNX-BAR二聚子进行精巧处理，具有非常高的产量和纯度。我们发现随后使用镇静剂珠的亲和纯化会产生不一致和降低的产量，因此我们建议在TEV裂解后停止。含有SNX-BAR蛋白和带有他（6）标记的TEV蛋白酶的TEV脱脂酯可以通过Ni-NTA抗胶珠进一步纯化。然而，我们也发现这一步可以降低整体SNX-BAR蛋白产量，这是不必要的，因为TEV蛋白酶不会干扰脂蛋白酶结合或输卵管测定。因此，如果纯化的 SNX-BARs 将用于任何其他应用，我们建议用户评估 TEV 蛋白酶在其检测中的影响。
到目前为止，我们已经成功地使用该协议和所述的修改来纯化酵母中的Snx4-Atg20和Vps5-Vps17异体体，并成功地评估了其在合成脂质体中的脂质特异性。然而，我们相信该协议可以成功地适应酵母中的任何SNX-BARs。也可以使用该系统从任何其他生物体中产生重组的SNX-BAR蛋白。然而，这将需要额外的菌株结构步骤，以将外源基因位点集成到酵母基因组中。我们还相信该系统可以扩展以纯化多种复合物，包括货物蛋白。因此，我们相信我们的表达系统可能超出对 SNX-BARs 的脂质指定的理解。未来的应用将允许研究人员重组脂质体上的整个货物捕获复合物，以了解完整组件如何影响膜重塑。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
本出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院国家普通医学研究所的支持，奖励号为GM060221，部分得到国家研究所国家普通医学研究所的支持。在奖励编号T32GM007223下的健康。R.C.部分得到了UNC-夏洛特学院研究资助计划的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm PC Membranes | Avanti | 610006 | |
| 10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) | Bio-Rad | 731-1550 | |
| 27 G needle | BD Biosciences | 301629 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff | Amicon | UFC501024 | |
| Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer | Avestin | EF-C3 | |
| BCA assay | Pierce | 23225 | |
| Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DOPC | Avanti | 850375 | |
| DOPS | Avanti | 840035 | |
| Ergosterol (Sigma) | Sigma | 47130-U | |
| Extruder Set with Block 0.2 μL/1 mL | Avanti | 610000 | |
| FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV) | |||
| Glass culture tubes | VWR | 47729-570 | |
| IgG sepharose beads (GE Healthcare) | GE Healthcare | 17-0969-01 | |
| Microlter glass syringes | Hamilton | 7637-01 | |
| New Brunswick Excella E25 | Eppendorf | M1353-0000 | or equivalent shaking 30 °C |
| Ni-NTA Magnetic Agarose Beads | Pierce | 78605 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| PI3P | Echelon | P-3016 | or Echelon equivalent |
| Polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter | 355622 | |
| TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Type 45 Ti Rotor | Beckman Coulter | ||
| Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve | VWR | 75871-436 | |
| Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) | A&J Vacuum | PN07050 | |
| Vortex with foam holder | VWR | 10153-838 | |
| VWR KIT MICROTUBE | VWR | 12620-880 |
References
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