Summary
تعقيدات الانسجه من أنظمه متعددة الخلايا العثور علي تحديد العلاقة السببية بين العظة خارج الخلية والسلوكيات الخلوية الفردية. هنا ، نقدم طريقه لدراسة الصلة المباشرة بين الإشارات التي تعتمد علي الاتصال ومحاور القسمة باستخدام الكريات البدائية الجنينية c. والخرز البوليسترين لاصقه.
Abstract
في النظم متعددة الخلايا ، وتحيط الخلية الفردية من العظة الفيزيائية والكيميائية المختلفة القادمة من الخلايا المجاورة والبيئة. وهذا التعقيد النسيجي يخلط بين تحديد العلاقة السببية بين العظة الخارجة والديناميكيات الخلوية. ويتغلب النظام المتعدد الخلايا المعاد تشكيله بشكل صناعي علي هذه المشكلة من خلال تمكين الباحثين من اختبار جديلة معينه مع القضاء علي الآخرين. هنا ، نقدم طريقه لأعاده تشكيل أنماط الاتصال الخلية مع معزولة Caenorhabditis البدائية والخرز البوليسترين لاصقه. وتشمل الإجراءات أزاله قشر البيض ، وعزل الخلايا البدائية عن طريق تعطيل التصاق خليه الخلية ، واعداد الخرز البوليسترين لاصقه ، وأعاده تشكيل خليه خليه أو خليه حبه الاتصال. وأخيرا ، نقدم تطبيق هذه الطريقة للتحقيق في اتجاه محاور الانقسام الخلوية التي تساهم في تنظيم الزخرفة الخلوية المكانية ومواصفات مصير الخلية في تطوير الاجنه. تمكن هذه الطريقة القوية والقابلة للتكرار ومتعددة الاستعمالات في المختبر من دراسة العلاقات المباشرة بين أنماط الاتصال بالخلايا المكانية والاستجابات الخلوية.
Introduction
خلال التنمية متعددة الخلايا ، يتم تحديد السلوكيات الخلوية (علي سبيل المثال ، محور القسمة) للخلايا الفردية بواسطة الإشارات الكيميائية والفيزيائية المختلفة. لفهم كيفيه الخلية الفردية يفسر هذه المعلومات ، وكيف انها تنظم التجمع متعدد الخلايا كخاصيه الناشئة هي واحده من الأهداف النهائية للدراسات التكوين. وقد ساهم الكائن النموذجي c. اليجانسيس بشكل كبير في فهم التنظيم علي مستوي الخلوية من تخلق مثل قطبيه الخلية1، الخلية تقسيم زخرفه1، الخلية مصير القرار2، واللوائح علي نطاق الانسجه مثل الأسلاك العصبية3 والعضوي4،5. علي الرغم من وجود العديد من الاداات الجينية المتاحة ، فان أساليب هندسه الانسجه محدوده.
طريقه هندسه الانسجه الأكثر نجاحا في الدراسة c. اليجايليس هو العزلة الكلاسيكية البدائية6; كما ج. وتحيط الاجنه الجنينية بقشره البيض وحاجز نفاذيه7، وأزالها هي واحده من الإجراءات الرئيسية لهذا الأسلوب. في حين ان هذه الطريقة العزلة الاريميه تمكن من أعاده الاتصال خليه خليه بطريقه مبسطه ، فانه لا يسمح للقضاء علي العظة غير المرغوب فيها ؛ الاتصال الخلية لا تزال تشكل كلا الميكانيكية (علي سبيل المثال ، التصاق) والعظة الكيميائية ، مما يحد من قدرتنا علي تحليل كامل للعلاقة السببية بين السلوك جديلة والخلوية.
تستخدم الطريقة المعروضة في هذه الورقة حبات البوليسترين المعدلة الكربوكسيل التي يمكن ان ترتبط بشكل خاص بأي جزيئات الأمين-التفاعلية بما في ذلك البروتينات كما ligands. علي وجه الخصوص ، استخدمنا شكل أمين التفاعلية من رومامين الأحمر-X باعتبارها يجند لجعل الخرز علي حد سواء بصريا تتبعها ولاصق إلى الخلية. وتقترن مجموعات الكربوكسيل من السطح حبه ومجموعات أمين الاوليه من الجزيئات القابلة للذوبان في الماء كربوديوميد 1-ايثيل-3-(ديميثيلامينوبروبيل) كربوديوميد (edac)8،9. الحصول علي حبات لاصقه تسمح للآثار من جديلة الميكانيكية علي ديناميات الخلوية10. لقد استخدمنا هذه التقنية لتحديد الإشارات الميكانيكية المطلوبة لتوجيه انقسام الخلية10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. اعداد حبه البوليسترين لاصقه
ملاحظه: هذا البروتوكول لا يتطلب تقنيه العقيم.
- تزن 10 ملغ من الخرز البوليسترين المعدلة الكربوكسيل في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 mL.
- لغسل الخرز ، أضافه 1 مل من 2-(ن-مورفينو) حمض اثانيسولفونيك (MES) العازلة في الأنبوب. منذ MES العازلة لا تحتوي علي الفوسفات والخلات ، والتي يمكن ان تقلل من تفاعل كربوديوميد ، وهي مناسبه للاستخدام في تفاعل البروتين اقتران. دوامه الأنبوب لخلط الخرز.
- تدور الانبوبه ل 60 s في 2,000 x g عبر أجهزه الطرد المركزي بينتوب.
- تجاهل ماده طافي عن طريق الأنابيب بعناية خارج المخزن المؤقت.
- غسل الخرز مره أخرى مع 1 مل من المخزن المؤقت MES عن طريق الخطوات التالية 1.2-1.4.
- أضافه 1 مل من العازلة MES التي تحتوي علي 10 ملغ من EDAC في أنبوب لتنشيط مجموعات الكربوكسيل السطحية. دوامه الأنبوب لخلط الخرز.
- تدوير واحتضان الأنبوب لمده 15 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
- تدور الخرز ل60 s في 2,000 x g.
- تجاهل ماده طافي عن طريق الأنابيب بعناية خارج المخزن المؤقت.
- لغسل الخرز ، أضافه 1 مل من الفوسفات المالحة المخزنة مؤقتا (تلفزيوني) في الأنبوب. دوامه الأنبوب لخلط الخرز.
- تدور أسفل الأنبوب ل 60 s في 2,000 x g.
- تجاهل ماده طافي عن طريق الأنابيب بعناية خارج المخزن المؤقت.
- غسل الخرز مره أخرى مع 1 مل من تلفزيوني باتباع الخطوات 1.10-1.12.
- التركيز النهائي من روناميني المستخدمة سوف تعتمد علي سلاله يجري imaged. اعداد 1 مل من 1-، 10-، 100-، و 1000 اضعاف سلسله التخفيف من رونامامين الأحمر-X من الحل الأسهم الأحمر-X 0.65 مم.
- ماصه 20 μL من الخرز في كل أنبوب التخفيف التسلسلي.
- تدوير واحتضان أنبوب لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة.
- غسل الخرز مرتين مع 1 مل من تلفزيوني عن طريق تكرار الخطوات 1.10-1.12.
- أضافه 1 مل من تلفزيوني في الأنبوب وتخزينه في 4 درجه مئوية لمده تصل إلى 6 أسابيع. تحقق من كثافة مضان من الخرز تحت المجهر المستخدمة للتصوير الحي. يعتمد التركيز المناسب لأستر رونامامين ريد-اكس X علي ظروف التصوير (الشكل 1).
ملاحظه: الخرز دون العلاج الأحمر رونامامين لا تلتزم الخلية. [روممين] [رد-اكس] يخدم كعلامة مضان [اس ول س] جزيء لاصقه. التفاعل الكهربائي ساكنه بين المشحونة إيجابيا الأحمر-X وغشاء البلازما مشحونة سلبا هو السبب المفترض للتصاق.
2. جمعيه ماصه الفم
- قطع واسعه (6.35 مم القطر الداخلي) وضيقه (3.175 مم الداخلية) أنابيب Tygon إلى حوالي 25 سم و 40 سم في الطول ، علي التوالي (الشكل 2).
- توصيل أنابيب Tygon مع تترافلوروايثيلين (PTFE) فلتر (0.2 μm حجم المسام) (الشكل 2).
- تفكيك أنبوب الشفط المتاحة تجاريا ونعلق صاحب الشعرية واللسان إلى نهاية أنابيب Tygon الضيقة وواسعة ، علي التوالي (الشكل 2).
ملاحظه: تم استخدام فلتر PTFE لمنع استنشاق أبخره محلول الكلوريد عن طريق ماصه الفم.
3-عزل الاجنه الجنينية
ملاحظه: ارتداء القفازات ومعطف المختبر لتجنب قطع والاتصال مع محلول التبييض.
- عقد كل طرف من الشعيرات الدقيقة (القدرة ؛ 10 μL) مع اليد اليمني واليسرى.
- سحب ميكروشعري نحو طرفي لتطبيق التوتر وجلب مركز الشعرية علي الموقد لجعل اثنين من الشعيرات الدمويةسحبتباليد (الشكل 3ا).
- تقليم نصائح الشعيرات الدموية سحبت باليد مع ملقط تحت تشريح المجهر ونعلق الشعرية سحبت في جهاز الفم الأنابيب (الشكل 2). اعداد نوعين من الماصات. وينبغي ان تكون احجام فتح الأطراف للماصات حوالي 2x و 1x طول المحور القصير لأجنه c. ايليتس (30 ميكرومتر) لنقل الاجنه وأزاله قشر البيض ، علي التوالي الشكل 3ب-د).
- ماصه 45 μL من محلول ملح البيض علي بئر من شريحة مولتيبئر (الشكل 4ا؛ أسفل).
- مكان 5-10 الكبار c. اليجاليس علي محلول الملح البيض التي تحتوي عليها جيدا.
- للحصول علي الاجنه المبكرة c. اليجانز , قطع البالغين إلى قطع عن طريق وضع اثنين من الابر إلى اليمين واليسار من الجسم c. اليجانز وانزلاق الابر الماضية بعضها البعض (الشكل 4ا; المخططات العليا).
- ماصه 45 μL من محلول هيبوكلوال علي بئر بجوار الحل الذي يحتوي علي ملح البيض جيدا (الشكل 4ب).
- ماصه 45 μL من وسط النمو شيلتون علي الآبار الثلاثة اللاحقة بجانب محلول الاحتواء علي البئر الذي يحتوي عليالشكل 4(ب).
- انقل المرحلة الاولي من الخلايا والاجنه المرحلة المبكرة ذات الخليتين إلى محلول الكلوريد بالفم بواسطة الأنابيب الشعرية المرسومة يدويا لنقل الاجنه (الشكل 4ب).
- انتظر 40 – 55 ثانيه.
- اغسل الاجنه عن طريق نقل الاجنه من محلول كلوكلوال إلى متوسط نمو شيلتون عن طريق الفم مع الشعرية المرسومة باليد لنقل الاجنه (الشكل 4ب).
- اغسل الاجنه مره أخرى عن طريق نقل الاجنه إلى بئر جديد من متوسط نمو شيلتون عن طريق الفم والأنابيب مع الشعرية المرسومة باليد لنقل الاجنه (الشكل 4ب).
- انقل الاجنه المغسولة إلى بئر جديد لمتوسط نمو شيلتون عن طريق الفم مع الشعيرات الشعرية المرسومة يدويا لنقل الاجنه. باستخدام الشعرية المرسومة باليد لأزاله قشر البيض ، كرر بعناية الأنابيب (الشكل 4ج؛ المخططات الوسطي). إذا تمت أزاله قشر البيض بنجاح ، فان الخلايا الجنينية تصبح أكثر كرويه (الشكل 4ج؛ يمين).
- افصل الخلايا البدائية الجنينية المرحلة ذات الخليتين عن طريق الوضع برفق وباستمرار مع الشعرية المرسومة يدويا لأزاله قشر البيض (الشكل 4د).
4. أعاده تشكيل أنماط الاتصال مع الكيسة وحبه
ملاحظه: العمل تحت مجهر التصوير لتجنب تفكك خليه من حبه وتسهيل الحصول علي الصورة في الوقت المناسب.
- لمراقبه استخدام المجهر المقلوب ، واعداد غرفه التصوير كما في الشكل 5.
- وضع الشفة علي حامل كوفيرسليب (الشكل 5ا).
- الشريط حواف المشبك لتحقيق الاستقرار فيه. الجانب مع الشريط هو "الجانب الخلفي" (الشكل 5ا ، ب).
- الوجه حامل كوفيرسليب إلى الجانب ' الجبهة ' ورسم دائره علي كوفيرسليب مع القلم مسعور (الشكل 5ج).
ملاحظه: يعمل اي طبق من الزجاج السفلي أيضا ، شريطه ان تكون الاجنه متلاعبة بواسطة ماصه الفم.
- أضافه وسط النمو شيلتون في الدائرة التي رسمها علامة مسعور (الشكل 5د).
- انقل الطبقة البدائية المعزولة إلى غرفه التصوير.
- الاستغناء عن حجم صغير من الخرز وظيفية كيميائيا باستخدام الشعرية مرسومه باليد لنقل الاجنه.
- السيطرة علي موقف من الخرز البوليسترين بالنفخ في الشعرية مرسومه باليد حتى حبه يعلق علي البدائية المعزولة.
- جبل الشفة لتجنب تبخر المتوسطة (الشكل 5ه). أداء التصوير الحي.
5. اعداد الكواشف الهامه
- الحل ملح البيض (10 مل): الجمع بين 235 μL من 5 م كلوريد الصوديوم و 240 μL من 2 م KCl مع 9525 μL من dH2O.
- الحل كلوكلوال (10 مل): الجمع بين 7.5 مل من Clorox (التي تحتوي علي ما يقرب من 7.5 ٪ من الصوديوم) مع 2.5 مل من هيدروكسيد الصوديوم 10 N (التركيز النهائي لل الكلوريكلوديوم هو تقريبا 5.625 ٪).
ملاحظه: علي الرغم من ان العديد من الأساليب المنشورة قد استخدمت chitinase لهضم قشور البيض الزيتية ، ونحن قد اعتمدت طريقه استخدام الحل هيبوكلواس11. من خلال تجنب الاختلافات دفعه إلى دفعه من الانشطه chitinase ، ونحن نعتقد ان هذا الأسلوب هو أكثر استنساخا ونهج فعاله من حيث التكلفة. - 0.81 الحل انولين مم (40 مل)
- أضافه 0.2 غرام من انولين إلى 40 مل من dH2س.
- الاوتوكلاف لأذابه.
ملاحظه: يحتفظ لمده 1 شهر في 4 درجه مئوية.
- 0.5 M MES العازلة (500 mL)
- تذوب 48.81 غرام من MES في 400 مل من الماء المقطر (dH2س).
- ضبط درجه الحموضة إلى 6.0.
- جلب الحجم الإجمالي إلى 500 مل مع dH2س.
- حلول تلفزيونيه (1 لتر)
- لجعل 10 اضعاف الحل برنامج تلفزيوني ، وحل 1 حزمه من البودرة بريميكس البرامج التلفزيونية في 1 لتر من dH2س.
- الجمع بين 100 مل من 10 اضعاف حل تلفزيوني مع 900 mL من dH2س.
- 5% بوليفينيلبيروليتم (PVP) محلول (4 مل)
- في ظل ظروف معقمه ، ذوب 0.2 غرام من PVP في 4 مل من المتوسطة دروفيا شنايدر.
ملاحظه: دائما فتح الأسهم المتوسطة شنايدر في النسيج الثقافة (TC) هود. يحفظ لمده 1 شهر عند 4 درجه مئوية.
- في ظل ظروف معقمه ، ذوب 0.2 غرام من PVP في 4 مل من المتوسطة دروفيا شنايدر.
- 0.65 mM الحل الأسهم الأحمر-X رونامين (2 مل)
- تزن 1 ملغ من رونامامين الأحمر-X.
- أضافه 2 مل من ثنائي ميثيل سولفوكسيد (DMSO) لأذابه.
- Aliquot ومخزن في-20 درجه مئوية.
- المتوسطة النمو شيلتون (SGM) (10.25 mL)
- تحت ظروف معقمه ، الجمع بين 8 مل من دروفيا شنايدر المتوسطة ، 1 مل من محلول PVP ، 1 مل من محلول انولين ، 1 مل من النسر المتوسط القاعدي (BME) الفيتامينات ، 50 μL من البنسلين ، ستربتوميسين ، و 100 μL من الدهون التركيز معا.
- Aliquot 325 μL من SGM إلى 1.5 mL ميكروانابيب.
ملاحظه: الاحتفاظ لمده 1 شهر في 4 درجه مئوية. - في يوم العزلة البدائية ، أضف 175 μL من مصل الأبقار الجنينية إلى SGM (للحجم الإجمالي 500 μL).
ملاحظه: تخزين في-20 درجه مئوية وذوبان قبل الاستخدام. ولا يلزم ان تكون الحرارة قد قتلت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لاعداد الخرز ، ونحن تحديد المبلغ الأمثل من روامين الأحمر-X استر الناجحة لسلاله المحورة وراثيا التعبير عن GFP-ميوسين الثانية و mCherry-histone (الشكل 1ا-د). استخدمنا mcherry الموسومة هيستون كعلامة علي تطور دوره الخلية. لان كلا من رونامين الأحمر-x و mcherry ستكون مضيئه بواسطة ليزر 561 nm ، والكثافة المثلي للاشاره الأحمر-x رونامين مماثله لتلك التي هيستون للسماح التصوير في وقت واحد من الخلية وحبه. علي سبيل المثال ، اشاره مضان من حبه تعامل مع 0.005 ميكروغرام/مل رونامامين الأحمر-X استر الناجحة ضعيفه جدا لتصور حبه (الشكل 1ا). من ناحية أخرى ، كانت اشاره مضان من الخرز تعامل مع 5 ميكروغرام/مل رونامامين الأحمر-X استر الناجحة قويه جدا للصورة mCherry-histone (الشكل 1د). قررنا ان 0.5 ميكروغرام/مل رونامامين الأحمر-X استر النجاح هو الأمثل لهذه السلالة الوراثية خاصه (الشكل 1ج).
وأجريت عزله الورم الارومي وفقا للإجراءات المبينة في الشكل 4. وينبغي معالجه النقاط التالية للتجارب الناجحة. 1) الاعلام في البئر يتبخر مع مرور الوقت ويصبح لزج. هذا يسبب الاجنه إلى التمسك الشعرية الزجاجية وغيرها من الاجنه ، لذلك جيدا جديده مع وسائل الاعلام الطازجة يحتاج إلى استخدامها. 2) في محلول الكلوريد ، تطفو الاجنه علي السطح. لذلك ، خفض التكبير من المجهر والتركيز علي سطح الحبريه لتخفيف مع نقل الاجنه. 3) قد تختلف فعاليه محلول كلوكلوريد. التالي ، ينبغي اختبار مده الاجنه التي تنفق في محلول هيبوكلوال لكل دفعه جديده من محلول الكلوريد. 4) ضع ماصه الفم علي مقربه من الجنين قدر الإمكان لتقليل القوه المستخدمة لضربه في الماصة ، ولكن أيضا ليست قريبه جدا بحيث يتم امتصاص الجنين حتى كذلك (وهذا صحيح أيضا عند ربط الخرز). 5) بعد أزاله قشر البيض ، تصبح الاجنه حساسة جدا. التالي ، تحتاج القوات التي تمارس علي ماصه الفم إلى خفض طفيف لمنع الاجنه من الانفجار. 6) الاستخدام المطول لماصه الفم قد يضعف فلتر PTFE ، و 7) يجب فصل الاجنه المرحلة 2 خليه فقط عندما تم تشكيل النواة بشكل واضح (الشكل 4ج، المخططات اليسار). بالمقارنة مع الخلايا في الاجنه سليمه (الشكل 4ا؛ الحق) ، والخلايا في الاجنه بدون قشر البيض تبدو مستديرة (الشكل 4ج؛ الحق). بالاضافه إلى ذلك ، بعد العزلة الاروميه ، يصبح شكل الورم الارومي كرويا (الشكل 4د؛ اليمين).
لاختبار اثار جديلة الاتصال المادية التي تعتمد علي التوجه انقسام الخلية ، ونحن تعلق الخرز الأحمر-X المغلفة روامين إلى الخلايا البدائية AB معزولة من مرحله 2 خليه وأداء التصوير الحي (الشكل 6، الشكل 7). لم الحبة دون رونامامين الأحمر-X العلاج لا تلتزم البدائية ، مما يوحي بان رونامامين الأحمر-X بمثابه علامة الفلورية وجزيء لاصق. لتحليل اتجاه انقسام الخلايا ، لدينا 3D أعاده بناء الصورة الفاصلة الزمنيه باستخدام وظيفة "3D المشروع" من ImageJ12 (الشكل 6ا؛ أماله حول محور Y). لتحديد الطائرة التي تحتوي علي المغزل ميتوتيك (الطائرة المغزل) ، حددنا لأول مره طائره حيث تم محاذاة اثنين من سينتسوميس عموديا (الشكل 6ب؛ 110 درجه): الطائرة مع ± 90 ° زاوية من هذه الطائرة هي الطائرة المغزل (الشكل 6ب؛-20 درجه). بعد ذلك ، قمنا بقياس زاوية المغزل (اتجاه المغزل) نسبه إلى واجهه الاتصال الخلية حبه (التوجه الاتصال) بعد سيتوكينسيس (الشكل 6ج). وعندما تعلق كلا الخليتين بالخرزة ، كان الخط الذي يمر بكل من موقعي الاتصال يستخدم كاتجاه للاتصال.
في دراستنا السابقة ، قمنا بتحديد تدفق الميوسين لسطح الخلية المتباينة الخواص خلال الاتجاه الذي يسببه الانقسام الخلوي الناتج عن الحبة AB10. ومع ذلك ، فانه من الصعب قياس تدفق الميوسين داخل الخلايا كما يتحرك الخلية اثناء الانقسام المنحى. لتنفيذ هذا ، أولا قمنا باختيار العينات مع المغزل محاذاة إلى الطائرة التصوير (xy الطائرة) (الشكل 7). وثانيا ، كان من المتوقع ان تستخدم الأكوام Z باستخدام طريقه الإسقاط القصوى (الشكل 7). ثالثا ، تم تصحيح حركات الخلية باستخدام المكدس خوارزميه التسجيل موضع subpixel reg المكونات في13 من imagej مع خيار الجسم جامده (الشكل 7ب). وبتسجيل الصور ، كان موقف الخلية متمهل (الشكل 7ب). وأخيرا ، باستخدام المكونات اليدوية للتتبع من imagej ، تم تتبع بؤر ميوسين (الشكل 7ج). وفقا للمعلومات الاحداثيه ، تم حساب سرعات ميوسين علي طول محور القسمة ، والمحور المتعامد معه ضمن 50 ثانيه بعد ظهور الخلوي.
الشكل 1: تحديد تركيز الروامين الأحمر-X. (الف-دال) تم وضع الاجنه التي تعبر عن GFP-ميوزين (الأخضر) و mCherry-histone (أرجواني) بالقرب من الخرز المربوط بتركيزات مختلفه من الروراامين ريد-اكس (أرجواني). يتم رسم كثافة الاشاره من mCherry و رونامامين الأحمر-X علي طول الخطوط المنقطة البيضاء (الرسوم البيانية أسفل). تم الكشف عن الخرز وإشارات هيستون بوضوح لخرز تعامل مع 0.5 ميكروغرام/مل رونامامين الأحمر-X. أشرطه مقياس تظهر 10 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تجميع ماصه الفم. يتم تجميع ماصه الفم عن طريق ربط ضيقه (1) وواسعة (2) أنابيب Tygon مع فلتر PTFE (3). في نهاية أنبوب Tygon الضيق والواسع ، تم إرفاق حامل الشعرية (4) وقطعه الفم (5) ، علي التوالي. ويمكن ادراج الشعرية الزجاج مرسومه باليد (6) في حامل الشعرية. شريط المقياس هو 50 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: العزلة الاروميه. (ا) سحب اليد من الزجاج الشعرية. (ب) الشعرية الزجاجية المرسومة باليد لنقل الاجنه. (ج) الشعرية الزجاج مرسومه باليد لأزاله قشر البيض. (د) مخططات تبين الحجم المناسب لفتحه شعريه لأزاله قشر البيض. تشير الأسهم إلى الاجنه. أشرطه مقياس تظهر 100 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: سير عمل عزل الطبقة البدائية. (ا) تشريح البالغين c. اليايليس في العازلة الملح البيض للحصول علي الاجنه. تظهر الصور الفوتوغرافية أجنه من مرحلتين و 4 خلايا قبل أزاله قشر البيض. (ب) معالجه وغسل الكلوريد. (ج) تصور الخطط التوقيت المناسب لأزاله قشر البيض. تظهر الصورة جنينا من 4 خلايا بعد أزاله قشر البيض. (د) انفصال الطبقة البدائية. تظهر الصورة جنينا منفصلا من مرحلتين. احجام الأسهم في C و D تشير إلى القوات النسبية المطلوبة اثناء التنضيد. أشرطه مقياس تظهر 50 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: جمعيه غرفه التصوير. (ا) ربط المشبك بحامل الشفة. (ب) صور حامل الشفة. يتم الاشاره إلى حامل coverslip قبل وبعد التجميع علي اليسار واليمين ، علي التوالي. (ج) دائره مرسومه بواسطة قلم مسعور. (د) أضافه متوسط نمو شيلتون وعينه داخل الدائرة. (ه) تركيب مشبك لتجنب التبخر. أشرطه مقياس تظهر 50 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تحليل اتجاه انقسام الخلايا. (ا) رسم تخطيطي للتحليل التوجيهي لتقسيم الخلية. (ب) تحديد مستوي المغزل. تظهر الصور اليسرى مثالا للعينه. تمت استدارة الأفلام الثلاثية الابعاد التي أعيد بناؤها بالتناوب حول المحور Y لتحديد المستوي الذي يتم فيه محاذاة الطبقتين الوسطيين عموديا (الصورة الصحيحة ؛ المخططات العليا اليمني). في هذا المثال ، الطائرة المغزل هو ± 90 ° 110 ° (الصورة الأوسط ؛ المخططات أسفل اليمين). (ج) قياس اتجاه المغزل بالنسبة للاتصال بحبه الخلية. باستخدام الصور من الطائرة المغزل ، تم تحديد اتجاه المغزل بعد سيتوكينسيس استنادا إلى زاوية بين خطوط ربط اثنين سينتسوميس (خطوط البرتقالي منقط في المخططات الصحيحة) والاتصال الخلية (خطوط زرقاء منقطه). عندما كانت كل من الخلايا ابنه تعلق علي الخرز ، والتوجه الاتصال حبه الخلية هو الخط الذي يمر كل من مواقع الاتصال. الأخضر هو ميوسين و سينتبعض ، الأرجواني هو هيستون والخرز. أشرطه المقياس هي 10 μm. الأوقات هي الدقائق والثواني. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تحليل تدفق الميوسين. (ا) رسم تخطيطي لتحليل تدفق الميوسين. (ب) تصحيح اتجاه تقسيم الخلايا. لقياس ديناميات تدفق ميوسين داخل الخلايا ، تم تصحيح دوران الخلية الفاصلة باستخدام المكون المساعد ImageJ المكدس ريج (خيارالجسم جامده ). الصور العلوية والسفلية قبل وبعد معالجه reg المكدس. تظهر معظم الصور الصحيحة رمز اللون الزمني للسلسلة الزمنيه. (ج) تتبع بؤر الميوسين. باستخدام الصور التي تم معالجتها بواسطة reg المكدس ، تم تتبع الحركات البؤر ميوسين الفردية من قبل ImageJ دليل تتبع المساعد. تم تعريف محور القسمة والمحور المتعامد معه علي انه x و y ، علي التوالي (المخططات الصحيحة). تم قياس سرعات تدفق ميوسين في محور x و y (Vx و Vy) وفقا للمعلومات الاحداثيه. أشرطه المقياس هي 10 μm. الأوقات هي الدقائق والثواني. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أعاده تشكيل أنماط الاتصال الخلية المبسطة سوف تسمح للباحثين لاختبار ادوار أنماط الاتصال خليه محدده في جوانب مختلفه من التكوين. لقد استخدمنا هذه التقنية لإظهار ان محور تقسيم الخلية يتم التحكم من قبل الاتصال المادي مع الخرز لاصقه10. كما مواصفات محور الشعبة أمر حاسم للتنمية متعددة الخلايا من خلال المساهمة في تخلق14، قسم الخلايا الجذعية15،16، والتوازن الانسجه15،16، وينبغي ان تكون هذه الطريقة قادره علي إلقاء النور علي اليه جديده من تشكيل الانسجه الحيوانية.
بالاضافه إلى توجيه انقسام الخلية ، هذا الأسلوب لديه امكانيه ان يكون منصة لاختبار العلاقة بين العظة الميكانيكية ومصير الخلية. وذكرت الدراسات السابقة ان الميكانيكية جديلة يتحكم مواصفات مصير الخلية. الخلايا الجذعية البشرية التي تفرق في الخلية العصبية ، الشحمية ، خلايا العضلات الهيكل العظمي ، والعظم عند مثقف في الركيزة مع صلابة مختلفه17. ردا علي تصلب الركيزة ، والمنظمين العابرين نعم-البروتين المرتبطة (ياب) و تاز (المنشط المشترك مع عزر الربط PDZ) سوف translocate إلى نواه ، لتنظيم مواصفات مصير الخلية18. الطريقة المعروضة في هذه الورقة يجب أيضا ان تكون مفيده لاختبار دور العظة الميكانيكية علي مواصفات مصير الخلية ، من خلال الخلية التي تقوم بالخياطة علي المدى الطويل في اتصال مع الخرز لاصقه.
هذا الأسلوب لديه قيود في تلخيص بعض العظة الميكانيكية التي لوحظت في الجسم المجري. في c. اليجان، قذيفة البيض الزيتية وحاجز نفاذيه بمثابه تقييد المادية. علي الرغم من ان أزاله قشر البيض لا يؤثر علي التنمية الطبيعية ، وأزاله كل من قشر البيض وحاجز نفاذيه النتائج في تشكيل نمط غير طبيعي19. في غياب قشره البيض وحاجز نفاذيه ، يصبح شكل الخلية أكثر كرويه ، مما يوحي بان الضغط بين الخلايا والخلية-قشر البيض يلعب دورا حاسما في تشوه الخلية والزخرفة. وفي الواقع ، اقترحت قوات الضغط خليه الخلية لتنظيم التوجه تقسيم الخلية20. دون الحاجة إلى تقييد المادية والضغط المفترض بين الانسجه ، ونحن نتوقع ان هذا الأسلوب أيضا لا يمكن تلخيص في منطقه الاتصال الخلية الجسم الخلوي. كما يعرف منطقه الاتصال الخلية تؤثر علي الشق إشارات21، وهذا القيد يحتاج إلى مزيد من النظر عند بعض الميكانيكية أو الكيميائية جديلة لا يعمل باستخدام هذا الأسلوب في المختبر.
لقد اختبرنا حتى الآن اتجاه انقسام الخلية من AB معزولة ، P1 ، EMS ، P2 ، ABa ، خلايا الجسر الأكاديمي (خلايا تصل إلى 6 مراحل الخلية) في ايدينا10، ولكن يمكن تطبيق الأسلوب علي التنمية في وقت لاحق بقدر الخلية الفردية يمكن ان تكون معزولة. وقد استخدمت دراسة التسلسل خليه واحده الاخيره الهضم pronase من الجسم دوده لعزل الخلية يرقات22. ولذلك ، يمكن للمرء ان يستخدم العلاج بروداز لعزل الخلايا الجنينية مرحله لاحقه وخلايا اليرقات.
في هذه الدراسة ، وأظهرنا مثال التفاعل بين جديلة الميكانيكية والتوجيه شعبه الخلية ، ولكن الاتصالات خليه الخلية هو أيضا بوساطة العظة الكيميائية مثل Wnt23، الشق24، التصاق المستقبلات المقرونة25 وهلم جرا. والاهم من ذلك ، فان طريقه اعداد الخرز المعروضة هنا يمكن للزوجين الخرز مع اي البروتينات ، مما يسمح باعاده تشكيل العظة الكيميائية. وقد استخدمت الدراسات السابقة أيضا حبه سفبرز26 والبروتين-A حبه المغناطيسي27 المغلفة مع بروتين wnt لإثبات العمليات التنموية التي تعتمد علي wnt. ومع ذلك ، هذه الخرز ليست متاحه تجاريا في مختلف الاحجام مقارنه مع الخرز البوليسترين المعدلة الكربوكسيل. التالي ، يمكن للبحوث المستقبلية استخدام الطريقة المعروضة كمنصة لاختبار دور كل من الإشارات الكيميائية والمادية في الأخلاق أكثر انضباطي. معا ، وهذه الطريقة هي مناسبه للباحثين ، الذين يدرسون السلوكيات الخلوية والاستجابات التي تنتج عن أنماط الاتصال الخلية المكانية وترغب في القضاء علي العظة الخلوية الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر جيمس بيس وبروس بورمان علي المشورة وتوفير سلالات c. اليجنز ، دون مورمان ، كوتا ميزوموتو ، ومعهد علوم الحياة مرفق التصوير الاساسيه لتقاسم المعدات والكاشفات ، أوى Hiroyasu ، ليزا فرناندو ، مين جي كيم للحفاظ علي c. اليجنز والقراءة النقدية لمخطوطنا. ويدعم عملنا مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا (NSERC) ، (RGPIN-2019-04442).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | Alfa Aesar | AAA1080703 | For the bead preparation |
| Aspirator Tube Assembly | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation. |
| Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | Strain used in this study |
| Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 | in house | KSG5 | Strain used in this study |
| Calibrated Mircopipets, 10 µL | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation |
| Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) | KISKER Biotech | PPS-30.0COOHP | For the bead preparation |
| CD Lipid Concentrate | Life Technologies | 11905031 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Clorox | Clorox | N. A. | For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well. |
| Coverslip holder | In house | N.A. | For the blastomere isolation. |
| Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. | Carl Zeiss | Stemi 508 | For the blastomere isolation. |
| Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin | Gibco | A3160701 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge | BD | 14-826AA | For the blastomere isolation |
| Inulin | Alfa Aesar | AAA1842509 | For the blastomere isolation |
| MEM Vitamin Solution (100x) | Gibco | 11120052 | For the blastomere isolation. |
| MES (Fine White Crystals) | Fisher BioReagents | BP300-100 | For the bead preparation |
| Multitest Slide 10 Well | MP Biomedicals | ICN6041805 | For the blastomere isolation |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder | Fisher BioReagents | BP665-1 | For the bead preparation |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | For the blastomere isolation. |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher BioReagents | BP431-100 | For the blastomere isolation |
| Potassium Chloride | Bioshop | POC888 | For the blastomere isolation |
| Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer | Molecular Probes | R6160 | For the bead preparation |
| Schneider’s Drosophila Sterile Medium | Gibco | 21720024 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Sodium Chloride | Bioshop | SOD001 | For the blastomere isolation |
| Sodium Hydroxide Solution, 10 N | Fisher Chemical | SS255-1 | For the blastomere isolation |
| Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. | Intelligent Imaging Innovation | N.A. | For live-imaging |
| Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile | Basix | 13100115 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-862 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-854 | For the blastomere isolation. |
References
- Herman, M.
- Rose, L., Gonczy, P. Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos. WormBook. , (2014).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Mango, S. The C. elegans pharynx: a model for organogenesis. WormBook. , (2007).
- McGhee, J.
- Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and Manipulation of Embryonic Cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
- Stein, K. K.
- Quash, G., et al. The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests. Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).
- Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).
- Sugioka, K., Bowerman, B. Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows. Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).
- Park, F. D., Priess, J. R. Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos. Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Gillies, T. E., Cabernard, C.
- Poulson, N. D., Lechler, T.
- Knoblich, J. A. Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Dupont, S., et al.
- Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux's Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).
- Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. Cell neighbor determination in the metazoan embryo system. Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).
- Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).
- Cao, J., et al. Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
- Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity. Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , (2005).
- Müller, A., et al. Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1. PLOS Genetics. 11 (10), 1005624 (2015).
- Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development. Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).
- Habib, S. J., et al. A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro. Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).
