Summary
여기서, 우리는 효모에서 SNX-BAR 헤테로디머의 발현, 정제 및 리포좀 결합에 대한 워크플로우를 제시한다.
Abstract
SNX-BAR 단백질은 내분비증 중 단백질과 지질의 분류 및 인신 매매, 내인성 시스템 내에서 선별 및 자가 포식에 중요한 역할을하는 세포 리모델링 단백질의 진화적으로 보존 된 클래스입니다. SNX-BAR 단백질 기능의 핵심은 고도로 보존된 포크스 상동성(PX) 및 BAR(빈/암피히신/Rvs) 도메인을 사용하여 멤브레인을 결합하는 호모디머 또는 이종자를 형성하는 능력입니다. 또한, 막에 SNX-BAR 이체의 올리고머는 막 tubules 및 소포의 형성을 유도할 수 있고 이 활동은 endosome 파생된 수송 운반체를 위한 외투 단백질로 그들의 기능을 반영하는 것으로 생각됩니다. 연구원은 합성 리포좀 또는 거 대 한 unilamellar 소포에 재조합 SNX-BAR 단백질을 사용 하 여 생체 외 바인딩 연구에서 오랫동안 활용 (GUVs) 막 리모델링을 구동 하는 데 필요한 지질의 정확한 메이크업을 공개, 따라서 행동의 그들의 메커니즘을 공개. 그러나, 이중 발현 시스템과 기술적 인 도전으로 인해, 박테리아에서 SNX-BAR 단백질 발현의 독성, 개별 SNX-BAR 단백질의 가난한 용해도, 현재까지 대부분의 연구는 박테리아에서 발현 중에 형성 비 생리 적 이형제를 포함하여 SNX-BAR 호모디머를 검사했다. 최근에는 일반적인 세균 발현 시스템의 주요 단점을 극복하기 위해 프로토콜을 최적화했습니다. 이 워크플로우를 사용하여 다량의 SNX-BAR 헤테로디머를 성공적으로 표현하고 정화하는 방법과 결합 및 튜브 배관 법을 위해 합성 리포좀에서 재구성하는 방법을 보여줍니다.
Introduction
혈장막, 소포체, 골지 장치, 리소좀(yeast vacuole) 및 내막과 같은 막-결합 소기관은 진핵 세포의 내막 시스템을 포함한다. 대부분의 세포기관은 소포 수송 캐리어를 통해 다른 세포기관과 통신하고 교환할 수 있습니다. 세포가 내막 시스템 내의 소포 수송 운반체의 포장 그리고 대형을 조정하는 방법은 잘 이해되지 않습니다. 그러나, 내막 시스템의 대부분을 구성하는 단백질 및 지질은 혈장 막 (PM)에서 내분비 소포에서 유래하는 것으로 알려져 있다. endosome는 이 소포를 위한 1 차적인 수용자 소기관이고 관 성 소기관의 다중 상호 연결된 세트로 이루어져 있습니다. endosome의 주요 기능은 영양 수집을 촉진 하는, 단백질 및 지질 회전율을 조절, 병원 체 감염으로부터 보호, 플라즈마 막에 대 한 지질의 기본 보충 소스 역할을. endosome는 혈장 막에서 화물 단백질 및 지질의 대량수신으로, 관 내인체 수송 캐리어 (ETCs)로 화물을 격리해서 분류 구획으로 작동합니다. ETC로 격리되지 않은 모든 단백질은 내분비계통 시스템을 통해 분해되도록 남아 있습니다. ETC로 분류하는 화물의 역조절은 영양소 섭취, 단백질 회전율 또는 지질 항상성의 손실로 이어질 수 있으며, 이로 인해 수많은 대사, 발달 및 신경 장애1,2. 그러나, 내인성에서 ETC의 중심 역할에도 불구하고, 내인성이 관상 운반체로 이질적인 화물의 다수의 포장을 선택적으로 조정할 수 있는 방법의 근본적인 기계장치는 알려져 있지 않다.
선별된 넥신(SNX) 패밀리는 세포3,4,5에서많은 소포 수송 반응에 중요한 것으로 밝혀진 진화적으로 보존된 단백질 등급이다. 선별 넥신은 내막에 모집되고 인내막에 농축된 지질인 인산염리노시톨-3-모노포스페이트(PtdIns(3)P)를 결합하는 특징적인 인록 상동성(PX) 도메인을 통해 화물 포획을 돕습니다. 포유동물은 다른 도메인1의존재에 따라 다중 하위 패밀리로 더 분할될 수 있는 33개의 SNX 단백질을 인코딩한다. 가장 주목할 만한, SNX-BAR 하위 가족은 인간에서 열두 로 구성된 가장 큰 하위 가족이며, 신생 효모, 사카로미세세스 세레비시아에있는 동안, 하위 패밀리는 단지 7개의 SNX-BARs로 감소된다. SNX-BAR 단백질은 PX 도메인과 양성 곡률 막을 결합하는 지질 저장소를 유발하는 빈-암피히신-Rvs(BAR) 도메인을 모두 가지고 있습니다. 따라서 SNX-BAR 제품군은 내인성에 대한 자연스러운 친화력을 가지며 멤브레인 리모델링 능력을 통해 ETC 형성을 중재할 수 있습니다. 시험관내에서 SNX-BARs의 리모델링 특성은 합성 리포좀에 정제된 SNX-BARs를 첨가하여 유도될 수 있으며, 이에 따른 좁고 코팅된 튜블의 형성은 전자 현미경으로 가시화될 수 있다. 이러한 방법을 사용하여, 연구원은 올리고머화 농도와 수축 강도 모두 그들이 ETC의 형성과 가위 모두에 도움이 될 수 제안 SNX-BAR 가족 사이에 변화하는 것으로 나타났습니다 결정했다.
SNX-BAR은 독점적인 이화 특성에 의해 추가로 분류될 수 있습니다. 시험관 내 결합 검사 및 구조 연구는 SNX-BAR 단백질이 특정 호모디머 또는 이종만 형성할 수 있음을 입증했습니다. 따라서, 원칙적으로, 각 잠재적SNX-BAR 디머-올리고머는 화물 별 인신매매 경로에 대한 튜번 코트를 제공할 수 있으며, 마찬가지로 다른 SNX-BAR 프로토머의 제한된 올리고머화는 또한 뚜렷한 수출 경로를 정의할 수 있다. 그러나 SNX 제품군 내에서 많은 수의 SNX-BARs와 다양성으로 인해 하나의 선별 된 넥신 원 화물 가설은 매우 드물다. 대신 SNX-BARs, 화물, 지질 특이성 및 기타 종속성과 같은 다양한 요인을 사용하여 조정된 노력이 더 가능성이 높습니다. 마찬가지로, 효모 SNX4 가족의 최근 연구는 PtdIns (3)P를 넘어 추가 지질 특이성에 대한 증거를 밝혀, 내분비 수송캐리어를potentiate 6. 본 연구에서, SNX-BAR 호모디머 Mvp1-Mvp1은 박테리아와 토종 이종자 Snx4-Atg20 및 Vps5-Vps17에서 정제되었으며, 효모에서 높은 수율로 정제되었으며, Snx4-Atg20만이 포스파티딜세린(PS) 및 좁은 결합 체형(PS) 및 좁은 결합 구조에서 포스파티딜세린(PS) 및 좁은 결합 체형(PS)을 우선적으로 결합하는 것으로나타났습니다. 현장에서 다른 사람들이 박테리아로부터 재조합 정제된 SNX-BAR 호모디머를 사용하여 SNX-BAR의 중요한 특성을 밝혀냈지만, 유사한 시스템에서 SNX-BAR 헤테로디머를 발현하는 것과 관련된 독성은 그들의 본래 특성화를 저해한7,8,9,10. 따라서 순수한 재조합으로 표현된 네이티브 헤테로디머를 얻기 위한 신뢰할 수 있는 시스템이 없다면, 연구자들은 이러한 조사 라인을 포기해야 한다. 도 1에서는,우리는 탠덤 친화도 정제를 위해 SNX-BAR 헤테로디머를 과발현하는 효모 균주를 구성하기 위해 4부트 워크플로우를 제시하고, 2) 네이티브 SNX-BAR 헤테로디머를 표현하고 정화하고, 3) 단층 합성 리포솜을 준비하고, 4) 리포솜 관 또는 침전검을 설정하여 연구원들이 자연에서 발견되는 넥신을 선별하는 카탈로그를 조사하는 데 중요한 도구를 제공한다.
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Protocol
1. 효모 변형 공사
- TVY614(pep4Δ::LEU2 prb1Δ::hisG prc1Δ::HIS3)11로 시작하십시오. 이 균주는 세포 용해 후 단백질 분해의 대부분에 기여하는 백공 프로테아제에 대한 결핍, 따라서 깨끗하고 보다 효율적인 정제를 허용.
- 디자인프라이머(12)는 동형 재조합을 사용하여 Atg20(SNX-BAR ORF 1)의 C-종점(T-terminus)에서 탠덤 친화도 정제(TAP) 태그를 통합한다. 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 통합을 확인합니다(그림2).
- 적절한 통합을 확인하기 위해 TAP 태그에 대해 셀 리세이트의 서쪽 블롯을수행13.
참고: SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 검증을 위해 3개의 OD(1 OD □ 1 x 107 셀)를 수확하는 것이 좋습니다. 내인성 프로모터를 GAL1 프로모터로 교체하기 전에 TAP 태그의 통합이 이루어져야 서부 블롯을 통해 보다 쉬운 TAP 태그 검증이 가능합니다. - 내인성 Snx4(SNX-BAR ORF1) 및 Atg20(SNX-BAR ORF 2) 프로모터를 각 개별 ORF14의순차적 상동 재조합 및 변형 단계를 사용하여 태그가 지정되지 않은 GAL1 프로모터로 교체합니다.
- PCR에 통합 사이트 외부의 측면 프라이머를 사용하여 성공적인 통합을 확인합니다(그림2). 이는 성장 배지에서 갈락토스의 부재 하에서 표적 SNX-BARs의 널 표현형을 초래할 것이다.
2. 효모 유도 및 SNX-BAR 이량체 정제
참고: 효모 세포는 변형이 염색체적으로 통합됨에 따라 표준 YPD(효모 추출물, 펩톤 및 2% 포도당) 한천 플레이트상에 전파될 수 있다.
- 50 mL의 표준 YP (효모 추출물 및 펩톤) 배지에 50 mL의 표준 YP (효모 추출물 및 펩톤) 배지를 접종하여 2 % 라피노스 및 0.1 % 포도당을 탄소 원으로 플라스크에서 적어도 4 배의 부피를 섭취하고 적절한 폭기를 허용하기 위해 30 °C 셰이커에서 하룻밤 동안 성장합니다. 이 매체의 성장은 표준 YPD에 비해 느려질 것으로 예상됩니다.
- 다음날 아침, 50 mL 프리컬쳐를 사용하여 2% 라피노스와 0.1% 포도당으로 표준 YP 배지 1L로 접종하고 30°C 셰이커에서 4-5시간 동안 자랍니다.
참고: 1L 배양을 접종하는 데 사용되는 프리컬쳐의 부피는 전배양의 OD600에 따라 조절될 수 있다. 접종 후 1 L 배양물의 OD600은 4-5 h 성장 동안 적어도 2개의 이중화를 허용하도록 약 0.2이어야 한다.- 적절한 폭기를 허용하기 위해 성장을 위해 당황 펀바흐 플라스크를 사용, 2.8 L 볼륨 플라스크는 충분하다. 적은 폭기 수확시 느린 성장과 작은 세포 펠릿 귀 착될 수 있습니다.
- OD600을 확인하여 4-5시간 동안 성장한 후 배양액이 로그 단계(0.5-1)에 있는지 확인합니다. 균주의 성장에 따라, 적어도 두 배의 성장을 허용하기 위해 성장 시간을 조정합니다. 2% 갈락토스를 넣고 30°C 셰이커에서 하룻밤 동안 자랍니다.
참고: OD600 은 하룻밤 성장 후 다양할 수 있지만 배양은 포화되어야 합니다. 세포는이 성장 프로토콜에 대 한 2% 갈락토오스를 추가 하기 전에 0.1% 포도 당에서 제거 될 필요가 없습니다. 검증을 위해 SDS-PAGE 및 서부 블롯(그림3A, B,레인 1-2)에 대해 이 단계에서 유도되지 않은 및 유도 된 세포의 3 OD를 수확하는 것이 좋습니다. - 15 분 동안 4500 x g에서 원심 분리에 의해 세포를 수확하십시오. 1L 볼륨 배양을 수용하는 스윙 버킷 로터를 여기에서 사용할 수 있습니다.
- 효모 펠릿을 50 mL 원점 튜브로 옮기십시오. 필요에 따라 제2 원심분리 단계를 수행할 수 있다. 상기 세포 펠릿은 일반적으로 졸업 표시에 의해 측정된 부피에서 약 10-15 mL일 것이며 즉시 사용되거나 -80°C에서 저장될 수 있다.
- 펠릿을 15 mL 정제 버퍼(50 mM Tris pH 7.4, 300 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2,1 mM 디티오트레이톨(DTT), 프로테아제 억제제 칵테일)에 재중단하여 약 30 mL의 최종 부피를 확인한다.
- 사용하기 전에 균질화기 4 °C를 식히고 정제 버퍼로 평형화하십시오. 기계식 세포 파괴자 또는 균질제를 사용하여 세포를 용해한다. 2-3 라운드에 대한 20,000-25,000 psi에서 균질화 및 용해로 샘플을로드; 세포가 용해됨에 따라 20,000-25,000 psi를 유지하기 위해 더 많은 입력 압력이 필요합니다. 얼음에 50 mL 원엽 튜브에서 세포 를 포란수집합니다.
참고: 추가 시료를 용해시켜야 하는 경우, 다음 시료를 로딩하기 전에 균질화제를 철저히 세척하고 평형화해야 합니다. 모든 세포가 얼음에 해리도록 유지하십시오. - 4 °C에서 1 시간 동안 35,000 x g에서 즉시 세포 용해를 지웁히 하십시오. 조심스럽게 상급을 새 튜브로 옮김. 세포 용해에서 지질원심 분리 도중 위로 떠있을 것이고 정화에 영향을 미치지 않을 것이라는 점에 유의하십시오.
참고: SDS-PAGE 샘플에 대한 용해수액과 펠릿을 0.5-1% 절약하는 것이 좋습니다. 전형적으로, 중요한 다름은 관찰되지 않으며 추가적인 서쪽 얼룩은 TAP 단백질 용해도를 확인하기 위하여 행해질 수 있습니다(그림 4,레인 1 및 2, 각각). - 정제 완충제와 IgG 세파로즈 비드의 300 μL을 평형화. 클리어된 셀에 용해시키고 4°C에서 회전하여 2시간 동안 배양합니다.
- 10 mL 크로마토그래피 컬럼에서 구슬을 수집하고 언바운드 리세이트가 통과할 수 있도록 합니다.
- 세척 버퍼 (50 mM Tris pH 7.4, 300 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM DTT)를 사용하여 구슬을 한 번에 1 mL을 추가하고 완전히 통과 할 수 있도록합니다.
참고: SDS-PAGE 샘플에 대한 바인딩 된 IgG 비드의 2 %를 저장하는 것이 좋습니다. 일반적으로, 우리는 네 개의 주요 밴드를 관찰; 두 개의 SNX-BAR 단백질과 IgG 헤비 및 라이트 체인(그림 4,레인 3). TEV 절단 효율을 비교하기 위해 'eluate'와 'TEV 후 IgG 구슬'의 동등한 양을 저장하는 것이 좋습니다. - 구슬을 수집하고 미세 원심 분리튜브로 옮김. 신선한 세척 버퍼로 총 부피 500 μL을 추가하고 10 mg/mL TEV 프로테아제 2 μL을 넣고 4 °C에서 회전하여 밤새 배양합니다.
- 다음날 아침, 27 G 바늘을 사용하여 상급체를 완전히 제거하고 단백질 순도를 10% 폴리아크릴아미드 SDS-PAGE(도4,레인 4)로 평가한다.
참고: 우리는 전형적으로 95% 순수한 헤테로디머의 0.5-1 mg/mL의 500 μL을 얻습니다(그림 4,레인 4). calmodulin 수지사용 추가 정제는 또한 행해질 수 있습니다, 그러나 우리는 일반적으로 수율에 있는 중요한 감소를 보고 순도가 >90%인 경우에 여기에서 중지하는 것을 추천합니다. TEV는 리포솜 결합 검사를 방해하지 않지만, TEV는 Ni-NTA 아가로즈비드(15)를사용하여 추가적으로 제거될 수 있다. - 농축하려면 제조업체의 지침에 따라 10 KDa 컷오프 및 원심 분리기로 0.5 mL 원심 필터로 샘플을 50 μL 이하로 옮김을 옮김을 사용하십시오. 브래드포드 단백질 분석판을 사용하여 농축 된 단백질을 정량화하십시오. 4 °C에서 보관하고 1 주일 이내에 사용하십시오.
3. 리포솜 준비
- 상업적으로 이용 가능한 지질을 구입: 포스파티딜세린 (PS), PI3P, 에르고스테롤, 그리고 포스파티딜콜린 (PC). 필요한 경우, 스톡 지질을 만들기 위해 권장 용매를 다시 중단하십시오.
참고: 지질은 제조업체의 권장 사항에 따라 메탄올/클로로폼 혼합물로 재중단됩니다. 사용하기 전에 지질 스톡이 깨끗하고 실온으로 데워졌는지 확인하십시오. 재중단된 지질은 아르곤 가스 하에 보관할 수 있으며 6-12개월 동안 또는 활성 손실이 관찰될 때까지 -20°C에서 왁스 필름(또는 이에 상응하는)을 사용하여 밀봉할 수 있습니다. - 원하는 지질 조성물을 혼합하여 만들기 위해 각 지질 스톡에 필요한 부피를 계산합니다(표 1참조). 지질 혼합물에서 총 1 두더지의 지질을 가정합니다.
- 화학 연기 후드에서 이 단계를 수행합니다. 클로로폼의 전체 주사기를 끌어올려 폐용기에 버려서 유리 주사기를 깨끗하게 청소합니다. 두 번 더 반복합니다. 클로로폼을 전달할 때는 유리 주사기 나 파이펫만 사용하십시오. 클로로폼을 그릴 때는 주사기에 가스 기포가 유입되는 것을 방지하기 위해 스토퍼를 천천히 당깁니다.
- 유리 주사기를 사용하여 깨끗한 유리 배양 튜브로 계산된 스톡 지질을 1% PI3P, 20% 에르고스테롤, 30% PS,PC(표 1)의최종 지질 혼합물을 만든다. 각 지질이 재중단되는 용매에 따라, 혼합물은 각 지질을 첨가할 때 흐린 방향으로 변할 수 있다.
참고: PS(0-30%)의 농도를 다양하게 하기 위해 그에 따라 볼륨을 조정하고 다양한 PC로보정합니다(표 1). - 지질 혼합물을 균일하게 건조시키기 위해 원형 운동으로 지질 혼합물을 향하게 하는 질소 가스를 사용하여 지질 혼합물을 조심스럽게 건조시다. 낮은 가스 흐름을 사용하여 건조 과정에서 유리 튜브의 바닥에 지질을 유지하십시오. 유리 배양 튜브를 호일로 감싸고 개구부를 덮지 않은 상태로 두고 1 시간 동안 진공 상태로 더 탈수합니다.
- 400 μL의 결합 버퍼(50 mM Tris pH 7.4, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl2)를추가하여 지질을 완전히 탈수하여 2.5 mM의 최종 리포좀 농도를 만듭니다.
참고: 최종 리포솜 농도는 더 많거나 적은 결합 버퍼를 첨가하여 조절될 수 있다. 예를 들어, 200 μL 결합 버퍼는 필요한 경우 5 mM의 리포솜 농도를 생성하기 위해 첨가될 수 있다(아래 참조).- 30 분 동안 실온에서 소용돌이에 중간 속도로 흔들어 서 지질을 다시 일시 중단. 버퍼는 지질이 다시 중단으로 흐리게 나타납니다.
- 재중단된 리포솜을 미세원심지 튜브로 옮김. 이 시점부터, 플라스틱 파이펫 팁은 지질이 더 이상 클로로포름에서 재중단되지 않도록 사용될 수 있다. 리포솜 솔루션은 흐린 것처럼 보일 것입니다.
- 액체 질소에 먼저 미세 원심 분리튜브를 침수시켜 7~8회 동결해한 다음 37°C 수조에 넣습니다. 리포솜 혼합물은 해동하기 전에 눈으로 완전히 얼어 붙고 단단하게 나타납니다.
- 화학 연기 후드에 클로로포름과 관련된 단계를 수행합니다. 1mL 유리 주사기 2개를 제거하고 클로로폼의 전체 주사기 볼륨을 각각 3회 폐기하여 잔여 지질을 제거합니다. 두 개의 주사기 부피를 끌어서 각 유리 주사기를 초순수와 평형화한 다음 두 개의 주사기 체적을 끌어서 바인딩 버퍼와 평형을 조정합니다.
- 제조업체의 권장 사항에 따라 미니 압출기를 조립하십시오. 결합 버퍼에서 각각을 침수하여 200 nm 멤브레인 1개와 필터 지지대 2개(재료 표참조)를 평형화합니다.
- 필터 지지대 사이에 멤브레인을 끼쳐 미니 압출기에 놓습니다. 조립된 미니 압출기에서 죽은 부피를 줄이고 어셈블리가 기밀인지 확인하기 위해 1 mL 유리 주사기를 사용하여 미니 압출기를 통해 리포솜 혼합물의 부피에 필적하는 결합 버퍼의 부피를 전달합니다.
- 1 mL 유리 주사기 중 하나를 사용하고 리포솜 혼합물을 그립니다. 미세원심지 튜브를 반전하여 유리 주사기로 끌어들이기 위한 튜브 캡에 리포좀 혼합물의 마지막을 수집한다.
- 200 nm 멤브레인을 19-21회 통과하여 리포솜을 돌출하였다. 새로운 미세 원심 분리튜브에서 압출 된 리포솜을 수집합니다.
참고: 압출 된 리포솜은 압출 전에 리포좀보다 덜 흐려나타납니다. 리포솜은 같은 날 사용하고 얼음에 저장해야합니다. 마지막 압출은 시작된 것과 반대되는 주사기에 리포좀을 놓아야 합니다.
4. SNX-BAR 리포솜 결합 및 튜브
- 리포솜 결합 및 침전 실험을 수행하기 전에 4°C에서 20분 동안 초원심분리기에서 100,000 x g에서 정제된 단백질을 미리 정제하였다. 상급체를 제거하고 새로운 미세 원심 분리튜브로 옮기십시오. 펠릿이 있는 경우 방해하지 마십시오.
- 리포솜 결합 및 관화 검사를 수행하기 위해, 총 반응 량 20 μL에서 4 μM 정제 된 Snx4-Atg20 및 2.5 mM 리포솜을 배양하고, 리포솜첨가의 부피를 변화시켰다.
참고: 동일한 실험에서 동일한 양의 리포솜을 사용해야합니다. - 30°C에서 30분 동안 배양한다.
참고: 우리는 침전 동안 시각화를 허용하기 위해 10 μL 리포솜 이상을 사용하여 각 반응에 추가 된 2.5 mM 리포좀의 양을 최대화하는 것이 좋습니다. 2.5 mM 리포솜의 10 μL이 20 μL 반응에서 사용되는 경우, 리포솜의 최종 농도는 1.25 mM이 될 것이다. 정제된 단백질이 희석되고 4 μM 단백질에 더 많은 부피가 요구되는 경우, 지질은 리포좀의 농도를 두 배로 하기 위해 재수화 단계 동안 200 μL에서 재중단될 수 있다(단계 3.6 참조); 그러나, 이것은 리포솜을 만들기 전에 단백질 사격을 알고 있을 것입니다. -
리포솜 튜브를 시각화하고 정량화합니다.
- 전자 현미경 분석을 위해 리포솜 결합 반응을 즉시 처리하십시오. 1% 우라일 아세테이트(도5B)16을사용하여 탄소 코팅 된 구리 메쉬 그리드 및 네거티브 얼룩상에 샘플을 스팟.
- 투과 전자 현미경(200 kV)에서 샘플을 분석합니다.
- 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 튜불 직경을 측정하고 정량화합니다. 단일 튜블의 수구 직경을 정확하게 정량화하려면 튜블의 길이와 평균을 따라 세 가지 직경을 측정합니다(그림5B).
참고: 분산의 양방향 분석은 통계적 유의성을 결정하기 위해사용되었다(도 5E). 우라벨 아세테이트는 방사성 독성이 있습니다. 이 단계를 수행하려면 적절한 실험실 안전 인증이 필요합니다.
-
리포솜 결합 및 침전.
- 반응(20 μL, 4.3단계에서)을 폴리카보네이트 원심분리기로 옮기고 호환되는 로터를 사용하여 4°C에서 20분 동안 초원심분리기에서 100,000 x g으로 회전합니다. 조심스럽게 상한을 제거하고 새로운 미세 원심 분리 튜브로 옮김. 펠릿은 그대로 유지되어야 합니다.
- 샘플 버퍼의 SDS-PAGE 40 μL에서 펠릿을 다시 중단하고 새로운 미세 원심 분리튜브로 옮김. 상급체에 20 μL의 샘플 버퍼를 추가합니다. 10% 폴리아크릴아미드 SDS-PAGE 겔에 펠렛 및 상층체에 상응하는 양의 펠릿을 적재하고, 리포솜에 결합된 SNX-BARs를 시각화하기 위해 쿠마시 염색을 수행한다(도5A).
- 펠릿 분획에서 SNX-BAR 복합체의 양을 정량화하기 위해 밀도 측정을 사용하여 밴드 강도를 정량화하고 펠릿 분획에서 SNX-BAR 단백질의 비율을 정량화합니다.
참고: 분산의 양방향 분석은 통계적 유의성을 결정하기 위해사용되었다(도 5C).
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Representative Results
이 프로토콜은 다운스트림 멤브레인 리모델링 분석에 사용될 수 있는 내인성 효모 SNX-BAR 복합체의 재현 가능하고 견고한 생산을 위한 방법을설명한다(도 1). 정제에 사용되는 효모 균주의 구성은 신생 효모에서 상동 재조합의 효율을 활용하여 표적 SNX-BARs의 게놈 성소에서 변형을 허용합니다(그림 2). 이러한 설계는 두 가지 장점을 가지며, (i) 변형을 유지하기 위해 선택이 필요하지 않기 때문에, 표준 YP 배지가 사용될 수 있고, 더 높은 세포 밀도로 성장을 허용하고 따라서 단백질의 더 높은 생산및 (ii) 표적 SNX-BARs의 발현 수준이 균등하게 될 것이며, 이종 복합체의 생산을 최적화할 것이다. 갈락토스를 첨가하기 전에, 표적 SNX-BARs는 널 표현형을 나타내며, 따라서 표적 SNX-BARs에 특이적인 성장 결함 또는 기타 알려진 결함을 초래할 수 있다. 또한, 2% 라피노스와 0.1%의 포도당 성장은 2% 포도당의 성장보다 느리다. 따라서, 갈락토스 유도 이전의 성장 기간은 각 특정 균주에 대한 최적화를 요구할 수 있다. SNX-BAR 발현의 적절한 유도를 확인하기 위해, SNX-BARs의 단백질 수준이 쿠마시 얼룩을 통해 검출되지 않을 수 있기 때문에 TAP 태그에 대한 웨스턴 블롯이 필요할 가능성이있다(그림 3). 그러나, SNX-BAR 복합체의 단 하나의 부재만이 태그를 가지고 있기 때문에, 정제의 모든 단계가 완료되지 않는 한 태그가 지정되지 않은 단백질의 발현을 확인할 수 없다. SNX-BAR 헤테로디머의 정제 후, 두 SNX-BARs의 밴드는 1:1 스토키오메트릭 비율로 나타나야 하며 오염 대역이 거의 또는 전혀 없어야합니다(도 4,레인 4). 추가적인 오염 밴드가 있고, 시작 효모 균주가 이미 프로테아제 결핍인 경우, 세포 용해 동안 더 많은 프로테아제 억제제가 첨가될 수 있다. 더욱이, 칼모둘린 수지를 이용한 제2 정제 단계가 수행될 수 있다.
막 리모델링 실험을 수행 할 때(그림 5),리포좀 및 정제 된 단백질의 동일한 준비는 동일한 실험에서 사용되어야한다. 단백질의 다중 정제 제제가 원하는 농도에 도달하기 위해 필요한 경우, 실험을 수행하기 전에 정제된 모든 단백질을 결합한다. 리포솜은당일(표 1)에만들어서 사용해야 한다. 리포솜 침전 실험을 실시할 때, 침전된 단백질이 침전된 단백질로 인큐베이션하기 직전에 20분 동안 100,000 x g의 동일한 침전 조건을 사용하여 정제된 단백질이 미리 제거되는 것이 중요합니다. 또한, 리포솜 펠릿은 침전 후 그대로 유지되어야합니다.
그림 1: SNX-BAR 바인딩 분석 순서도. 간단히, 단계 1-2에서, 우리는 두 개의 SNX-BAR 게놈 로시로 GAL 프로모터를 엔지니어링하고, 각각의 내인성 프로모터를 대체하고 C-터미널 TAP 태그를 두 개의 SNX-BAR 로시 중 하나로 엔지니어링합니다. 다음으로, 3-7단계에서, 우리는 갈락토오스로 세포를 유도하고 SNX-BAR 헤테로디머를 균질성으로 정제한다. 8-12 단계에서, 우리는 계산하고 unilamellar 리포솜을 준비합니다. 마지막으로, 우리는 SNX-BAR 헤테로디머를 unilamellar 리포솜과 결합하고 2개의 애세서를 능력을 발휘할 수 있습니다; 단계 14a-16a는 막 관화를 포함하고 14b-16a는 침전 분석서를 관련시킵니다. 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: SNX-BAR 통합 전략. 2개의 SNX-BAR 로시가 상동 재조합을 사용하여 GAL 발현을 대상으로 했다. SNX-BAR ORF1(Atg20)은 C-단말 TAP 태그를 표현하기 위해 추가로 타겟팅되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 갈락토제 유도 검증. (A-B) Atg20-TAP의 GAL 유도를 확인하기 위해 2% 갈락토제(A, B, 레인 2) 및 유도되지 않은 세포 추출물의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 권장합니다(A, B, 레인 1). (C)웨스턴 블롯 멤브레인도 박리되고 로딩 제어를 위해 안티 pgk1로 프로브됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: Atg20-Snx4 헤테로디머의 예시 정제. 갈락토오스 프로모터에 의해 구동되는 Atg20-TAP 및 Snx4를 발현하도록 설계된 효모 세포는 2% 갈락토오스로 유도되었고, IgG 세파로스를 사용하여 용해되고, TEV 프로테아제로 용출하였다. 정제의 각 단계에서 샘플은 10% SDS-PAGE에 도시된다. 레인 1: 유도된 포세이트 의 상급체. 레인 2: 유도된 포탄을 리세이트. 레인 3: IgG 세파로즈에 결합된 단백질의 샘플. 레인 4: IgG 세파로스의 순수 Atg20-Snx4 헤테로디머의 TEV 용루. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 대표적인 리포솜 결합 및 관배 분석. (A)SNX-BAR 헤테로디머, Atg20-Snx4 및 Vps5-Vps17효모로부터, 텍스트에 기재된 바와 같이 합성 리포좀에 발현, 정제 및 결합하였다. Mvp1은 호모디머를 형성하고 박테리아로 발현되었다는 점에 유의하십시오. (B)Snx4-Atg20 리포솜 관 분석 및 튜울 측정(inset)의 EM 현미경 그래프. (C)다양한 리포솜 조성물에 결합하는 SNX-BAR를 고밀도 측정에 의해 정량화하였다. 그래프는 평균의 평균 및 표준 오차를 나타냅니다. ** p < 0.002. (D) 튜불 직경을 정량화하고 본문에 설명된 바와 같이 그래프로 하였다. 배율 막대 = 200 nm. 오차 막대는 분산의 양방향 분석을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 전형적인 리포솜 조성물 | 도PC | 도프 스 | 에르고스테롤 | PI3P-C16 |
| Mw | 786.1 | 810.0 | 396.7 | 957.0 |
| 몰 분수 | 49% | 30% | 20% | 1% |
| 스톡 mM | 32.0 | 12.0 | 25.0 | 1.0 |
| 질량 (mg) | 385.2 | 243.0 | 79.3 | 9.6 |
| 농도(mg/mL) | 25.2 | 9.7 | 9.9 | 1.0 |
| RXN(mL)으로의 볼륨 | 15.3 | 25.0 | 8.0 | 10.0 |
표 1: 리포솜 레시피. 합성 리포솜은 DOPC, DOPS, 에르고스테롤 및 PI3P의 조합을 사용하여 제조하였다. 우리는 지질의 1 몰에 최종 농도를 계산합니다. 당사의 표준 조성물에는 20% 에르고스테롤, 1% PI3P, DOPS(최대 30%) 및 다양한 양의 DOPC가 포함됩니다. 표는 30% DOPS의 400 μL에 대한 전형적인 제형을 포함한다.
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Discussion
여기에서는 효모와 2개의 분석에 SNX-BAR 이분무를 정화하여 합성 리포좀에 대한 생물물리학적 특성을 평가하기 위한 최적화된 워크플로우를 시연합니다. 대장균 또는 다른 시스템에서 일반적인 재조합 단백질 발현에 비해 주요 장점은 기본 숙주에서 SNX-BAR 단백질을 고르게 발현할 수 있는 능력으로, 다른 시스템에서 SNX-BARs를 정화할 때 발견되는 독성 및 불용성 문제를 피할 수 있다는 것입니다. 또한 우리의 시스템은 분자 복제 또는 다중 발현벡터(17)의항만을 필요로 하지 않는다는 것을 주목할 만하다. 당사의 이중 SNX-BAR 효모 균주는 염색체적으로 설계된 갈락토제 프로모터에 의해 구동되므로 유도 시에도 균일한 발현을 보장합니다. 중요한 고려 사항은 갈락토스가 없는 경우 표적 SNX-BARs의 발현이 거의 또는 전혀 없을 것이고, 따라서 null 표현형을 초래한다는 것이다. 또한 SNX-BARs는 C-터미널 태그를 잘 허용하는 경향이 있으므로 C-종점에서 TAP 태그를 추가할 수 있습니다. 그러나, 태그되는 단백질에 따라, N-말단 TAP 태그도12를사용할 수 있다. 또한 SNX-BARs는 1:1 디머만 형성하기 때문에 정제목적으로 하나의 단백질만 태그가 지정되어야 합니다. 그러나, 세포에서 일반적으로 이종화를 형성하는 일부 SNX-BARs는 비 생리학적 농도7하에서 호모디머를 형성하는 것으로 나타났다. 따라서, 이종odimer의 정제시, 두 SNX-BARs의 stoichiometric 비율은 SDS-PAGE 젤에 정제 된 복합체의 aliquot를 실행하고 Coomassie 염색을 수행하여 검증 할 수있는 1 : 1이어야한다. 일단 설계되면, 이러한 효모 균주는 -80 °C에서 15 % (v / v) 글리세롤 스톡으로 영구적으로 저장되거나 추가 바인딩 파트너를 쿼리하기 위해 추가로 수정 될 수 있습니다. 우리의 워크플로우는 일반적으로 균주 건설을 위한 2-3 주 및 표현과 정화를 위한 3-4 일 및 리포솜 결합 계산을 위한 1 일 걸립니다. 우리는 이 워크플로우가 합성 리포좀 또는 거대한 unilamellar 소포 (GUV)에 네이티브 BAR 단백질을 사용하여 SNX-BAR 단백질의 지질 특이성을 더 이해하고 막 리모델링을 유도하는 데 필요한 지질의 정확한 메이크업을 밝히는 데 도움이 될 수 있다고 믿습니다.
중요한 단계
비 프로테아제 결핍 세포에서 SNX-BAR 헤테로디머를 정화하는 첫 번째 시도 에서, 우리는 종종 감소 된 수율과 분해 제품을 발견했습니다. 따라서, 변형 구조의 초기 단계 동안, 우리는 주요 vacuolar 단백질 아제 중 하나 이상에 대한 결핍 부모 효모 균주로 시작하는 것이 중요하다고 생각합니다. 특히, 우리는 펩4, prb1및 prc1에대한 고갈된 효모 균주 TVY614가 가장 최적이라는 것을 발견했습니다. TVY614 균주를 사용하여, 우리는 정기적으로 얻을 >90% 순수 Snx4-Atg20 이종(그림 4 및 그림 5A). 그러나, 3개의 단백질아제 모두에 대한 필요성은 SNX-BAR 조합 특이적일 수 있다. 예를 들어, Vps5-Vps17 이종은 비 프로테아제 결핍 균주10에서 성공적으로 정제되었으며 PEP4 절제의 첨가를 포함했을 때, 우리는 수율과 순도의 겸손한 증가를 관찰합니다(그림 5A). 따라서 사용자의 다운스트림 어플리케이션과 순도 또는 선택 가능한 마커의 필요성에 따라 발현 균주를 설계할 때 유연성이 있을 수 있습니다.
유전자 생성순서도 중요하다. 갈라토스 유도없이 서쪽 얼룩에 의한 발현을 확인하기 위해 먼저 C-말단 TAP Tagging SNX-BAR ORF 1을 권장합니다(그림1). 갈락토오스 유도 도중, 2% raffinose 및 0.1% 포도당에서 밤새 세포를 미리 조건화하는 것이 중요합니다. 세포를 미리 조절하지 못하면 매우 느린 성장 또는 세포 사멸이 발생합니다. 그러나, 그것은 또한 하룻밤 성장 하는 동안 나머지 포도 당을 고갈 하는 세포에 대 한 중요 한, 그렇지 않으면 galactose 유도 부정적인 영향을 받을 수 있습니다. 또한 TAP 태그가 지정된 SNX-BAR 단백질의 발현 균질성을 평가하기 위해 웨스턴 블롯에 의한 다중 분리물을 확인하는 것이 좋습니다. 우리는 일반적으로 2-3 격리를 화면과 가장 강력하게 표현 후보를 선택합니다.
수정, 대체 접근 방식 및 향후 응용 프로그램
단계 2.8에서, 탠덤 친화도 정제(TAP)는 전형적으로 TEV절단(12)후에 IgG 및 칼모둘린 비드를 이용한 2단계 친화도 정제를 필요로 한다. 그러나, 이 프로토콜에서는, 우리는 매우 높은 수율과 순도와 TEV 프로테아제에 의해 SNX-BAR 이분미를 용출. 우리는 calmodulin 비드를 사용하여 후속 친화도 정제가 일관성과 감소 된 수율을 생성 찾을 수, 따라서 우리는 TEV 분열 후 중지하는 것이 좋습니다. SNX-BAR 단백질 및 His(6)태그된 TEV 프로테아제를 함유하는 TEV 용출액은 Ni-NTA 아가로즈 비드에 의해 더욱 정제될 수 있다. 그러나, 우리는 또한 이 단계는 전반적인 SNX-BAR 단백질 수율을 감소시킬 수 있고, TEV protease가 리포솜 결합 또는 관 배관 검정을 방해하지 않기 때문에 불필요하다는 것을 것을을 발견합니다. 따라서 정제된 SNX-BAR이 다른 용도로 사용될 경우, 사용자는 TEV 프로테아제의 영향을 평가할 것을 권장합니다.
지금까지, 우리는 효모에 Snx4-Atg20 및 Vps5-Vps17 이종화를 정화하기 위하여 이 프로토콜 그리고 기술된 수정을 성공적으로 사용하고 합성 리포좀에 그들의 지질 특이성을 성공적으로 평가했습니다. 그러나, 우리는 프로토콜이 효모에 있는 SNX-BARs의 어느 것이라도에 성공적으로 적응될 수 있다고 믿습니다. 또한 이 시스템을 사용하여 임의의 다른 유기체로부터 재조합 SNX-BAR 단백질을 생산할 수 있다. 그러나, 이것은 효모 게놈으로 외인성 유전자 궤적을 통합하기 위하여 긴장 건축의 추가 단계를 요구할 것입니다. 우리는 또한 화물 단백질을 포함하여 다중 복합체를 정화하기 위하여 시스템이 확장될 수 있다는 것을 믿습니다. 따라서, 우리는 우리의 발현 시스템이 SNX-BARs의 지질 지정을 이해하는 것 이상으로 확장될 수 있다고 믿습니다. 미래의 응용 프로그램을 통해 연구원은 리포솜의 전체 화물 포획 단지를 재구성하여 전체 어셈블리가 멤브레인 리모델링에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 이해할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 간행물에 보고 된 연구는 수상 번호 GM060221에서 건강의 국립 연구소의 국립 연구소에 의해 지원 되었다 그리고 부분적으로 국립 연구소의 일반 의학의 국립 연구소에 의해 수상 번호 T32GM007223에서 건강의. R.C.는 UNC-샬롯 교수 연구 보조금 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm PC Membranes | Avanti | 610006 | |
| 10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) | Bio-Rad | 731-1550 | |
| 27 G needle | BD Biosciences | 301629 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff | Amicon | UFC501024 | |
| Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer | Avestin | EF-C3 | |
| BCA assay | Pierce | 23225 | |
| Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DOPC | Avanti | 850375 | |
| DOPS | Avanti | 840035 | |
| Ergosterol (Sigma) | Sigma | 47130-U | |
| Extruder Set with Block 0.2 μL/1 mL | Avanti | 610000 | |
| FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV) | |||
| Glass culture tubes | VWR | 47729-570 | |
| IgG sepharose beads (GE Healthcare) | GE Healthcare | 17-0969-01 | |
| Microlter glass syringes | Hamilton | 7637-01 | |
| New Brunswick Excella E25 | Eppendorf | M1353-0000 | or equivalent shaking 30 °C |
| Ni-NTA Magnetic Agarose Beads | Pierce | 78605 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| PI3P | Echelon | P-3016 | or Echelon equivalent |
| Polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter | 355622 | |
| TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Type 45 Ti Rotor | Beckman Coulter | ||
| Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve | VWR | 75871-436 | |
| Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) | A&J Vacuum | PN07050 | |
| Vortex with foam holder | VWR | 10153-838 | |
| VWR KIT MICROTUBE | VWR | 12620-880 |
References
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